CN114875115A - 一种显色剂的稳定剂及稳定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种显色剂的稳定剂及稳定方法，本发明提供一种显色剂的稳定剂，所述稳定剂包括还原性物质和弱酸性缓冲液；所述弱酸性缓冲液的pH为3.8～6.2；所述还原性物质为亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠或1‑巯基甘油中的一种或多种；所述显色剂为吩噻嗪类显色剂或三苯甲烷类显色剂中的一种或两种；利用所述稳定剂可稳定保存显色剂，所述稳定保存显色剂的方法是将显色剂溶于稳定剂中，显色剂可以在稳定剂中稳定保存2周，且稳定剂对于显色剂的后续使用并不会存在抑制作用，不仅解决了显色试剂稳定低，存在容易自发发色的问题，同时避免了稳定剂对于显色剂性能的影响，为显色剂保存提供新的方法。

Description

一种显色剂的稳定剂及稳定方法
技术领域
本发明属于化学检测领域，具体涉及一种显色剂的稳定剂及稳定方法。
背景技术
人体各种体液中的各种成分变化跟疾病发生有很大关系，通常在进行疾病发生的风险预测，辅助诊断以及疗效监控的判断需要定量或定性某些体液中的成分变化：如血液中的糖化血红蛋白、糖化白蛋白、尿酸、尿素、葡萄糖、甘油三酯等多种微量成分。对这些微量成分的定性定量分析，对疾病的辅助诊断发挥很大作用。
目前对于人体液中各种微量成分定量定性分析手段有多种，广泛应用于临床测定的为酶偶联比色法，即使目标成分与特异作用的氧化酶作用生成过氧化氢，使用过氧化物酶(POD)及作为显色成分的被氧化的显色剂，将过氧化氢诱导成显色体系，再通过比色定量其显色程度求得目标成分量的方法。熟知的显色体系是有4-氨基安替比林(4-AAP)或3-甲基-2-苯并噻唑腙(MBTH)与苯酚衍生物、苯胺衍生物等生色团的氧化缩合而生成色素的Trinder试剂。但使用这种被氧化显色剂的显色系对于定量微量成分的灵敏度低，容易受到样本中血红蛋白和胆红素影响。为解决典型Trinder试剂的问题，新型的过氧化氢显色试剂得到广泛关注，但由于新型的过氧化氢显色剂稳定低，存在容易自发发色问题，限制了新型的过氧化氢显色剂的应用。
现有技术公开了一种显色剂的稳定剂及其应用，所述稳定剂可以很好的稳定例如3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色剂，但是，该稳定剂含有偶氮染料，偶氮染料会提高试剂的整体空白，不利于实际应用。因此，开发新的显色剂的稳定化方法及稳定剂十分有必要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有过氧化氢显色剂稳定化方法的不足，提供一种显色剂的稳定剂及稳定方法。
本发明的目的在于提供一种显色剂的稳定剂。
本发明的目的还在于提供一种组合物在制备显色剂的稳定剂中的应用。
本发明的目的还在于提供所述稳定剂在酶偶联比色法检测或制备酶偶联比色法检测的试剂盒中的应用。
本发明的目的还在于提供稳定显色剂的方法。
本发明的目的还在于提供一种试剂盒。
本发明的上述目的通过以下技术手段实现：
一种显色剂的稳定剂，所述稳定剂包括还原性物质和弱酸性缓冲液，所述弱酸性缓冲液的pH为3.8～6.2；所述还原性物质为亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠或1-巯基甘油中的一种或多种；所述显色剂为吩噻嗪类显色剂或三苯甲烷类显色剂中的一种或两种。
优选地，所述弱酸性缓冲液的pH为4～6。
进一步优选地，所述弱酸性缓冲液的pH为5。
优选地，所述还原性物质为亚硫酸钠或硫代硫酸钠中的一种或两种。
进一步优选地，显色剂为吩噻嗪类显色剂，所述还原性物质为硫代硫酸钠；显色剂为三苯甲烷类显色剂，所述还原性物质为亚硫酸钠。
进一步优选地，显色剂为吩噻嗪类显色剂，所述弱酸性缓冲液的pH为5～6，所述还原性物质为硫代硫酸钠；显色剂为三苯甲烷类显色剂，所述弱酸性缓冲液的pH为4～5，所述还原性物质为亚硫酸钠。
