JPS62104598A - クレアチンキナ−ゼ測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は、生体液中のクレアチンキナーゼ（以下ＣＫと
略記する。）の定量用試薬に関するものである。

「従来の技術」 ＣＫは、全身の筋組織及び脳に存在し、臨床検査の領域
においてＣＫ活性の測定は、筋疾患、神経性疾患、中枢
神経系疾患、精神病、心疾患などの診断に日常的に測定
されている重要な項目の一つである。

ＣＫは、（１）式の左右両方向の反応を触媒する酵素で
ある。

ＣＫ ＣＰ＋ＡＤＰぞ＝吐Ｃ＋　ＡＴＰ　　　　　　　・・・
・・・　（１）（略号は、ＣＰ：クレアチンリン酸、　
Ｃ：クレアチン、　ＡＤＰ　：アデノシンニリン醗、Ａ
ｒｐ：アデノシン三すン醗でおる。） 従来から、糧々のＣＫ測定法が提案されてきた。

その一つは、（１）式の左方向の活性を測定するという
方法で、これらの中には■ＣＰの加水分解で生ずる無機
リン酸を測定する方法、■ＡＤＰ　ｆｔピルビン酸キナ
ーゼ（以下ＰＫと略記する。〕と乳酸脱水素酵素（以下
ＬＤＩ（と略記する。）の作用で還元型β−ニコチンア
ミドアデニンゾヌクレオチド（以下ＮＡＤＨと略記する
。）に導き、吸収減少として測定する方法、■ＡＤＰを
ＰＫでピルビン酸に導キ、次いで２，４−ノニトロフェ
ニルヒドラゾンとの反応で生成したヒドラゾンを測定す
る方法などがある。また、（１）式の右方向の活性を測
定する方法には、■生成し九Ｃを色素と反応させて比色
する、あるいは螢光を測定する方法、■ルシフェラーゼ
を用いる方法（特開昭５１−４１５９７号公報、特開昭
５５−１２０７９６号公報、特開昭５６−２６２００号
公報、特開昭５７−１０５１９９号公報参照。）、■ホ
スホグリセリン酸キナーゼ（以下ＰＧＫと略記する。〕
と〕グリセルアルデヒドー３−リン酸デヒドロｒナーゼ
以下ＧＡＰＤＨと略記する。〕を用いる方法（特公昭５
９−３４１１９号公報、特開昭５６−１５５０００号公
報参照。〕■ヘキソキナーゼ（以下Ｅ（Ｋと略記する。

〕と〕グルコースー６−リン酸脱水素酢素以下Ｇ６ＰＤ
Ｈと略記するっ　）を用いる方法などがある。■のＨＫ
／Ｇ６ＰＤＨ法は原理的に最も優れ、感度、再現性も良
いこと、及び多数検体処理も可能なことから最も多用さ
れている。

ところで、ＣＫは不安定な酵素で、通常その活性値測定
に際してはＣＫ活性の賦活効果を高めるため、活性賦活
剤としてＮ−アセチルシステイン（以後ＮＡＣと略記す
る。）、ジチオスレイトール、グルタチオン、メルカプ
トエタノールなどの、−わゆるＳＨ基含有化合物（以後
ＳＨ試薬と略記する。）が用のられており、その中でも
特にＮＡＣが好ましいとされている（　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ
、　Ｃｈｅｍ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｂｉｏｃｈ＠ｍ　Ｖｏｌ、　１５　ｔ　ｐ２４９〜２５
４　ｅ　１９７７参照）。

またＣＫの作用する反応に際して最も好ましく用いられ
る二価イオンはマグネシウムイオンである。

ちなみに、文献値として（１）式におけるＣＫの作用す
る反応においてマグネシウムイオンに関するｋｍ値は、
３０℃左方向の反応に関してはＭｇ″６Ｘ１０”Ｍ、右
方向の反応についてはＭｇ”６Ｘ１０−３Ｍとされてい
る（臨床検査Ｖｏ１．１５，４１２　　ｐ１２５７，１
９７１）。

このようにＣＫの作用する反応で主たる成分以外にＮＡ
Ｃ及びマグネシウムイオンはその好ましい実施のために
は同時に不可欠め要素とされている。

「発明が解決しようとする間眺点」 従来からＣＫ測定用試薬は溶液状態での室温保存安定性
が乏しく、特に室温〔１８〜ｂの寿命は非常に短いとい
う欠点を有していた。従って、試薬の調製後短時間のう
ちに使用しなくてはならず、比較的長時間にわたる多検
体処理、都度の試薬調製による効率の悪さ、あるいは不
定期に緊急性の高い少数検体を測定する緊急用自動分析
装置に使角する場合には不適当であった。特にＮＡＣを
含有せしめると、ＣＫ活性の賦活効果を高めるが、ＮＡ
Ｃは比較的不安定な試薬であるため、溶液状態ではＳＨ
基が徐々に酸化されてＣＫ活性賦活剤としての効果が長
時間持続できなくなる。

