CN112285367B - 一种检测钙离子的试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及体外检测技术领域，尤其涉及一种检测钙离子的试剂盒及其应用。用于缓冲的试剂1和用于显色的试剂2；所述试剂1包括：稳定剂；所述试剂2包括邻甲酚酞络合酮；所述稳定剂为天然或合成的多糖，或甘油，所述稳定剂在试剂1中浓度为250‑500g/L。本发明通过在邻甲酚酞络合酮法检测钙离子的试剂中加入天然或合成的多糖，或甘油作为稳定剂，增加溶液粘度，阻碍二氧化碳在气液界面和溶液内部的扩散行为，有效延长开盖稳定期达4倍以上，在延长pH值对于检测准确性有明显影响的检测方法中具有重要意义。

Description

一种检测钙离子的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及体外检测技术领域，尤其涉及一种检测钙离子的试剂盒及其应用。
背景技术
钙测定试剂盒是用于体外定量检测人血清样本中钙含量的试剂盒，作辅助诊断用。钙离子是机体内含量最多的五种元素之一，参考范围非常窄（2.20-2.55mmol/L），临床生物化学常规检验项目分析质量指标中规定总误差为5%。钙的生理功能主要为：构成骨骼和牙齿、持和修补骨骼的完整、传导神经冲动、维持细胞的正常生理通透性、参与凝血过程、激活酶的活性等。人体中钙含量的变化能反映出诸多代谢调节情况成人体内的钙离子大部分以胞外钙的形式存在，因此对钙含量的检测有很重要的临床意义。
现有的检测方法有滴定法、比色法、原子吸收分光光度法、酶法和同位素稀释质谱法等。其中，比色法由于其操作简便、结果准确等优点，为常用检验方法之一。常用检测钙的比色法根据显色剂不同可分为邻甲酚酞络合酮法、偶氮胂III法、偶氮膦或者偶氮氯膦法等。偶氮胂III、偶氮膦等偶氮类显色剂均有一定毒性，因此邻甲酚酞络合酮法应用广泛。然而邻甲酚酞络合酮法的显色非常依赖溶液pH，pH变化会导致钙与邻甲酚酞络合酮反应程度改变而影响结果准确性。邻甲酚酞络合酮法最佳反应pH为10.5~11。在日常使用过程中，碱性的试剂容易吸收环境中的二氧化碳而导致试剂pH降低，从而影响试剂的稳定性，导致频繁定标，影响检测准确度和重复性，造成严重成本的浪费。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种检测钙离子的试剂盒及其应用。本发明通过添加稳定剂，增加溶液粘度，阻碍二氧化碳在气液界面和溶液内部的扩散行为，有效延缓溶液的pH变化速率，保证钙离子检测试剂盒的稳定性。
第一方面本发明提供一种检测钙离子的试剂盒，包括：用于缓冲的试剂1和用于显色的试剂2；所述试剂1包括稳定剂；所述试剂2包括邻甲酚酞络合酮；
所述稳定剂为天然或合成的多糖，或甘油，所述稳定剂在试剂1中浓度为250-500g/L。
邻甲酚酞络合酮法检测钙离子的测定原理是:在一定碱性条件下，邻甲酚酞络合酮与Ca2+、Mg2+螯合成紫红色的可溶性螯合物，在一定波长有吸收峰。所以通常在试剂中加入一定量的Mg2+掩蔽剂屏蔽Mg2+的干扰，进而通过比色法检测得到Ca2+的浓度。从邻甲酚酞络合酮法的原理来看，其检测时的pH值至关重要，当pH值降低时，会导致邻甲酚酞络合酮与Ca2+、Mg2+螯合能力变差，影响实际检测的准确率。因此本发明向试剂盒中加入天然或合成的多糖或者甘油，甘油和多糖一方面不会影响邻甲酚酞络合酮与Ca2+的螯合，另一方面在加入至缓冲液中后会提高缓冲液的粘稠度，使其形成多重缓冲体系，这可以有效阻碍二氧化碳在气液界面和溶液内部的扩散行为，提高检测试剂pH值的稳定性。并且，本发明发现在一定浓度范围内，稳定剂不会影响试剂盒的检测效果，但若是添加过多稳定剂，则会导致粘稠度太高，检测结果的准确性反而降低，可重复性也同样降低。
进一步地，所述稳定剂包括甘油、甘露醇、海藻糖、山梨糖醇、明胶、右旋糖酐类、羟乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟甲基纤维素钠中的一种或多种。
进一步地，所述试剂1还包括缓冲液和表面活性剂；
所述表面活性剂为非离子表面活性剂，在试剂1中浓度为1-15 g/L。
进一步地，所述缓冲液包括乙醇胺、乙二胺、三乙胺、氨水、醋酸钾、盐酸、乙二醇、硼酸、氢氧化钠、2-氨基-甲基-1-丙醇（AM）或三羟甲基氨基甲烷（Tris）中的一种或多种；和/或，
所述表面活性剂的亲水基团为甘油、聚乙二醇或山梨醇；亲油基团可以为长链脂肪酸、长链脂肪醇、烷基或芳基；亲油基团以酯基或醚基与亲水基团结合。
进一步地，所述试剂2还包括掩蔽剂，所述掩蔽剂包括8-羟基喹啉、盐酸、苯甲酸、酒石酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇、二硫赤鲜醇、DMSO、甲醇或乙醇中的一种或多种。
