CN116042785A - 用于rt-lamp扩增试剂的缓冲剂及rt-lamp扩增试剂 - Google Patents

用于rt-lamp扩增试剂的缓冲剂及rt-lamp扩增试剂 Download PDF

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Abstract

本申请涉及RT‑LAMP扩增技术，尤其涉及一种用于RT‑LAMP扩增试剂的缓冲剂及RT‑LAMP扩增试剂。所述用于RT‑LAMP扩增试剂的缓冲剂，包括体积摩尔浓度为2mM的Tris‑HCl、2~10mM的葡萄糖酸钠及2~10mM的甲酸钠。本申请所得的缓冲剂可以既保证其不受环境中的CO2影响，又可以保证其不被反应过程中产生的H+中和。

Description

用于RT-LAMP扩增试剂的缓冲剂及RT-LAMP扩增试剂
技术领域
本申请涉及RT-LAMP扩增技术，尤其涉及一种用于RT-LAMP扩增试剂的缓冲剂及RT-LAMP扩增试剂。
背景技术
LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)技术依赖于识别保守序列DNA的4-6条特异性引物和一种具有链置换功能的DNA聚合酶（如Bst DNA polymerase）在约65℃的恒温条件下处理一小时即可实现对靶分子的109-1010倍扩增。LAMP检测方法具有效率高、耗时短、通量大、不依赖仪器、结果可直接肉眼观察、操作简单等优势，能够同时检测大批量的病理样本，非常适合基层快速诊断，具有巨大的未来市场价值。
RT-LAMP 扩增试剂在扩增反应过程中产生大量H+，使反应前后的pH 发生较大的变化，通过在扩增反应液中加入常用的Tris-HCl缓冲液及酚红指示剂，可有效指示反应液变化；当在pH 大于8.0时呈现紫红色，在pH小于6.8 时呈现黄色，通过肉眼即可根据颜色的变化判断反应的阴阳性；因此，pH 指示剂法RT-LAMP因其结果可肉眼区分被广泛应用。
但在实际应用过程中，反应前后颜色的变化对反应体系中的缓冲液的量要求较高，其添加量太多会导致RT-LAMP 反应产生的H+被中和，其添加量较少，使试剂容易受到环境中的CO2的影响而变酸，容易产生假阳性的结果。
发明内容
为了解决上述技术问题，本申请提供一种用于RT-LAMP扩增试剂的缓冲剂及RT-LAMP扩增试剂，所提供的缓冲剂可以既保证其不受环境中的CO2影响，又可以保证其不被反应过程中产生的H+中和。
本申请所提供的第一种方案为：用于RT-LAMP扩增试剂的缓冲剂，包括体积摩尔浓度为2mM的Tris-HCl、2~10mM的葡萄糖酸钠及2~10mM的甲酸钠。
可选的，包括体积摩尔浓度为2mM的Tris-HCl、2mM的葡萄糖酸钠及2mM的甲酸钠。
本申请还提供一种RT-LAMP扩增试剂，包括前述所述的缓冲剂、RT-LAMP 扩增所需的非酶原料、RT-LAMP 扩增所需的酶原料以及pH指示剂；所述缓冲剂包括体积摩尔浓度为2mM的Tris-HCl、2~10mM的葡萄糖酸钠、2~10mM的甲酸钠。
可选的，所述缓冲剂包括体积摩尔浓度为2mM的Tris-HCl、2mM的葡萄糖酸钠、2mM的甲酸钠。
可选的，所述RT-LAMP 扩增所需的非酶原料包含体积摩尔浓度为20~60mM的KCl、3~5mM的MgCl2、5~9mM的dNTPS。
可选的，所述RT-LAMP 扩增所需的酶原料包含10~60U的逆转录酶、10~20U的RNAase抑制剂、20~150U的Bst酶。
可选的，所述pH 指示剂包含质量百分比为0.1%~1%的酚红和0.03%~0.3%的姜黄素。
可选的，所述扩增试剂由前述所述的缓冲剂、RT-LAMP 扩增所需的非酶原料、RT-LAMP 扩增所需的酶原料以及pH指示剂组成；所述缓冲剂由体积摩尔浓度为2mM的Tris-HCl、2mM的葡萄糖酸钠、2mM的甲酸钠组成；所述RT-LAMP 扩增所需的非酶原料由60mM的KCl、5mM的MgCl2、9mM的dNTPS组成；所述RT-LAMP 扩增所需的酶原料由60U的逆转录酶、20U的RNAase抑制剂、150U的Bst酶组成；所述pH 指示剂由质量百分比为0.1%的酚红和0.03%的姜黄素组成。
