JPH0534960B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は、生体液中のクレアチンキナーゼ（以
下CKと略記する。）の定量用試薬に関するもので
ある。

「従来の技術」 CKは、全身の筋組織及び脳に存在し、臨床検
査の領域においてCK活性の測定は、筋疾患、神
経性疾患、中枢神経系疾患、精神病、心疾患など
の診断に日常的に測定されている重要な項目の一
つである。

CKは、(1)式の左右両方向の反応を触媒する酵
素である。

CP＋ADPCK ――→ ←―― ＋ATP ……(1) （略号は、CP：クレアチンリン酸、Ｃ：クレ
アチン、ADP：アデノシン二リン酸、ATP：ア
デノシン三リン酸である。） 従来から、種々のCK測定法が提案されてきた。
その一つは、(1)式の左方向の活性を測定するとい
う方法で、これらの中にはCPの加水分解で生
ずる無機リン酸を測定する方法、ADPをピル
ビン酸キナーゼ（以下PKと略記する。）と乳酸脱
水素酵素（以下LDHと略記する。）の作用で還元
型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（以下NADHと略記する。）に導き、吸収減少と
して測定する方法、ADPをPKでピルビン酸に
導き、次いで２，４−ジニトロフエニルヒドラジ
ンとの反応で生成したヒドラゾンを測定する方法
などがある。また、(1)式の右方向の活性を測定す
る方法には、生成したＣを色素と反応させて比
色する、あるいは螢光を測定する方法、ルシフ
エラーゼを用いる方法（特開昭51−41597号公報、
特開昭55−120796号公報、特開昭56−26200号公
報、特開昭57−105199号公報参照。）、ホスホグ
リセリン酸キナーゼ（以下PGKと略記する。）と
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナー
ゼ（以下GAPDHと略記する。）を用いる方法
（特公昭59−34119号公報、特開昭56−155000号公
報参照。）ヘキソキナーゼ（以下HKと略記す
る。）とグルコース−６−リン酸脱水素酵素（以
下G6PDHと略記する。）を用いる方法などがあ
る。のHK／G6PDH法は原理的に最も優れ、
感度、再現性も良いこと、及び多数検体処理も可
能なことから最も多用されている。

ところで、CKは不安定な酵素で、通常その活
性値測定に際してはCK活性の賦活効果を高める
ため、活性賦活剤としてＮ−アセチルシステイン
（以後NACと略記する。）、ジチオスレイトール、
グルタチオン、メルカプトエタノールなどの、い
わゆるSH基含有化合物（以後SH試薬と略記す
る。）が用いられており、その中でも特にNACが
好ましいとされている（J.Clin.Chem.Clin.
Biochem Vol.15，p249〜254，1977参照）。また
CKの作用する反応に際して最も好ましく用いら
れる二価イオンはマグネシウムイオンである。ち
なみに、文献値として(1)式におけるCKの作用す
る反応においてマグネシウムイオンに関するKm値
は、30℃左方向の反応に関してはMg６×
10^-4M、右方向の反応についてはMg６×
10^-3Mとされている（臨床検査Vol.15，No.12
p1257，1971）。このようにCKの作用する反応で
主たる成分以外にNAC及びマグネシウムイオン
はその好ましい実施のためには同時に不可欠の要
素とされている。

「発明が解決しようとする問題点」 従来からCK測定用試薬は溶液状態での室温保
存安定性が乏しく、特に室温（18〜37℃）での寿
命は非常に短いという欠点を有していた。従つ
て、試薬の調製後短時間のうちに使用しなくては
ならず、比較的長時間にわたる多検体処理、都度
の試薬調製による効率の悪さ、あるいは不定期に
緊急性の高い少数検体を測定する緊急用自動分析
装置に使用する場合には不適当であつた。特に
NACを含有せしめると、CK活性の賦活効果を高
めるが、NACは比較的不安定な試薬であるため、
溶液状態ではSH基が徐々に酸化されてCK活性賦
活剤としての効果が長時間持続できなくなる。さ
らにNACの分解物はCK活性を阻害するという報
告もあり（CLIN.CHEM.Vol22，No.５，p650〜
656，1976号参照。）、活性賦活効果の減少とあわ
せてCK測定用試薬の溶液状態における不安定性
の大きな原因となつている。

