KR100319653B1 - 크레아틴키나제측정용시약 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 글루코키나제 또는 헥소키나제, 글루코스-6-인산 탈수소효소, 아데노신 5'-이인산, 크레아틴인산, 산화형 니코틴아미드아데닌 디뉴클레오티드 인산, 마그네슘 염 및 글루코스를 포함하는, 적어도 글루코키나제 또는 헥소키나제, 글루코스-6-인산 탈수소효소, 아데노신 5'-이인산 및 크레아틴 인산을 포함하는 제 1 시약 및 적어도 산화형 니코틴아미드아데닌 디뉴클레오티드 인산을 포함하는 제 2 시약으로 구성되고, 상기 제 1 시약의 pH가 7.5 내지 10 이고, 상기 제 2 시약의 pH가 2 내지 5 인 크레아틴 키나제 측정응 시약에 관한 것이다. 이러한 시약은 어두운 장소 및 밝은 장소에서 상온이하의 온도에서 액체형태로 장기간 보존할 수 있다. 따라서, 이러한 시약은 임상 검사를 실시하는 현장에서 장기적으로 보존하여 놓고, 사용시 용액으로 조제할 필요없이 그대로 자동분석기등에 적용할 수 있다.
Description
CK는 골격근, 심근, 평활근 및 뇌등에 분포하고, 에너지 대사에 관계하는 중요한 효소이다. 또한, CK는 근질환 또는 심질환등에서 조직으로부터 혈액중으로 방출되기 때문에, 이러한 CK 활성을 측정하는 것은 각종 질환의 지표로서 중요하다.
CK는 이하의 반응을 촉매한다.
ATP + 크레아틴 --→ ADP + 크레아틴 인산(정반응)
ADP + 크레아틴 인산 --→ ATP + 크레아틴(역반응)
(상기에서, ATP는 아데노신 5'-삼인산이고, ADP는 아데노신 5'-이인산 이다.)
CK 활성의 측정에는, 상기 정반응과 역반응 모두의 생성물이 사용되고 있고, 측정하는 반응생성물에 의해, 이하의 4가지 측정법으로 크게 분류되고 있다.
(1) ADP를 측정하는 방법으로서는, 피루브산 키나제와 락트산 탈수소효소를 공동효소로 사용하여 환원형 니코틴아미도아데닌 디뉴클레오티드(NADH)의 감소를측정하는 방법이 있다.
(2) 크레아틴 인산을 측정하는 방법으로서는 크레아틴 인산을 물에 용해시켜 생성된 무기인을 측정하는 방법이 있다.
(3) ATP를 측정하는 방법으로서는, 주로 헥소키나제(이후 HK로 약칭함) 또는 글루코키나제(이후 GlcK로 약칭함)와 글루코스-6-인산 탈수소효소(이후 G6PDH로 약칭함)를 공동효소로서 사용하여, 환원형 니코틴아미드아데닌 디뉴클레오티드 인산(이하 NADPH로 약칭함)의 증가를 측정하는 방법이 있다.
(4) 크레아틴을 측정하는 방법으로서는, CK 효소반응으로부터 생성되는 크레아틴을 크레아티닌으로 전환시켜 야페(Jaffe)법등으로 측정하는 방법등이 있다.
이들 각 방법 (1) 내지 (4) 중에서, 지금까지 광범위하게 사용되고 있는 것은 ATPP를 측정하는 (3)번의 방법이고, CK 활성측정의 표준법으로서 일본임상화학회(JSCC)로부터도 추천되고 있다.
ATP 측정법 (3)의 대표적인 예인 HK-G6PDH법에 의한 CK 활성측정의 반응식을 이하에 나타낸다.
(상기에서, NADP+는 산화형 니코틴아미드아데닌 디뉴클레오티드 인산이다.)
상기 HK-G6PDH법은 CK 활성측정법으로서 매우 우수하지만, 특히 불안정한 효소와 기질류를 사용하고, 액상으로 장기간 보존하는 것이 어렵기 때문에, 효소와 기질등은 동결건조품으로 공급되고 있다. 또한, 각성분의 안정조건도 각각 상이하기 때문에, 시약을 구성하는 경우 이들 시약의 안정성은 각성분의 조성에 의해서 크게 변화되지만, 액상 시약의 경우, 통상의 조성으로는 장기간 안정성을 유지하는 것이 곤란하였다.
