JP2539225B2 - グルコ−ス定量用安定化液体酵素組成物、それを用いる試薬キット及び定量方法 - Google Patents
グルコ−ス定量用安定化液体酵素組成物、それを用いる試薬キット及び定量方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はグルコース定量分析操作における酵素ヘキソ
キナーゼ及びグルコース−６−リン酸脱水素酵素の使用
法に関する。
キナーゼ及びグルコース−６−リン酸脱水素酵素の使用
法に関する。
（従来の技術） 酵素及びその他の生物学的成分の定量において反応は
一般に酵素、補酵素及び基質を含む。
一般に酵素、補酵素及び基質を含む。
酵素は大きい分子量を有するタンパク質複合体であ
り、通常その化学的構造は未知である。酵素はその基質
の特異性及び触媒活性に応じて分類される。酵素は生物
学的な触媒であり、単一の基質の反応又は一群の同質基
質の反応の触媒作用を行うことができる。
り、通常その化学的構造は未知である。酵素はその基質
の特異性及び触媒活性に応じて分類される。酵素は生物
学的な触媒であり、単一の基質の反応又は一群の同質基
質の反応の触媒作用を行うことができる。
補酵素は明確に限定された化学的構造を有する有機化
学薬品である。分子量は通常酵素よりも小さい。補酵素
は特定の酵素検定又は酵素反応において必要とされる。
補酵素は検定試験においてその構造及び／又は原子組成
を検出可能に変化する。その反応は基質について化学量
論的に行われる。強い吸光性を有するある種の補酵素の
場合、吸光性形態の出現又は消滅は測光学的に追求する
ことができる。例えば、ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド（NAD）及びニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド還元体（NADH）は多くの重要な臨床検定に用いら
れる。両者は約700の分子量を有している。NADHは340nm
で強く吸光し、一方NADは吸光しない。
学薬品である。分子量は通常酵素よりも小さい。補酵素
は特定の酵素検定又は酵素反応において必要とされる。
補酵素は検定試験においてその構造及び／又は原子組成
を検出可能に変化する。その反応は基質について化学量
論的に行われる。強い吸光性を有するある種の補酵素の
場合、吸光性形態の出現又は消滅は測光学的に追求する
ことができる。例えば、ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド（NAD）及びニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド還元体（NADH）は多くの重要な臨床検定に用いら
れる。両者は約700の分子量を有している。NADHは340nm
で強く吸光し、一方NADは吸光しない。
基質は構造既知の有機化学薬品で、その反応及び相互
作用は酵素により触媒され、基質の化学的構造、原子組
成又は立体化学性の変化が生じる。一般に、基質は化学
的にも、微生物学的にも分解されやすい。基質は水性媒
体中で分解又は加水分解され、細菌、かび及びその他の
微生物の餌となる。典型的な基質はグルコース、乳酸塩
又は乳酸、グルコン酸塩などである。
作用は酵素により触媒され、基質の化学的構造、原子組
成又は立体化学性の変化が生じる。一般に、基質は化学
的にも、微生物学的にも分解されやすい。基質は水性媒
体中で分解又は加水分解され、細菌、かび及びその他の
微生物の餌となる。典型的な基質はグルコース、乳酸塩
又は乳酸、グルコン酸塩などである。
高度の特異性の故に、酵素定量法の使用は近年非常に
多くなった。現在、酵素試薬使用の最大の限界はその中
の薬品の不安定性に由来する。通常、多数の反応活性成
分が含有されている。問題を複雑にするのは酵素の正確
な性質がその作用の機構とともに大部分未知であること
である。それ故、精密かつ首尾一貫した結果を確保する
ため、厳密な品質コントロール手段が必要とされる。そ
のような手段はコスト高になり易い。
多くなった。現在、酵素試薬使用の最大の限界はその中
の薬品の不安定性に由来する。通常、多数の反応活性成
分が含有されている。問題を複雑にするのは酵素の正確
な性質がその作用の機構とともに大部分未知であること
である。それ故、精密かつ首尾一貫した結果を確保する
ため、厳密な品質コントロール手段が必要とされる。そ
のような手段はコスト高になり易い。
従来の技術においては、厳密な品質コントロールを行
うため試薬中の反応活性成分を安定化する、すなわちそ
の分解を防止することに重点がおかれていた。例えば、
酵素及び補酵素は固体マトリックス中へ乾燥混合、凍結
乾燥又は酵素の化学的構造の固体マトリックス上の固定
のいずれかにより固定させることができる。これらの方
法は費用がかかり、複雑な製造工程が必要であり、ユー
ザーにとって便利なものではない。固体試薬では生成物
の均一性を維持することは困難である。例えば、多くの
凍結乾燥基準血清商品には各びん間の許容し得る酵素成
分の変動は平均値の±10％であると記載されている。よ
り重要なことは、ユーザーが希釈した場合の品質管理を
自分で確認すること及び固体試薬を使用することなどの
負担に耐えねばならないことである。固体酵素又は補酵
素試薬については品質管理の難点があり、かつ簡便性の
面から、ユーザーは一般に液体で使い易く、固体（例え
ば凍結乾燥）組成物よりも均質な試薬を望んでいる。
うため試薬中の反応活性成分を安定化する、すなわちそ
の分解を防止することに重点がおかれていた。例えば、
酵素及び補酵素は固体マトリックス中へ乾燥混合、凍結
乾燥又は酵素の化学的構造の固体マトリックス上の固定
のいずれかにより固定させることができる。これらの方
法は費用がかかり、複雑な製造工程が必要であり、ユー
ザーにとって便利なものではない。固体試薬では生成物
の均一性を維持することは困難である。例えば、多くの
凍結乾燥基準血清商品には各びん間の許容し得る酵素成
分の変動は平均値の±10％であると記載されている。よ
り重要なことは、ユーザーが希釈した場合の品質管理を
自分で確認すること及び固体試薬を使用することなどの
負担に耐えねばならないことである。固体酵素又は補酵
素試薬については品質管理の難点があり、かつ簡便性の
面から、ユーザーは一般に液体で使い易く、固体（例え
ば凍結乾燥）組成物よりも均質な試薬を望んでいる。
グルコース/HK/G−６−PDHの化学 ここで使用する符号は次のような成分を表わす。
ADP＝アデノシン−５′−二リン酸 ATP＝アデノシン三リン酸 HK＝ヘキソキナーゼ NAD＝ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド NADH＝ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド還元体 Ｇ−６−PDH＝グルコース−６−リン酸脱水素酵素 Ｇ−６−Ｐ＝グルコース−６−リン酸 次の反応式は酵素HK及びＧ−６−PDHの存在下で補酵
素ATP及びNADを用いるグルコース定量の反応を示す。
素ATP及びNADを用いるグルコース定量の反応を示す。
上記の反応式において、一次反応を生じさせる酵素は
HKであり、測定反応を生じさせる酵素はＧ−６−PDHで
ある。グルコースの定量は測定反応においてNADHが形成
される速度を測定することにより行われる。上記の反応
式は、血清、血漿、血液全体、脳液／骨髄液、及び尿な
どの体液中のグルコースの濃度が高いのは糖尿病に伴な
ったものであることが指摘された場合の臨床検定に広く
用いられている。
HKであり、測定反応を生じさせる酵素はＧ−６−PDHで
ある。グルコースの定量は測定反応においてNADHが形成
される速度を測定することにより行われる。上記の反応
式は、血清、血漿、血液全体、脳液／骨髄液、及び尿な
どの体液中のグルコースの濃度が高いのは糖尿病に伴な
ったものであることが指摘された場合の臨床検定に広く
用いられている。
グルコースの定量においては上記の反応は一般に完了
するまで行われる。形成されたNADHの量は試験試料中の
グルコースの量に対応する。NADHは340nmで強く吸光す
るが他の試薬及び生成物は吸光しない。形成されたNADH
の量、すなわち試験試料中のグルコースの量は分光光度
計を用いて340nmで追求することができる。酵素の活性
は通常国際単位（IU）により示される。１国際単位は特
定された条件下で１分間あたり基質１マイクロモルの転
化を触媒する酵素の量として定義される。グルコース検
定試験の条件下では比較的速い反応速度を得るため十分
な量の酵素（HK及びＧ−６−PDH）及び補酵素（ATP及び
NAD）が添加される。上記検定における反応は好ましく
は数10分以内、より好ましくは10分以内に実質的に完了
するよう行われる。
するまで行われる。形成されたNADHの量は試験試料中の
グルコースの量に対応する。NADHは340nmで強く吸光す
るが他の試薬及び生成物は吸光しない。形成されたNADH
の量、すなわち試験試料中のグルコースの量は分光光度
計を用いて340nmで追求することができる。酵素の活性
は通常国際単位（IU）により示される。１国際単位は特
定された条件下で１分間あたり基質１マイクロモルの転
化を触媒する酵素の量として定義される。グルコース検
定試験の条件下では比較的速い反応速度を得るため十分
な量の酵素（HK及びＧ−６−PDH）及び補酵素（ATP及び
NAD）が添加される。上記検定における反応は好ましく
は数10分以内、より好ましくは10分以内に実質的に完了
するよう行われる。
上記グルコース検定に含まれる成分は反応活性が大き
いから、一般に定量用試薬の各成分は別々に貯蔵され、
検定が行われる直前においてのみ混合される。例えば、
市販の上記グルコース検定用試薬は通常それぞれ補酵素
試薬と酵素試薬からなる２種の試薬包装として出されて
いる。補酵素は酵素ほど反応活性が大きくなく、一般に
便利さのため溶液にされている。グルコース検定用の液
体補酵素試薬は一般にATPとNADの両補酵素、マグネシウ
ム塩（通常酢酸マグネシウム）、保存剤、及びグルコー
ス検定を行うのに好ましいpHである約7.5のpHを保持す
る緩衝剤を含有している。
いから、一般に定量用試薬の各成分は別々に貯蔵され、
検定が行われる直前においてのみ混合される。例えば、
市販の上記グルコース検定用試薬は通常それぞれ補酵素
試薬と酵素試薬からなる２種の試薬包装として出されて