进一步地，所述试剂2中邻甲酚酞络合酮的浓度为5-12mmol/L，掩蔽剂的浓度为5~20mmol/L。
进一步地，所述试剂1的pH值为10.9~11.5；和/或，所述试剂2的pH值为3.5~4.5。
作为一种优选的具体实施方式，本发明提供一种检测钙离子的试剂盒，包括用于缓冲的试剂1和用于显色的试剂2；所述试剂1包括：缓冲液、稳定剂和表面活性剂；所述试剂2包括邻甲酚酞络合酮和掩蔽剂；
所述缓冲液包括乙二胺、Tris、乙醇胺或AMP中的两种，为70-200 mL/L；
所述稳定剂包括甘油、明胶、海藻糖或羟甲基纤维素钠的两种，为250~500 g/L；
所述表面活性剂包括盐酸、Triton、聚氧月桂醚中的两种，为1~15 g/L；
所述邻甲酚酞络合酮的用量为5-12 mmol/L；
所述掩蔽剂包括8-羟基喹啉、盐酸、苯甲酸、酒石酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇、二硫赤鲜醇、DMSO、甲醇或乙醇中的一种或多种，为5~20 mmol/L。
在添加稳定剂的基础上，本发明进一步改进缓冲液的体系，以降低稳定剂的添加可能对试剂盒检测钙离子准确度的影响，保持整个试剂盒检测钙离子的准确性不变。
本发明进一步提供所述试剂盒在提高邻甲酚酞络合酮法检测钙离子试剂的稳定性中的应用。
本发明具有如下有益效果：
本发明通过在邻甲酚酞络合酮法检测钙离子的试剂中加入天然或合成的多糖或者甘油作为稳定剂，可以有效增加溶液粘度，阻碍二氧化碳在气液界面和溶液内部的扩散行为，降低二氧化碳在溶液中的溶解速度，从而稳定溶液性质，延缓溶液pH变化。
本发明构建多重缓冲体系，进一步提高溶液对于二氧化碳酸性气体的缓冲能力，同时调整试剂整体配方，保证对钙测定的准确性，在钙测定的准确性保持不变的情况下有效延长开盖稳定性4倍以上，在延长pH值对于检测准确性有明显影响的检测方法中具有重要意义。
附图说明
图1为本发明提供的市售钙离子检测试剂的线性偏差结果；
图2为本发明提供的实施例1的钙离子检测试剂的线性偏差结果；
图3为本发明提供的实施例2的钙离子检测试剂的线性偏差结果；
图4为本发明提供的实施例3的钙离子检测试剂的线性偏差结果；
图5为本发明提供的对比例2的钙离子检测试剂的线性偏差结果。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供一种钙检测试剂盒及其制备方法。
按以下成分和用量配制钙检测试剂盒：
Figure 536422DEST_PATH_IMAGE001
实施例2
本实施例提供一种钙检测试剂盒及其制备方法。
按以下成分和用量配制钙检测试剂盒：
Figure 767683DEST_PATH_IMAGE002
实施例3
本实施例提供一种钙检测试剂盒及其制备方法。
按以下成分和用量配制钙检测试剂盒：
Figure 93141DEST_PATH_IMAGE003
对比例1
本对比例提供一种钙检测试剂盒及其制备方法，其与实施例1的制备方法相同，区别仅在于甘油的浓度为700g/L。
对比例2
本对比例提供一种钙检测试剂盒及其制备方法，其与实施例2的制备方法相同，区别仅在于没有羟甲基纤维素钠和海藻糖。
实验例1
本实验例对实施例1-3和对比例1-2的产品空白吸光度、准确度、分析灵敏度、相关性、重复性、线性范围等各项性能指标分别进行了检测等性能进行了测试。
测试方法为：使用全自动生化检测仪，市售常见钙检测试剂、血清基质校准品和质控品，标准物质GBW(E)090593。实验首日，以校准品定标后，用市售钙检测试剂测定质控品值以保证监测体系在控。
1、试剂空白吸光度实验方法：用纯化水作为样本重复测定2次，计算试剂空白吸光度（A）。
2、重复性实验方法：重复测试高浓度和低浓度的样本各10次，分别计算测定值的 均值（
Figure 486076DEST_PATH_IMAGE004
）和标准差（s）。
3、准确度实验方法：重复测定GBW(E)090593三次，计算相对偏差（B）。
4、分析灵敏度实验方法：测定钙浓度为2.5mmol/L的样品所引起的吸光度差值（△A）。
5、线性范围实验方法：取线性高值样本（5mmol/L）梯度稀释9个浓度，每个浓度平行测试3次，测得结果进行回归分析，绘制拟合曲线图，判定线性。
6、开盖稳定性实验方法：将试剂开盖放放置于全自动生化分析仪中，保持仪器开机状态。每天测定质控品3次，计算与实验首日的相对偏差。每次测值之前对试剂1的pH值进行检测。
测试结果为：
1、试剂空白吸光度
Figure 526845DEST_PATH_IMAGE005
由此结果可知，本发明实施例1-3的空白吸光度与市售钙检测试剂盒无明显差别。
2、重复性
Figure 296217DEST_PATH_IMAGE006