NACが不安定であるために生じる具体的現象
は、例えば血清希釈テストの際に顕著にあらわれ
る。すなわち、試薬調製後の日数と共に、血清希
釈テストから得られる検量線の傾きが徐々にゆる
やかになる。即ち感度が低下するという現象が観
察される。このような現象は明らかに臨床検査に
おける精度管理上の大きな問題である。

一方、NACはエチレンジアミン四酢酸（以下
EDTAと略記する）などのキレート剤によつて
安定化されるという報告があり、25℃における
NACの保存テストでは７日間位は安定であると
されている。しかしながら、そのような対策をほ
どこしてもNACに由来する微量のCK活性に対す
る阻害因子の生成が避けられず、実際にこのよう
なCK定量用試薬を用いて得られるCK活性値は、
調製した試薬を25℃に保存した場合、２日間位は
同じであるがその後は極端に低下する。即ち、
NACのEDTAによる安定化効果は未だ実用的レ
ベルに達しないと言わざるを得ない。（CLIN.
CHEM.Vol.25，No.３，1979参照） 本発明者らはこのような問題点を解決すべく鋭
意研究を重ねた結果、NACとEDTAを共存させ
る場合に、CK活性測定の際必要であるマグネシ
ウム塩類をNACとEDTAを含む試薬群とは別の
試薬群に含ませることによりEDTAのNACに対
する安定化効果が飛躍的に向上することを見出
し、本発明を完成するに至つた。

「問題点を解決するための手段」 以下CK測定のための具体的な反応系に例をと
つて本発明を説明すると反応式(1)，(2)，(3)の場合
において CP＋ADPクレアチンキナーゼ ―――――――――→ （Mg²⁺）Ｃ＋ATP ……(1) ATP＋グルコースＫ ――――――→ （Mg²⁺）ADP＋Ｇ−６−Ｐ ……(2) Ｇ−６−Ｐ−NAD(P)G6PDH ―――――――→ ６−PGA＋NAD(P)Ｈ ……(3) （上記略号のうち、Ｇ−６−Ｐはグルコース−
６−リン酸、NAD(P)はβ−ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（リン酸）、NAD(P)Ｈは還元
型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（リン酸）、６−PGAは６−ホスホグルコン酸で
ある。） この反応系に基づくクレアチンキナーゼ定量測
定法に用いられる少くともCP、ADP、グルコー
ス、HK又はGluk、NAD(P)、G6PDH、マグネシ
ウム塩類、NAC及びEDTAを必須成分とする試
薬において、NACとEDTAを含む試薬群とマグ
ネシウム塩類を含む試薬群で構成若しくは調製さ
れることを特徴とするクレアチンキナーゼ定量用
試薬に関するものである。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の試薬は例えばCP、ADP、グルコー
ス、HK、NAD(P)、G6PDHが反応に関与する主
成分であり、その他通常では賦活剤としてNAC
が含まれ、更にEDTA、マグネシウム塩類が含
まれているが、この場合NAC、EDTAを含む試
薬群とマグネシウム塩類を含む試薬群とに分ける
必要がある。

本発明はCK測定法として反応式(2)以下の反応
の種類によらず、CK反応の反応式(1)にかかわる
添加物であるNAC、EDTA及びマグネシウム塩
類をNAC、EDTMを含む試薬群とマグネシウム
を含む試薬群に分けて構成若しくは調製すること
により成立するものである。

通常これら２つの試薬群に分けることが実用上
測定機器への適合性等の面からも便利であるが、
場合によつてはNACとEDTAを含む試薬群とマ
グネシウム塩類を含む試薬群の他に適当な試薬を
分離若しくは追加して測定用試薬を構成すること
も可能である。

また反応式(1)，(2)，(3)による場合ADP、グル
コース、HKまたはGluk、NAD(P)、G6PDH、
NAC、EDTAなどから成る試薬群とCP、マグネ
シウム塩類などから成る試薬群とに分けて実施す
ることが好ましい。