优选地，所述还原性物质的浓度为0.01～20mM。
进一步优选地，所述还原性物质的浓度为1～10mM。
进一步优选地，所述还原性物质的浓度为10mM。
更进一步优选地，显色剂为吩噻嗪类显色剂，所述弱酸性缓冲液的pH为5，所述还原性物质为浓度为10mM的硫代硫酸钠；显色剂为三苯甲烷类显色剂，所述弱酸性缓冲液的pH为5，所述还原性物质为浓度为10mM的亚硫酸钠。
优选地，所述弱酸性缓冲液为柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、4-吗啉乙磺酸缓冲液(MES缓冲液)、乙酸缓冲液或咪唑缓冲液中的一种或多种。
进一步优选地，所述弱酸性缓冲液为柠檬酸缓冲液、4-吗啉乙磺酸缓冲液(MES缓冲液)中的一种或两种。
优选地，所述吩噻嗪类显色剂为10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲基氨基)吩噻嗪钠盐(DA-67)或3,7-双(二甲氨基)-N-乙基-10H-吩噻嗪-10-甲酰胺(MCDP)中的一种或两种。
优选地，所述三苯甲烷类显色剂为隐色孔雀石绿或无色结晶紫中的一种或两种。
一种组合物在制备显色剂的稳定剂中的应用，所述组合物为上述显色剂的稳定剂；所述稳定剂包括还原性物质和弱酸性缓冲液；所述显色剂为吩噻嗪类显色剂或三苯甲烷类显色剂中的一种或两种。
所述稳定剂在酶偶联比色法检测或制备酶偶联比色法检测的试剂盒中的应用也在本发明的保护范围之内。
一种试剂盒，包括试剂R2，所述试剂R2包括所述显色剂和所述稳定剂；所述试剂盒用于酶偶联比色法的检测。
优选地，所述显色剂为吩噻嗪类显色剂或三苯甲烷类显色剂。
所述试剂盒还包括试剂R1，所述试剂R1包括缓冲液、过氧化物酶、防腐剂、氧化酶、合成酶或腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)中的一种或多种。
优选地，所述试剂盒还包括前处理液，所述前处理液包括表面活性剂和亚硝酸钠。
进一步优选地，所述表面活性剂为曲拉通Triton X-100、吐温-20或Triton X-405。
进一步优选地，所述表面活性剂为曲拉通Triton X-100。
优选地，所述试剂R1中氧化酶为果糖基氨基酸氧化酶或酰基辅酶A氧化酶。
优选地，所述试剂R1中合成酶为酰基辅酶A合成酶。
优选地，所述试剂R2包括含有硫代硫酸钠、pH为5～6缓冲液的稳定剂和吩噻嗪类显色剂。
进一步优选地，所述试剂R2包括含有硫代硫酸钠、pH为5缓冲液的稳定剂和吩噻嗪类显色剂。
优选地，所述试剂R2包括含有亚硫酸钠、pH为4～5缓冲液的稳定剂和三苯甲烷类显色剂。
进一步优选地，所述试剂R2包括含有亚硫酸钠、pH为5缓冲液的稳定剂和三苯甲烷类显色剂。
优选地，所述试剂R2还包括防腐剂、表面活性剂和辅酶A。
优选地，所述防腐剂为Proclin-300或苯甲酸钠。
优选地，所述表面活性剂为直链仲醇聚氧乙烯醚(TergitolTM 15-S-9)或GenapolX 080。
进一步优选地，所述表面活性剂为直链仲醇聚氧乙烯醚(TergitolTM 15-S-9)。
作为具体实施方案，一种试剂盒，利用酶偶联比色法检测血样中糖化血红蛋白，所述试剂盒包括：前处理液、试剂R1和试剂R2；所述前处理液为曲拉通Triton X-100和亚硝酸钠；所述试剂R1为Tris-HCl缓冲液、过氧化物酶、果糖基氨基酸氧化酶和叠氮钠；所述试剂R2为4-吗啉乙磺酸缓冲液(MES缓冲液)、10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲基氨基)吩噻嗪钠盐(DA-67)、硫代硫酸钠和Proclin-300。
所述检测血样中糖化血红蛋白的试剂盒的使用方法：在全血样本中加入抗凝剂EDTA二钠，离心分层，从最下层取红细胞与前处理液充分混合制得前处理样本。然后将前处理样本与试剂R1混匀，37℃孵育5min，测定吸光度A1，然后再加入试剂R2混匀，37℃孵育5min后，测定吸光度A2。
