DE2648759C3 - Stabilisierungsmittel für Enzyme - Google Patents

Stabilisierungsmittel für Enzyme

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Description

Die Erfindung betrifft ein Stabilisierungsmittel für Enzyme, insbesondere für Enzyme, die zur Aktivierung organische Sulfhydrylverbindungen benötigen.
Es ist bekannt, daß Enzympräparationen, wie z. B. enzymhaltige Reagentien für die klinische Analyse oder die Lebensmittelanalyse, standardisierte Testpräparate, lösliche Enzympräparate für katalytische, präparative Zwecke und dergleichen, stabilisiert werden müssen gegen Verlust an enzymatischer Aktivität Als Stabilisierungsmittel für diese Zwecke haben sich dabei enzymatisch inaktive Proteinpräparationen besonders bewährt. Insbesondere Albumine wie Rinderserumalbumin werden aus diesem Grunde in großem Umfang den genannten enzymhaltigen Präparaten als Stabilisierungsmittel und Schutzkolloid für die Enzyme zugesetzt.
Diese Stabilisierungsmittel auf Proteinbasis sind jedoch gegen Denaturierung empfindlich und können zur Bildung von höchst unerwünschten Trübungen führen, welche insbesondere dann störend sind, wenn in der die Enzyme enthaltenden Lösung optische Messungen durchgeführt werden sollen. Dies ist beispielsweise regelmäßig bei analytischen Reagenszusammensetzungen der Fall, bei denen die Meßreaktion photometrisch, nephelometrisch oder nach anderen optischen Methoden verfolgt wird.
Die genannte Schwierigkeit tritt insbesondere dann auf, wenn die zu stabilisierende Enzympräparation organische Sulfhydrylverbindungen enthält. Derartige Sulfhydrylverbindungen (SH-Verbindungen) werden von vielen Enzymen zur Aktivierung benötigt. Weiter werden derartige SH-Verbindungen häufig bei kombinierten Präparaten als Stabilisatoren, insbesondere als Oxydationsschutzmittel zugesetzt, und zwar sowohl für manche Enzyme wie auch für andere, nichtproteinische Substanzen, die gegen Oxydation empfindlich sind. Derartige SH-Verbindungen führen jedoch häufig zu einer Denaturierung der als Stabilisierungsmittel zugesetzten, enzymatisch inaktiven Proteine, wie z. B. von Serumalbumin. Diese Denaturierung führt dann zum Auftreten der oben beschriebenen Trübungen.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Stabilisierungsmittel für Enzyme /u finden, welches hinsichtlich seiner stabilisierenden Wirksamkeit den bisher gebräuchlichen Stabilisatoren auf Basis natürlicher Proteine gleichkommt, unter den bei enzymatischen Präparationen auftretenden Bedingungen jedoch keine Neigung zur Bildung von Trübungen aufweist. Insbesondere ist es ein Ziel der F.rfindung, ein derartiges Stabilisierungsmittel zu schaffen, welches gegenüber SH-Verbindungen stabil ist und nicht zu Ausfällungen führt
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch
ein Stabilisierungsmittel für Enzyme, welches dadurch
■> gekennzeichnet ist, daß es eine dialysierte und anschließend lyophilisierte Oxypolygelatine in einer zur
Stabilisierung ausreichenden Menge enthält
Oxypolygelatine ist bekannt und im Handel erhältlich. Sie läßt sich erhalten durch hydrolytischen Abbau von κι Gelatine, Umsetzung der Abbauprodukte mit Glyoxal und Oxydation des Umsetzungsproduktes mit einem Oxydationsmittel wie H2O2. Das mittlere Molekulargewicht einer für die erfindungsgemäßen Zwecke verwendeten Oxypolygelatine liegt vorzugsweise zwii<i sehen 10 000 und 50 000.
Das erfindungsgemäße Stabilisierungsmittel kann auch andere bekannte Stabilisierungsmittel enthalten, also nur Bestandteil eines komplexen Stabilisierungsmittels sein. Seine stabilisierende Wirksamkeit ent-2» spricht mindestens der der bisher verwendeten Stabilisierungsmittel auf Basis nativer Proteine. Dabei bezieht sich dies auf Gewichtsbasis, d. h, die im Anspruch 1 angegebene Oxypolygelatine wird zur Erzielung gleicher Stabilisierungswirkung in gleicher Menge verwendet, wie native stabilisierende Proteine, beispielsweise Serumalbumin. Man kann daher in existierenden enzymhaltigen Präparaten, welche bisher durch native Proteine stabilisiert wurden, letztere durch eine gleiche Gewichtsmenge Oxypolygelatine ersetzen, um die ίο Vorteile der Erfindung zu erhalten.
Das erfindungsgemäße Stabilisierungsmittel eignet sich nicht nur zur Stabilisierung von durch SH-Verbindungen aktivierten Enzymen, sondern auch für andere Enzyme. Beispiele für erfindungsgemäß stabilisierbare Γι Enzyme sind