さらにＮＡＣの分解物はＣＫ活性を阻害するという報告
もあり（ＣＬＩＮ、　ＣＨｇＷｉ、　Ｖｏｌ　２２　、
Ａ５　、　ｐ６５０〜６５６．１９７６参照。）、活性
賦活効果の減少とあわせてＣＫ測定用試薬の溶液状態に
おける不安定性の大きな原因となっている。

ＮＡＣが不安定であるために生じる具体的現象は、例え
ば血清希釈テストの際に顕著にあられれる。

すなわち、試薬調製後の日数と共に、血清希釈テストか
ら得られる検量線の傾きが徐々にゆるやかになる。即ち
感度が低下するという現象が観察される。このような現
象は明らかに臨床検査における精度管理上の大きな問題
である。

一方、ＮＡＣはエチレンシアミン四酢酸（以下ＥＤＴＡ
と略記する）などのキレート剤によりて安定化されると
いう報告があり、２５℃におけるＮＡＣの保存テストで
は７日間位は安定であるとされている。しかしながら、
そのような対策をほどこしてもＮＡＣに由来する微量の
ＣＫ活性に対する阻害因子の生成が避けられず、実際に
このようなＣＫ定量用試薬を用−て得られるＣＫ活性値
は、調製した試薬を２５℃に保存した場合、２日間位は
同じであるがその後は極端に低下する。即ち、ＮＡＣＯ
ＥＤＴＡによる安定化効果は未だ実用的レベルに達しな
いと言わざるを得ない。（ＣＬＩＮ、　ＣＨＥＭ、　Ｖ
ｏ　１　。

２５、Ａ３，１９７９参照〕 本発明者らはこのような問題点を解決すべく鋭意研究を
重ねた結果、ＮＡＣとＥＤＴＡを共存させる場合に、Ｃ
Ｋ活性測定の際必要であるマグネシウム塩類なＮＡＣと
ＥＤＴＡを含む試薬群とは別の試薬群に含ませることに
よ、９　ＥＤＴＡのＮＡＣに対する安定化効果が飛躍的
に向上することを見出し、本発明を完成するに至った。

「問題点を解決するための手段」 以下ＣＫ測測定ための具体的な反応系に例をとって本発
明を説明すると反応式（ｔ）　ｔ　（２）　ｅ　（３）
の場合において ６ＰＤＨ Ｇ−６−Ｐ＋ＮＡＤ（Ｐ）＋６−ＰＧＡ＋ＮＡＤ（Ｐ）
Ｈ・・・・・・（３） （上記略号のうち、Ｇ−６−Ｐはグルコース−６＝リン
酸、　ＮＡＤ（Ｐ）はβ−ニコチンアミドアデニン・ジ
ヌクレオチド（リン酸）　、　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは還元型
β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸〕
、６−ＰＧＡは６−ホスホグルコン酸で６る。）この反
応系に基づくクレアチンキナーゼ定量測定法に用いられ
る少くともＣＰ、ＡＤＰ、グルコース、Ｉ（Ｋ又はＧｌ
ｕｋ　、　ＮＡＤ（Ｐ）、Ｇ６ＰＤＨ，マグネシウム塩
類、ＮＡＣ及びＥＤＴＡを必須成分とする試薬において
、ＮＡＣとＥＤＴＡを含む試薬群とマグネシウム塩類を
含む試薬群で構成若しくは調製されることを特徴とする
クレアチンキナーゼ定量用試薬に関するものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明の試薬は例えばＣＰ％ＡＤＰ　、グルコース、Ｈ
Ｋ　、　ＮＡＤ（Ｐ）、Ｇ６ＰＤＨが反応に関与する主
成分であり、その他通常では賦活剤としてＮＡＣ、Ｅ：
ＤＴＡ、マグネシウム塩類が含まれているが、この場合
ＮＡＣ，ＥＤＴＡを含む試薬群とマグネシウム塩類を含
む試薬群とに分ける必要がある。

本発明はＣＫ測定法として反応式（２）以下の反応の種
類によらず、ＣＫ反応の反応式（１）にかかわる添加物
であるＮＡＣ％ＥＤＴＡ及びマグネシウム塩類なＮＡＣ
，ＥＤＴＡを含む試薬群とマグネシウムを含む試薬群に
分けて構成若しくは調製することにより成立するもので
ある。

通常これら２つの試薬群に分けることが実用上測定機器
への適合性等の面からも便利であるが、場合によっては
ＮＡＣとＥＤＴＡを含む試薬群とマグネシウム塩類を含
む試薬群の他に適当な試薬を分離若しくは追加して測定
用試薬を構成することも可能である。