作为具体实施方案，一种试剂盒，利用酶偶联比色法检测血样中游离脂肪酸，所述试剂盒包括：试剂R1和试剂R2，所述试剂R1为HEPES缓冲液、酰基辅酶A合成酶、酰基辅酶A氧化酶、ATP、过氧化物酶和叠氮钠；所述试剂R2为柠檬酸缓冲液、直链仲醇聚氧乙烯醚(TergitolTM 15-S-9)、辅酶A、隐色孔雀石绿、亚硫酸钠和苯甲酸钠。
检测血样中游离脂肪酸的试剂盒的使用方法：将血清与试剂R2混匀，37℃孵育5min，测定600nm波长下的吸光度A1，然后再加入45μL试剂R1混匀，37℃孵育5min后，测定600nm波长下的吸光度A2。
一种稳定显色剂的方法，将所述显色剂溶于所述稳定剂中，即可抑制显色剂的自发显色，稳定保存显色剂。
所述稳定剂包括还原性物质和弱酸性缓冲液，所述弱酸性缓冲液的pH为3.8～6.2；所述还原性物质为亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠或1-巯基甘油中的一种或多种；所述显色剂为吩噻嗪类显色剂或三苯甲烷类显色剂中的一种或两种。
本发明利用所述含有还原性物质的稳定剂保存显色剂，可抑制显色剂的自发显色，且对于显色剂的性质不产生影响，不影响显色剂的应用。
相比现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明利用弱酸性缓冲液或含有还原性物质的弱酸性缓冲液作为稳定剂保存吩噻嗪类显色剂或三苯甲烷类显色剂，可以抑制显色剂的自发显色，延长显色剂的保存时间，保持显色剂的显色能力；同时不干扰显色剂的氧化还原反应，可应用于吩噻嗪类显色剂或三苯甲烷类显色剂的稳定保存。
(2)利用所述稳定剂可稳定保存显色剂，所述稳定保存显色剂的方法是将显色剂溶于稳定剂中，显色剂可以在稳定剂中稳定保存2周，且稳定剂对于显色剂的后续使用并不会存在抑制作用，不仅解决了显色试剂稳定低，存在容易自发发色的问题，同时避免了稳定剂对于显色剂性能的影响，为显色剂保存提供新的方法。
附图说明
图1为本发明以对比试验1测定的结果作为X轴，试验1的测定结果为Y轴拟合的相关性回归方程图。
图2为本发明以对比试验1测定的结果作为X轴，试验2的测定结果为Y轴拟合的相关性回归方程图。
图3为本发明以对比试验1测定的结果作为X轴，试验3的测定结果为Y轴拟合的相关性回归方程图。
图4为本发明以对比试验2测定的结果作为X轴，试验4的测定结果为Y轴拟合的相关性回归方程图。
图5为本发明以对比试验2测定的结果作为X轴，试验5的测定结果为Y轴拟合的相关性回归方程图。
图6为本发明以对比试验2测定的结果作为X轴，试验6的测定结果为Y轴拟合的相关性回归方程图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明所述保存溶液即所述稳定剂。
Tris缓冲液(pH＝8.00)：三羟甲基氨基甲烷1.21g，加纯化水50mL溶解，并使用盐酸调整pH至8.00后，加纯化水定容至100mL。
磷酸盐缓冲液(pH＝7.00)：无水磷酸二氢钠1.20g，加纯化水50mL溶解，并使用氢氧化钠调整pH至7.00后，加纯化水定容至100mL。
MES缓冲液(pH＝6.00)：2-(N-吗啉)乙磺酸1.95g，加纯化水50mL溶解，并使用氢氧化钠调整pH至6.00后，加纯化水定容至100mL。
咪唑缓冲液(pH＝6.00)：三羟甲基氨基甲烷0.68g，加纯化水50mL溶解，并使用盐酸调整pH至6.00后，加纯化水定容至100mL。
柠檬酸缓冲液(pH＝5.00)：一水柠檬酸2.10g，加纯化水50mL溶解，并使用氢氧化钠调整pH至5.00后，加纯化水定容至100mL。
MES缓冲液(pH＝5.00)：2-(N-吗啉)乙磺酸1.95g，加纯化水50mL溶解，并使用氢氧化钠调整pH至5.00后，加纯化水定容至100mL。
乙酸缓冲液(pH＝4.00)：三水乙酸钠1.36g，加纯化水50mL溶解，并使用盐酸调整pH至4.00后，加纯化水定容至100mL。