可选的，所述缓冲剂的pH为7.8。
可选的，所述RT-LAMP扩增试剂反应的灵敏度最低可到每个反应10 拷贝，反应的颜色变化由紫红色变成亮黄色。
本申请通过在低浓度的Tris-HCl液中添加2~10mM的葡萄糖酸钠与2~10mM 甲酸钠混合物，可以既保证其不受环境中的CO2影响，又可以保证其不被反应过程中产生的H+中和。甲酸钠和葡糖糖酸钠二者作为强碱弱酸盐，低浓度的甲酸钠和葡萄糖酸钠呈弱碱性，可以中和溶解在水溶液中的空气中的CO2，同时不使缓冲体系的pH 发生较大的变化。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处描述和示出的本申请实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
以下是对本申请方案的详细说明：
本申请通过在低浓度的Tris-HCl 缓冲液中添加2~10mM的葡萄糖酸钠与2~10mM的甲酸钠混合物，可以既保证缓冲液不受环境中的CO2影响，又可以保证反应过程中产生的H+不被缓冲液中和。
此外，本申请还对pH指示剂进行了调整。现有常规使用的pH指示剂多是单独以酚红为指示剂，在pH 大于8.0时呈现紫红色，在pH小于6.8 时呈现黄色，当体系中的待扩增模板浓度较低时，即使产生了H+，但反应的PH 变化仍较小，颜色变化不明显，无法与反应前的颜色明确区分。本申请优化将pH指示剂调整为酚红和姜黄素的混合物可以使pH≧8.0的反应液呈现紫色，pH<8.0 的反应液呈现黄色，该混合物组合所得的指示剂极大提高了低浓度模板在反应前后的颜色区分度，提高了扩增试剂的灵敏度。
综上，本申请原理大致如下：
1、甲酸钠和葡糖糖酸钠二者作为强碱弱酸盐，低浓度的甲酸钠和葡萄糖酸钠呈弱碱性，可以中和溶解在水溶液中的空气中的CO2，同时不使缓冲体系的pH 发生较大的变化。
2、姜黄素作为pH 指示剂，其在pH为7.8时呈黄色，在pH为9.2 时为红棕色；酚红作为指示剂，其在pH 大于8.0时呈现紫红色，在pH小于6.8 时呈现黄色；姜黄素与酚红的混合物可以促使其缩小颜色变化pH区间，颜色变化更灵敏，并且使反应后的颜色更亮黄，增加肉眼区分度，降低结果误判率。
根据现有常规使用的RT-LAMP扩增试剂作为本申请的实施例的基础，并制备出以下对比例及实施例，具体如下：
对比例1
pH指示剂法RT-LAMP 扩增试剂包含：
2mM的Tris-HCl；
60mM的KCl、5mM的MgCl2、9mM的dNTPS；
60U的逆转录酶、20U的RNAase抑制剂、150U的Bst酶；
0.1%的酚红。
实施例1
pH指示剂法RT-LAMP 扩增试剂包含：
2mM的Tris-HCl；
60mM的KCl、5mM的MgCl2、9mM的dNTPS；
60U的逆转录酶、20U的RNAase抑制剂、150U的Bst酶；
0.1%的酚红、0.03%姜黄素。
实施例2
pH指示剂法RT-LAMP 扩增试剂包含：
2mM的Tris-HCl、2mM的葡萄糖酸钠；
60mM的KCl、5mM的MgCl2、9mM的dNTPS；
60U的逆转录酶、20U的RNAase抑制剂、150U的Bst酶；
0.1%的酚红、0.03%姜黄素。
实施例3
pH指示剂法RT-LAMP 扩增试剂包含：
2mM的Tris-HCl、2mM的葡萄糖酸钠、2mM的甲酸钠；
60mM的KCl、5mM的MgCl2、9mM的dNTPS；
60U的逆转录酶、20U的RNAase抑制剂、150U的Bst酶；
0.1%的酚红、0.03%的姜黄素。
上述各实施例所采用的成分均可通过市售购买获得。
所采用的Tris-HCl为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐。
所采用的dNTPS为脱氧核糖核苷三磷酸，N是指A、T、G、C四种的任意一种。
所采用的逆转录酶、RNAase抑制剂、Bst酶均采用现有常规在RT-LAMP扩增试剂中常用的成分。
