JP3310296B2 - クレアチンキナーゼ測定用試薬 - Google Patents
クレアチンキナーゼ測定用試薬Info
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、試料中のクレアチンキナーゼ（以下CKと略
す）を測定するCK測定用試薬に関する。より詳細には、
長期間安定なCK測定用試薬の改良された液状試薬に関す
るものである。
す）を測定するCK測定用試薬に関する。より詳細には、
長期間安定なCK測定用試薬の改良された液状試薬に関す
るものである。
背景技術 CKは骨格筋、心筋、平滑筋及び脳などに分布し、エネ
ルギー代謝に関わる重要な酵素である。またCKは筋疾患
又は心疾患などで組織から血中に逸脱し、そのCK活性を
測定することは各種疾患の指標として重要である。
ルギー代謝に関わる重要な酵素である。またCKは筋疾患
又は心疾患などで組織から血中に逸脱し、そのCK活性を
測定することは各種疾患の指標として重要である。
CKは以下の反応を触媒する。
ATP＋クレアチン−−→ADP＋クレアチン燐酸（正反
応） ADP＋クレアチン燐酸−−→ATP＋クレアチン（逆反
応） （ATPはアデノシン5'−三燐酸であり、ADPはアデノシン
5'−二燐酸である） CK活性の測定には、前記の正反応及び逆反応のいずれ
かの生成物が利用されており、測定する反応生成物によ
り、以下の４つの測定法に大きく分類されている。
応） ADP＋クレアチン燐酸−−→ATP＋クレアチン（逆反
応） （ATPはアデノシン5'−三燐酸であり、ADPはアデノシン
5'−二燐酸である） CK活性の測定には、前記の正反応及び逆反応のいずれ
かの生成物が利用されており、測定する反応生成物によ
り、以下の４つの測定法に大きく分類されている。
（１）ADPを測定する方法としては、ピルビン酸キナー
ゼと乳酸脱水素酵素とを共役酵素として還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド（NADH）の減少を測定す
る方法がある。
ゼと乳酸脱水素酵素とを共役酵素として還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド（NADH）の減少を測定す
る方法がある。
（２）クレアチン燐酸を測定する方法としては、クレア
チン燐酸を水解して生じる無機燐を測定する方法があ
る。
チン燐酸を水解して生じる無機燐を測定する方法があ
る。
（３）ATPを測定する方法としては、主にヘキソキナー
ゼ（以下HKと略す）又はグルコキナーゼ（以下Glckと略
す）とグルコース−６−燐酸脱水素酵素（以下G6PDHと
略す）とを共役酵素として、還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド燐酸（以下NADPHと略す）の増加を
測定する方法がある。
ゼ（以下HKと略す）又はグルコキナーゼ（以下Glckと略
す）とグルコース−６−燐酸脱水素酵素（以下G6PDHと
略す）とを共役酵素として、還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド燐酸（以下NADPHと略す）の増加を
測定する方法がある。
（４）クレアチンを測定する方法としては、CK酵素反応
から生成するクレアチンをクレアチニンに転化させてヤ
フェ法などで測定する方法などがある。
から生成するクレアチンをクレアチニンに転化させてヤ
フェ法などで測定する方法などがある。
これらの各方法（１）〜（４）のうち、従来から広く
使用されているのは、ATPを測定する方法（３）であ
り、CK活性測定の標準法として日本臨床化学会（JSCC）
からも推奨されている。
使用されているのは、ATPを測定する方法（３）であ
り、CK活性測定の標準法として日本臨床化学会（JSCC）
からも推奨されている。
ATP測定法（３）の代表例であるHK−G6PDH法によるCK
活性測定の反応式を以下に示す。
活性測定の反応式を以下に示す。
（前記式中、NADPは酸化型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド燐酸である） 前記のHK−G6PDH法はCK活性測定法として大変優れて
いるが、非常に不安定な酵素や基質類を使用しており、
液状での長期保存が難しいので、酵素や基質等は凍結乾
燥品として供給されていた。また、各成分の安定条件も