邻苯二甲酸氢钾缓冲液(pH＝4.00)：邻苯二甲酸氢钾2.04g，加纯化水50mL溶解，并使用氢氧化钠调整pH至4.00后，加纯化水定容至100mL。
实施例1 DA-67在不同缓冲液保存条件下的稳定性
1.方法
将显色剂10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲基氨基)吩噻嗪钠盐(DA-67)分别溶解于不同缓冲液保存溶液中，显色剂DA-67的终浓度均为50μM。在37℃下保存2周，每隔2天抽取一部分溶液，利用紫外分光光度计测定660nm波长下的吸光度。
2.结果
编号1～8不同保存条件下显色剂DA-67的吸光度的变化如表1所示。
表1编号1～8不同保存条件下显色剂DA-67的吸光度的变化
Figure BDA0003617374870000061
Figure BDA0003617374870000071
从表1可以看出，显色剂DA-67在不同缓冲液保存溶液中37℃下保存2周的吸光度具有明显的差异。随着保存天数的增加，显色剂DA-67变化趋势大致相同。DA-67在pH为8.00，100mM的Tris-HCl缓冲液中吸光度增加了1.7792；DA-67在pH为7，100mM的磷酸盐缓冲液中吸光度增加了1.537；而在pH为4～6的缓冲液中吸光度仅增加了1.1848～1.2633；在pH为5.00的缓冲液中吸光度仅增加了1.1848或1.1973，吸光度变化最小，说明DA-67的吸光度在偏酸性环境下(pH为4～6的缓冲液)变化明显小于偏碱性环境，相比于碱性缓冲液，pH为4～6弱酸性缓冲液的保存溶液可以明显减缓显色剂的自发显色，一定程度的抑制显色剂的自发显色，稳定显色剂。pH为5弱酸性缓冲液的保存溶液抑制显色剂的自发显色的效果最好。
实施例2 DA-67在不同还原性物质保存条件下的稳定性
1.方法
将显色剂10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲基氨基)吩噻嗪钠盐(DA-67)分别溶解于不同还原性物质保存溶液中，显色剂DA-67的终浓度均为50μM。在37℃下保存2周，每隔2天抽取一部分溶液，利用紫外分光光度计测定660nm波长下的吸光度。
2.结果
编号9～12不同保存条件下显色剂DA-67的吸光度的变化如表2所示。
表2编号9～12不同保存条件下显色剂DA-67的吸光度的变化
Figure BDA0003617374870000072
Figure BDA0003617374870000081
从表2可以看出，显色剂DA-67在不同还原性物质保存溶液中37℃下保存2周的吸光度变化趋势大致相同。在不同还原性物质保存溶液中，DA-67在pH为5，含有3mM硫代硫酸钠的柠檬酸缓冲液的保存溶液中吸光度仅增加了0.6873，吸光度变化最小，抑制自发显色效果优于还原性物质亚硫酸钠、亚硫酸氢钠和1-巯基甘油。
将保存溶液换成pH为5的其他缓冲溶液，含有硫代硫酸钠的保存溶液抑制自发显色效果同样优于还原性物质亚硫酸钠、亚硫酸氢钠和1-巯基甘油。
实施例3 DA-67在不同浓度硫代硫酸钠保存条件下的稳定性
1.方法
将显色剂10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲基氨基)吩噻嗪钠盐(DA-67)分别溶解于不同浓度硫代硫酸钠保存溶液中，显色剂DA-67的终浓度均为50μM。在37℃下保存2周，每隔2天抽取一部分溶液，利用紫外分光光度计测定660nm波长下的吸光度。
2.结果
编号13～16不同保存条件下显色剂DA-67的吸光度的变化如表3所示。
表3编号13～16不同保存条件下显色剂DA-67的吸光度的变化
Figure BDA0003617374870000082
Figure BDA0003617374870000091