한편, 자동분석기의 보급에 의해서, CK 활성측정법의 시약구성도 하나의 시약계로부터 2가지 시약계로 바뀌어 가고 있다. 2가지 시약계에서 지금까지의 시약조성의 조합은 개시시약(제 2 시약)에 CK의 측정용 기질인 크레아틴 인산을 포함시키고, 나머지 성분들을 모두 제 1 시약에 포함시키는 것이 일반적이었지만, 액상으로서의 보존안정성은 극히 부족하였다. 그외에도, 제 2 시약으로서 HK 및/또는 S6PDH의 효소를 사용하는 경우가 있었지만, 효소의 안정성에 문제가 있었다. 또한, 그외에도, 지금까지 사용된 조합으로는 충분한 보존안정성을 얻을 수 없었다.
또한, 최근, 시약을 사용시에 액상으로 조제하지 않고, 공급시 부터 액상으로 하여 사용자의 작업성을 향상시키기 위한 연구가 수행되고 있다.
효소자체의 안정성에 있어서는, 효소를 고도로 정제하여 유해한 혼합효소를 제거하는 것과, 내열효소류, 예를 들면, 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)로부터 의 글루코키나제(이하 GlcK로 약칭함), 유전자 교환에의해 효모로부터 얻은 HK, 또는 이들의 화학수식효소를 사용하는 방법에 의해 개선될 수 있었다. 그렇지만, 이들 안정화 효소를 사용하여도, 액상 시약으로서의 충분한 보존안정성을 얻는 것은 곤란하였다. 특히, 본 발명자들은 상기 HK-G6PDH법에 사용되는 시약에서, 안정한 효소와 기질류를 액상중으로 공존시켰을 때, 단독으로는 안정하던 효소가 불안정하게 되어버리는 현상을 발견하였다. 즉, 본 발명자들은 효소류이외의 구성성분인 NADP+와 크레아틴 인산등의 기질류가 효소를 불안정화시키는 가장 큰 요인중 하나라는 것을 발견하고, 기질에 대해서도 각각의 기질에 따라 바람직한 배치와 환경(농도, pH)을 제공할 필요가 있음을 밝혀내었는데, 이는 시약의 액상화에 있어서 극히 중요한 점이 된다.
발명의 개시
본 발명자들은 이러한 문제를 해결하기 위해서 예의 검토한 결과, 액상 시약의 형태로 공급하여도, 장기간에 걸쳐서 충분한 보존안정성을 갖는 시약조성을 발견하였다. 본 발명은 이러한 발견을 기초로 한 것이다.
따라서, 본 발명은 글루코키나제 또는 헥소키나제, 글루코스-6-인산 탈수소효소, 아데노신 5'-이인산, 크레아틴 인산, 산화형 니코틴아미드아데닌 디뉴클레오티드 인산, 마그네슘 염 및 글루코스를 포함하는 크레아틴 키나제 측정용 시약에 있어서, 적어도 글루코키나제 또는 헥소키나제, 글루코스-6-인산 탈수소효소, 아데노신 5'-이인산 및 크레아틴 인산을 포함하는 제 1 시약과, 적어도 산화형 니코틴아미드아데닌 디뉴클레오티드 인산을 포함하는 제 2 시약으로 구성되고, 제 1 시약의 pH가 7.5 내지 10 이고, 제 2 시약의 pH가 2 내지 5 이며, 이들 각각이 액상 시약으로 존재함을 특징으로 하는, 크레아틴 키나제 측정용 시약에 관한 것이다.
본 발명은 시료중의 크레아틴 키나제(이하 CK로 약칭함)를 측정하기 위한 CK 측정용 시약에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 장기간 안정하도록 개량된 CK 측정용 액상 시약에 관한 것이다.
제 1 도는 본 발명의 시약을 4 ℃에서 보존한 경우의 안정성을 나타내는 그래프이다.
제 2 도는 본 발명의 시약을 10 ℃에서 보존한 경우의 안정성을 나타내는 그래프이다.
제 3 도는 비교용 시약을 10 ℃에서 보존한 경우의 안정성을 나타내는 그래프이다.