いる。補酵素は酵素ほど反応活性が大きくなく、一般に
便利さのため溶液にされている。グルコース検定用の液
体補酵素試薬は一般にATPとNADの両補酵素、マグネシウ
ム塩（通常酢酸マグネシウム）、保存剤、及びグルコー
ス検定を行うのに好ましいpHである約7.5のpHを保持す
る緩衝剤を含有している。
酵素HK及びＧ−６−PDHに関しては安定性の問題が重
大である。従来、グルコース検定用酵素試薬は乾燥包装
品又は冷凍乾燥品の形とされている。乾燥酵素は検定が
行われる直前に溶液に入れられる。
大である。従来、グルコース検定用酵素試薬は乾燥包装
品又は冷凍乾燥品の形とされている。乾燥酵素は検定が
行われる直前に溶液に入れられる。
液体HK/G−６−PDH酵素の安定化 固体酵素試薬が多くの欠点を有しているため、酵素HK
及びＧ−６−PDHを溶液中で安定化する試みがなされて
きた。そのうち一般的な例は保存剤として高濃度（例え
ば３モル）の硫酸アンモニウムを使用することである。
酵素HKとＧ−６−PDHは最初水溶液にされ、次に硫酸ア
ンモニウムが添加される。この液体酵素試薬の安定性は
満足すべきものであるが、この方式は重大な障害を有し
ている。第一に、硫酸塩は上述のグルコース検定反応に
対するよく知られた反応阻害剤である。反応を許容し得
る速度で進行させるためには、阻害を克服するため比較
的多量の酵素（HK及びＧ−６−PDH）を使用することが
必要である。これはコストを追加する。第二に、硫酸ア
ンモニウムが一度添加されると酵素が溶液から沈殿す
る。従って、この液体試薬は均質なものではなく、実際
は「懸濁液」試薬である。この懸濁液試薬では強烈なか
きまぜを行ってさえも再現可能な結果を得るのは困難で
ある。沈殿した酵素を正確な量で測定する（例えば、ピ
ペットにより）ことは難しいことである。さらに、この
懸濁液酵素試薬は使用可能にするためよくかきまぜなけ
ればならない。僅かではあるが、最近使用される分光光
度計には成分試薬を予備混合する設備をつけたものがあ
る。さらに、硫酸アンモニウムの強力な阻害効果の故
に、この懸濁液酵素試薬は最低容量使用する必要があ
る。典型的には、酵素試薬と補酵素試薬は1:100又はそ
れ以上の比率で混合される。使用されるこの均質な酵素
試薬が少量なことは再現性のある検定結果を得ることを
困難にさえしている。
及びＧ−６−PDHを溶液中で安定化する試みがなされて
きた。そのうち一般的な例は保存剤として高濃度（例え
ば３モル）の硫酸アンモニウムを使用することである。
酵素HKとＧ−６−PDHは最初水溶液にされ、次に硫酸ア
ンモニウムが添加される。この液体酵素試薬の安定性は
満足すべきものであるが、この方式は重大な障害を有し
ている。第一に、硫酸塩は上述のグルコース検定反応に
対するよく知られた反応阻害剤である。反応を許容し得
る速度で進行させるためには、阻害を克服するため比較
的多量の酵素（HK及びＧ−６−PDH）を使用することが
必要である。これはコストを追加する。第二に、硫酸ア
ンモニウムが一度添加されると酵素が溶液から沈殿す
る。従って、この液体試薬は均質なものではなく、実際
は「懸濁液」試薬である。この懸濁液試薬では強烈なか
きまぜを行ってさえも再現可能な結果を得るのは困難で
ある。沈殿した酵素を正確な量で測定する（例えば、ピ
ペットにより）ことは難しいことである。さらに、この
懸濁液酵素試薬は使用可能にするためよくかきまぜなけ
ればならない。僅かではあるが、最近使用される分光光
度計には成分試薬を予備混合する設備をつけたものがあ
る。さらに、硫酸アンモニウムの強力な阻害効果の故
に、この懸濁液酵素試薬は最低容量使用する必要があ
る。典型的には、酵素試薬と補酵素試薬は1:100又はそ
れ以上の比率で混合される。使用されるこの均質な酵素
試薬が少量なことは再現性のある検定結果を得ることを
困難にさえしている。
また、HK及びＧ−６−PDHなどの酵素を水性媒体中で
安定化する、すなわち、水と混合できるポリオール有機
溶媒（グリセリンなど）を10−50％（v/v）添加するこ
とによって分解を阻止し得ることが提案されている。し
かしながら、実際にはこの提案はしばしば作用しないこ
とが見いだされた。酵素は時間とともになお分解し、こ
のポリオール−安定化液体酵素試薬は推奨された貯蔵温
度範囲２−８℃（高温では酵素の分解が急激に増加す
る）においてさえも比較的貯蔵寿命が短かい。かりにポ
リオール溶媒が何らかの安定化効果をもっているとして
も、安定化の程度は許容し得るものではない。分解の生
じたことは上述のグルコース検定反応の速度低下によっ
て証明される。
安定化する、すなわち、水と混合できるポリオール有機
溶媒（グリセリンなど）を10−50％（v/v）添加するこ
とによって分解を阻止し得ることが提案されている。し
かしながら、実際にはこの提案はしばしば作用しないこ
とが見いだされた。酵素は時間とともになお分解し、こ
のポリオール−安定化液体酵素試薬は推奨された貯蔵温
度範囲２−８℃（高温では酵素の分解が急激に増加す
る）においてさえも比較的貯蔵寿命が短かい。かりにポ
リオール溶媒が何らかの安定化効果をもっているとして
も、安定化の程度は許容し得るものではない。分解の生
じたことは上述のグルコース検定反応の速度低下によっ
て証明される。
酵素HKとＧ−６−PDHの分解はロット間、特に貯蔵時
間の相違した試薬間の変動で明らかにすることができ
る。この変動はグルコース検定の信頼性に逆効果を与え
るものである。
間の相違した試薬間の変動で明らかにすることができ
る。この変動はグルコース検定の信頼性に逆効果を与え
るものである。
酵素ヘキソキナーゼ及びグルコース−６−リン酸脱水
素酵素は高度に反応活性であり、ともに時間経過によ
り、特に高温度で分解することがよく知られている。グ
リセリンのような水と混合可能な有機ポリオール溶媒の
存在が水溶液中のこれら酵素を安定化し得ることがすで
に提案されている。しかしながら、有機ポリオール溶媒
により試みられた安定化は、特に市販級の溶媒を用いた
場合首尾一貫しない結果を与えることが見いだされた。
また、市販級の有機ポリオール溶媒、例えばグリセリン
は特に不適切な処理及び／又は貯蔵されたもの及び酵素
試薬を調合するのに用いられた水はともに事実上酵素HK
及びＧ−６−PDHの分解を助成する汚染物を含有するこ
とが見いだされた。
素酵素は高度に反応活性であり、ともに時間経過によ
り、特に高温度で分解することがよく知られている。グ
リセリンのような水と混合可能な有機ポリオール溶媒の
存在が水溶液中のこれら酵素を安定化し得ることがすで
に提案されている。しかしながら、有機ポリオール溶媒
により試みられた安定化は、特に市販級の溶媒を用いた
場合首尾一貫しない結果を与えることが見いだされた。
また、市販級の有機ポリオール溶媒、例えばグリセリン
は特に不適切な処理及び／又は貯蔵されたもの及び酵素
試薬を調合するのに用いられた水はともに事実上酵素HK
及びＧ−６−PDHの分解を助成する汚染物を含有するこ
とが見いだされた。
それ故、グルコース検定用として再現性のある検定結
果を与え、かつ急速にグルコース定量終点を与える貯蔵
寿命の長い均質な液体HK及びＧ−６−PDH酵素試薬への
要望がなされている。
果を与え、かつ急速にグルコース定量終点を与える貯蔵
寿命の長い均質な液体HK及びＧ−６−PDH酵素試薬への
要望がなされている。
（問題点を解決するための手段） 本発明者らは上記問題点を解決すべき鋭意研究を重ね
た結果、有機ポリオール溶媒の存在するある種の安定剤
系により酵素HK及びＧ−６−PDHを含有する均質な液体
酵素溶液の安定性が改善でき上記の要望が満足されるこ
とを見いだした。この安定剤系に適した成分はその酵素
安定効率、グルコース酵素反応に対する非阻害性、コス
ト、溶解性、無臭性及び易廃棄性などに基づいて選択さ
れる。本発明はこの知見に基づいてなされたものであ
る。
た結果、有機ポリオール溶媒の存在するある種の安定剤
系により酵素HK及びＧ−６−PDHを含有する均質な液体
酵素溶液の安定性が改善でき上記の要望が満足されるこ
とを見いだした。この安定剤系に適した成分はその酵素
安定効率、グルコース酵素反応に対する非阻害性、コス
ト、溶解性、無臭性及び易廃棄性などに基づいて選択さ
れる。本発明はこの知見に基づいてなされたものであ
る。
すなわち本発明は、補酵素としてアデノシン三リン酸
及びニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドを用い、
過剰の補酵素の存在下で行うグルコース検定によりグル
コースを定量測定するのに使用される酵素試薬で、はじ
めに （ａ）少なくとも60％（v/v）の水 （ｂ）水と混合し得る約20〜約40％（v/v）の量のポリ
オール有機溶媒 （ｃ）ヘキソキナーゼ酵素 （ｄ）グルコース−６−リン酸脱水素酵素 （ｅ）該酵素試薬が約２℃から約８℃の温度範囲で貯蔵
された時に少なくとも２年間の貯蔵寿命を有するよう少
なくとも0.5mMの十分な量の重金属イオンキレート剤を
含んでなる安定化剤系 を含んでなる成分で調製される長い貯蔵寿命を有する均
質な液体酵素試薬を提供するものである。
及びニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドを用い、
過剰の補酵素の存在下で行うグルコース検定によりグル
コースを定量測定するのに使用される酵素試薬で、はじ
めに （ａ）少なくとも60％（v/v）の水 （ｂ）水と混合し得る約20〜約40％（v/v）の量のポリ
オール有機溶媒 （ｃ）ヘキソキナーゼ酵素 （ｄ）グルコース−６−リン酸脱水素酵素 （ｅ）該酵素試薬が約２℃から約８℃の温度範囲で貯蔵
された時に少なくとも２年間の貯蔵寿命を有するよう少
なくとも0.5mMの十分な量の重金属イオンキレート剤を
含んでなる安定化剤系 を含んでなる成分で調製される長い貯蔵寿命を有する均
質な液体酵素試薬を提供するものである。
好ましくはキレート剤はEDTAである。好ましくは安定
化剤系はまた酸化防止剤又は微生物コントロール剤を含
んでなる。酸化防止剤としては牛の血清アルブミン（BS
A）、又はポリビニルピロリドン−40（PVD−40）とＮ−
アセチルシステインの混合物をあげることができる。微
生物コントロール剤としてはアジ化ナトリウムがある。
化剤系はまた酸化防止剤又は微生物コントロール剤を含
んでなる。酸化防止剤としては牛の血清アルブミン（BS
A）、又はポリビニルピロリドン−40（PVD−40）とＮ−