通常NAC、EDTAは反応に必要な主成分を含
む第一の試薬群に、マグネシウム塩類はCKの基
質と共に第二の試薬群に分けて構成若しくは調製
されることが多い。第一の試薬群による第一反応
液中で検体のCKの賦活が行なわれ、次に第二の
試薬群による第二反応液で基質が加わり実際の
CKの測定がスタートされる。

また、CKの測定を測定の当初から反応液を一
液で使用する一液法においては、その使用直前に
上記の第１反応液と第二反応液を適当な割合に混
合して用いることができる。なお、NAC、
EDTAを含む試薬群にマグネシウムイオンを完
全に除くことは現実には不可避であるが、微量の
マグネシウムイオンの存在は本発明の効果に影響
を及ぼさない。マグネシウム塩類としては塩化マ
グネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウ
ムなど通常のものを使用することが可能である
が、その中でも特に酢酸マグネシウムが好まし
い。

NACの濃度としては0.1〜100mMが適当であ
り、0.5〜50mM、特に1.0〜30mMが好ましい。
またEDTMの濃度としては0.01〜30mMが適当で
あり、0.1〜15mM、特に0.5〜10mMが好ましい。

マグネシウム塩類の濃度としては0.1〜100mM
が適当であり、１〜50mM、特に５〜30mMが最
も好ましい。

「実施例」 次に、本発明を実施例により具体的に説明す
る。

実施例１，比較例１ バチルスステアロサーモフイルス由来のGluk
（生化学工業株式会社製グルコキナーゼ120387）
3u／ml、ロイコノストツクメセンテロイデス由
来のG6PDH（オリエンタル酵母株式会社より購
入）1u／ml、ADP二カリウム塩2mM、NADP・
ナトリウム塩2.5mM、グルコース25mM、
AMP6mM、Ap5A10μM、NAC25mM、
EDTA2.5mM、アジ化ナトリウム0.1％、イミダ
ゾール−酢酸緩衝液（PH6.7）150mMから成る試
薬群とCP125mM、酢酸マグネシウム50mMから
成る試薬群を調製し、各々第一、第二試薬とし
た。サンプルとしては市販のウサギ筋肉由来の
CK約2000u／を原液とし、これを蒸留水によ
つて希釈した希釈系列を使用した。

これら希釈系列を測定し、測定値と希釈倍率を
プロツトするいわゆる希釈テストを調製直後の試
薬と、28日前にあらかじめ調製し４℃に保存して
おいた試薬の２つの試薬を用いて行つた。（実施
例１） 比較のため第一試薬中に酢酸マグネシウム
12.5mMを含み、第二試薬としてはCP125mMの
みである試薬を調製し、他の条件はすべて実施例
１と同様なテストを行つた。（比較例１）。

CK活性の測定は上記各第一試薬を2.4mlと各サ
ンプル20μを光路長１cmのセルに入れ37℃に３
分間保温した後上記各第二試薬0.6mlを添加し、
セル室を同じく37℃に保温した分光光度計にて
340nmの吸光度変化により求めた。

その結果を第１図、第２図示す。このように実
施例１（第１図）においては希釈テストの傾斜は
まつたく変化がなかつたが、比較例１第２図にお
いては傾斜がゆるやかになつており、明らかに感
度の低下が認められた。

さらに比較例１において４℃28日間の保存中に
劣化した試薬を補充して再度希釈テストを行つた
が感度の回復は認められなかつた。このことは感
度低下の原因が試薬の劣化にともなうものでな
く、明らかにCK活性への阻害因子の生成である
ことを示唆するものである。

（参考例） NAC25mM、イミダゾール−酢酸（PH6.7）
150mMの溶液を調製し、EDTA、酢酸マグネシ
ウムを単独あるいは両方添加してNACの安定性
に対する影響を調べた。上記各溶液を37℃に保存
し、通常のSH基測定方法を利用して経日的に
NACの定量を行つた。