본 발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 크레아틴 키나제 측정용 시약은
(1) 적어도 GlsK 또는 HK, G6PDH, ADP 및 크레아틴 인산을 포함하고, pH가 7.5 내지 10 인 액상 제 1 시약 및
(2) 적어도 NADP를 포함하고, pH가 2 내지 5 인 액상 제 2 시약 으로 구성된다.
기질인 글루코스는 제 1 시약 또는 제 2 시약중 하나 또는 둘다에 모두 존재하여도 좋지만, 제 1 시약에 포함되어 GlcK 및 HK와 공존하는 것이 이들 효소의 안정화 측면에서 바람직하다.
또한, 마그네슘 염도 제 1 시약 또는 제 2 시약중 하나 또는 둘다에 모두 존재하여도 좋다. 단, 액상으로 장기간(예를 들면, 6개월 이상) 안정성을 유지하기에는 크레아틴 인산이 마그네슘 염보다 조금더 분해되는 경향이 있기 때문에, 원칙으로는 마그네슘 염을 제 2 시약에 포함시키는 것이 바람직하다.
제 1 시약에 포함되는 크레아틴 인산은 pH 7.5 내지 10 의 알칼리 완충액중에서 안정하기 때문에, 적어도 HK 또는 GlcK와 G6PDH 및 ADP를 함유하는 제 1 시약은 pH 7.5 내지 10 의 완충액에 용해시키는 것이 바람직하다. pH 10을 초과하면 효소의 안정성이 저하된다. pH 7.5 미만에서는 특히 크레아틴 인산의 안정성이 저하되기 때문에 바람직하지 못하다. 또한, 완충액으로서는 상기 pH 범위에서 통상 사용되는 임의의 완충액을 사용할 수 있지만, 예를 들면, 바람직한 완충액, 특히 HEPES 완충액(pH 8.5)을 사용하는 것이 바람직하다.
HK 또는 GlcK로서는, pH 안정성이 약알칼리(pH 7 내지 9.5)에 있는 효소, 예를 들면, 효모로부터 얻은 HK 또는 바실러스 스테아로써모필러스로부터 얻은 GlcK등을 사용할 수 있는데, HK 및/또는 GlcK는 약 0.1 U/㎖ 이상, 바람직하게는 약 0.1 내지 40 U/㎖, 특히 바람직하게는 약 0.2 내지 10 U/㎖의 양으로 첨가하는 것이 좋다. HK 및/또는 GlcK의 양이 0.1 U/㎖ 미만일 경우, CK를 측정하는데 충분한 효소활성을 얻을 수 없다. 40 U/㎖를 초과하여도 측정하는데 장애가 없지만, 불순물 혼입의 문제와 비용적 측면에서 반드시 유리한 것은 아니기 때문에, 필요이상의 과량을 첨가할 필요는 없다. G6PDH로서는, 상기의 pH 범위에서 안정한 임의의 효소를 사용할 수 있지만, 류코노스톡 메센테로이드스(Leuconostoc mesenteroides)로부터 얻은 G6PDH가 적합하고, 약 0.1 U/㎖ 이상, 바람직하게는 약 0 1 내지 40 U/㎖,특히 바람직하게는 약 0.2 내지 10 U/㎖의 양으로 첨가하는 것이 좋다. G6PDH의 양이 0.1 U/㎖ 미만일 경우, CK를 측정하기에 충분한 효소활성을 얻을 수 없다. 40 U/㎖를 초과하여도 측정상 장애는 없지만, 불순물 출입의 문제와 비용적인 측면에서 반드시 유리한 것은 아니기 때문에, 필요이상의 과량을 첨가할 필요는 없다.