从表3可以看出，显色剂DA-67不同浓度硫代硫酸钠保存溶液中37℃下保存2周的吸光度变化趋势大致相同。在不同浓度硫代硫酸钠保存溶液中，DA-67在pH为5，含有10mM硫代硫酸钠的柠檬酸缓冲液保存溶液中吸光度仅增加了0.4242，吸光度变化最小，抑制自发显色效果最优。由此可知，DA-67在含有10mM硫代硫酸钠，pH为5的柠檬酸缓冲液中保存，稳定效果最优。
将保存溶液换成pH为5的其他缓冲溶液，DA-67同样在含有10mM硫代硫酸钠的缓冲液中保存，稳定效果最优。
实施例4隐色孔雀石绿在不同缓冲液保存条件下的稳定性
1.方法
将显色剂隐色孔雀石绿分别溶解于不同缓冲液保存溶液中，显色剂隐色孔雀石绿的终浓度均为10μM。在37℃下保存2周，每隔2天抽取一部分溶液，利用紫外分光光度计测定660nm波长下的吸光度。
2.结果
编号17～24不同保存条件下显色剂隐色孔雀石绿的吸光度的变化如表4所示。
表4编号17～24不同保存条件下显色剂隐色孔雀石绿的吸光度的变化
Figure BDA0003617374870000101
从表4可以看出，显色剂隐色孔雀石绿在不同缓冲液保存溶液中37℃下保存2周的吸光度具有明显的差异，随着保存天数的增加，隐色孔雀石绿在pH为8的Tris-HCl缓冲液中吸光度增加了0.3743；在pH为7.00的磷酸盐缓冲液中吸光度增加了0.3509；而在pH为4～6的缓冲液中吸光度仅仅增加了0.224～0.279，在pH为5的缓冲液中吸光度仅为0.224或0.2289，吸光度变化最小；说明隐色孔雀石绿在弱酸性条件下(pH为4～6的缓冲液)自发显色的程度比中性或碱性的低，pH为5时抑制自发显色效果最好。
实施例5隐色孔雀石绿在不同还原性物质保存条件下的稳定性
1.方法
将显色剂隐色孔雀石绿分别溶解于不同还原性物质保存溶液中，显色剂隐色孔雀石绿的终浓度均为10μM。在37℃下保存2周，每隔2天抽取一部分溶液，利用紫外分光光度计测定660nm波长下的吸光度。
2.结果
编号25～28不同保存条件下显色剂隐色孔雀石绿的吸光度的变化如表5所示。
表5编号25～28不同保存条件下显色剂隐色孔雀石绿的吸光度的变化
Figure BDA0003617374870000111
从表5可以看出，显色剂隐色孔雀石绿在不同还原性物质保存溶液中37℃下保存2周的吸光度具有明显的差异，随着保存天数的增加，显色剂隐色孔雀石绿在pH为5的含有3mM亚硫酸钠的MES缓冲液中吸光度仅仅增加了0.1825，吸光度变化最小，抑制自发显色效果优于还原性物质硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和1-巯基甘油。
将保存溶液换成pH为5的其他缓冲溶液，含有亚硫酸钠的保存溶液抑制自发显色效果同样优于还原性物质硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和1-巯基甘油。
实施例6隐色孔雀石绿在不同浓度亚硫酸钠保存条件下的稳定性
1.方法
将显色剂隐色孔雀石绿分别溶解于不同浓度亚硫酸钠保存溶液中，显色剂隐色孔雀石绿的终浓度均为10μM。在37℃下保存2周，每隔2天抽取一部分溶液，利用紫外分光光度计测定660nm波长下的吸光度。
2.结果
编号29～32不同保存条件下显色剂隐色孔雀石绿的吸光度的变化如表6所示。
表6编号29～32不同保存条件下显色剂隐色孔雀石绿的吸光度的变化
Figure BDA0003617374870000121
从表6可以看出，显色剂隐色孔雀石绿在不同浓度亚硫酸钠保存溶液中37℃下保存2周的吸光度具有明显的差异，随着保存天数的增加，显色剂隐色孔雀石绿在pH为5的含有10mM亚硫酸钠的MES缓冲液中吸光度仅仅增加了0.1329，吸光度变化最小，抑制自发显色效果最优。由此可知，隐色孔雀石绿在含有10mM亚硫酸钠，pH为5的MES缓冲液中保存，稳定效果最优。
将保存溶液换成pH为5的其他缓冲溶液，隐色孔雀石绿同样在含有10mM亚硫酸钠的缓冲液中保存，稳定效果最优。
实施例7无色结晶紫在不同缓冲液保存条件下的稳定性
1.方法
将显色剂无色结晶紫分别溶解于不同缓冲液保存溶液中，显色剂无色结晶紫的终浓度均为10μM。在37℃下保存2周，每隔2天抽取一部分溶液，利用紫外分光光度计测定590nm波长下的吸光度。