それぞれ異なっているので、試薬を構成する場合には、
それら試薬の安定性は各成分の組み合わせにより大きく
変化するが、液状試薬の場合、通常の組み合わせでは長
期間安定性を維持するのが困難であった。
クレオチド燐酸である） 前記のHK−G6PDH法はCK活性測定法として大変優れて
いるが、非常に不安定な酵素や基質類を使用しており、
液状での長期保存が難しいので、酵素や基質等は凍結乾
燥品として供給されていた。また、各成分の安定条件も
それぞれ異なっているので、試薬を構成する場合には、
それら試薬の安定性は各成分の組み合わせにより大きく
変化するが、液状試薬の場合、通常の組み合わせでは長
期間安定性を維持するのが困難であった。
一方、自動分析機の普及に伴って、CK活性測定法の試
薬構成も１試薬系から２試薬系に代わってきている。２
試薬系での試薬組成の従来の組み合わせは、開始試薬
（第二試薬）にCKの測定用基質であるクレアチン燐酸を
含有させ、残りの成分をすべて第一試薬に含有させる場
合が一般的であったが、液状での保存安定性は極めて乏
しいものであった。その他にも、第二試薬としてHK及び
／又はG6PDHの酵素を使用する場合があったが、酵素の
安定性に問題があった。また、その他の従来の組み合わ
せでも充分な保存安定性を得ることはできなかった。
薬構成も１試薬系から２試薬系に代わってきている。２
試薬系での試薬組成の従来の組み合わせは、開始試薬
（第二試薬）にCKの測定用基質であるクレアチン燐酸を
含有させ、残りの成分をすべて第一試薬に含有させる場
合が一般的であったが、液状での保存安定性は極めて乏
しいものであった。その他にも、第二試薬としてHK及び
／又はG6PDHの酵素を使用する場合があったが、酵素の
安定性に問題があった。また、その他の従来の組み合わ
せでも充分な保存安定性を得ることはできなかった。
更に、近年、使用時に試薬を液状に調製するのではな
く、供給時の試薬形態から液状とし、ユーザーの作業性
を向上させることが求められている。
く、供給時の試薬形態から液状とし、ユーザーの作業性
を向上させることが求められている。
酵素自体の安定化については、酵素を高度に精製して
有害な共雑酵素を除去することや、耐熱酵素類、例えば
バチルス・ステアロサーモフィルス（Batillus stearot
hermophilus）由来のグルコキナーゼ（以下GlcKと略
す）、遺伝子組み換えによる酵母由来HK、又はそれらの
化学修飾酵素を用いることによって改善されてきた。し
かしながら、それらの安定化酵素を使用しても、液状試
薬としての充分な保存安定性を得ることは困難であっ
た。特に、前記のHK−G6PDH法に用いる試薬では、安定
な酵素と基質類とを液状中に共存させると、単独では安
定な酵素が不安定になってしまうという現象を本発明者
は見出した。すなわち、酵素類以外の構成成分である、
NADPやクレアチン燐酸などの基質類が不安定化の最も大
きな要因の１つであることを本発明者が見出し、基質に
関してもそれぞれの基質により、望ましい配置及び環境
（濃度、pH）を施す必要があり、試薬の液状化にとって
極めて重要なポイントとなる。
有害な共雑酵素を除去することや、耐熱酵素類、例えば
バチルス・ステアロサーモフィルス（Batillus stearot
hermophilus）由来のグルコキナーゼ（以下GlcKと略
す）、遺伝子組み換えによる酵母由来HK、又はそれらの
化学修飾酵素を用いることによって改善されてきた。し
かしながら、それらの安定化酵素を使用しても、液状試
薬としての充分な保存安定性を得ることは困難であっ
た。特に、前記のHK−G6PDH法に用いる試薬では、安定
な酵素と基質類とを液状中に共存させると、単独では安
定な酵素が不安定になってしまうという現象を本発明者
は見出した。すなわち、酵素類以外の構成成分である、
NADPやクレアチン燐酸などの基質類が不安定化の最も大
きな要因の１つであることを本発明者が見出し、基質に
関してもそれぞれの基質により、望ましい配置及び環境
（濃度、pH）を施す必要があり、試薬の液状化にとって
極めて重要なポイントとなる。
発明の開示 本発明者等はこうした従来の問題を解決すべく種々鋭
意検討した結果、液状試薬の形態で供給しても、長期間
にわたって充分な保存安定性を有する試薬組成を見出し
た。本発明はこうした知見に基づくものである。
意検討した結果、液状試薬の形態で供給しても、長期間