크레아틴 인산은 제 1 시약중에 약 2 내지 200 mM, 바람직하게는 약 10 내지 100 mM의 양으로 첨가하여 사용할 수 있다. 크레아틴 인산의 양이 2 mM 미만일 경우, CK를 측정하기에 충분한 효소반응이 일어나지 않고, 200 mM를 초과할 경우, 불순물의 혼입 및 비용적 측면이외에도 특히 기질 저해가 일어나기 때문에 바람직하지 않다. ADP는 제 1 시약중에 약 0.1 mM 이상, 바람직하게는 약 0.1 내지 20 mM, 보다 바람직하게는 약 0.2 내지 10 mM의 양으로 첨가하여 사용할 수 있다. ADP의 양이 0.1 mM 미만일 경우, CK를 측정하기에 충분한 효소반응이 일어나지 않는다. 20 mM을 초과하여도 측정상 장애는 없지만, 불순물 혼입의 문제와 비용적인 측면에서 반드시 유리한 것은 아니기 때문에, 필요이상의 과량을 첨가할 필요는 없다. 또한, 글루코스를 제 1 시약에 포함시킬 경우에는 약 1 mM 이상, 바람직하게는 약 1 내지 1000 mM, 보다 바람직하게는 2.5 내지 250 mM의 양으로 첨가하여 사용할 수 있다. 글루코스의 양이 1 mM 미만일 경우, CK를 측정하기에 충분한 효소반응이 일어나지 않는다. 1000 mM을 초과하여도 측정상 장애는 없지만, 불순물 혼입의 문제와 비용적인 측면에서 반드시 유리한 것은 아니다. 또한, 마그네슘 염을 제 1 시약에 포함시킬 경우에는, 임의의 무기 또는 유기 수용성 마그네슘 염을 사용할 수 있는데, 예를 들면, 염화 마그네슘, 아세트산 마그네슘 및 황산 마그네슘을 들 수 있다. 염화 마그네슘 농도는 바람직하게는 약 0.5 mM 이상, 더욱 바람직하게는 약 1 내지 100 mM, 특히 바람직하게는 5 내지 60 mM의 범위이다. 염화 마그네슘 농도가 0.5 mM 미만일 경우, CK, 및 HK 또는 GlcK에 의한 효소반응이 진행되지 않는다. 100 mM을 초과하여도 측정상의 장애는 없지만, 불순물 혼입의 문제와 비용적인 측면, 특히 액상에서의 장기간 보존(예를 들면, 6 개월이상)시에, 크레아틴 인산의 분해를 초래하는 경향이 있어 바람직하지 못하다. 제 1 시약에는, 필요에 따라서, 킬레이트화제, 예를 들면, 에틸렌디아민, 테트라아세트산(이후 EDTA로 약칭한다), 방부제, 또는 일본 특허 공개공보 92-287698 호와 같이(측정의 정밀도를 보다 향상시키기 위해서) 6-포스포글루코노락트나제등을 첨가하여도 좋다.
제 2 시약에 포함되는 NADP+는 산성 완충액중에서 안정하기 때문에 적어도 NADP+는 pH 2 내지 5 의 완충액에 용해된다. 이러한 pH 범위외에서는 NADP+가 불안정하게 된다. 또한, 완충액으로서는 상기 pH 범위에서 통상 사용되는 임의의 완충액을 사용할 수 있고, 예를 들면, 아세트산 완충액(pH 3)이 적당하지만, 제 1 시약과 혼합한 다음에 혼합액이 pH 6 내지 7 이 되도록 제 2 시약의 완충액 농도를 조정한다. NADP는 약 0.1 mM 이상, 바람직하게는 약 0.1 내지 20 mM, 보다 바람직하게는 약 0,5 내지 15 mM의 범위에서 사용할 수 있다. NADP의 양이 0.1 mM 미만일 경우, C6PDH에 의한 효소반응이 충분히 진행되지 않는다. 20 mM을 초과하여도 측정상의 장애는 없지만, 불순물 혼입의 문제와 비용적인 측면에서 반드시 유리한 것은 아니다. 마그네슘 염을 제 2 시약에 포함시키는 경우에는 임의의 무기 또는 유기수용성 마그네슘 염을 사용할 수 있고, 예를 들면, 염화 마그네슘, 아세트산 마그네슘 및 황산 마그네슘을 들 수 있다. 염화 마그네슘 농도는 바람직하게는 약 0.5 mM 이상, 더욱 바람직하게는 약 1 내지 100 mM, 특히 바람직하게는 5 내지 60 mM의 범위이다. 