また反応式（１）　、　（２）　？　（３）による場合
ＡＩ）Ｐ、グルコース、Ｉ（ＫまたはＧｌｕｋ　、　Ｎ
ＡＤ（Ｐ）、Ｇ６ＰＤＨ，ＮＡＣ。

ＥＤＴＡなどから成る試薬群とＣＰ、マグネシウム塩類
などから成る試薬群とに分けて実施することが好ましい
。

通常ＮＡＣ，Ｆ：、ＤＴＡは反応に必要な主成分を含む
第一の試薬群に、マグネシウム塩類はＣＫの基質と共に
第二の試薬群に分けて構成若しくは調製されることが多
い。第一の試薬群による第一反応液中で検体のＣＫの賦
活が行なわれ、次に第二の試薬群による第二反応液で基
質が加わり実際のＣＫの測定がスタートされる。

また、ＣＫの測定を測定の当初から反応液を一族で使用
する一液法においては、その使用直前に上記の第一反応
液と第二反応液を適当な割合に混合して用いることがで
きる。なお、　ＮＡＣ％ＥＤＴＡを含む試薬群にマグネ
シウムイオンを完全に除くことは現実には不可避である
が、根跡程度のマグネシウムイオンの存在は本発明の効
果に影響を及ぼさない、の点からマグネシウム塩類とし
ては塩化マグネシウム、硫醒マグネシウム、酢酸マグネ
シウムなど通常のものを使用することが可能であるが、
その中でも特に酢酸マグネシウムが好ましい。

ＮＡＣの濃度としては０．１〜１００ｍＭが適当であり
、０．５〜５０ｍＭ、特に１．０〜３０ｍＭが好ましい
。

またＥＤＴＡの濃度としては０．０１〜３０　ｍＭ　　
が適当であり、０．１〜１５　ｍＭ、特に０．５〜１０
ｍＭが好ましい。

マグネシウム塩類の濃度としては０．１〜１００ｍＭが
適当であり、１〜５０　ｍＭ　、　％　Ｉｃ　５〜３０
　ｍＭが最も好まじり。

「実施例」 次に、本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例１．比較例１ ペーカーズイースト由来のＨＫ（オリエンタル酵母株式
会社より購入）３ｕ／ＩｒＬｌ、ロイコノスト。

クメセンテロイデス由来のＧ６ＰＤＨ（オリエンタル酵
母株式会社より購入）　１　ｕ　７ｍ１．ＡＤＰニカリ
ウム塩２　ｍＭ　、　ＮＡＤＰ−ナトリウム塩２．５　
ｍＭ　、グルコース２５　ｍＭ　、　ＡＭＰ　６　ｍＭ
　、　Ａｐ５Ａ　１０　μＭ、　ＮＡＣ２５ｍＭ　、　
ｇＤＴＡ　２．５　ｍＭ　、アゾ化ナトリウム０．１％
、イミダゾール−酢酸緩衝液（ｐＨ６，７）　１５０ｍ
Ｍから成る試薬群とＣＰ　１２５ｍＭ、酢酸マグネシウ
ム５０　ｍＭから成る試薬群を調製し、各々第一、第二
試薬とした。サンプルとしては市販のウサギ筋肉由来の
ＣＫ約２０００ｕ／ｌを原液とし、これを蒸留水によっ
て希釈した希釈系列を使用した。

これら希釈系列を測定し、測定値と希釈倍率をプロット
するいわゆる希釈テストを調製直後の試薬と、６日前に
あらかじめ調製し３７℃に保存しておいた試薬の２つの
試薬を用いて行った。（実施例１） 比較のため第−試薬中に酢酸マグネシウム１２．５ｍＭ
を含み、第二試薬としてはＣＰ１２５−のみである試薬
を調製し、他の条件はすべて実施例１と同様なテストを
行った（比較例１）。

ＣＫ活性の測定は上記各第一試薬を２．４コと各サンプ
ル２０μｌを光路長１譚のセルに入れ３７℃に３分間保
温し喪後上記各第二試薬０．６４を添加し、セル室を同
じく３７℃に保温した分光光度計にて３４０　ａｍの吸
光度変化により求めた。

その結果を第１図、第２図示す。このように実施例１（
第１図〕においては希釈テストの傾斜ばまり念く変化が
なかったが、比較例１第２図においては傾斜がゆるやか
になっており、明らかに感度の低下が認められた。

さらに比較例１において３７℃６日間の保存中に劣化し
た試薬を補充して再度希釈テストを行ったが感度の回復
は認められなかった。このことは感度低下の原因が試薬
の劣化にともなうものでなく、明らかにＣＫ活性への阻
害因子の生成であることを示唆するものである。