にわたって充分な保存安定性を有する試薬組成を見出し
た。本発明はこうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、グルコキナーゼ又はヘキソキナー
ゼ、グルコース−６−燐酸脱水素酵素、アデノシン5'−
二燐酸、クレアチン燐酸、酸化型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド燐酸、マグネシウム塩及びグルコース
を含むクレアチンキナーゼ測定用試薬において、少なく
ともグルコキナーゼ又はヘキソキナーゼ、グルコース−
６−燐酸脱水素酵素及びアデノシン5'−二燐酸及びクレ
アチン燐酸を含む第一試薬と、少なくとも酸化型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド燐酸を含む第二試薬と
からなり、第一試薬のpHが7.5〜10であり、第二試薬のp
Hが２〜５であり、それぞれが液状試薬であることを特
徴とする、クレアチンキナーゼ測定用試薬に関する。
ゼ、グルコース−６−燐酸脱水素酵素、アデノシン5'−
二燐酸、クレアチン燐酸、酸化型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド燐酸、マグネシウム塩及びグルコース
を含むクレアチンキナーゼ測定用試薬において、少なく
ともグルコキナーゼ又はヘキソキナーゼ、グルコース−
６−燐酸脱水素酵素及びアデノシン5'−二燐酸及びクレ
アチン燐酸を含む第一試薬と、少なくとも酸化型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド燐酸を含む第二試薬と
からなり、第一試薬のpHが7.5〜10であり、第二試薬のp
Hが２〜５であり、それぞれが液状試薬であることを特
徴とする、クレアチンキナーゼ測定用試薬に関する。
図面の簡単な説明 図１は、本発明試薬を４℃で保存した場合の安定性を
示すグラフである。
示すグラフである。
図２は、本発明試薬を10℃で保存した場合の安定性を
示すグラフである。
示すグラフである。
図３は、比較用試薬を10℃で保存した場合の安定性を
示すグラフである。
示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態 以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のクレアチンキナーゼ測定用試薬は、 （１）少なくともGlcK又はHKと、G6PDHと、ADPと、クレ
アチン燐酸とを含み、pHが7.5〜10の液状第一試薬と、 （２）少なくともNADPを含み、pH2〜５の液状第二試薬
と から構成される。
アチン燐酸とを含み、pHが7.5〜10の液状第一試薬と、 （２）少なくともNADPを含み、pH2〜５の液状第二試薬
と から構成される。
基質のグルコースは、第一試薬又は第二試薬のどちら
か一方、又は両方に存在させてもよいが、第一試薬にの
み含有させてGlckやHKと共存させると、それら酵素の安
定化の面で好ましい。
か一方、又は両方に存在させてもよいが、第一試薬にの
み含有させてGlckやHKと共存させると、それら酵素の安
定化の面で好ましい。
また、マグネシウム塩も第一試薬又は第二試薬のどち
らか一方、又は両方に存在させてもよい。但し、液状で
長期間（例えば６カ月以上）安定性を保つには、クレア
チン燐酸がマグネシウム塩により若干、劣化する傾向が
認められるため、原則としては、マグネシウム塩を第二
試薬側に存在させるのが好ましい。
らか一方、又は両方に存在させてもよい。但し、液状で
長期間（例えば６カ月以上）安定性を保つには、クレア
チン燐酸がマグネシウム塩により若干、劣化する傾向が
認められるため、原則としては、マグネシウム塩を第二
試薬側に存在させるのが好ましい。
第一試薬に含まれるクレアチン燐酸は、pH7.5〜10程
度のアルカリ緩衝液中で安定であるので、少なくともHK
又はGlcKとG6PDH及びADPを含有する第一試薬は、pH7.5
〜10の緩衝液に溶解すれば良い。pH10を越えると、酵素
の安定性が悪くなる。pH7.5未満では、特にクレアチン
燐酸の安定性が劣るため好ましくない。また、緩衝液と
しては、前記pH範囲で通常使用される任意の緩衝液を用
いることができるが、例えばグッド緩衝液が好適に用い
られ、特にHEPES（以後HEPESと略する）緩衝液（pH8.