2.结果
编号33～40不同保存条件下显色剂无色结晶紫的吸光度的变化如表7所示。
表7编号33～40不同保存条件下显色剂无色结晶紫的吸光度的变化
Figure BDA0003617374870000131
从表7可以看出，显色剂无色结晶紫在不同缓冲液保存溶液中37℃下保存2周的吸光度具有明显的差异，随着保存天数的增加，显色剂无色结晶紫在在pH为8的Tris-HCl缓冲液中吸光度增加了0.423；在pH为7.00的磷酸盐缓冲液中吸光度增加了0.3859；而在pH为4～6的缓冲液中吸光度仅仅增加了0.2528～0.3219，在pH为5的缓冲液中吸光度仅仅增加了0.2528或0.2553，吸光度变化最小；说明无色结晶紫在弱酸性条件下(pH为4～6的缓冲液)自发显色的程度比中性或碱性的低，pH为5时抑制自发显色效果最好。
实施例8无色结晶紫在不同还原性物质保存条件下的稳定性
1.方法
将显色剂无色结晶紫分别溶解于不同还原性物质保存溶液中。显色剂无色结晶紫的终浓度均为10μM。在37℃下保存2周，每隔2天抽取一部分溶液，利用紫外分光光度计测定590nm波长下的吸光度。
2.结果
编号41～44不同保存条件下显色剂无色结晶紫的吸光度的变化如表8所示。
表8编号41～44不同保存条件下显色剂无色结晶紫的吸光度的变化
Figure BDA0003617374870000141
从表8可以看出，显色剂无色结晶紫在不同还原性物质保存溶液中37℃下保存2周的吸光度具有明显的差异，随着保存天数的增加，显色剂无色结晶紫在pH为5的含有3mM亚硫酸钠的MES缓冲液中吸光度仅仅增加了0.2276，吸光度变化最小，抑制自发显色效果优于还原性物质硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和1-巯基甘油。
将保存溶液换成pH为5的其他缓冲溶液，含有亚硫酸钠的保存溶液抑制自发显色效果同样优于还原性物质硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和1-巯基甘油。
实施例9无色结晶紫在不同浓度亚硫酸钠保存条件下的稳定性
1.方法
将显色剂无色结晶紫分别溶解于不同浓度亚硫酸钠保存溶液中显色剂无色结晶紫的终浓度均为10μM。在37℃下保存2周，每隔2天抽取一部分溶液，利用紫外分光光度计测定590nm波长下的吸光度。
2.结果
编号45～48不同保存条件下显色剂无色结晶紫的吸光度的变化如表9所示。
表9编号45～48不同保存条件下显色剂无色结晶紫的吸光度的变化
Figure BDA0003617374870000151
从表9可以看出，显色剂无色结晶紫在不同浓度亚硫酸钠保存溶液中37℃下保存2周的吸光度具有明显的差异，随着保存天数的增加，显色剂无色结晶紫在编号39即pH为5的含有10mM亚硫酸钠的MES缓冲液中吸光度仅仅增加了0.1688，吸光度变化最小，抑制自发显色效果最优。由此可知，无色结晶紫在含有10mM亚硫酸钠，pH为5的MES缓冲液中保存，稳定效果最优。
将保存溶液换成pH为5的其他缓冲溶液，无色结晶紫同样在含有10mM亚硫酸钠的缓冲液中保存，稳定效果最优。
对比例DA-67在不同保存条件下的稳定性
1.方法
将显色剂10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲基氨基)吩噻嗪钠盐(DA-67)分别溶解于不同保存溶液中，显色剂DA-67的终浓度均为40μM。在37℃下保存2周，每隔2天抽取一部分溶液，利用紫外分光光度计测定660nm波长下的吸光度。
2.结果
编号49～52不同保存条件下显色剂DA-67的吸光度的变化如表10所示。
表10编号49～52不同保存条件下显色剂DA-67的吸光度的变化
Figure BDA0003617374870000161