염화 마그네슘 농도가 0.5 mM 미만일 경우, CK, 및 HK 또는 GlcK에 의한 효소반응이 충분히 진행되지 않는다. 100 mM을 초과하여도 측정상의 장애는 없지만, 불순물 혼입의 문제와 비용적인 측면에서 반드시 유리한 것은 아니다. 또한, 글루코스를 제 2 시약에 포함시킬 경우에는 약 1 mM 이상, 바람직하게는 1 내지 1000 mM, 보다 바람직하게는 2.5 내지 250 mM의 양으로 첨가하여 사용할 수 있다. 글루코스의 양이 1 mM 미만일 경우, CK를 측정하기에 충분한 효소반응이 일어나지 않는다. 1000 mM을 초과하여도 측정상 장애는 없지만, 불순물 혼입의 문제와 비용적인 측면에서 반드시 유리한 것은 아니다. 제 2 시약에는, 필요에 따라서, CK의 활성화제인 SH 화합물(예를 들면, N-아세틸시스테인등)과 EDTA, 방부제등을 첨가하여도 좋다. 또한, 글루코스를 제 1 시약 및 제 2 시약 모두에 포함시킬 경우에는 양쪽의 글루코스를 합한 양이 약 1 mM 이상, 바람직하게는 약 1 내지 1000 mM, 보다 바람직하게는 2.5 내지 250 mM이 되도록 첨가하여 사용할 수 있다. 글루코스의 총량이 1 mM 미만일 경우, CK를 측정하기에 충분한 효소반응이 일어나지 않는다. 총량이 1000 mM을 초과하여도 측정상 장애는 없지만, 불순물 혼입의 문제와 비용적인 측면에서 반드시 유리한 것은 아니다. 또한, 마그네슘 염을 제 1 시약 및 제 2 시약 모두에 포함시킬 경우에는, 임의의 무기 또는 유기 수용성 마그네슘 염을 사용할 수 있고, 예를 들면, 염화 마그네슘, 아세트산 마그네슘 및 황산 마그네슘을들 수 있다. 염화 마그네슘 농도는 총량이 바람직하게는 약 0.5 mM 이상, 더욱 바람직하게는 약 1 내지 100 mM, 특히 바람직하게는 5 내지 60 mM의 범위이다. 염화 마그네슘 농도가 0.5 mM 미만일 경우, CK, 및 HK 또는 Glck에 의한 효소반응이 진행되지 않는다. 100 mM을 초과하여도 측정상의 장애는 없지만, 불순물 출입의 문제와 비용적인 측면에서, 특히 제 1 시약에 포함되는 마그네슘 염의 양이 많을 경우, 장기보존시(예를 들면, 6 개월이상) 상기한 바와 같이 일반적으로 크레아틴 인산에 바람직하지 않은 영향을 미친다는 측면에서 바람직하지 못하다. 양쪽 모두에 마그네슘 염을 포함시킬 경우, 그 함유량의 비는 제 2 시약에서 더 많도록 설정하는 것이 안정성의 측면에서 바람직하다.
이상과 같이 구성된 액상 시약은 기존의 제품과 비교할 경우, 장기보존시의 안정성이 향상된다. 또한, 공동효소인 G6PDH의 조효소인 NADP를 개시시약(제 2 시약)으로 사용하는 것은 지금까지 밝혀진 바 없는 획기적인 것이라고 할 수 있다.
이하, 실시예에 의해서 본 발명은 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
실시예 1
(1) 시약의 조제
하기 조성으로부터 제 1 시약 및 제 2 시약을 조제하였다.
제 1 시약
50 mM HEPES 완충액 pH 8.5
30 mM 크레아틴 인산
25 mM 글루코스
2 mM EDTA
2 mM ADP
6 mM AMP(아데노신 5'-일인산)
12.5 μM 디아데노신 5'-펜타포스페이트
4 U/㎖ GlcK
1 U/㎖ G6PDH
제 2 시약
103 mM 아세트산 완충액 pH 3.0
2 mM EDTA
10 mM NADP
100 mM N-아세틸시스테인
50 mM 염화 마그네슘
(2) 안정성
상기 (1)에서 조제한 제 1 시약 및 제 2 시약을 각각 4 ℃ 또는 10 ℃에서 보존한 후, 일정기간(2 주간, 1 개월, 2 개월 및 8 개월) 경과후예 샘플을 얻고, 이를 인간혈청(3800IU/L)의 생리식염수로 5 단계로 희석하여 사용함으로써, 하기 측정조건에서 CK 활성을 측정하였다.