5）を用いるのが好ましい。
度のアルカリ緩衝液中で安定であるので、少なくともHK
又はGlcKとG6PDH及びADPを含有する第一試薬は、pH7.5
〜10の緩衝液に溶解すれば良い。pH10を越えると、酵素
の安定性が悪くなる。pH7.5未満では、特にクレアチン
燐酸の安定性が劣るため好ましくない。また、緩衝液と
しては、前記pH範囲で通常使用される任意の緩衝液を用
いることができるが、例えばグッド緩衝液が好適に用い
られ、特にHEPES（以後HEPESと略する）緩衝液（pH8.
5）を用いるのが好ましい。
HK又はGlcKとしては、pH安定性が弱アルカリ（pH7〜
9.5）にある酵素、例えば酵母由来のHK又はバチルス・
ステアロサーモフィルス（Batillus stearothermophilu
s）由来のGlcKなどを用いることができ、HK及び／又はG
lcKを約0.1U/ml以上、好ましくは約0.1〜40U/ml、特に
好ましくは約0.2〜10U/mlの量で添加すればよい。HK及
び／又はGlcKの量が0.1U/ml未満であるとCKを測定する
のに充分な酵素活性が得られない。40U/mlを超えても測
定上の支障はないが、不純物混入の問題やコストの面か
らは必ずしも有利ではなく、必要以上の過剰量を添加す
る必要はない。G6PDHとしては、前記のpH範囲で安定な
任意の酵素を用いることができるが、ロイコノストック
・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）由
来のG6PDHが好適であり、約0.1U/ml以上、好ましくは約
0.1〜40U/ml、特に好ましくは約0.2〜10U/mlの量で添加
すればよい。G6PDHの量が0.1U/ml未満であるとCKを測定
するのに充分な酵素活性が得られない。40U/mlを超えて
も測定上の支障はないが、不純物混入の問題やコストの
面からは必ずしも有利ではなく、必要以上の過剰量を添
加する必要はない。
9.5）にある酵素、例えば酵母由来のHK又はバチルス・
ステアロサーモフィルス（Batillus stearothermophilu
s）由来のGlcKなどを用いることができ、HK及び／又はG
lcKを約0.1U/ml以上、好ましくは約0.1〜40U/ml、特に
好ましくは約0.2〜10U/mlの量で添加すればよい。HK及
び／又はGlcKの量が0.1U/ml未満であるとCKを測定する
のに充分な酵素活性が得られない。40U/mlを超えても測
定上の支障はないが、不純物混入の問題やコストの面か
らは必ずしも有利ではなく、必要以上の過剰量を添加す
る必要はない。G6PDHとしては、前記のpH範囲で安定な
任意の酵素を用いることができるが、ロイコノストック
・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）由
来のG6PDHが好適であり、約0.1U/ml以上、好ましくは約
0.1〜40U/ml、特に好ましくは約0.2〜10U/mlの量で添加
すればよい。G6PDHの量が0.1U/ml未満であるとCKを測定
するのに充分な酵素活性が得られない。40U/mlを超えて
も測定上の支障はないが、不純物混入の問題やコストの
面からは必ずしも有利ではなく、必要以上の過剰量を添
加する必要はない。
クレアチン燐酸は、第一試薬中に約２〜200mM、好ま
しく10〜100mMの量で添加して用いることができる。ク
レアチン燐酸の量が2mM未満だとCKを測定するのに充分
な酵素反応が行われず、200mMを超えると、不純物混入
やコストの面以外にも、特に基質阻害がおこるので好ま
しくない。ADPは、第一試薬中に約0.1mM以上、好ましく
は約0.1〜20mM、より好ましくは約0.2〜10mMの量で添加
して用いることができる。ADP量が0.1mM未満だとCKを測
定するのに充分な酵素反応が行われない。20mMを超えて
も測定上支障はないが、不純物混入の問題やコストの面
からは必ずしも有利ではなく、必要以上の過剰量を添加
する必要はない。また、グルコースを第一試薬に含有さ
せる場合には、約1mM以上、好ましくは約１〜1000mM、
より好ましくは2.5〜250mMの量で添加して用いることが
できる。グルコース量が1mM未満だとCKを測定するのに
充分な酵素反応が行われない。1000mMを超えても測定上
の支障はないが、不純物混入の問題やコストの面からは
必ずしも有利ではない。更にマグネシウム塩を第一試薬
に含有させる場合には、任意の無機又は有機水溶性マグ
ネシウム塩を用いることができ、例えば、塩化マグネシ
ウム、酢酸マグネシウムや硫酸マグネシウムを挙げるこ
とができる。塩化マグネシウム濃度は、好ましくは約0.