アセチルシステインの混合物をあげることができる。微
生物コントロール剤としてはアジ化ナトリウムがある。
好ましくは酵素試薬はマグネシウムイオンと補酵素ア
デノシン三リン酸及びニコチンアミド−アデニンジヌク
レオチドを含有する補酵素試薬とともに使用される。酵
素試薬を補酵素試薬及びグルコース含有試験試料と混合
して検定反応混合液を形成させる場合、好ましくは酵素
試薬からのキレート剤の量は補酵素試薬からのマグネシ
ウムイオンの約半分よりも多くなく、より好ましくは約
1/10よりも多くない。
デノシン三リン酸及びニコチンアミド−アデニンジヌク
レオチドを含有する補酵素試薬とともに使用される。酵
素試薬を補酵素試薬及びグルコース含有試験試料と混合
して検定反応混合液を形成させる場合、好ましくは酵素
試薬からのキレート剤の量は補酵素試薬からのマグネシ
ウムイオンの約半分よりも多くなく、より好ましくは約
1/10よりも多くない。
本発明に用いられる安定剤系は重金属イオンキレート
剤を含んでなる。このことはマグネシウムイオンがグル
コースとATPとの間の一次反応を触媒するのに必要であ
り、マグネシウムイオンは一般に補酵素試薬の１成分と
して含有され、キレート剤はマグネシウムイオンを触媒
としては無効なものとし、グルコース検定に悪影響する
と予期されていたという事実の観点からすれば驚くべき
ことである。適した重金属イオンキレート剤には、例え
ば、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）が含まれる。
剤を含んでなる。このことはマグネシウムイオンがグル
コースとATPとの間の一次反応を触媒するのに必要であ
り、マグネシウムイオンは一般に補酵素試薬の１成分と
して含有され、キレート剤はマグネシウムイオンを触媒
としては無効なものとし、グルコース検定に悪影響する
と予期されていたという事実の観点からすれば驚くべき
ことである。適した重金属イオンキレート剤には、例え
ば、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）が含まれる。
好ましくは安定剤系はまた酸化防止剤を含んでなる。
適した酸化防止剤には例えば、下記のものが含まれる。
適した酸化防止剤には例えば、下記のものが含まれる。
1.L−システインエチルエステル塩化水素（CEE） 2.N−アセチル−システイン（NAC） 3.DL−ホモシステインチオラクトン塩化水素（HCTL） 4.L−システイン 5.メルカプトエタノール（ME） 6.ジチオトレイトール（DTT） 7.ジチオエリスリトール（DTE） 8.アミノエチルイソチオウロニウムブロマイド（AET） 9.グルタチオン（GSH） 10.チオグリコール酸（TGA） 11.N−グアニル−Ｌ−システイン 12.N−グアニル−DL−イソシアナート 13.N−アセチル−Ｓ−グアニル−Ｌ−システイン 14.N−アセチル−Ｓ−ベンゾイル−Ｌ−システイン 15.N,S−ジグアニル−Ｌ−システイン 16.S−カルバモイル−Ｌ−システイン 17.S−カルボキシメチル−Ｌ−システイン 18.L−チアゾリジン−４−カルボン酸 19.S−グアニル−Ｌ−システインヒダントイン 20.S−アセチルグアニル−DL−システインアズラクトン 21.2−イミノ−Ｌ−システインヒダントイン 22.N−アセチル−DL−ホモシステインチオラクトン 23.1,3−ジメチルカプト−２−プロパノール 24.2,3−ジメチルカプト−１−プロパノール 25.1,2−ジメチルカプト−エタン 26.L−システインメチルエステル 27.L−システインエチルエステル 28.N−アセチル−DL−イソシステイン 29.ポリエチレングリコールジメルカプトアセテート 30.チオグリコース 31.ポリビニルピロリドン−40（PVP−40） 32.牛の血清アルブミン 好ましくは安定剤系はまたミクロバイオスタット合は
殺菌剤のような微生物コントロール剤を含んでなる。適
した微生物コントロール剤には、例えば、アジ化ナトリ
ウム、安息香酸、フェノール、チモール、又はペンタク
ロロフェノールが含まれる。
殺菌剤のような微生物コントロール剤を含んでなる。適
した微生物コントロール剤には、例えば、アジ化ナトリ
ウム、安息香酸、フェノール、チモール、又はペンタク
ロロフェノールが含まれる。
検定反応混合液における酵素試薬からのキレート剤の
量は好ましくは補酵素試薬からのマグネシウムイオンに
対しモル比で半分よりも多くなく、より好ましくは1/10
よりも多くない。
量は好ましくは補酵素試薬からのマグネシウムイオンに
対しモル比で半分よりも多くなく、より好ましくは1/10
よりも多くない。
上述のように、グルコース検定反応は反応が実質的に
完了するまで行わせる。測定反応はNADHを発生するが、
これは分光光度計を用いて容易に認めることができる。
検定反応の実質的な完了点すなわち終点は一般にNADHの
濃度がNADHの最終平衡濃度の少なくとも約98％になる点
であると定義される。この終点は分光光度計の（340nm
における）読みを時間経過で走査することにより観察す
ることができる。吸光度、すなわちNADHの濃度ははじめ
増大し、徐々に横ばいになり比較的一定な値になる。吸
光度が最初に横ばい（反応完了時の98％以上）になった
点を終点とする。
完了するまで行わせる。測定反応はNADHを発生するが、
これは分光光度計を用いて容易に認めることができる。
検定反応の実質的な完了点すなわち終点は一般にNADHの
濃度がNADHの最終平衡濃度の少なくとも約98％になる点
であると定義される。この終点は分光光度計の（340nm
における）読みを時間経過で走査することにより観察す
ることができる。吸光度、すなわちNADHの濃度ははじめ
増大し、徐々に横ばいになり比較的一定な値になる。吸
光度が最初に横ばい（反応完了時の98％以上）になった
点を終点とする。
グルコース検定の終点はできる限り短時間で到達する
ことが望ましい。急速終点定量は特にグルコース検定を
自動化する場合、血清分析機のコストが高くなるのに関
与するから重要である。
ことが望ましい。急速終点定量は特にグルコース検定を
自動化する場合、血清分析機のコストが高くなるのに関
与するから重要である。
上記の安定剤系と共用される本発明の酵素試薬は２年
以上の貯蔵寿命を有している。酵素試薬の貯蔵寿命は酵
素試薬が標準グルコース検定において許容し得る成果を
与える時間的な期間であると一般に定義される。標準グ
ルコース検定はグルコース酵素試薬１部とグルコース補
酵素試薬10部を混合して配合試薬とし、次いでこの配合
試薬100部とグルコースを含有する試験試料１部を混合
して検定反応混合液を形成することと定義される。これ
らの部はすべて容積部である。
以上の貯蔵寿命を有している。酵素試薬の貯蔵寿命は酵
素試薬が標準グルコース検定において許容し得る成果を
与える時間的な期間であると一般に定義される。標準グ
ルコース検定はグルコース酵素試薬１部とグルコース補
酵素試薬10部を混合して配合試薬とし、次いでこの配合
試薬100部とグルコースを含有する試験試料１部を混合
して検定反応混合液を形成することと定義される。これ
らの部はすべて容積部である。
グルコース検定HK/G−６−PDHの仕様は特定された時
間（例えば10分間）内に終点に達するのに必要な量であ
ると一般に定義され、試験試料中のグルコース濃度は酵
素試薬が作動できる濃度範囲内にあるようにされる。こ
の濃度範囲は酵素試薬の「動的範囲」（dynamic rang
e）と呼ばれる。本発明の酵素試薬の貯蔵寿命は上記の
標準グルコース試験の試験試料中に10〜500mg/dlの動的
範囲内のグルコースが含まれた場合に10分以下で終点に
到達させるものと定義される。終点に５分以下で到達す
ることがより好ましい。終点に２分以下で到達するのが
もっとも好ましい。
間（例えば10分間）内に終点に達するのに必要な量であ
ると一般に定義され、試験試料中のグルコース濃度は酵
素試薬が作動できる濃度範囲内にあるようにされる。こ
の濃度範囲は酵素試薬の「動的範囲」（dynamic rang
e）と呼ばれる。本発明の酵素試薬の貯蔵寿命は上記の
標準グルコース試験の試験試料中に10〜500mg/dlの動的
範囲内のグルコースが含まれた場合に10分以下で終点に
到達させるものと定義される。終点に５分以下で到達す
ることがより好ましい。終点に２分以下で到達するのが
もっとも好ましい。
連日グルコース検定を行う場合、検定反応混合液中の
補酵素の量を使用される酵素試薬のグルコースの動的範
囲の最大量に比して実質的に過剰な量を使用するのが通
例である。反応混合液中のATP対グルコースのモル比は
約3:1から約14:1の範囲にあるのが好ましい。反応混合
液中のNAD対グルコースのモル比は5:1以上であるのが好
ましい。これらの比率は酵素試薬の動的範囲の上限のグ
ルコース濃度を用いて算出される。これらの補酵素濃度
範囲は本発明の酵素試薬に対する上記定義内にあると想
定される。それゆえ、検定反応混合液中にある与えられ
たグルコース濃度における測定反応の速度に影響する決
定的な変数は酵素試薬中の酵素の活性度である。酵素を
多重添加することは理論的には反応速度を大きくし、よ
り速い終点の測定がもたらされる。しかしながら対照的
な考え方がある。酵素のコストは実質的な過剰量の使用
を阻止する。さらに、汚染物及び阻害物がヘキソキナー
ゼ及びグルコース−６−リン酸脱水素酵素の精製品中に
存在することが知られている。例えば、汚染物ホスホヘ
キソ−スイソメラーゼが精製ヘキソキナーゼ中に存在す
ることがあるのが知られている。この汚染物はグルコー
ス−６−リン酸（グルコース検定中の中間精製物）をフ
ラクトース−６−リン酸に変える。そのためグルコース
検定結果は不自然に低いものとなる。それらの汚染物及
び阻害物の量を制限するには汚染物及び阻害物の有害な
影響が小さくなるよう酵素HK及びＧ−６−PDHを少量使
用することが望ましい。
補酵素の量を使用される酵素試薬のグルコースの動的範
囲の最大量に比して実質的に過剰な量を使用するのが通
例である。反応混合液中のATP対グルコースのモル比は
約3:1から約14:1の範囲にあるのが好ましい。反応混合
液中のNAD対グルコースのモル比は5:1以上であるのが好
ましい。これらの比率は酵素試薬の動的範囲の上限のグ
ルコース濃度を用いて算出される。これらの補酵素濃度
範囲は本発明の酵素試薬に対する上記定義内にあると想
定される。それゆえ、検定反応混合液中にある与えられ
たグルコース濃度における測定反応の速度に影響する決