从表10可以看出，显色剂DA-67在不同保存溶液中37℃下保存2周的吸光度具有明显的差异，显色剂DA-67在含有十六烷基三甲基溴化铵和苯扎氯胺保存溶液中吸光度分别增加1.2424和1.1663，显著高于在含有还原性物质1-巯基甘油和硫代硫酸钠保存溶液中吸光度，说明显色剂DA-67在含有还原性物质1-巯基甘油和硫代硫酸钠的弱酸性缓冲液中的自发显色显著低于含有季铵的弱酸性缓冲液；说明含有还原性物质1-巯基甘油和硫代硫酸钠等的弱酸性缓冲液保存溶液对显色剂的稳定效果更优。
应用例1显色剂的应用
1.方法
利用含有还原性物质的弱酸性缓冲液保存溶液保存显色剂，并利用该显色剂对糖化血红蛋白进行测定。
糖化血红蛋白测定试剂成分如下表11。
表11糖化血红蛋白测定试剂成分
Figure BDA0003617374870000171
糖化血红蛋白测定方法：
在全血样本中加入抗凝剂EDTA二钠，离心分层，从最下层取25μL红细胞与500μL前处理液充分混合制得前处理样本。取12μL前处理样本与180μL试剂R1混匀，37℃孵育5min，测定660nm波长下的吸光度A1，然后再加入60μL试剂R2混匀，37℃孵育5min后，测定660nm波长下的吸光度A2，计算A2-A1差值。
以上述操作方法和上机参数利用全自动日立7180生化分析仪校准定标，确定糖化血红蛋白浓度与A2-A1差值的线性关系，根据糖化血红蛋白与A2-A1差值的线性关系和EDTA二钠全血样本的A2-A1差值计算糖化血红蛋白的浓度。
将含有还原剂的稳定剂与显色剂共存一周后，以试剂R2中还原性物质为硫代硫酸钠的作为试验1；以试剂R2中还原性物质为维生素C的作为试验2；以试剂R2中还原性物质为硼氢化钠的作为试验3；以购自积水医疗科技(中国)有限公司的酶法糖化血红蛋白检测试剂盒作为对比试验1，对比试验1按照其试剂盒的说明书进行测试；以试验1～3、对比试验1的试剂分别测定30例EDTA二钠全血样本的糖化血红蛋白浓度。
以对比试验1测定的结果作为X轴，试验1～3的测定结果为Y轴分别拟合相关性回归方程，确定试剂R2中不同还原性物质对测定结果的影响。
2.结果
(1)30例EDTA二钠全血样本的糖化血红蛋白浓度测定结果
试验1～3、对比试验1测定的30例EDTA二钠全血样本的糖化血红蛋白浓度测定结果如表12所示。
表12 30例EDTA二钠全血样本的糖化血红蛋白浓度测定结果
Figure BDA0003617374870000181
Figure BDA0003617374870000191
(2)试验1～3的测定结果与对比试验1测定结果的相关性
对比试验1测定的结果作为X轴，试验1～3的测定结果为Y轴分别拟合相关性回归方程图，试验1～3拟合的相关性结果分别如图1～图3所示。从图1可以看出，试验1的测定结果与对比试验1的拟合性的相关系数R2为0.9839，相关性良好，而图2和图3显示试验2和试验3的测定结果与对比试验1的拟合性的相关系数R2为0.2679/0.3786，相关性很差，说明以还原性物质维生素C或硼氢化钠作为试剂盒试剂R2时，糖化血红蛋白的测定受到了抑制影响，测定准确性差，而以本发明的还原性物质硫代硫酸钠作为试剂盒试剂R2时，则不存在抑制反应，且测定结果与商品化试剂相关性良好，测定准确性好。
应用例2显色剂的应用
1.方法
利用含有还原性物质的弱酸性缓冲液保存溶液保存显色剂，并利用该显色剂对游离脂肪酸进行测定。
游离脂肪酸测定试剂成分如下表13。
表13游离脂肪酸测定试剂成分
Figure BDA0003617374870000192
Figure BDA0003617374870000201
游离脂肪酸测定方法：
取3μL血清与180μL试剂R2混匀，37℃孵育5min，测定600nm波长下的吸光度A1，然后再加入45μL试剂R1混匀，37℃孵育5min后，测定600nm波长下的吸光度A2，计算A2-A1差值。
以上述操作方法和上机参数利用全自动日立7180生化分析仪校准定标，确定游离脂肪酸浓度与A2-A1差值的线性关系，根据游离脂肪酸与A2-A1差值的线性关系和血清样本的A2-A1差值计算游离脂肪酸的浓度。