5mM以上、より好ましくは約１〜100mM、特に好ましくは
５〜60mMの範囲である。塩化マグネシウム濃度が0.5mM
未満になるとCK及びHK又はGlckによる酵素反応が充分に
進行しない。100mMを超えても測定上の支障はないが、
不純物の混入の問題、コスト面、特に液状での長期保存
（例えば６カ月以上）中に、クレアチン燐酸の劣化を招
く傾向が認められるので好ましくない。第一試薬には、
必要に応じてキレート剤、例えばエチレンジアミン四酢
酸（以後EDTAと略する）、防腐剤、更には特開平４−28
7698号公報の如く（より測定精度を向上させるため）６
−ホスホグルコノラクトナーゼなどを添加してもよい。
しく10〜100mMの量で添加して用いることができる。ク
レアチン燐酸の量が2mM未満だとCKを測定するのに充分
な酵素反応が行われず、200mMを超えると、不純物混入
やコストの面以外にも、特に基質阻害がおこるので好ま
しくない。ADPは、第一試薬中に約0.1mM以上、好ましく
は約0.1〜20mM、より好ましくは約0.2〜10mMの量で添加
して用いることができる。ADP量が0.1mM未満だとCKを測
定するのに充分な酵素反応が行われない。20mMを超えて
も測定上支障はないが、不純物混入の問題やコストの面
からは必ずしも有利ではなく、必要以上の過剰量を添加
する必要はない。また、グルコースを第一試薬に含有さ
せる場合には、約1mM以上、好ましくは約１〜1000mM、
より好ましくは2.5〜250mMの量で添加して用いることが
できる。グルコース量が1mM未満だとCKを測定するのに
充分な酵素反応が行われない。1000mMを超えても測定上
の支障はないが、不純物混入の問題やコストの面からは
必ずしも有利ではない。更にマグネシウム塩を第一試薬
に含有させる場合には、任意の無機又は有機水溶性マグ
ネシウム塩を用いることができ、例えば、塩化マグネシ
ウム、酢酸マグネシウムや硫酸マグネシウムを挙げるこ
とができる。塩化マグネシウム濃度は、好ましくは約0.