定的な変数は酵素試薬中の酵素の活性度である。酵素を
多重添加することは理論的には反応速度を大きくし、よ
り速い終点の測定がもたらされる。しかしながら対照的
な考え方がある。酵素のコストは実質的な過剰量の使用
を阻止する。さらに、汚染物及び阻害物がヘキソキナー
ゼ及びグルコース−６−リン酸脱水素酵素の精製品中に
存在することが知られている。例えば、汚染物ホスホヘ
キソ−スイソメラーゼが精製ヘキソキナーゼ中に存在す
ることがあるのが知られている。この汚染物はグルコー
ス−６−リン酸（グルコース検定中の中間精製物）をフ
ラクトース−６−リン酸に変える。そのためグルコース
検定結果は不自然に低いものとなる。それらの汚染物及
び阻害物の量を制限するには汚染物及び阻害物の有害な
影響が小さくなるよう酵素HK及びＧ−６−PDHを少量使
用することが望ましい。
貯蔵寿命は酵素試薬が貯蔵される温度に非常に大きく
依存する。酵素HK及びＧ−６−PDHは温度が高いと非常
に急速に分解する。実用上許容されるのは酵素試薬を約
２〜約８℃の温度で貯蔵することで、最も好ましいのは
約４℃の貯蔵である。
依存する。酵素HK及びＧ−６−PDHは温度が高いと非常
に急速に分解する。実用上許容されるのは酵素試薬を約
２〜約８℃の温度で貯蔵することで、最も好ましいのは
約４℃の貯蔵である。
上述のグルコース検定反応混合液配合に関し、下記の
実施例３及び第７図、第８図に示すように上限濃度が50
0mg/dlのグルコース濃度の動的範囲に対する酵素試薬中
のHK及びＧ−６−PDHの最適濃度範囲は次のようにな
る：一般に濃度範囲の下限は終点に到達し得る時間によ
り制限され、その上限はコストによって制限される。濃
度範囲の下限については10分終点が好ましく、２分終点
が最も好ましいとされる。酵素試薬中のHKの濃度範囲は
好ましくは約６〜約80KIU/、より好ましくは約10〜約
60KIU/、最も好ましくは約15〜約35KIU/である。こ
れらの濃度は検定反応混合液中のHKの濃度範囲として好
ましくは約0.54〜約7.2KIU/、より好ましくは約0.9〜
約5.4KIU/、最も好ましくは約1.35〜約3.15KIU/に
対応する。酵素試薬中のＧ−６−PDHの対応する最適濃
度は約３〜約60KIU/、より好ましくは約15〜約40KIU/
、最も好ましくは約20〜約35KIU/である。これらの
濃度は検定反応混合液中のＧ−６−PDHの濃度範囲とし
て好ましくは0.27〜約5.4KIU/、より好ましくは約1.3
5〜約3.6KIU/、最も好ましくは約1.8〜約3.15KIU/
に対応する。
実施例３及び第７図、第８図に示すように上限濃度が50
0mg/dlのグルコース濃度の動的範囲に対する酵素試薬中
のHK及びＧ−６−PDHの最適濃度範囲は次のようにな
る：一般に濃度範囲の下限は終点に到達し得る時間によ
り制限され、その上限はコストによって制限される。濃
度範囲の下限については10分終点が好ましく、２分終点
が最も好ましいとされる。酵素試薬中のHKの濃度範囲は
好ましくは約６〜約80KIU/、より好ましくは約10〜約
60KIU/、最も好ましくは約15〜約35KIU/である。こ
れらの濃度は検定反応混合液中のHKの濃度範囲として好
ましくは約0.54〜約7.2KIU/、より好ましくは約0.9〜
約5.4KIU/、最も好ましくは約1.35〜約3.15KIU/に
対応する。酵素試薬中のＧ−６−PDHの対応する最適濃
度は約３〜約60KIU/、より好ましくは約15〜約40KIU/
、最も好ましくは約20〜約35KIU/である。これらの
濃度は検定反応混合液中のＧ−６−PDHの濃度範囲とし
て好ましくは0.27〜約5.4KIU/、より好ましくは約1.3
5〜約3.6KIU/、最も好ましくは約1.8〜約3.15KIU/
に対応する。
グルコースHK/G−６−PDH酵素試薬の安定性の今１つ
の測定標準は半反応時間、Ｔ（1/2）である。この時間
はグルコース検定中の測定反応が半分完了した時間であ
る。これはグルコース検定用の340nmにおける最終と最
初の吸光度の比較により求められる。吸光度が最初と最
終の吸光度間の中央になった時の反応時間が半反応時間
である。補酵素濃度が過剰である場合半反応時間は検定
反応混合液のグルコース及び未分解酵素の濃度に依存す
る。酵素試薬の貯蔵寿命期間中、貯蔵した本発明の酵素
試薬を用いるグルコース検定の半反応時間は好ましく製
造直後のその酵素試薬を用いる同じ検定における半反応
時間の1.5倍を越えない。
の測定標準は半反応時間、Ｔ（1/2）である。この時間
はグルコース検定中の測定反応が半分完了した時間であ
る。これはグルコース検定用の340nmにおける最終と最
初の吸光度の比較により求められる。吸光度が最初と最
終の吸光度間の中央になった時の反応時間が半反応時間
である。補酵素濃度が過剰である場合半反応時間は検定
反応混合液のグルコース及び未分解酵素の濃度に依存す
る。酵素試薬の貯蔵寿命期間中、貯蔵した本発明の酵素
試薬を用いるグルコース検定の半反応時間は好ましく製
造直後のその酵素試薬を用いる同じ検定における半反応
時間の1.5倍を越えない。
上述のグルコース検定において半反応時間が30秒及び
1.5分であることはそれぞれ終点３分及び10分に相当す
る。
1.5分であることはそれぞれ終点３分及び10分に相当す
る。
グルコース検定に関しここで述べるすべての議論はそ
の検定にとって最適の温度及びpHにおいてその検定が行
われる場合に基づいている。温度は約37℃、pHは約7.5
にすべきであると一般に認められている。
の検定にとって最適の温度及びpHにおいてその検定が行
われる場合に基づいている。温度は約37℃、pHは約7.5
にすべきであると一般に認められている。
本発明の酵素試薬の好ましい説明では、酵素試薬はは
じめに調製された時次の成分を含んでなる。
じめに調製された時次の成分を含んでなる。
（ａ）少なくとも約60％（v/v）の水、 （ｂ）約20〜約40％（v/v）の量の水と混合可能なポリ
オール有機溶媒 （ｃ）約６〜約80KIU/の量のヘキソキナーゼ酵素 （ｄ）約３〜約60KIU/の量のグルコース−６−リン酸
脱水素酵素 （ｅ）次の成分を含んでなる安定剤系 （ｉ）約0.5〜約5mMの量のエチレンジアミン四酢酸（ED
TA）である重金属イオンキレート剤、 （ii）約２〜約8g/の量の牛の血清アルブミンである
酸化防止剤、 （iii）約0.25〜約1.0g/の量のアジ化ナトリウムであ
る微生物抑制剤、 （ｆ）約0.05〜0.2mMの量のトリス−塩酸緩衝剤。
オール有機溶媒 （ｃ）約６〜約80KIU/の量のヘキソキナーゼ酵素 （ｄ）約３〜約60KIU/の量のグルコース−６−リン酸
脱水素酵素 （ｅ）次の成分を含んでなる安定剤系 （ｉ）約0.5〜約5mMの量のエチレンジアミン四酢酸（ED
TA）である重金属イオンキレート剤、 （ii）約２〜約8g/の量の牛の血清アルブミンである
酸化防止剤、 （iii）約0.25〜約1.0g/の量のアジ化ナトリウムであ
る微生物抑制剤、 （ｆ）約0.05〜0.2mMの量のトリス−塩酸緩衝剤。
ここに酵素試薬のpHは好ましくは氷酢酸を用いて約7.
5に調製される。
5に調製される。
酵素試薬のもう１つの好ましい組成（version）では
牛の血清アルブミン（BSA）の代りに約２〜約8g/の量
のポリビニルピロリドン−40と約0.4〜約1.6g/のＮ−
アセチルシステインが用いられる。その他の成分はすべ
て同じである。
牛の血清アルブミン（BSA）の代りに約２〜約8g/の量
のポリビニルピロリドン−40と約0.4〜約1.6g/のＮ−
アセチルシステインが用いられる。その他の成分はすべ
て同じである。
上述の酵素試薬の好ましい組成は上述の標準グルコー
ス濃度の動的範囲が好ましくは10〜1000mg/dl、最も好
ましくは10〜500mg/dlの場合に使用するのに適してい
る。
ス濃度の動的範囲が好ましくは10〜1000mg/dl、最も好
ましくは10〜500mg/dlの場合に使用するのに適してい
る。
本発明の酵素試薬は次の組成を有する均質な補酵素試
薬と用いるように設計されている。
薬と用いるように設計されている。
（ａ）少なくとも約80％（v/v）の水、 （ｂ）約５〜約20％（v/v）の量の水と混合可能なポリ
オール有機溶媒、 （ｃ）アデノシン三リン酸補酵素、及び （ｄ）ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド補酵
素。
オール有機溶媒、 （ｃ）アデノシン三リン酸補酵素、及び （ｄ）ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド補酵
素。
好ましくは補酵素系試薬もまたMg++イオンを含有す
る。好ましくは補酵素試薬はトリス−塩酸で緩衝され、
そのpHは約7.5に調整される。補酵素試薬はまた微生物
コントロール剤を含有してもよい。
る。好ましくは補酵素試薬はトリス−塩酸で緩衝され、
そのpHは約7.5に調整される。補酵素試薬はまた微生物
コントロール剤を含有してもよい。
補酵素試薬中における補酵素アデノシン三リン酸とニ
コチンアミド−アデニンジヌクレオチドの最適量は下記
の第９図及び第10図に示す。補酵素試薬における２種の
補酵素の好ましい濃度範囲は、ATP約0.3〜約6.0mM、よ
り好ましくは約１〜約4.2mM、NAD約1.4〜4.2mM、より好
ましくは約2.5〜約3.5mMである。標準グルコース検定反
応混合液における補酵素の対応濃度は、ATP約0.3〜約5.
4mM、より好ましくは0.9〜約3.8mM、NAD約1.3〜約3.8m
M、より好ましくは約2.2〜約3.2mMである。試験試料中
のグルコース濃度が500mg/dlの時の検定反応混合液中の
ATP体グルコースのモル比は、好ましくは約1:1から約2
0:1の範囲内に、より好ましくは3:1から約14:1までの間
にある。試験試料中のグルコース濃度が500mg/dlである
検定反応混合液中のNAD対グルコースのモル比は、好ま
しくは5:1と13:1の間、より好ましくは9:1と11:1の間に
ある。
コチンアミド−アデニンジヌクレオチドの最適量は下記
の第９図及び第10図に示す。補酵素試薬における２種の
補酵素の好ましい濃度範囲は、ATP約0.3〜約6.0mM、よ
り好ましくは約１〜約4.2mM、NAD約1.4〜4.2mM、より好
ましくは約2.5〜約3.5mMである。標準グルコース検定反
応混合液における補酵素の対応濃度は、ATP約0.3〜約5.