将含有还原剂的稳定剂与显色剂共存一周后，以试剂R2中还原性物质为亚硫酸钠的作为试验4；以试剂R2中还原性物质为维生素C的作为试验5；以试剂R2中还原性物质为硼氢化钠的作为试验6；以购自德赛诊断系统(上海)有限公司的游离脂肪酸测定试剂盒作为对比试验2，对比试验2按照其试剂盒的说明书进行测试；以试验4～6、对比试验2的试剂分别测定40例血清的游离脂肪酸。
以对比试验2测定的结果作为X轴，试验4～6的测定结果为Y轴分别拟合相关性回归方程，确定试剂R2中不同还原性物质对测定结果的影响。
2.结果
(1)40例血清样本的游离脂肪酸浓度测定结果。
试验4～6、对比试验2测定的40例血清样本的游离脂肪酸浓度测定结果如表14所示。
表14 40例血清样本的游离脂肪酸浓度测定结果
Figure BDA0003617374870000202
Figure BDA0003617374870000211
Figure BDA0003617374870000221
(2)试验4～6的测定结果与对比试验2测定结果的相关性
对比试验2测定的结果作为X轴，试验4～6的测定结果为Y轴分别拟合相关性回归方程图，试验4～6拟合的相关性结果分别如图4～图6所示。从图4可以看出，试验4的测定结果与对比试验2的拟合性的相关系数R2为0.9805，相关性良好，而图5和图6显示试验5和试验6的测定结果与对比试验2的拟合性的相关系数R2为0.8242/0.8566，相关性较差，说明以还原性物质维生素C或硼氢化钠作为试剂盒试剂R2时，游离脂肪酸的测定受到了抑制影响，测定准确性差，而以本发明的还原性物质亚硫酸钠作为试剂盒试剂R2时，则不存在抑制反应，且测定结果与商品化试剂相关性良好，测定准确性好。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种显色剂的稳定剂，其特征在于，所述稳定剂包括还原性物质和弱酸性缓冲液；所述弱酸性缓冲液的pH为3.8～6.2；所述还原性物质为亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠或1-巯基甘油中的一种或多种；所述显色剂为吩噻嗪类显色剂或三苯甲烷类显色剂中的一种或两种。
2.根据权利要求1所述稳定剂，其特征在于，所述弱酸性缓冲液为柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、4-吗啉乙磺酸缓冲液、乙酸缓冲液或咪唑缓冲液中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述稳定剂，其特征在于，所述吩噻嗪类显色剂为10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪钠盐或3,7-双(二甲氨基)-N-乙基-10H-吩噻嗪-10-甲酰胺中的一种或两种；所述三苯甲烷类显色剂为隐色孔雀石绿或无色结晶紫中的一种或两种。
4.根据权利要求1所述稳定剂，其特征在于，所述还原性物质为亚硫酸钠或硫代硫酸钠中的一种或两种。
5.根据权利要求1所述稳定剂，其特征在于，所述还原性物质的浓度为0.01～20mM。
6.根据权利要求1所述稳定剂，其特征在于，所述弱酸性缓冲液的pH为4～6。
7.根据权利要求1所述稳定剂，其特征在于，显色剂为吩噻嗪类显色剂，所述还原性物质为硫代硫酸钠；显色剂为三苯甲烷类显色剂，所述还原性物质为亚硫酸钠。
8.一种组合物在制备显色剂的稳定剂中的应用，其特征在于，所述组合物为权利要求1所述显色剂的稳定剂；所述稳定剂包括还原性物质和弱酸性缓冲液；所述显色剂为吩噻嗪类显色剂或三苯甲烷类显色剂中的一种或两种。
9.权利要求1～7所述稳定剂在酶偶联比色法检测或制备酶偶联比色法检测的试剂盒中的应用。
10.一种试剂盒，其特征在于，包括试剂R2，所述试剂R2包括权利要求2～8中任一显色剂和权利要求2～8任一所述稳定剂。
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