5mM以上、より好ましくは約１〜100mM、特に好ましくは
５〜60mMの範囲である。塩化マグネシウム濃度が0.5mM
未満になるとCK及びHK又はGlckによる酵素反応が充分に
進行しない。100mMを超えても測定上の支障はないが、
不純物の混入の問題、コスト面、特に液状での長期保存
（例えば６カ月以上）中に、クレアチン燐酸の劣化を招
く傾向が認められるので好ましくない。第一試薬には、
必要に応じてキレート剤、例えばエチレンジアミン四酢
酸（以後EDTAと略する）、防腐剤、更には特開平４−28
7698号公報の如く（より測定精度を向上させるため）６
−ホスホグルコノラクトナーゼなどを添加してもよい。
第二試薬に含まれるNADPは酸性緩衝液中で安定である
ので少なくともNADPは、pH2〜５の緩衝液に溶解する。
このpH範囲外ではNADPが不安定になる。また、緩衝液と
しては、前記pH範囲で通常使用される任意の緩衝液を用
いることができ、例えば酢酸緩衝液（pH3）が好適であ
るが、第一試薬と混合した後に混合液がpH6〜７になる
ように第二試薬の緩衝液濃度を調整する。NADPは約0.1m
M以上、好ましくは約0.1〜20mM、より好ましくは約0.5
〜15mMの範囲で使用することができる。NADP量が0.1mM
未満であると、G6PDHによる酵素反応が充分に進行しな
い。20mMを超えても測定上の支障はないが、不純物混入
の問題やコストの面からは必ずしも有利ではない。マグ
ネシウム塩を第二試薬に含有させる場合には、任意の無
機又は有機水溶性マグネシウム塩を用いることができ、
例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウムや硫酸マ
グネシウムを挙げることができる。塩化マグネシウム濃
度は、好ましくは約0.5mM以上、より好ましくは約１〜1
00mM、特に好ましくは５〜60mMの範囲である。塩化マグ
ネシウム濃度が0.5mM未満になるとCK及びHK又はGlckに
よる酵素反応が充分に進行しない。100mMを超えても測
定上の支障はないが、不純物混入の問題やコストの面か
ら必ずしも有利ではない。また、グルコースを第二試薬
に含有させる場合には、約1mM以上、好ましくは約１〜1
000mM、より好ましくは2.5〜250mMの量で添加して用い
ることができる。グルコース量が1mM未満だとCKを測定
するのに充分な酵素反応が行われない。1000mMを超えて
も測定上の支障はないが、不純物混入の問題やコストの
面からは必ずしも有利ではない。第二試薬には、必要に
応じてCKの賦活化剤であるSH化合物（例えば、Ｎ−アセ
チルシステイン等）やEDTA、防腐剤などを添加してもよ
い。更に、グルコースを第一試薬及び第二試薬の両方に
含有させる場合には、両者の合計量が約1mM以上、好ま
しくは約１〜1000mM、より好ましくは2.5〜250mMになれ
ばよい。合計量が1mM未満だとCKを測定するのに充分な
酵素反応が行われない。合計量が1000mMを超えても測定
上の支障はないが、不純物混入の問題やコストの面から
は必ずしも有利ではない。更に、マグネシウム塩を第一
及び第二試薬の両方に含有させる場合には、任意の無機
又は有機水溶性マグネシウム塩を用いることができ、例
えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウムや硫酸マグ
ネシウムを挙げることができる。塩化マグネシウム濃度
は、両者の合計量が好ましくは約0.5mM以上、より好ま
しくは約１〜100mM、特に好ましくは５〜60mMの範囲で
ある。塩化マグネシウム濃度が0.5mM未満になるとCK及
びHK又はGlckによる酵素反応が充分に進行しない。100m
Mを超えても測定上の支障はないが、不純物混入の問
題、コスト面、特に第一試薬側に含有させるマグニシウ
ム塩の量が多くなると、長期保存（例えば６カ月以上）
中に、前述の通りクレアチン燐酸へ影響があるので好ま
しくない。両者にマグネシウム塩を含有させる場合、そ
の含有量の比は第二試薬側が大となるように設定する方
が、安定性の面で好ましい。
ので少なくともNADPは、pH2〜５の緩衝液に溶解する。
このpH範囲外ではNADPが不安定になる。また、緩衝液と
しては、前記pH範囲で通常使用される任意の緩衝液を用
いることができ、例えば酢酸緩衝液（pH3）が好適であ
るが、第一試薬と混合した後に混合液がpH6〜７になる
ように第二試薬の緩衝液濃度を調整する。NADPは約0.1m
M以上、好ましくは約0.1〜20mM、より好ましくは約0.5
〜15mMの範囲で使用することができる。NADP量が0.1mM
未満であると、G6PDHによる酵素反応が充分に進行しな