所采用的酚红、姜黄素也是常规的pH指示剂成分。
本申请浓度单位mM表示体积摩尔浓度，1mM表示1mmol/L；U表示酶原料的活力单位值，即1min内能转化1μmol底物的酶量称为1酶单位(U)。
将上述所得各实施例的扩增试剂在空气中开盖放置不同时间的颜色变化如下：
颜色变化 30min 1小时 8小时
对比例1 黄色 黄色 黄色
实施例1 橙黄色 橙黄色 橙黄色
实施例2 紫红色 紫红色 紫红色
实施例3 紫红色 紫红色 紫红色
另，将上述所得扩增试剂用于常规核酸进行常规扩增实验，在不同拷贝数下所得各实施例的颜色变化如下：
颜色变化 100拷贝 50拷贝 10拷贝
对比例1 反应前紫红色反应后橙黄色 反应前紫红色反应后橙黄色 反应前紫红色反应后淡紫色
实施例1 反应前紫红色反应后亮黄色 反应前紫红色反应后亮黄色 反应前紫红色反应后亮黄色
实施例2 反应前紫红色反应后亮黄色 反应前紫红色反应后亮黄色 反应前紫红色反应后亮黄色
实施例3 反应前紫红色反应后亮黄色 反应前紫红色反应后亮黄色 反应前紫红色反应后亮黄色
从上述实施例及对应实验可得知，本申请所得缓冲剂在用于RT-LAMP扩增试剂时，可有效中和溶解在水溶液中的空气中的CO2，同时不使缓冲体系的pH 发生较大的变化。同时，姜黄素与酚红的混合物可以促使其缩小颜色变化pH区间，颜色变化更灵敏，并且使反应后的颜色更亮黄，增加肉眼区分度，降低结果误判率。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.用于RT-LAMP扩增试剂的缓冲剂，其特征在于，包括体积摩尔浓度为2mM的Tris-HCl、2~10mM的葡萄糖酸钠及2~10mM的甲酸钠。
2.根据权利要求1所述的缓冲剂，其特征在于，包括体积摩尔浓度为2mM的Tris-HCl、2mM的葡萄糖酸钠及2mM的甲酸钠。
3.一种RT-LAMP扩增试剂，其特征在于，包括权利要求1所述的缓冲剂、RT-LAMP 扩增所需的非酶原料、RT-LAMP 扩增所需的酶原料以及pH指示剂；所述缓冲剂包括体积摩尔浓度为2mM的Tris-HCl、2~10mM的葡萄糖酸钠、2~10mM的甲酸钠。
4.根据权利要求3所述的RT-LAMP扩增试剂，其特征在于，所述缓冲剂包括体积摩尔浓度为2mM的Tris-HCl、2mM的葡萄糖酸钠、2mM的甲酸钠。
5.根据权利要求3所述的RT-LAMP扩增试剂，其特征在于，所述RT-LAMP 扩增所需的非酶原料包含体积摩尔浓度为20~60mM的KCl、3~5mM的MgCl2、5~9mM的dNTPS。
6.根据权利要求3所述的RT-LAMP扩增试剂，其特征在于，所述RT-LAMP 扩增所需的酶原料包含10~60U的逆转录酶、10~20U的RNAase抑制剂、20~150U的Bst酶。
7.根据权利要求3所述的RT-LAMP扩增试剂，其特征在于，所述pH 指示剂包含质量百分比为0.1%~1%的酚红和0.03%~0.3%的姜黄素。
8.根据权利要求3所述的RT-LAMP扩增试剂，其特征在于，所述扩增试剂由权利要求1所述的缓冲剂、RT-LAMP 扩增所需的非酶原料、RT-LAMP 扩增所需的酶原料以及pH指示剂组成；所述缓冲剂由体积摩尔浓度为2mM的Tris-HCl、2mM的葡萄糖酸钠、2mM的甲酸钠组成；所述RT-LAMP 扩增所需的非酶原料由60mM的KCl、5mM的MgCl2、9mM的dNTPS组成；所述RT-LAMP扩增所需的酶原料由60U的逆转录酶、20U的RNAase抑制剂、150U的Bst酶组成；所述pH 指示剂由质量百分比为0.1%的酚红和0.03%的姜黄素组成。
9.根据权利要求3所述的RT-LAMP扩增试剂，其特征在于，所述缓冲剂的pH为7.8。
10.根据权利要求3所述的RT-LAMP扩增试剂，其特征在于，所述RT-LAMP扩增试剂反应的灵敏度最低可到每个反应10 拷贝，反应的颜色变化由紫红色变成亮黄色。
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