（参考例） ＮＡＣ２５ｍＭ　、イミダゾール−酢酸（ｐＨ６，７）
１５０ｍＭの溶液を調製し、ＥＤＴＡ　、酢酸マグネシ
ラムを単独あるいは両方添加してＮＡＣの安定性に対す
る影響を調べた。上記各溶液を３７℃に保存し、通常の
ＳＨ基測測定方法利用して経日的にＮＡＣの定量を行り
念。

その結果を第３図に示すように、ＮＡＣはＥＤＴＡによ
っである程度安定化されるが、酢酸マグネシウムを共存
させない場合にさらにその安定化効果が大きいことが判
明した。

「発明の効果」 本発明のＣＫ定量用試薬はＮＡＣとＥＤＴＡを共存させ
、しかもマグネシウム塩類を共存させないことによって
ＣＫの活性賦活剤であるＮＡＣの安定化を可能にし、賦
活効果を長時間持続させることと共に、ＣＫ活性を阻害
するＮＡＣの分解物の生成を抑制することができる。そ
のため、本発明のＣＫ測定用試薬は浴液状態でも長期間
使用することが可能となり、一度に人世の試薬を調整し
ておくことができる。このことにより、緊急検査にも迅
速に対応することができると共に作業効率の改善、余剰
試薬廃棄の頻度の減少などが可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明にかかる試薬の安定性を示すグラフ図で
あり、第２図はＮＡＣをマグネシウム塩と共存させ九試
薬の安定性を示すグラフ図であり、第３図はＮＡＣの共
存化合物による安定性の経時変化を示すグラフ図である
。 ａ・・・調製直後の本発明試薬、ｂ・・・６日前調製の
本発明試薬、Ｃ・・・調製直後の比較例試薬、ｄ・・・
６日前調製の比較例試薬、ｅ・・・ＥＤＴＡ含有試薬、
ｆ・・・ＥＤＴＡ　、酢酸マグネシウム含有試薬、ｇ・
・・ＮＡＣ単独試薬。 弄私至 第２図 弄尽享

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）反応式（１） ▲数式、化学式、表等があります▼ ・・・・・・（１） に基づき、マグネシウム塩類の存在下賦活剤としてＮ−
   アセチルシステインを用いて実施されるクレアチンキナ
   ーゼ測定用試薬において、少なくともＮ−アセチルシス
   テイン及びエチレンジアミン四酢酸塩を含む試薬群とマ
   グネシウムを含む試薬群に分けて構成若しくは調製する
   ことを特徴とするクレアチンキナーゼ測定用試薬。 （上記略号のうちＡＤＰはアデノシン二リン酸、ＡＴＰ
   はアデノシン三リン酸）
2. （２）クレアチンキナーゼ測定法が反応式（１）に基づ
   き生成するＡＴＰを酵素的測定法により行なわれるとこ
   ろの特許請求の範囲第１項記載のクレアチンキナーゼ測
   定用試薬。
3. （３）クレアチンキナーゼ測定法が反応式（１）、（２
   ）、（３） ▲数式、化学式、表等があります▼ ・・・・・・（１） ▲数式、化学式、表等があります▼ ・・・・・・（２） Ｇ−６−Ｐ＋ＮＡＤ（Ｐ）→６−ＰＧＡ＋ＮＡＤ（Ｐ）
   Ｈ・・・・・・（３） （上記略号のうち、ＨＫはヘキソキナーゼ、Ｇｌｕｋは
   グルコキナーゼ、Ｇ−６−Ｐはグルコース−６−リン酸
   、ＮＡＤ（Ｐ）はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレ
   オチド（リン酸）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは還元型β−ニコチ
   ンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）、６−ＰＧ
   Ａは６−ホスホグルコン酸である。）に基づきクレアチ
   ンリン酸、ＡＤＰ、グルコース、ＨＫ又はＧｌｕＫ、Ｎ
   ＡＤ（Ｐ）、Ｇ６ＰＤＨ、マグネシウム塩類、Ｎ−アセ
   チルシステイン及びエチレンジアミン四酢酸を必須成分
   とする特許請求の範囲第１項に記載のクレアチンキナー
   ゼ測定用試薬。
4. （４）クレアチン測定法が反応式（１）、（２）、（３
   ）に基づき、少くともＡＤＰ、グルコース、ＨＫ／また
   はＧｌｕｋ、ＮＡＤ（Ｐ）、Ｇ６ＰＤＨ、Ｎ−アセチル
   システイン、エチレンジアミン四酢酸塩を必須成分とす
   る試薬群及びクレアチンリン酸、マグネシウム塩類を必
   須成分とする試薬群に分けて構成若しくは調製すること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のクレアチン
   キナーゼ測定用試薬。