4mM、より好ましくは0.9〜約3.8mM、NAD約1.3〜約3.8m
M、より好ましくは約2.2〜約3.2mMである。試験試料中
のグルコース濃度が500mg/dlの時の検定反応混合液中の
ATP体グルコースのモル比は、好ましくは約1:1から約2
0:1の範囲内に、より好ましくは3:1から約14:1までの間
にある。試験試料中のグルコース濃度が500mg/dlである
検定反応混合液中のNAD対グルコースのモル比は、好ま
しくは5:1と13:1の間、より好ましくは9:1と11:1の間に
ある。
（実施例） 以下に本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明す
る。なお、ここで用いた薬品及び供給源、処方、測定
機、実験操作及び計算法は次の通りである。
る。なお、ここで用いた薬品及び供給源、処方、測定
機、実験操作及び計算法は次の通りである。
A.薬品及び供給源 特記しない限り、次の供給源からの薬品を用いた。
グルコース標準液はロードアイランド、イーストプロ
ビデンスのニューイングランド・リエイジエント・ラボ
ラトリー（NERL）から得られる。グルコース、安息香
酸、グリセリン、酢酸マグネシウム、アジ化ナトリウ
ム、氷酢酸、及びEDTAはニュージャージー、フィリップ
スバーグのJ.T.ベーカー・ケミカル会社から得られる。
トリス−塩酸緩衝剤、BSA、PVP−40及びＮ−アセチルシ
ステインはミズリー、セントルイスのシグマ・ケミカル
会社から得られる。補酵素ATP及びNAD、及び酵素HK及び
Ｇ−６−PDHはインディアナ、インディアナポリスのボ
ーリンガー・マンハイム・バイオケミカルスから得られ
る。
ビデンスのニューイングランド・リエイジエント・ラボ
ラトリー（NERL）から得られる。グルコース、安息香
酸、グリセリン、酢酸マグネシウム、アジ化ナトリウ
ム、氷酢酸、及びEDTAはニュージャージー、フィリップ
スバーグのJ.T.ベーカー・ケミカル会社から得られる。
トリス−塩酸緩衝剤、BSA、PVP−40及びＮ−アセチルシ
ステインはミズリー、セントルイスのシグマ・ケミカル
会社から得られる。補酵素ATP及びNAD、及び酵素HK及び
Ｇ−６−PDHはインディアナ、インディアナポリスのボ
ーリンガー・マンハイム・バイオケミカルスから得られ
る。
B.処方 特記しない限り、次の処方を用いた。
（１）グルコース標準液 次の２種のグルコース標準液を用いた。
（ａ）研究室調製グルコース標準液−固形グルコースを
乾燥器（80℃）中に24時間入れた。その後デシケーター
中で冷却した。予め決められた種々の濃度の標準グルコ
ース溶液はこの乾燥グルコースから重量分析的に調製し
た。標準液はまた防腐剤として0.2％の安息香酸を含有
している。
乾燥器（80℃）中に24時間入れた。その後デシケーター
中で冷却した。予め決められた種々の濃度の標準グルコ
ース溶液はこの乾燥グルコースから重量分析的に調製し
た。標準液はまた防腐剤として0.2％の安息香酸を含有
している。
（ｂ）NERLグルコース標準液−NERLグルコース標準液は
購入品を使用した。必要な場合標準液を希釈する（例え
ば50mg/dlから25mg/dlへ）には脱イオン水を使用した。
NERLグルコース標準液は50、100、200、400及び750mg/d
lの各濃度で入手した。
購入品を使用した。必要な場合標準液を希釈する（例え
ば50mg/dlから25mg/dlへ）には脱イオン水を使用した。
NERLグルコース標準液は50、100、200、400及び750mg/d
lの各濃度で入手した。
（２）補酵素溶液 グリセリン 100 mg トリス−塩酸 12.0 ｇ 酢酸マグネシウム 2.2 ｇ アジ化ナトリウム 0.5 ｇ 氷酢酸（pH7.5へ） 4.6 ml ATP 2.526 g NAD 2.026 g 上記成分を脱イオン水を用いて１に希釈した。
（３）酵素溶液 （ａ）BSA組成 グリセリン 300 ml トリス−塩酸 2.11 g EDTA（遊離酸） 0.29 g 氷酢酸（pH7.5へ） 4.28 g BSA 4.0 ｇ HK 19.2KIU/ Ｇ−６−PDH 30 KIU/ 上記成分を脱イオン水を用いて１に希釈した。
（ｂ）PVP−40組成−BSAを次に変えた以外BSA組成と同
じである。
じである。
ポリビニルピロリドン−40（PVP−40） 4.0 ｇ Ａ−アセチルシステイン（NAC） 0.815g C.測定機及び計装 ベックマン・インスツルメンツ社のモデルDU−７分光
光度計を用いた。この分光光度計のセッティングは次の
ようにした。
光度計を用いた。この分光光度計のセッティングは次の
ようにした。
モード：タイムドライブ 機 能：［吸光］ 波 長:340nm 速 度：［1200］ 全時間:5分間 上 限:3 下 限:0 温 度:37℃ またロシエ・アナリティカル・コバス・バイオ臨床分
析計（コバスバイオ）を用いた。計器のセッティングは
次のようにした。
析計（コバスバイオ）を用いた。計器のセッティングは
次のようにした。
1.単位 mg/dl 2.計算ファクター 0 3.標準１コンク 150 4.標準２コンク 150 5.標準３コンク 150 6.リミット 0 7.温度 37℃ 8.分析型式 1 9.波長［nm］ 340 10.試料容量［μ］ 3 11.希釈液容量［μ］ 10 12.試薬容量［μ］ 300 13.温置時間［秒］ 180 14.開始試薬容量［μ］ 0 15.最初の読みの時間［秒］ 180 16.時間間隔 180 17.読みの数 1 18.ブランクモード 1 19.印刷モード １及び３ D.操作 （１）酵素溶液の熱解離 酵素溶液試料を標識のついたバレックスカートリッジ
にびんづめし、種々の温度にセットしたインキュベータ
ー中へ入れた。各温度における分解を異なった温置時間
について下記に示すグルコース検定の温置酵素試薬を用
いることにより監視した。高温での温置は分解を加速
し、低温長時間での分解に近付く。
にびんづめし、種々の温度にセットしたインキュベータ
ー中へ入れた。各温度における分解を異なった温置時間
について下記に示すグルコース検定の温置酵素試薬を用
いることにより監視した。高温での温置は分解を加速
し、低温長時間での分解に近付く。
（２）グルコース検定 （ａ）DU−７分光光度計−試薬としてはじめに酵素溶液
0.18ml（１部）と補酵素溶液1.81ml（10部）の割合でキ
ューベット中で混合した。この結果試薬を37℃で４時間
温置した。次に試料20μをキューベットに添加して反
応を開始させた。試料をキューベットへ添加するのと同
時にDU−７の作動ボタンを押し分光光度計をスタートさ
せた。試料は対にして試験した。
0.18ml（１部）と補酵素溶液1.81ml（10部）の割合でキ
ューベット中で混合した。この結果試薬を37℃で４時間
温置した。次に試料20μをキューベットに添加して反
応を開始させた。試料をキューベットへ添加するのと同
時にDU−７の作動ボタンを押し分光光度計をスタートさ
せた。試料は対にして試験した。
（ｂ）コバスバイオー上述のセッティングをプログラム
した後、対にした２試料を試料カップ中に入れた。グル
コース酵素試薬及び補酵素試薬の成分をコバスパイオ試
薬トレイ中で次のように混合した：酵素試薬成分1ml及
び補酵素試薬10ml。ベッグマンASTRA校正標準液（部品
番号886384）をトレイの標準仕切りの中に入れた。
した後、対にした２試料を試料カップ中に入れた。グル
コース酵素試薬及び補酵素試薬の成分をコバスパイオ試
薬トレイ中で次のように混合した：酵素試薬成分1ml及
び補酵素試薬10ml。ベッグマンASTRA校正標準液（部品
番号886384）をトレイの標準仕切りの中に入れた。
上記の検定操作において両方とも結合試薬中の酵素溶
液と補酵素溶液の容積比率は1:10であった。結合試薬と
試験試料との比率は容積で100:1であった。
液と補酵素溶液の容積比率は1:10であった。結合試薬と
試験試料との比率は容積で100:1であった。
E.計算 （１）半反応時間 半反応時間、Ｔ（1/2）はグルコース検定の測定反応
が最終及び最初の340nmの吸光度に基づいて半分終了す
る時間である。この時間は次のようにして計算された。
反応終了後、210秒での吸光度をDU−７の結果から測定
した。最初の吸光度を最終の吸光度から差引き、その差
を２で割って半反応の吸光度を求めた。この吸光度に対
応する時間（DU−７分光光度計の結果からの読み）が半
反応時間Ｔ（1/2）である。
が最終及び最初の340nmの吸光度に基づいて半分終了す
る時間である。この時間は次のようにして計算された。
反応終了後、210秒での吸光度をDU−７の結果から測定
した。最初の吸光度を最終の吸光度から差引き、その差
を２で割って半反応の吸光度を求めた。この吸光度に対
応する時間（DU−７分光光度計の結果からの読み）が半
反応時間Ｔ（1/2）である。
（２）直線性検討 酵素試薬の分解の程度は半反応時間Ｔ（1/2）の変化
に比例する。コバスバイオで得た結果を印刷モード１及
び３で表示した。印刷モード３から各試料のデルタ吸光
度を最初の読みと最終の吸光度の差を求めることにより
計算した。最終吸光度は3.5分後に測定した。この結果
はmg/dlで示す標準濃度にたいしてプロットした。
に比例する。コバスバイオで得た結果を印刷モード１及
び３で表示した。印刷モード３から各試料のデルタ吸光
度を最初の読みと最終の吸光度の差を求めることにより
計算した。最終吸光度は3.5分後に測定した。この結果
はmg/dlで示す標準濃度にたいしてプロットした。
実施例１ 分解加速条件下でのHK/G−６−PDH酵素溶液の安定性試
験 酵素溶液のBSA組成及びPVP−40の試料を４、15、25、
32、37及び41℃の各温度において熱解離処理した。酵素
溶液の活性度は上記のグルコース検定法においてそれぞ
れ650及び1000mg/dlのグルコースを含有する研究室調製
グルコース標準液を用いて検討した。これら比較的高い
グルコース濃度は酵素分解が高いグルコース濃度でより
大きな有害効果を受けることから選ばれた。また、これ
らグルコース高濃度はＴ（1/2）測定を容易にする。
験 酵素溶液のBSA組成及びPVP−40の試料を４、15、25、
32、37及び41℃の各温度において熱解離処理した。酵素
溶液の活性度は上記のグルコース検定法においてそれぞ
れ650及び1000mg/dlのグルコースを含有する研究室調製
グルコース標準液を用いて検討した。これら比較的高い
グルコース濃度は酵素分解が高いグルコース濃度でより
大きな有害効果を受けることから選ばれた。また、これ
らグルコース高濃度はＴ（1/2）測定を容易にする。
安定性試験の結果はそれぞれ酵素溶液のBSA組成及びP
VP−40組成の結果を示す第１図及び第２図に示した。第
１図及び第２図はともに分解の速度（傾斜値）対温度
（゜K）の逆数の関係を示すアルレニウスプロットであ
る。傾斜値は各温度ごとに直線関数In［1/T（1/2）］対
時間（日数）をプロットすることにより測定した。各ア
ルレニウスプロットに示す２本の線はこの試験に使用し
た２種のグルコース濃度（標準）を示している。
VP−40組成の結果を示す第１図及び第２図に示した。第
１図及び第２図はともに分解の速度（傾斜値）対温度
（゜K）の逆数の関係を示すアルレニウスプロットであ
る。傾斜値は各温度ごとに直線関数In［1/T（1/2）］対
時間（日数）をプロットすることにより測定した。各ア
ルレニウスプロットに示す２本の線はこの試験に使用し
た２種のグルコース濃度（標準）を示している。
第１表は各温度における酵素溶液のＴ（1/2）が25秒
に到達する時間を求めるように決められた線型回帰に基
づく算出寿命を示す。このＴ（1/2）25秒は反応完了時
間約３〜４分にほぼ対応する。計算は最初のＴ（1/2）
が650mg/dlでは19秒、1000mg/dlでは22秒であることに
基づいて行われた。
に到達する時間を求めるように決められた線型回帰に基
づく算出寿命を示す。このＴ（1/2）25秒は反応完了時
間約３〜４分にほぼ対応する。計算は最初のＴ（1/2）
が650mg/dlでは19秒、1000mg/dlでは22秒であることに
基づいて行われた。
実施例２ HK/G−６−PDH酵素溶液の直線性の検討 新しく調製した酸素溶液（日数０、４℃）をそれぞれ
25、50、100、150、200、400、500、650及び1000mg/dl
濃度の研究室調製グルコース標準液を用いるグルコース
検定に使用した。第３図に最初と最後の吸光度の差（Δ
吸光度）をグルコース濃度に対してプロットした。最初
の吸光度は両酵素溶液とも約0.06であった。４℃で０日
貯蔵した酵素溶液BSA組成、PVP−40組成とも良好な直線
性を示している。
25、50、100、150、200、400、500、650及び1000mg/dl
濃度の研究室調製グルコース標準液を用いるグルコース
検定に使用した。第３図に最初と最後の吸光度の差（Δ
吸光度）をグルコース濃度に対してプロットした。最初
の吸光度は両酵素溶液とも約0.06であった。４℃で０日
貯蔵した酵素溶液BSA組成、PVP−40組成とも良好な直線
性を示している。
同じ操作を25℃で106日貯蔵した２種の組成の溶液に
ついて繰り返した。研究室調製グルコース標準液のグル
コース濃度はそれぞれ25、150、650及び1000mg/dlであ
った。106日における両酵素組成の最初の吸光度は約0.1
であった。結果を第４図に示した。グルコース濃度1000
mg/dlまでは再び良好な直線性を示した。
ついて繰り返した。研究室調製グルコース標準液のグル
コース濃度はそれぞれ25、150、650及び1000mg/dlであ
った。106日における両酵素組成の最初の吸光度は約0.1
であった。結果を第４図に示した。グルコース濃度1000
mg/dlまでは再び良好な直線性を示した。
別の現実時間直線試験では、４℃で約１年間貯蔵した
後の２種の組成の酵素溶液について同じ操作を繰り返し
た。最初の吸光度は0.17まで増大したが、得られた直線
性は残っていた。第５図は両組成の酵素溶液に対するΔ
吸光度対グルコース濃度をプロットしたものである。10
00mg/dlまで直線性は優れていた。
後の２種の組成の酵素溶液について同じ操作を繰り返し
た。最初の吸光度は0.17まで増大したが、得られた直線
性は残っていた。第５図は両組成の酵素溶液に対するΔ
吸光度対グルコース濃度をプロットしたものである。10
00mg/dlまで直線性は優れていた。
2 1/2年現実時間直線性試験では４℃で約2 1/2年間貯
蔵したBSA組成酵素溶液について同じ操作を繰り返し
た。それぞれ25、50、150、450及び600mg/dlの濃度を有
するNERLグルコース標準液を用いた。最初の吸光度は0.
