JPH078297A - 生体物質の測定方法 - Google Patents
生体物質の測定方法Info
- Publication number
- JPH078297A JPH078297A JP17599693A JP17599693A JPH078297A JP H078297 A JPH078297 A JP H078297A JP 17599693 A JP17599693 A JP 17599693A JP 17599693 A JP17599693 A JP 17599693A JP H078297 A JPH078297 A JP H078297A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nad
- reagent
- measuring
- reaction
- measurement
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 臨床検査などの分野で使用され、血清、尿な
どの検体中の生体物質の新規な測定法を提供することを
目的とする。 【構成】 本発明の方法は、酵素反応を用いて生体物質
を測定する方法であり、ピルビン酸脱炭酸酵素及びアル
デヒド脱水素酵素の存在下、ＮＡＤ（Ｐ）+類をＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ類に還元する反応を用い、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の
生成量に基づいて生体物質を測定することからなる。本
発明の方法では、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量に基づいて
生体物質を測定するので、測定限界が高く、また検体中
の還元物質などの影響を受けないという利点を有する。
従って、本発明によれば、生体物質を高精度且つ高範囲
に測定することができ、自動分析にも適用することがで
きるという効果を奏する。
どの検体中の生体物質の新規な測定法を提供することを
目的とする。 【構成】 本発明の方法は、酵素反応を用いて生体物質
を測定する方法であり、ピルビン酸脱炭酸酵素及びアル
デヒド脱水素酵素の存在下、ＮＡＤ（Ｐ）+類をＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ類に還元する反応を用い、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の
生成量に基づいて生体物質を測定することからなる。本
発明の方法では、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量に基づいて
生体物質を測定するので、測定限界が高く、また検体中
の還元物質などの影響を受けないという利点を有する。
従って、本発明によれば、生体物質を高精度且つ高範囲
に測定することができ、自動分析にも適用することがで
きるという効果を奏する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は生体物質の測定方法に関
する。より詳細には、臨床検査などの分野で用いられ、
血清、血漿、尿などの検体中の生体物質の測定（定量及
び活性測定）に関する。
する。より詳細には、臨床検査などの分野で用いられ、
血清、血漿、尿などの検体中の生体物質の測定（定量及
び活性測定）に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、臨床検査、生化学検査などの分野
においては、生体物質の定量や酵素活性の測定が頻繁に
行われており、この測定には反応特異性の高い酵素反応
を用いた方法が汎用されている。このような酵素反応を
用いた生体物質の測定法においては、例えば、測定対
象である生体物質が関与し且つ過酸化水素を生成する酵
素反応系を用い、生成した過酸化水素をパーオキシダー
ゼの存在下、発色性物質と反応させることにより発色さ
せ、その吸光度変化量に基づいて生体物質を測定する方
法；測定対象である生体物質が関与し且つＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ［還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド（リン酸）］からＮＡＤ（Ｐ）+［酸化型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）］を生成する酵
素反応系を用い、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの吸光度減少量に基づ
いて生体物質を測定する方法などが用いられており、ま
た測定対象である生体物質が関与し且つＮＡＤ+から
ＮＡＤＨを生成する酵素反応系を用い、ＮＡＤＨの吸光
度増加量に基づいて生体物質を測定する方法（特開平５
−９５７９８号公報参照）が知られている。
においては、生体物質の定量や酵素活性の測定が頻繁に
行われており、この測定には反応特異性の高い酵素反応
を用いた方法が汎用されている。このような酵素反応を
用いた生体物質の測定法においては、例えば、測定対
象である生体物質が関与し且つ過酸化水素を生成する酵
素反応系を用い、生成した過酸化水素をパーオキシダー
ゼの存在下、発色性物質と反応させることにより発色さ
せ、その吸光度変化量に基づいて生体物質を測定する方
法；測定対象である生体物質が関与し且つＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ［還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド（リン酸）］からＮＡＤ（Ｐ）+［酸化型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）］を生成する酵