Figure 738831DEST_PATH_IMAGE007
Figure 302668DEST_PATH_IMAGE008
结论：实施例1、2、3和对比例2的重复性均无明显差别，表现出良好的重复性。对比例1的重复性不佳，是由于稳定剂量大导致体系粘度过高，影响了仪器吸液的准确性。由于对比例1的重复性不佳，因此没有进行对比例1后续的性能评价。
3、准确度
Figure 827802DEST_PATH_IMAGE009
由此可知，实施例1-3和对比例2的测值准确度均无明显差别，表现出良好的测值准确度。
4、分析灵敏度
Figure 400866DEST_PATH_IMAGE010
由此可得，实施例1-3和对比例2的分析灵敏度均与市面上在售试剂无明显差别。
5、线性范围实验结果
Figure 432407DEST_PATH_IMAGE011
Figure 432724DEST_PATH_IMAGE012
Figure 182506DEST_PATH_IMAGE013
Figure 559260DEST_PATH_IMAGE014
Figure 710887DEST_PATH_IMAGE015
表10-表14为市售试剂、实施例1-3、对比例2的线性偏差结果，图1-图5为和其相对应的结果图（图1对应市售试剂，图2-图4对应实施例1-3，图5对应对比例2）由此可见，实施例1-3和对比例2在[1.00，3.75 ]mmol/L范围内偏差无明显差别，均小于10%，表现出良好的线性关系，满足中华人民共和国医药行业标准《YY/T 1229-2014》。
6、开瓶稳定性结果
下表为不同开瓶天数试剂1的pH值：
Figure 76579DEST_PATH_IMAGE016
可以明显看出，实施例1、实施例2、实施例3在开盖12天时pH值稳定，没有明显变化。而在售试剂和对比例的pH值不稳定，下降明显。
下表为不同开瓶天数检测质控品与实验首日对比偏差:
Figure 110394DEST_PATH_IMAGE017
如上结果可以看出，现有市售钙检测试剂盒开盖第4天时，质控测值偏差大于2%，超过了临床允许总误差的1/3。实施例1、实施例2、实施例3在开盖第12天时，质控测值偏差小于2%，满足。对比例2在开盖第4天质控测值偏差大于2%。说明实施例试剂的稳定性明显提高，开盖稳定期延长了至少4倍。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种检测钙离子的试剂盒，其特征在于，包括：用于缓冲的试剂1和用于显色的试剂2；所述试剂1包括稳定剂、缓冲液和表面活性剂；所述试剂2包括邻甲酚酞络合酮和掩蔽剂；
所述稳定剂包括甘油、明胶、海藻糖或羟甲基纤维素钠中的两种，所述稳定剂在试剂1中浓度为250-500g/L。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂为非离子表面活性剂，在试剂1中浓度为1-15 g/L。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述掩蔽剂包括8-羟基喹啉、盐酸、苯甲酸、酒石酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇、二硫赤鲜醇、DMSO、甲醇或乙醇中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂2中邻甲酚酞络合酮的浓度为5-12mmol/L，掩蔽剂的浓度为5~20mmol/L。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂1的pH值为10.9~11.5；和/或，所述试剂2的pH值为3.5~4.5。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂1包括：缓冲液、稳定剂和表面活性剂；所述试剂2包括邻甲酚酞络合酮和掩蔽剂；
所述缓冲液包括乙二胺、三羟甲基氨基甲烷、乙醇胺或AMP中的两种，为70-200ml/L；
所述稳定剂包括甘油、明胶、海藻糖或羟甲基纤维素钠的两种，为250-500g/L；
所述表面活性剂包括盐酸、Triton、聚氧月桂醚中的两种，为1~15g/L；
所述邻甲酚酞络合酮的用量为5-15mmol/L；
所述掩蔽剂包括8-羟基喹啉、盐酸、苯甲酸、酒石酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇、二硫赤鲜醇、DMSO、甲醇或乙醇中的一种或多种，为5~20 mmol/L。
7.权利要求1-6任一项所述的试剂盒在提高邻甲酚酞络合酮法检测钙离子试剂的稳定性中的应用。
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