Hexokinase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase, KreatinMnase, Lactat- Dehydrogenase, Malat-Dehydrogenase, Glutamat-Dehydrogenase, Alkohol-Dehydrogenase, Aldolase,
4» Trioseisomerase, Diaphorase.
Beispiel I
Yi Eine Reagentienlösung der nachstehend angegebenen Zusammensetzung A wurde zu je 1,00 ml in Flaschen abgefüllt und die Lösung lyophilisiert. Das Lyophilisat wurde 3 Wochen bei +330C gelagert. Nach dieser Zeit wurde zur Bestimmung der Stabilität der
">o Hexokinase (HK) und Glucose-b-phosphat-dehydrogenase (G6P-DH), der Funktion (Wiederfindung der Kreatinkinase-Aktivität [CK] im Kontrollserum) sowie der Trübung das Lyophilisat mit je 2,5 ml einer Pufferlösung der Zusammensetzung B aufgelöst und die
Vi entsprechenden Tests durchgeführt.
Reagentienlösung A:
220 mg Adenosindiphosphosäure
653 mg Adenosinmonophosphat-Na.2
w) 445 mg Nicotinamidadenin-dinucleotid-
phosphat-Na2
2887 mg Creatinphosphat Na. -6 H)C
8,5 mg N-Acetylcystein
880U Hexokinase
ir, 45OU G6P-DH
ohne Zusatz oder mit 2,0 mg Oxypolygelatine dialysiert und lyophilisiert oder mit 2,0 mg Scrumalbiimin vom Kind.
Diese Substanzen wurden in 100 ml Wasser gelöst, die Lösung zu je 1,0 ml abgefüllt und lyophilisiert
Pufferlösung B Imidazo]
496 mg Glucose H2O
288 mg Magnesiumacetat 4 H2O
156 mg EDTA
82 mg Essigsäure ad pH 6,7 bidesL
q.s. Wasser ad 70 ml
Typisch zur Aktivierung oder Oxydationsinhibierung verwendete SH-Verbindungen sind: Derivate von Cystein und Homocystein:
N-Guanyl-L-cystein N-Guanyl-DL-isocystein N-Acetyl-S-Guanyl-L-cystein N-Acetyl-S-benzyl-L-cystein N.S-Diguanyl-L-cystein S-Carbamoyl-L-cystein S-Carboxymethyl-L-cystein S-Guanyl-L-cysteinhydantoin S-Acetylguanyl-DL-cysteinazlacton
2-Imino-L-cysteinhydantoin
N-Acetyl-DL-homocysteinthiolacton DL-Homocysteinthiolacton
L-Cystein
L-Cysteinmethylester
s L-Cysteinäthylester
N-Acetyl-L-cystein
N-Acetyl-DL-Isocystein Als HS-haltiges Peptid (Tripeptid):
reduz. Glutathion ίο Thioalkohole einschließlich Mercaptane:
13 Dimercapto-2-propanol
23 Dimercapto-1-propanol
1,2 Dimercapto-äthan
Dithiothreit Dithioerythrit
Mercaptoäthanol Als Thiosäure:
Thioglycolsäure
L-Thiazolidin-4-ca; bonsäure sowie:
Aminoäthylisothiouroniumbromid
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
1. Messung der Aktivität von Hexokinase und G6P-DH (in U/Flasche)
Ohne Stabilisierungsmittel
HK G6P-DH
Mit OPO
HK G6P-DH
Mit Albumin
HK G6P-DH
Anfangswert vor Lyophilisation 8,9 4,4 83 4,5 83 4,5
Nach3W/33°C 0,1 0,05 6,9 4,0 6,7 4,2
2. Wiederfindung der CK-Aktivität im Kontrollserum (in % des Sollwertes)
Ohne Stabili- Mit OPG Mit sierungsmittel Albumin
Anfangswert vor 97% 99% 97%
Lyophilisation
Nach3W/33°C 5% 96% 95%
3. Messung der Trübung im aufgelösten Lyophilisat bei 546 nm
Ohne Stabili- Mit OPG sierungsmittel
Anfangswert
vor Lyophilisation
Nach J W/3J"C
0,125
0,128
0,135 0,138
Mit Albumin
0,330
1,235
Die oben wiedergegebenen Vergleichsversuchswerte zeigen, daß ohne Zusatz eines Stabilisierungsmittels eine sehr rasche Inaktivierung der Enzyme erfolgt Mit Zusatz des bekannten Stabilisierungsmittels Serumalbumin lassen sich zwar die Enzyme gut stabilisieren, es entsteht jedoch eine starke Trübung aufgrund einer Denaturierung des Stabilisierungsmittels, die im opti schen Test eine sehr hohe Anfangsextinktion hervorruft. Aufgrund dieser hohen Anfangsextinktion können mit herkömmlichen Photometern keine exakten Werte mehr gemessen werden.
Bei Zusatz des erfindungsgemäßen Stabilisierungsmittels hingegen ist sowohl die Aktivitätserhaltung auch bei der beschleunigten Alterung bei erhöhter Temperatur sehr gut, als auch ein völliges Fehlen von Trübungen, die durch das Stabilisierungsmittel bedingt sind, feststellbar.

Claims (3)

Patentansprüche:
1. Stabilisierungsmittel für Enzyme, dadurch gekennzeichnet, daß es eine dialysierte und anschließend lyophilis.erte Oxypolygelatine in einer zur Stabilisierung ausreichenden Menge enthält
2. Verfahren zur Herstellung des Stabilisierungsmittels nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß handelsübliche Oxypoiygelatine durch Dialyse von niedermolekularen Bestandteilen befreit und dann lyophilisiert wird.
3. Verwendung des Mittels von Anspruch 1 zur Stabilisierung von Enzymen in Gegenwart von organischen Sulfhydrylverbindungen.
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