素反応系を用い、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの吸光度減少量に基づ
いて生体物質を測定する方法などが用いられており、ま
た測定対象である生体物質が関与し且つＮＡＤ+から
ＮＡＤＨを生成する酵素反応系を用い、ＮＡＤＨの吸光
度増加量に基づいて生体物質を測定する方法（特開平５
−９５７９８号公報参照）が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上記の測定方法にお
いては、検体中に存在する還元性物質（例えば、尿酸、
アスコルビン酸、ビリルビン、ヘモグロビン等）や酸化
性物質などにより過酸化水素の分解などが生じやすく、
正確な値を与えない場合がある。一方、上記の方法に
おいては、十分量の基質［ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、補酵素等］
を反応系に添加することが困難なので定量限界が低く、
また測定波長における検体の吸収（濁り、溶血、黄疸
等）により測定できる範囲が狭くなるという問題があ
る。このような問題から、酵素反応による生体物質の測
定に際しては、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する反応系を用
い、生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの吸光度の上昇に基づいて
生体物質を測定する方法が好適であり、自動分析にも適
している。
いては、検体中に存在する還元性物質（例えば、尿酸、
アスコルビン酸、ビリルビン、ヘモグロビン等）や酸化
性物質などにより過酸化水素の分解などが生じやすく、
正確な値を与えない場合がある。一方、上記の方法に
おいては、十分量の基質［ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、補酵素等］
を反応系に添加することが困難なので定量限界が低く、
また測定波長における検体の吸収（濁り、溶血、黄疸
等）により測定できる範囲が狭くなるという問題があ
る。このような問題から、酵素反応による生体物質の測
定に際しては、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する反応系を用
い、生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの吸光度の上昇に基づいて
生体物質を測定する方法が好適であり、自動分析にも適
している。
【０００４】しかしながら、上記の方法では、酵素と
してピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体が用いられてお
り、当該酵素複合体は３種の酵素が非共有結合で分子集
合した複合体なので、高純度の酵素複合体を得ることが
困難である。また、還元作用を示すコエンザイムＡを利
用しなければならず、コエンザイムＡが測定値に影響を
与えるおそれがある。更に、ひとつの酵素作用としてリ
ポアミド−ＦＡＤが関与するためにホルマザン法への応
用が困難であり、また干渉を受けやすい。加えて、一般
に検体にはＬＤＨ（ラクテートデヒドロゲナーゼ）が含
まれており、上記の方法では検体中のＬＤＨの干渉
（即ち、ＬＤＨによる乳酸＋ＮＡＤ+⇔ピルビン酸＋Ｎ
ＡＤＨの酵素反応が生ずるので、ＮＡＤＨ量の変動等が
起る）を考慮しなければならないという問題がある。Ｌ
ＤＨはＮＡＤ+には作用するがＮＡＤＰ+には作用しない
ため、基質としてＮＡＤＰ+を用いればＬＤＨの干渉は
回避できるが、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体はＮ
ＡＤＰ+に作用しないので、基質をＮＡＤＰ+に変更して
も上記の問題を解消することはできない。
してピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体が用いられてお
り、当該酵素複合体は３種の酵素が非共有結合で分子集
合した複合体なので、高純度の酵素複合体を得ることが
困難である。また、還元作用を示すコエンザイムＡを利
用しなければならず、コエンザイムＡが測定値に影響を
与えるおそれがある。更に、ひとつの酵素作用としてリ
ポアミド−ＦＡＤが関与するためにホルマザン法への応
用が困難であり、また干渉を受けやすい。加えて、一般
に検体にはＬＤＨ（ラクテートデヒドロゲナーゼ）が含
まれており、上記の方法では検体中のＬＤＨの干渉
（即ち、ＬＤＨによる乳酸＋ＮＡＤ+⇔ピルビン酸＋Ｎ
ＡＤＨの酵素反応が生ずるので、ＮＡＤＨ量の変動等が
起る）を考慮しなければならないという問題がある。Ｌ
ＤＨはＮＡＤ+には作用するがＮＡＤＰ+には作用しない
ため、基質としてＮＡＤＰ+を用いればＬＤＨの干渉は
回避できるが、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体はＮ
ＡＤＰ+に作用しないので、基質をＮＡＤＰ+に変更して
も上記の問題を解消することはできない。
【０００５】かかる観点から、本発明者等は、ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈを生成する酵素反応であり、単独で又は他の酵
素反応系と共役させることにより、生体物質の測定に広
く利用できる酵素反応を鋭意検討した結果、ピルビン酸
脱炭酸酵素（E.C 4.1.1.1、以下、ＰＤＣという）及び
アルデヒド脱水素酵素（E.C 1.2.1.3，1.2.1.4，1.2.1.