측정조건은 희석한 샘플 8 ㎕에 제 1 시약 320 ㎕를 첨가하고, 37 ℃에서 5분간 가온한 다음, 제 2 시약 80 ㎕를 첨가하고, 37 ℃에서 5 분간 가온한 후의 340 nm의 흡광도를 측정하였다.
각각의 측정결과를 제 1 도(4 ℃에서 보존한 시약), 및 제 2 도(10 ℃에서 보존한 시약)에 나타내었다.
비교예
비교예로서, 하기 조성으로부터 제 1 시약 및 제 2 시약을 조제하고, 각각 10 ℃에서 보존한 후, 일정기간(2 주간, 1 개월, 2 개월, 3 개월, 4 개월 및 5 개월) 경과후에 상기 실시예 1 과 동일한 시험을 수행하고, 시약의 안정성을 비교하였다. 결과를 제 3도에 나타내었다.
제 1 시약
75 mM 아미다졸 완충액 pH 6.7
25 mM 글루코스
2 mM EDTA
2 mM ADP
6 mM AMP
12.5 μM 디아데노신 5'-펜타포스페이트
2.5 mM NADP
25 mM N-아세틸시스테인
4 U/㎖ GlcK
1 U/㎖ G6PDH
제 2 시약
25 mM 트리스 완충액 pH 7.5
130 mM 크레아틴 인산
50 mM 아세트산 마그네슘
본 발명의 CK 측정용 시약은 액상 형태 그대로 밝은 장소 또는 어두운 장소에서 상온이 아닌 저온에서 장기간(적어도 1 년)에 걸쳐 안정하게 저장할 수 있다. 따라서, 임상 검사를 실시하는 현장에서 장기적으로 보존하여 놓고, 사용시 용액으로 조제할 필요없이 그대로 자동 분석기등에 적용할 수 있다.
지금까지 본 발명을 특정한 양태에 따라 설명하였지만, 본 발명의 범위내에서 다양한 변화가 가능하다는 것을 당해 분야의 숙련인이라면 이해할 것이다.
Claims (10)
- 글루코키나제 또는 헥소키나제, 글루코스-6-인산 탈수소효소, 아데노신 5'-이인산, 크레아틴인산, 산화형 니코틴아미드아데닌 디뉴클레오티드 인산, 마그네슘 염 및 글루코스를 포함하며,글루코키나제 또는 헥소키나제, 글루코스-6-인산 탈수소효소, 아데노신 5'-이인산 및 크레아틴 인산을 포함하는 제 1 시약; 및 산화형 니코틴아미드아데닌 디뉴클레오티드 인산을 포함하는 제 2 시약으로 구성되고,상기 제 1 시 약의 pH가 7.5 내지 10 이고, 상기 제 2 시약의 pH가 2 내지 5 이며, 이들 각각이 액상 시약임을 특징으로 하는크레아틴 키나제 측정용 시약.
- 제 1 항에 있어서,제 1 시약이 글루코스를 추가로 포함하는시약.
- 제 1 항에 있어서,제 1 시약이 0.1 U/㎖ 이상의 글루코키나제 또는 헥소키나제를 포함하는시약.
- 제 1 항에 있어서,제 1 시약이 0.1 U/㎖ 이상의 글루코스-6-인산 탈수소효소를 포함하는시약.
- 제 1 항에 있어서,제 1 시약이 0.1 mM 이상의 아데노신 5'-이인산을 포함하는 시약.
- 제 1 항에 있어서,제 1 시약이 2 mM 이상의 크레아틴 인산을 포함하는 시약.
- 제 1 항에 있어서,제 2 시약이 0.1 mM 이상의 산화형 니코틴아미드아데닌 디뉴클레오티드 인산을 포함하는 시약.
- 제 1 항에 있어서,제 2 시약이 마그네슘 염을 추가로 포함하는시약.
- 제 8 항에 있어서,제 2 시약이 0.5 mM 이상의 염화 마그네슘을 포함하는 시약.
- 제 1 항에 있어서,제 1 시약과 제 2 시약의 혼합액의 pH가 6 내지 7 이 되도록제 1 시약 및 제 2시약의 완충액 농도를 조절하여 수득된시약.
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