17（１年）から0.21（2 1/2年）に増加した。しかし、
吸光度差対グルコース濃度のプロットである第６図に示
すように直線性は600mg/dlまで優れている。
蔵したBSA組成酵素溶液について同じ操作を繰り返し
た。それぞれ25、50、150、450及び600mg/dlの濃度を有
するNERLグルコース標準液を用いた。最初の吸光度は0.
17（１年）から0.21（2 1/2年）に増加した。しかし、
吸光度差対グルコース濃度のプロットである第６図に示
すように直線性は600mg/dlまで優れている。
実施例３ 試薬成分の最適化 各酵素（HK及びＧ−6PDH）及び補酵素（ATP及びNAD）
の濃度の変化の影響を、他の試薬成分を一定（上記の処
方に示すとおり）にしたままで、グルコース濃度650mg/
dlを有する研究室調製グルコース標準液を用いる上述の
グルコース検定法を使用して試験した。この標準研究で
は酵素溶液のBSA組成を用いた。
の濃度の変化の影響を、他の試薬成分を一定（上記の処
方に示すとおり）にしたままで、グルコース濃度650mg/
dlを有する研究室調製グルコース標準液を用いる上述の
グルコース検定法を使用して試験した。この標準研究で
は酵素溶液のBSA組成を用いた。
第７、８、９、10図は試薬成分のＴ（1/2）に対する
影響を示す。結果は上記した処方に使用した酵素及び補
酵素濃度は最適範囲内にあることを示した。HK及びＧ−
６−PDHはともに酵素濃が高くなるほど反応が早くな
り、したがってＴ（1/2）が短時間になる。最適化はコ
ストと反応速度のバランスに実質上基づくものである。
影響を示す。結果は上記した処方に使用した酵素及び補
酵素濃度は最適範囲内にあることを示した。HK及びＧ−
６−PDHはともに酵素濃が高くなるほど反応が早くな
り、したがってＴ（1/2）が短時間になる。最適化はコ
ストと反応速度のバランスに実質上基づくものである。
実施例４ 現実時間安定性研究 酵素溶液の２種の組成を４℃において約2 1/2年間に
わたって貯蔵した。グルコース検定をそれぞれ１年及び
2 1/2年貯蔵の酵素溶液を用いて行った。反応経過は340
nmにおける吸光度対時間（秒）を走査して追跡した。１
年貯蔵の研究では、グルコース濃度150及び650mg/dlの
研究室調製グルコース標準液を用いた。2 1/2年貯蔵の
研究ではグルコース濃度500mg/dlのNERLグルコース標準
液を用いた。第11〜15図は１年及び2 1/2年における反
応経過を走査したものである。全ての検定において半反
応時間もまた測定した。
わたって貯蔵した。グルコース検定をそれぞれ１年及び
2 1/2年貯蔵の酵素溶液を用いて行った。反応経過は340
nmにおける吸光度対時間（秒）を走査して追跡した。１
年貯蔵の研究では、グルコース濃度150及び650mg/dlの
研究室調製グルコース標準液を用いた。2 1/2年貯蔵の
研究ではグルコース濃度500mg/dlのNERLグルコース標準
液を用いた。第11〜15図は１年及び2 1/2年における反
応経過を走査したものである。全ての検定において半反
応時間もまた測定した。
第２表は本発明の酵素試薬を４℃で2 1/2年まで貯蔵
した場合の半反応時間Ｔ（1/2）と実質的に反応が完了
する（終点）時間を比較したものである。
した場合の半反応時間Ｔ（1/2）と実質的に反応が完了
する（終点）時間を比較したものである。
以上本発明をある好ましい組成に関連して相当詳細に
説明したが、他の組成は可能である。それゆえ、特許請
求の範囲の精神及び範囲は好ましい組成についての記載
に必然的に限定されるべきものではない。
説明したが、他の組成は可能である。それゆえ、特許請
求の範囲の精神及び範囲は好ましい組成についての記載
に必然的に限定されるべきものではない。
（発明の効果） 本発明の酵素試薬は多くの利点を有している。この酵
素試薬を４℃において正常に貯蔵したときの算定寿命は
15年以上になり得る。このことは試薬が貯蔵または輸送
中受ける時々の誤処理に耐えうることを意味する。室温
での貯蔵寿命は1 1/2年まで可能である。500mg/dlグル
コース標準液での反応は２分以内に完了する。終点安定
性は５分までである。これによってグルコースの非常に
迅速な定量を可能にする。最初のブランクは低い値であ
り、高い感度を与えることになる。試薬の直線性はグル
コース濃度約1000mg/dlまで優れている。この試薬のBSA
組成の500mg/dl標準液を用いた場合の計算上の感度はキ
ューベット光路1cmにおいて340nmで0.0032吸光度/mg/dl
である。
素試薬を４℃において正常に貯蔵したときの算定寿命は
15年以上になり得る。このことは試薬が貯蔵または輸送
中受ける時々の誤処理に耐えうることを意味する。室温
での貯蔵寿命は1 1/2年まで可能である。500mg/dlグル
コース標準液での反応は２分以内に完了する。終点安定
性は５分までである。これによってグルコースの非常に
迅速な定量を可能にする。最初のブランクは低い値であ
り、高い感度を与えることになる。試薬の直線性はグル
コース濃度約1000mg/dlまで優れている。この試薬のBSA
組成の500mg/dl標準液を用いた場合の計算上の感度はキ
ューベット光路1cmにおいて340nmで0.0032吸光度/mg/dl
である。
また、本発明の安定な液体酵素試薬は均質性であるた
め従来技術のグルコース試薬の問題点、特に試薬取り扱
い上及び検定の品質管理上の問題点が解決される。本発
明の酵素試薬は硫酸アンモニウム安定化酵素試薬の場合
のように液体懸濁物が存在しないから容易にピペット採
取及び秤取することができる。本酵素試薬を用いる検定
結果は再現性のあるものである。本発明の酵素試薬は手
動分析器及び自動分析器の両方に容易に適用される。
め従来技術のグルコース試薬の問題点、特に試薬取り扱
い上及び検定の品質管理上の問題点が解決される。本発
明の酵素試薬は硫酸アンモニウム安定化酵素試薬の場合
のように液体懸濁物が存在しないから容易にピペット採
取及び秤取することができる。本酵素試薬を用いる検定
結果は再現性のあるものである。本発明の酵素試薬は手
動分析器及び自動分析器の両方に容易に適用される。
第１図及び第２図は本発明の酵素試薬のBSA及びPVP−40
組成に対する分解速度（傾斜）対温度の逆数をアルレニ
ウスプロットしたものであり、 第３〜６図は本発明の酵素試薬の直線性をそれぞれ
（ａ）調製直後、（ｂ）25℃で106日貯蔵、（ｃ）４℃
で１年間貯蔵、（ｄ）４℃で2 1/2年間貯蔵の場合につ
いてプロットした図である。 第７〜10図はそれぞれHK、Ｇ−６−PDH、ATP及びNADの
濃度を他の成分の濃度を一定に保って変えた場合の半反
応時間Ｔ（1/2）に対する影響を示す。 第11〜15図は４℃で１年から2 1/2年間貯蔵期間を変え
て貯蔵した本発明の酵素試薬を用いた場合の反応経過で
ある。
組成に対する分解速度（傾斜）対温度の逆数をアルレニ
ウスプロットしたものであり、 第３〜６図は本発明の酵素試薬の直線性をそれぞれ
（ａ）調製直後、（ｂ）25℃で106日貯蔵、（ｃ）４℃
で１年間貯蔵、（ｄ）４℃で2 1/2年間貯蔵の場合につ
いてプロットした図である。 第７〜10図はそれぞれHK、Ｇ−６−PDH、ATP及びNADの
濃度を他の成分の濃度を一定に保って変えた場合の半反
応時間Ｔ（1/2）に対する影響を示す。 第11〜15図は４℃で１年から2 1/2年間貯蔵期間を変え
て貯蔵した本発明の酵素試薬を用いた場合の反応経過で
ある。
Claims (47)
- 【請求項１】補酵素としてアデノシン三リン酸及びニコ
チンアミド−アデニンジヌクレオチドを用い、補酵素を
過剰に存在させて行うグルコース検定におけるグルコー
ス定量用であり、 （ａ）少なくとも約60％（v/v）の水、 （ｂ）水と混合できる約20〜約40％（v/v）のポリオー
ル有機溶媒、 （ｃ）ヘキソキナーゼ酵素、 （ｄ）グルコース−６−リン酸脱水素酵素、 （ｅ）約２℃から約８℃の範囲の温度で貯蔵したとき少
なくとも２年の貯蔵寿命を有するのに十分な少なくとも
0.5mMの重金属イオンキレート剤を含んでなる安定剤系 の各成分を含んではじめに調製された貯蔵寿命の長い均
質液体酵素試薬。 - 【請求項２】キレート剤がエチレンジアミン四酢酸であ
る特許請求の範囲第１項記載の酵素試薬。 - 【請求項３】安定剤系が酸化防止剤をも含む請求の特許
範囲第１項記載の酵素試薬。 - 【請求項４】酸化防止剤が少なくとも2g/の量の牛の
血清アルブミンである特許請求の範囲第３項記載の酵素
試薬。 - 【請求項５】酸化防止剤が少なくとも約2g/の量のポ