5、以下、ＡｌＤＨという）の存在下、ＮＡＤ（Ｐ）+、
チオ−ＮＡＤ（Ｐ）+、３−アセチル−ＮＡＤ（Ｐ）+な
どのＮＡＤ（Ｐ）+類からその還元体であるＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ類を生成する酵素反応が極めて有用であり、か
かる反応は生体物質の測定に普遍的に利用できる酵素反
応であることを見出して本発明を完成した。即ち、本発
明は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量を測定することによ
り、簡便且つ高精度で生体物質を測定することができる
方法を提供することを目的とする。
（Ｐ）Ｈを生成する酵素反応であり、単独で又は他の酵
素反応系と共役させることにより、生体物質の測定に広
く利用できる酵素反応を鋭意検討した結果、ピルビン酸
脱炭酸酵素（E.C 4.1.1.1、以下、ＰＤＣという）及び
アルデヒド脱水素酵素（E.C 1.2.1.3，1.2.1.4，1.2.1.
5、以下、ＡｌＤＨという）の存在下、ＮＡＤ（Ｐ）+、
チオ−ＮＡＤ（Ｐ）+、３−アセチル−ＮＡＤ（Ｐ）+な
どのＮＡＤ（Ｐ）+類からその還元体であるＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ類を生成する酵素反応が極めて有用であり、か
かる反応は生体物質の測定に普遍的に利用できる酵素反
応であることを見出して本発明を完成した。即ち、本発
明は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量を測定することによ
り、簡便且つ高精度で生体物質を測定することができる
方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決すべく
なされた本発明の生体物質の測定方法は、酵素反応を用
いて生体物質を測定する方法であり、ＰＤＣ及びＡｌＤ
Ｈの存在下、ＮＡＤ（Ｐ）+類をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類に還
元する反応を用い、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量に基づい
て生体物質を測定することからなり、また酵素反応を用
いて生体物質を測定する方法であり、当該測定方法がピ
ルビン酸とＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を生成する酵素反応又はこ
の酵素反応を含む反応系からなるとき、ＰＤＣ及びＡｌ
ＤＨの存在下、ＮＡＤ（Ｐ）+類をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類に
還元する反応を、上記酵素反応又は酵素反応系と共役さ
せることにより、生成したピルビン酸を消費すると共に
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量を増加させ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
類の生成量に基づいて生体物質を測定することからな
る。
なされた本発明の生体物質の測定方法は、酵素反応を用
いて生体物質を測定する方法であり、ＰＤＣ及びＡｌＤ
Ｈの存在下、ＮＡＤ（Ｐ）+類をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類に還
元する反応を用い、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量に基づい
て生体物質を測定することからなり、また酵素反応を用
いて生体物質を測定する方法であり、当該測定方法がピ
ルビン酸とＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を生成する酵素反応又はこ
の酵素反応を含む反応系からなるとき、ＰＤＣ及びＡｌ
ＤＨの存在下、ＮＡＤ（Ｐ）+類をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類に
還元する反応を、上記酵素反応又は酵素反応系と共役さ
せることにより、生成したピルビン酸を消費すると共に
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量を増加させ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
類の生成量に基づいて生体物質を測定することからな
る。
【０００７】本発明で用いられる、ＰＤＣ及びＡｌＤＨ
の存在下、ＮＡＤ（Ｐ）+類からＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を生
成する酵素反応は下記酵素反応式１及び２で示される。
の存在下、ＮＡＤ（Ｐ）+類からＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を生