その結果を第３図に示すように、NACは
EDTAによつてある程度安定化されるが、酢酸
マグネシウムを共存させない場合にさらにその安
定化効果が大きいことが判明した。

「発明の効果」 本発明のCK定量用試薬はNACとEDTAを共存
させ、しかもマグネシウム塩類を共存させないこ
とによつてCKの活性賦活剤であるNACの安定化
を可能にし、賦活効果を長時間持続させることと
共に、CK活性を阻害するNACの分解物の生成を
抑制することができる。そのため、本発明のCK
測定用試薬は溶液状態でも長時間使用することが
可能となり、一度に大量の試薬を調整しておくこ
とができる。このことにより、緊急検査にも迅速
に対応することができると共に作業効率の改善、
余剰試薬廃棄の頻度の減少などが可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明にかかる試薬の安定性を示すグ
ラフ図であり、第２図はNACをマグネシウム塩
と共存させた試薬の安定性を示すグラフ図であ
り、第３図はNACの共存化合物による安定性の
経時変化を示すグラフ図である。 ａ…調製直後の本発明試薬、ｂ…28日前調製の
本発明試薬、ｃ…調製直後の比較例試薬、ｄ…28
日前調製の比較例試薬、ｅ…EDTA含有試薬、
ｆ…EDTA、酢酸マグネシウム含有試薬、ｇ…
NAC単独試薬。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 反応式(1) クレアチンリン酸＋ADPクレアチンキナーゼ ――――――――――――→ ←―――――――――――― （Mg²⁺）クレアチン＋ATP ……(1) に基づき、マグネシウム塩類の存在下賦活剤とし
   てＮ−アセチルシステインを用いて実施されるク
   レアチンキナーゼ測定用試薬において、少なくと
   もＮ−アセチルシステイン及びエチレンジアミン
   四酢酸塩を含む試薬群とマグネシウムを含む試薬
   群に分けて構成若しくは調製することを特徴とす
   るクレアチンキナーゼ測定用試薬。 （上記略号のうちADPはアデノシン二リン酸、
   ATPはアデノシン三リン酸） ２ クレアチンキナーゼ測定法が反応式(1)に基づ
   き生成するATPを酵素的測定法により行なわれ
   るところの特許請求の範囲第１項記載のクレアチ
   ンキナーゼ測定用試薬。 ３ クレアチンキナーゼ測定法が反応式(1)，(2)，
   (3) クレアチンリン酸＋ADPクレアチンキナーゼ ――――――――――――→ （Mg²⁺）クレアチン＋ATP ……(1) ATP＋グルコースHK（あるいはGluk） ――――――――――――→ （Mg²⁺）ADP＋Ｇ−６−Ｐ ……(2) Ｇ−６−Ｐ＋NAD――――→６−PGA＋NAD
   (P)Ｈ ……(3) ［上記略号のうち、HKはヘキソキナーゼ、
   Glukはグルコキナーゼ、Ｇ−６−Ｐ−グルコー
   ス−６−リン酸、NAD(P)はβ−ニコチンアミド
   アデニンジヌクレオチド（リン酸）、NAD(P)Ｈは
   還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
   ド（リン酸）、６−PGAは６−ホスホグルコン酸
   である。］ に基づきクレアチンリン酸、ADP、グルコース、
   HK又はGluk、NAD(P)、G6PDH、マグネシウム
   塩類、Ｎ−アセチルシステイン及びエチレンジア
   ミン四酢酸を必須成分とする特許請求の範囲第１
   項に記載のクレアチンキナーゼ測定用試薬。 ４ クレアチンキナーゼ測定法が反応式(1)，(2)，
   (3)に基づき、少なくともADP、グルコース、
   HK／またはGluk、NAD(P)、G6PDH、Ｎ−アセ
   チルシステイン、エチレンジアミン四酢酸塩を必
   須成分とする試薬群及びクレアチンリン酸、マグ
   ネシウム塩類を必須成分とする試薬群に分けて構
   成若しくは調製することを特徴とする特許請求の
   範囲第１項に記載のクレアチンキナーゼ測定用試
   薬。