リビニルピロリドン−40及び少なくとも約0.4g/の量
のＮ−アセチルシステインを含む特許請求の範囲第３項
記載の酵素試薬。 - 【請求項６】安定剤系が微生物コントロール剤をも含む
特許請求の範囲第１項記載の酵素試薬。 - 【請求項７】微生物コントロール剤が少なくとも約0.25
g/の量のアジ化ナトリウムである特許請求の範囲第６
項記載の酵素試薬。 - 【請求項８】ポリオール溶媒がグリセリンであり、 （ａ）約６〜約80KIU/の量のヘキソキナーゼ酵素、 （ｂ）約３〜約60KIU/の量のグルコース−６−リン酸
脱水素酵素、 （ｃ）約２〜約8g/の量の牛の血清アルブミン、 （ｄ）約0.5〜約5mMの量のエチレンジアミン四酢酸、 （ｅ）約0.25〜約1.0g/の量のアジ化ナトリウム、 （ｆ）約0.05〜約0.2mMの量のトリス−塩酸緩衝剤、 を含んでなり、pHを約7 1/2に調整された特許請求の範
囲第４項記載の酵素試薬。 - 【請求項９】ポリオールがグリセリンであり、 （ａ）約６〜約80KIU/の量のヘキソキナーゼ酵素、 （ｂ）約３〜約60KIU/の量のグルコース−６−リン酸
脱水素酵素、 （ｃ）約２〜約8g/の量のポリビニルピロリドン−40
及び約0.4〜約1.6g/の量のＮ−アセチルシステイン、 （ｄ）約0.5〜約5mMの量のエチレンジアミン四酢酸、 （ｅ）約0.25〜約1.0g/の量のアジ化ナトリウム、 （ｆ）約0.05〜約0.2mMの量のトリス−塩酸緩衝剤、 を含んでなり、pHを約7 1/2に調整された特許請求の範
囲第５項記載の酵素試薬。 - 【請求項１０】グルコース検定に使用される酵素試薬
が、マグネシウムイオン及び補酵素アデノシン三リン酸
及びニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドを含有す
る液体補酵素試薬並びにグルコースを含有する試験試料
と混合されて、酵素試薬：補酵素試薬：試験試料が容積
比で100:1000:11の割合であって、試験試料中のグルコ
ース濃度が約10〜約500mg/dlの範囲にあり、その検定反
応混合液中の補酵素が同液中のグルコース濃度に比較し
てグルコース検定用としては実質的に過剰に存在し、か
つ反応混合液中のキレート剤濃度が同液中のマグネシウ
ムイオン濃度の約50％より多くなく存在する検定反応混
合液を形成するときに、 酵素試薬の貯蔵寿命が、グルコース検定の終点が約10分
より長くない時間内に到達し得る時間的な範囲にある特
許請求の範囲第８項記載の酵素試薬。 - 【請求項１１】ヘキソナーゼが約1.5〜約3.5KIU/の量
であり、グルコース−６−リン酸脱水素酵素が約20〜35
KIU/の量であり、アデノシン三リン酸のグルコースに
対するモル比が反応混合液中で約3:1よりも大きく、ニ
コチンアミドアデノシンジヌクレオチドのグルコースに
対するモル比が5:1よりも大きく、検定の終点が約２分
以内の時間に到達し得る特許請求の範囲第10項記載の酵
素試薬。 - 【請求項１２】グルコース検定に使用される酵素試薬
が、マグネシウムイオン及び補酵素アデノシン三リン酸
及びニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドを含有す
る液体補酵素試薬並びにグルコースを含有する試験試料
と混合されて、酵素試薬：補酵素試薬：試験試料が容積
比で100:1000:11の割合であって、試験試料中のグルコ
ース濃度が約10〜約500mg/dlの範囲にあり、その検定反
応混合液中の補酵素が同液中のグルコース濃度に比較し
てグルコース検定用としては実質的に過剰に存在し、か
つ反応混合液中のキレート剤濃度が同液中のマグネシウ
ムイオン濃度の約50％より多くなく存在する検定反応混
合液を形成するときに、 酵素試薬の貯蔵寿命が、グルコース検定の終点が約10分
より長くない時間内に到達し得る時間的な範囲にある特
許請求の範囲第９項記載の酵素試薬。 - 【請求項１３】ヘキソナーゼが約1.5〜約3.5KIU/の量
であり、グルコース−６−リン酸脱水素酵素が約20〜35
KIU/の量であり、アデノシン三リン酸のグルコースに
対するモル比が反応混合液中で約3:1よりも大きく、ニ
コチンアミドアデノシンジヌクレオチドのグルコースに
対するモル比が5:1よりも大きく、検定の終点が約２分
以内の時間に到達し得る特許請求の範囲第12項記載の酵
素試薬。 - 【請求項１４】グルコース検定に使用される酵素試薬
が、マグネシウムイオン及び補酵素アデノシン三リン酸
及びニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドを含有す
る液体補酵素試薬並びにグルコースを含有する試験試料
と混合されて、酵素試薬：補酵素試薬：試験試料が容積
比で100:1000:11の割合であって、試験試料中のグルコ
ース濃度が約10〜約500mg/dlの範囲にあり、その検定反
応混合液中の補酵素が同液中のグルコース濃度に比較し
てグルコース検定用としては実質的に過剰に存在し、か
つ反応混合液中のキレート剤濃度が同液中のマグネシウ
ムイオン濃度の約50％より多くなく存在する検定反応混
合液を形成するときに、 酵素試薬の貯蔵寿命が、グルコース検定の半反応時間が
調製当初の同じ検定における半反応時間の約1.5倍より
大きくない時間的な範囲にある特許請求の範囲第８項記
載の酵素試薬。 - 【請求項１５】グルコース検定に使用される酵素試薬
が、マグネシウムイオン及び補酵素アデノシン三リン酸
及びニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドを含有す
る液体補酵素試薬並びにグルコースを含有する試験試料
と混合されて、酵素試薬：補酵素試薬：試験試料が容積
比で100:1000:11の割合であって、試験試料中のグルコ
ース濃度が約10〜約500mg/dlの範囲にあり、その検定反
応混合液中の補酵素が同液中のグルコース濃度に比較し
てグルコース検定用としては実質的に過剰に存在し、か
つ反応混合液中のキレート剤濃度が同液中のマグネシウ
ムイオン濃度の約50％より多くなく存在する検定反応混
合液を形成するときに、 酵素試薬の貯蔵寿命が、グルコース検定の半反応時間が
調製当初の同じ検定における半反応時間の約1.5倍より
大きくない時間的な範囲にある特許請求の範囲第９項記
載の酵素試薬。 - 【請求項１６】（ａ）（ｉ）少なくとも60％（v/v）の
水、 （ii）水と混合可能な約20〜約40％（v/v）の量のポリ
オール有機溶媒、 （iii）ヘキソキナーゼ酵素、 （iv）グルコース−６−リン酸脱水素酵素、 （ｖ）約２℃から約８℃の範囲の温度で貯蔵したとき少
なくとも２年の貯蔵寿命を有するのに十分な少なくとも
約0.5mMの量の重金属イオンキレート剤を含んでなる安
定剤系 の各成分を含んではじめに調製された貯蔵寿命の長い均
質液体酵素試薬、並びに （ｂ）（ｉ）少なくとも80％（v/v）の水、 （ii）水と混合可能な約５〜約20％（v/v）の量のポリ
オール有機溶媒、 （iii）アデノシン三リン酸補酵素、 （iv）ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド補酵
素、及び （ｖ）マグネシウムイオン を含んでなる均質液体補酵素試薬 の各試薬を有してなり、両試薬が混合されてグルコース
検定に適した結合試薬とされるとき結合試薬中において
酵素試薬からのキレート剤の量がモル比で補酵素試薬か
らのマグネシウムイオンの量の約半分よりも長くないよ
うに処方されるグルコース検定におけるグルコース定量
用キット。 - 【請求項１７】結合試薬が酵素試薬及び補酵素試薬を1:
10（v/v）で混合して形成され、結合試薬中での酵素試
薬からのキレート剤の量が補酵素試薬からのマグネシウ
ムイオンの量の約1/10よりも長くない特許請求の範囲第
10項記載のキット。 - 【請求項１８】キレート剤がエチレンジアミン四酢酸で
ある特許請求の範囲第16項記載のキット。 - 【請求項１９】安定剤系が酸化防止剤をも含む特許請求
の範囲第16項記載のキット。 - 【請求項２０】酸化防止剤が少なくとも2g/の量の牛
の血清アルブミンである特許請求の範囲第19項記載のキ
ット。 - 【請求項２１】酸化防止剤が少なくとも約2g/の量の
ポリビニルピロリドン−40及び少なくとも約0.4g/の
Ｎ−アセチルシステインを含む特許請求の範囲第19項記
載のキット。 - 【請求項２２】安定剤系が微生物コントロール剤をも含
む特許請求の範囲第16項記載のキット。 - 【請求項２３】微生物コントロール剤が少なくとも約0.