い。20mMを超えても測定上の支障はないが、不純物混入
の問題やコストの面からは必ずしも有利ではない。マグ
ネシウム塩を第二試薬に含有させる場合には、任意の無
機又は有機水溶性マグネシウム塩を用いることができ、
例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウムや硫酸マ
グネシウムを挙げることができる。塩化マグネシウム濃
度は、好ましくは約0.5mM以上、より好ましくは約１〜1
00mM、特に好ましくは５〜60mMの範囲である。塩化マグ
ネシウム濃度が0.5mM未満になるとCK及びHK又はGlckに
よる酵素反応が充分に進行しない。100mMを超えても測
定上の支障はないが、不純物混入の問題やコストの面か
ら必ずしも有利ではない。また、グルコースを第二試薬
に含有させる場合には、約1mM以上、好ましくは約１〜1
000mM、より好ましくは2.5〜250mMの量で添加して用い
ることができる。グルコース量が1mM未満だとCKを測定
するのに充分な酵素反応が行われない。1000mMを超えて
も測定上の支障はないが、不純物混入の問題やコストの
面からは必ずしも有利ではない。第二試薬には、必要に
応じてCKの賦活化剤であるSH化合物（例えば、Ｎ−アセ
チルシステイン等）やEDTA、防腐剤などを添加してもよ
い。更に、グルコースを第一試薬及び第二試薬の両方に
含有させる場合には、両者の合計量が約1mM以上、好ま
しくは約１〜1000mM、より好ましくは2.5〜250mMになれ
ばよい。合計量が1mM未満だとCKを測定するのに充分な
酵素反応が行われない。合計量が1000mMを超えても測定
上の支障はないが、不純物混入の問題やコストの面から
は必ずしも有利ではない。更に、マグネシウム塩を第一
及び第二試薬の両方に含有させる場合には、任意の無機
又は有機水溶性マグネシウム塩を用いることができ、例
えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウムや硫酸マグ
ネシウムを挙げることができる。塩化マグネシウム濃度
は、両者の合計量が好ましくは約0.5mM以上、より好ま
しくは約１〜100mM、特に好ましくは５〜60mMの範囲で
ある。塩化マグネシウム濃度が0.5mM未満になるとCK及
びHK又はGlckによる酵素反応が充分に進行しない。100m
Mを超えても測定上の支障はないが、不純物混入の問
題、コスト面、特に第一試薬側に含有させるマグニシウ
ム塩の量が多くなると、長期保存（例えば６カ月以上）
中に、前述の通りクレアチン燐酸へ影響があるので好ま
しくない。両者にマグネシウム塩を含有させる場合、そ
の含有量の比は第二試薬側が大となるように設定する方
が、安定性の面で好ましい。
以上のように構成した液状試薬は、従来品と比較して
格段に長期保存安定性が向上する。ましてや、共役酵素
のG6PDHの補酵素であるNADPを開始試薬（第二試薬）と
することは、従来にない発想法であるといえる。
格段に長期保存安定性が向上する。ましてや、共役酵素
のG6PDHの補酵素であるNADPを開始試薬（第二試薬）と
することは、従来にない発想法であるといえる。
実施例 以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、
これらは本発明の範囲を限定するものではない。
これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１ （１）試薬の調製 以下の組成からなる第一試薬と第二試薬を調製した。
第一試薬 50mM HEPES緩衝液pH8.5 30mM クレアチン燐酸 25mM グルコース 2mM EDTA 2mM ADP 6mM AMP（アデノシン5'−一燐酸） 12.5μＭ ジアデノシン5'−ペンタホスフェート 4U/ml GlcK 1U/ml G6PDH 第二試薬 103mM 酢酸緩衝液pH3.0 2mM EDTA 10mM NADP 100mM Ｎ−アセチルシステイン 50mM 塩化マグネシウム （２）安定性 前記（１）で調製した第一試薬及び第二試薬を別々に
４℃又は10℃で保存し、一定期間（２週間、１カ月、２
カ月及び８カ月）経過毎にサンプルを取り出し、検体と
して高単位ヒト血清（3800IU/L）の生理食塩水の５段階
希釈列を用いて、以下の測定条件でCK活性測定を行っ
た。
４℃又は10℃で保存し、一定期間（２週間、１カ月、２
カ月及び８カ月）経過毎にサンプルを取り出し、検体と
して高単位ヒト血清（3800IU/L）の生理食塩水の５段階
希釈列を用いて、以下の測定条件でCK活性測定を行っ
た。
測定操作は、検体８μｌに第一試薬320μｌを加え、3