成する酵素反応は下記酵素反応式１及び２で示される。
【０００８】
【化１】
【０００９】この酵素反応の基質であるピルビン酸及び
ＮＡＤ（Ｐ）+類はそれ自体が生体物質として測定の対
象とされ、また多くの生体物質は酵素反応によりこれら
のいずれかの物質に変換することができるので、当該酵
素反応と上記酵素反応式１及び２で示される酵素反応を
共役させることにより、測定対象である生体物質をＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈ類の生成量として測定することができる。酵
素反応式１及び２で示される酵素反応はそれぞれ公知で
あるが、酵素反応式１及び２で示される酵素反応により
ＮＡＤ（Ｐ）+からＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成させる反応を
利用して生体物質を測定する例は知られていない。以
下、本発明をより詳細に説明する。
ＮＡＤ（Ｐ）+類はそれ自体が生体物質として測定の対
象とされ、また多くの生体物質は酵素反応によりこれら
のいずれかの物質に変換することができるので、当該酵
素反応と上記酵素反応式１及び２で示される酵素反応を
共役させることにより、測定対象である生体物質をＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈ類の生成量として測定することができる。酵
素反応式１及び２で示される酵素反応はそれぞれ公知で
あるが、酵素反応式１及び２で示される酵素反応により
ＮＡＤ（Ｐ）+からＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成させる反応を
利用して生体物質を測定する例は知られていない。以
下、本発明をより詳細に説明する。
【００１０】上記酵素反応式１で示される酵素反応に用
いられるＰＤＣは、植物及び微生物に広く存在する酵素
であり、例えば、コムギ胚芽、酵母などから分離・精製
することにより得ることができる。また、上記酵素反応
式２で示される酵素反応に用いられるＡｌＤＨは、動物
及び微生物に広く存在する酵素であり、例えば、動物肝
などから分離・精製することにより得ることができる。
本発明において、ＰＤＣ及びＡｌＤＨの由来は特に限定
されない。
いられるＰＤＣは、植物及び微生物に広く存在する酵素
であり、例えば、コムギ胚芽、酵母などから分離・精製
することにより得ることができる。また、上記酵素反応
式２で示される酵素反応に用いられるＡｌＤＨは、動物
及び微生物に広く存在する酵素であり、例えば、動物肝
などから分離・精製することにより得ることができる。
本発明において、ＰＤＣ及びＡｌＤＨの由来は特に限定
されない。
【００１１】酵素反応式２に示されるように、上記Ａｌ
ＤＨが触媒する酵素反応は、アセトアルデヒドの酸化的
脱水素反応であり、この間にＮＡＤ（Ｐ）+類は還元さ
れてＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類が生成する。ここにおけるＮＡＤ
（Ｐ）+類には、通常単にＮＡＤ（Ｐ）+と称されるβ−
ＮＡＤ（Ｐ）+［本明細書においても、単にＮＡＤ
（Ｐ）+と記す］の他に、例えば、α−ＮＡＤ（Ｐ）+、
チオ−ＮＡＤ（Ｐ）+、３−アセチル−ＮＡＤ（Ｐ）+、
デスオキシ−ＮＡＤ（Ｐ）+、イソニコチン酸ヒドラジ
ド−ＮＡＤ（Ｐ）+、６−アミノ−ＮＡＤ（Ｐ）+、１，
Ｎ6−エテノ−ＮＡＤ（Ｐ）+、デアミノ−ＮＡＤ（Ｐ）
+、デアミド−ＮＡＤ（Ｐ）+、３−ピリジンアルデヒド
−ＮＡＤ（Ｐ）+、３−ピリジンアルデヒド−デアミノ
−ＮＡＤ（Ｐ）+などが包含されるが、上記酵素反応式
２の酵素反応に基づいて還元体を生成するＮＡＤ（Ｐ）
+アナログであればこれらに限定されるものではない。
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類は上記のＮＡＤ（Ｐ）+類の還元型を
意味する。また、酵素反応１の酵素反応はチアミンピロ
リン酸（ＴＰＰ）の存在下に反応が進行するので、反応
系にはＴＰＰを添加するのが好ましい。更に、ＰＤＣは
Ｍｇ2+により活性化されるので、反応系にはＭｇ2+を添
加するのが好ましい。
ＤＨが触媒する酵素反応は、アセトアルデヒドの酸化的
脱水素反応であり、この間にＮＡＤ（Ｐ）+類は還元さ
れてＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類が生成する。ここにおけるＮＡＤ
（Ｐ）+類には、通常単にＮＡＤ（Ｐ）+と称されるβ−
ＮＡＤ（Ｐ）+［本明細書においても、単にＮＡＤ
（Ｐ）+と記す］の他に、例えば、α−ＮＡＤ（Ｐ）+、
チオ−ＮＡＤ（Ｐ）+、３−アセチル−ＮＡＤ（Ｐ）+、
デスオキシ−ＮＡＤ（Ｐ）+、イソニコチン酸ヒドラジ
ド−ＮＡＤ（Ｐ）+、６−アミノ−ＮＡＤ（Ｐ）+、１，
Ｎ6−エテノ−ＮＡＤ（Ｐ）+、デアミノ−ＮＡＤ（Ｐ）
+、デアミド−ＮＡＤ（Ｐ）+、３−ピリジンアルデヒド
−ＮＡＤ（Ｐ）+、３−ピリジンアルデヒド−デアミノ