25g/の量のアジ化ナトリウムである特許請求の範囲第
22項記載のキット。 - 【請求項２４】ポリオール溶媒がグリセリンであり、酵
素試薬が （ａ）約６〜約80KIU/の量のヘキソキナーゼ酵素、 （ｂ）約３〜約60KIU/の量のグルコース−６−リン酸
脱水素酵素、 （ｃ）約２〜約8g/の量の牛の血清アルブミン、 （ｄ）約0.5〜約5mMの量のエチレンジアミン四酢酸、 （ｅ）約0.25〜約1.0g/の量のアジ化ナトリウム、 （ｆ）約0.05〜約0.2mMの量のトリス−塩酸緩衝剤、 を含んでなり、pHを約7 1/2に調整されたものである特
許請求の範囲第20項記載のキット。 - 【請求項２５】ポリオール溶媒がグリセリンであり、酵
素試薬が （ａ）約６〜約80KIU/の量のヘキソキナーゼ酵素、 （ｂ）約３〜約60KIU/の量のグルコース−６−リン酸
脱水素酵素、 （ｃ）約２〜約8g/の量のポリビニルピロリドン−40
及び約0.4〜約1.6g/の量のＮ−アセチルシステイン、 （ｄ）約0.5〜約5mMの量のエチレンジアミン四酢酸、 （ｅ）約0.25〜約1.0g/の量のアジ化ナトリウム、 （ｆ）約0.05〜約0.2mMの量のトリス−塩酸緩衝剤、 を含んでなり、pHを約7 1/2に調整されたものである特
許請求の範囲第21項記載のキット。 - 【請求項２６】グルコース検定に使用される酵素試薬
が、液体補酵素試薬並びにグルコースを含有する試験試
料と混合されて、酵素試薬：補酵素試薬：試験試料が容
積比で100:1000:11の割合であって、試験試料中のグル
コース濃度が約10〜約500mg/dlの範囲にあり、その検定
反応混合液中の補酵素が同液中のグルコース濃度に比較
してグルコース検定用としては実質的に過剰に存在し、
かつ反応混合液中のキレート剤濃度が同液中のマグネシ
ウムイオン濃度の約50％より多くなく存在する検定反応
混合液を形成するときに、 グルコース検定の終点が約10分より長くない時間内に到
達し得る時間的な範囲にある貯蔵寿命を有する酵素試薬
である特許請求の範囲第24項記載のキット。 - 【請求項２７】ヘキソナーゼが約1.5〜約3.5KIU/の量
であり、グルコース−６−リン酸脱水素酵素が約20〜35
KIU/の量であり、アデノシン三リン酸のグルコースに
対するモル比が反応混合液中で約3:1よりも大きく、ニ
コチンアミドアデノシンジヌクレオチドのグルコースに
対するモル比が5:1よりも大きく、検定の終点が約２分
以内の時間に到達し得るものである特許請求の範囲第26
項記載のキット。 - 【請求項２８】グルコース検定に使用される酵素試薬
が、液体補酵素試薬並びにグルコースを含有する試験試
料と混合されて、酵素試薬：補酵素試薬：試験試料が容
積比で100:1000:11の割合であって、試験試料中のグル
コース濃度が約10〜約500mg/dlの範囲にあり、その検定
反応混合液中の補酵素が同液中のグルコース濃度に比較
してグルコース検定用としては実質的に過剰に存在し、
かつ反応混合液中のキレート剤濃度が同液中のマグネシ
ウムイオン濃度の約50％より多くなく存在する検定反応
混合液を形成するときに、 グルコース検定の終点が約10分より長くない時間内に到
達し得る時間的な範囲にある貯蔵寿命を有する酵素試薬
である特許請求の範囲第25項記載のキット。 - 【請求項２９】ヘキソナーゼが約1.5〜約3.5KIU/の量
であり、グルコース−６−リン酸脱水素酵素が約20〜35
KIU/の量であり、アデノシン三リン酸のグルコースに
対するモル比が反応混合液中で約3:1よりも大きく、ニ
コチンアミドアデノシンジヌクレオチドのグルコースに
対するモル比が5:1よりも大きく、検定の終点が約２分
以内の時間に到達し得る特許請求の範囲第28項記載のキ
ット。 - 【請求項３０】グルコース検定に使用される酵素試薬
が、液体補酵素試薬並びにグルコースを含有する試験試
料と混合されて、酵素試薬：補酵素試薬：試験試料が容
積比で100:1000:11の割合であって、試験試料中のグル
コース濃度が約10〜約500mg/dlの範囲にあり、その検定
反応混合液中の補酵素が同液中のグルコース濃度に比較
してグルコース検定用としては実質的に過剰に存在し、
かつ反応混合液中のキレート剤濃度が同液中のマグネシ
ウムイオン濃度の約50％より多くなく存在する検定反応
混合液を形成するときに、 グルコース検定の半反応時間が調製当初の同じ検定にお
ける半反応時間の約1.5倍より大きくない時間的な範囲
にある貯蔵寿命を有する酵素試薬である特許請求の範囲
第24項記載のキット。 - 【請求項３１】グルコース検定に使用される酵素試薬
が、液体補酵素試薬並びにグルコースを含有する試験試
料と混合されて、酵素試薬：補酵素試薬：試験試料が容
積比で100:1000:11の割合であって、試験試料中のグル
コース濃度が約10〜約500mg/dlの範囲にあり、その検定
反応混合液中の補酵素が同液中のグルコース濃度に比較
してグルコース検定用としては実質的に過剰に存在し、
かつ反応混合液中のキレート剤濃度が同液中のマグネシ
ウムイオン濃度の約50％より多くなく存在する検定反応
混合液を形成するときに、 グルコース検定の半反応時間が調製当初の同じ検定にお
ける半反応時間の約1.5倍より大きくない時間的な範囲
にある貯蔵寿命を有する酵素試薬である特許請求の範囲
第25項記載のキット。 - 【請求項３２】（ａ）（ｉ）グルコースを含有する試験
試料、 （ii）A.少なくとも約60％（v/v）の水 B.水と混合可能な少なくとも約20〜約40％（v/v）のポ
リオール有機溶媒 C.ヘキソキナーゼ酵素 D.グルコース−６−リン酸脱水素酵素 E.約２℃から約８℃の範囲で貯蔵したとき少なくとも２
年の貯蔵寿命を有するのに十分な少なくとも約0.5mMの
量の金属イオンキレートを含んでなる安定剤系 の各成分を含んではじめに調製された貯蔵寿命の長い均
質液体酵素試薬、並びに （iii）A.少なくとも約80％（v/v）の水 B.水と混合可能な少なくとも５〜20％（v/v）の量のポ
リオール有機溶媒 C.アデノシン三リン酸補酵素 D.ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド補酵素、及
び E.マグネシウムイオン を含んでなる均質補酵素試薬 の各試薬を混合するに際し、酵素試薬からのキレート剤
の量がモル比で補酵素試薬からのマグネシウムイオンの
量の約半分より大きくならないような割合で試薬と試験
試料を混合する段階、及び （ｂ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元物を
測定する段階 の各段階を含んでなるグルコース定量方法。 - 【請求項３３】混合段階が最初に酵素試薬と補酵素試薬
を1:10（v/v）で混合して結合試薬を形成させるに際し
混合試薬中において酵素試薬からのキレート剤の量が補
酵素試薬からのマグネシウムイオンの量の約1/10よりも
多くならないように混合することを含んでなる特許請求
の範囲第32項記載の方法。 - 【請求項３４】キレート剤がエチレンジアミン四酢酸で
ある特許請求の範囲第32項記載の方法。 - 【請求項３５】安定剤系が酸化防止剤をも含む特許請求
の範囲第32項記載の方法。 - 【請求項３６】酸化防止剤が少なくとも2g/の量の牛
の血清アルブミンである特許請求の範囲第35項記載の方
法。 - 【請求項３７】酸化防止剤が少なくとも約2g/の量で
あるポリビニルピロリデン−40及び少なくとも約0.4g/
のＮ−アセチルシステインを含む特許請求の範囲第35
項記載の方法。 - 【請求項３８】安定剤系が微生物コントロール剤をも含
む特許請求の範囲第32項記載の方法。 - 【請求項３９】微生物コントロール剤が少なくとも約0.
25g/の量のアジ化ナトリウムである特許請求の範囲第
38項記載の方法。 - 【請求項４０】ポリオール溶媒がグリセリンであり、酵
素試薬が （ａ）約６〜約80KIU/の量のヘキソキナーゼ酵素、 （ｂ）約３〜約60KIU/の量のグルコース−６−リン酸
脱水素酵素、 （ｃ）約２〜約8g/の量の牛の血清アルブミン、 （ｄ）約0.5〜約5mMの量のエチレンジアミン四酢酸、 （ｅ）約0.25〜約1.0g/の量のアジ化ナトリウム、 （ｆ）約0.05〜約0.2mMの量のトリス−塩酸緩衝剤、 を含んでなり、pHを約7 1/2に調整されたものである特
許請求の範囲第36項記載の方法。 - 【請求項４１】ポリオール溶媒がグリセリンであり、酵
素試薬が （ａ）約６〜約80KIU/の量のヘキソキナーゼ酵素、 （ｂ）約３〜約60KIU/の量のグルコース−６−リン酸
脱水素酵素、 （ｃ）約２〜約8g/の量のポリビニルピロリドン−40
及び約0.4〜約1.6g/の量のＮ−アセチルシステイン、 （ｄ）約0.5〜約5mMの量のエチレンジアミン四酢酸、 （ｅ）約0.25〜約1.0g/の量のアジ化ナトリウム、 （ｆ）約0.05〜約0.2mMの量のトリス−塩酸緩衝剤、 を含んでなり、pHを約7 1/2に調整されたものである特
許請求の範囲第37項記載の方法。 - 【請求項４２】グルコース検定に使用される酵素試薬
が、液体補酵素試薬並びにグルコースを含有する試験試
料と混合されて、酵素試薬：補酵素試薬：試験試料が容
積比で100:1000:11の割合であって、試験試料中のグル
コース濃度が約10〜約500mg/dlの範囲にあり、その検定
反応混合液中の補酵素が同液中のグルコース濃度に比較
してグルコース検定用としては実質的に過剰に存在し、
かつ反応混合液中のキレート剤濃度が同液中のマグネシ
ウムイオン濃度の約50％より多くなく存在する検定反応
混合液を形成するときに、 グルコース検定の終点が約10分より長くない時間内に到
達し得る時間的な範囲にある貯蔵寿命を有する酵素試薬
である特許請求の範囲第40項記載の方法。 - 【請求項４３】ヘキソナーゼが約1.5〜約3.5KIU/の量
であり、グルコース−６−リン酸脱水素酵素が約20〜35
KIU/の量であり、アデノシン三リン酸のグルコースに
対するモル比が反応混合液中で約3:1よりも大きく、ニ
コチンアミドアデノシンジヌクレオチドのグルコースに
対するモル比が5:1よりも大きく、検定の終点が約２分
以内の時間に到達し得るものである特許請求の範囲第42
項記載の方法。 - 【請求項４４】グルコース検定に使用される酵素試薬
が、液体補酵素試薬並びにグルコースを含有する試験試
料と混合されて、酵素試薬：補酵素試薬：試験試料が容
積比で100:1000:11の割合であって、試験試料中のグル
コース濃度が約10〜約500mg/dlの範囲にあり、その検定
反応混合液中の補酵素が同液中のグルコース濃度に比較
してグルコース検定用としては実質的に過剰に存在し、
かつ反応混合液中のキレート剤濃度が同液中のマグネシ
ウムイオン濃度の約50％より多くなく存在する検定反応
混合液を形成するときに、 グルコース検定の終点が約10分より長くない時間内に到
達し得る時間的な範囲にある貯蔵寿命を有する酵素試薬
である特許請求の範囲第41項記載の方法。 - 【請求項４５】ヘキソナーゼが約1.5〜約3.5KIU/の量
であり、グルコース−６−リン酸脱水素酵素が約20〜35
KIU/の量であり、アデノシン三リン酸のグルコースに
対するモル比が反応混合液中で約3:1よりも大きく、ニ
コチンアミドアデノシンジヌクレオチドのグルコースに
対するモル比が5:1よりも大きく、検定の終点が約２分
以内の時間に到達し得るものである特許請求の範囲第44
項記載の方法。 - 【請求項４６】グルコース検定に使用される酵素試薬
が、液体補酵素試薬並びにグルコースを含有する試験試
料と混合されて、酵素試薬：補酵素試薬：試験試料が容
積比で100:1000:11の割合であって、試験試料中のグル
コース濃度が約10〜約500mg/dlの範囲にあり、その検定
反応混合液中の補酵素が同液中のグルコース濃度に比較
してグルコース検定用としては実質的に過剰に存在し、
かつ反応混合液中のキレート剤濃度が同液中のマグネシ
ウムイオン濃度の約50％より多くなく存在する検定反応
混合液を形成するときに、 グルコース検定の半反応時間が調製当初の同じ検定にお
ける半反応時間の約1.5倍より大きくない時間的な範囲
にある貯蔵寿命を有する酵素試薬である特許請求の範囲
第40項記載の方法。 - 【請求項４７】グルコース検定に使用される酵素試薬
が、液体補酵素試薬並びにグルコースを含有する試験試
料と混合されて、酵素試薬：補酵素試薬：試験試料が容
積比で100:1000:11の割合であって、試験試料中のグル
コース濃度が約10〜約500mg/dlの範囲にあり、その検定
反応混合液中の補酵素が同液中のグルコース濃度に比較
してグルコース検定用としては実質的に過剰に存在し、
かつ反応混合液中のキレート剤濃度が同液中のマグネシ
ウムイオン濃度の約50％より多くなく存在する検定反応
混合液を形成するときに、 グルコース検定の半反応時間が調製当初の同じ検定にお
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第41項記載の方法。
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