7℃で５分間加温した後、第二試薬80μｌを加え、37℃
で５分間加温した後の340nmの吸光度を測定した。
7℃で５分間加温した後、第二試薬80μｌを加え、37℃
で５分間加温した後の340nmの吸光度を測定した。
それぞれの測定結果を図１（４℃保存試薬）、及び図
２（10℃保存試薬）に示す。
２（10℃保存試薬）に示す。
比較例 比較用として、以下の組成からなる第一試薬及び第二
試薬を調製し、それぞれ10℃にて保存して一定期間（２
週間、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月及び５カ月）経
過毎に上記実施例１と同様の試験を行い、試薬の安定性
を調べた。結果を図３に示す。
試薬を調製し、それぞれ10℃にて保存して一定期間（２
週間、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月及び５カ月）経
過毎に上記実施例１と同様の試験を行い、試薬の安定性
を調べた。結果を図３に示す。
第一試薬 75mM イミダゾール緩衝液pH6.7 25mM グルコース 2mM EDTA 2mM ADP 6mM AMP 12.5μＭ ジアデノシン5'−ペンタホスフェート 2.5mM NADP 25mM Ｎ−アセチルシステイン 4U/ml GlcK 1U/ml G6PDH 第二試薬 25mM トリス緩衝液pH7.5 130mM クレアチン 50mM 酢酸マグネシウム 産業上の利用可能性 本発明のCK測定用試薬は、液状のままで、暗所又は明
所にて、常温ないし低温下で長期間（少なくとも１年程
度）にわたって安定に貯蔵することができる。従って、
臨床検査を実施する現場で長期に保存しておき、使用に
際しては、溶解操作の必要もなく、そのまま自動分析機
などに適用することができる。
所にて、常温ないし低温下で長期間（少なくとも１年程
度）にわたって安定に貯蔵することができる。従って、
臨床検査を実施する現場で長期に保存しておき、使用に
際しては、溶解操作の必要もなく、そのまま自動分析機
などに適用することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業
者に自明の変形は本発明の範囲に含まれる。
者に自明の変形は本発明の範囲に含まれる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/50 C12Q 1/32 C12Q 1/48 C12Q 1/54 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (10)
- 【請求項１】グルコキナーゼ又はヘキソキナーゼ、グル
コース−６−燐酸脱水素酵素、アデノシン5'−二燐酸、
クレアチン燐酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド燐酸、マグネシウム塩及びグルコースを含むク
レアチンキナーゼ測定用試薬において、 少なくともグルコキナーゼ又はヘキソキナーゼ、グルコ
ース−６−燐酸脱水素酵素、アデノシン5'−二燐酸及び
クレアチン燐酸を含む第一試薬と、少なくとも酸化型ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド燐酸を含む第二試
薬とからなり、第一試薬のpHが7.5〜10であり、第二試
薬のpHが２〜５であり、それぞれが液状試薬であること
を特徴とする、クレアチンキナーゼ測定用試薬。 - 【請求項２】第一試薬がグルコースを更に含む請求項１
に記載の試薬。 - 【請求項３】第一試薬がグルコキナーゼ又はヘキソキナ
ーゼ約0.1U/ml以上を含有する請求項１に記載の試薬。 - 【請求項４】第一試薬がグルコース−６−燐酸脱水素酵
素約0.1U/ml以上を含有する請求項１に記載の試薬。 - 【請求項５】第一試薬がアデノシン5'−二燐酸約0.1mM
以上を含有する請求項１に記載の試薬。 - 【請求項６】第一試薬がクレアチン燐酸約2mM以上を含
有する請求項１に記載の試薬。 - 【請求項７】第二試薬が酸化型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド燐酸約0.1mM以上を含有する請求項１に
記載の試薬。 - 【請求項８】第二試薬がマグネジウム塩を更に含む請求
項１に記載の試薬。 - 【請求項９】第二試薬が塩化マグネシウム約0.5mM以上
を含有する請求項８に記載の試薬。 - 【請求項１０】第一試薬と第二試薬との混合液のpHが６
〜７となるように第一試薬及び第二試薬の緩衝液濃度を
調整した、請求項１に記載の試薬。
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