−ＮＡＤ（Ｐ）+などが包含されるが、上記酵素反応式
２の酵素反応に基づいて還元体を生成するＮＡＤ（Ｐ）
+アナログであればこれらに限定されるものではない。
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類は上記のＮＡＤ（Ｐ）+類の還元型を
意味する。また、酵素反応１の酵素反応はチアミンピロ
リン酸（ＴＰＰ）の存在下に反応が進行するので、反応
系にはＴＰＰを添加するのが好ましい。更に、ＰＤＣは
Ｍｇ2+により活性化されるので、反応系にはＭｇ2+を添
加するのが好ましい。
【００１２】上記酵素反応式１及び２に示される酵素反
応は、ピルビン酸及びＮＡＤ（Ｐ）+類を基質とする反
応であり、上記２種の物質のいずれかを基質とすること
により他の物質をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量に基づいて
定量することができる。また、基質であるピルビン酸及
びＮＡＤ（Ｐ）+類を過剰に添加することにより、補欠
分子族であるＴＰＰや活性化因子であるＭｇ2+をＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ類の生成量に基づいて定量することができる。
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量は種々の方法により測定する
ことができるが、通常、簡便且つ高精度で測定すること
ができるので吸光度測定法により行われる。測定波長は
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の種類により適宜選択され、例えば、
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、３−アセチル−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、デア
ミノ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈなどの場合には３４０ｎｍ、チオ
−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの場合には４０５ｎｍの波長が選択さ
れる。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量の測定法として、テト
ラゾリウム塩を共存させてホルマザンに変換し、生成ホ
ルマザンの呈色度を測定する方法などを用いてもよい。
応は、ピルビン酸及びＮＡＤ（Ｐ）+類を基質とする反
応であり、上記２種の物質のいずれかを基質とすること
により他の物質をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量に基づいて
定量することができる。また、基質であるピルビン酸及
びＮＡＤ（Ｐ）+類を過剰に添加することにより、補欠
分子族であるＴＰＰや活性化因子であるＭｇ2+をＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ類の生成量に基づいて定量することができる。
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量は種々の方法により測定する
ことができるが、通常、簡便且つ高精度で測定すること
ができるので吸光度測定法により行われる。測定波長は
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の種類により適宜選択され、例えば、
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、３−アセチル−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、デア
ミノ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈなどの場合には３４０ｎｍ、チオ
−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの場合には４０５ｎｍの波長が選択さ
れる。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量の測定法として、テト
ラゾリウム塩を共存させてホルマザンに変換し、生成ホ
ルマザンの呈色度を測定する方法などを用いてもよい。
【００１３】前述のように、各種生体物質は種々の酵素
反応系を用いることにより、酵素反応式１及び２の酵素
反応の基質であるピルビン酸又はＮＡＤ（Ｐ）+類に導
くことができる。従って、これらの酵素反応系と酵素反
応式１及び２で示される酵素反応系を共役させることに
より、各種生体物質（基質、補欠分子族、活性化因子な
ど）量又は生体物質としての酵素の活性を、ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ類の生成量として測定することができる。これ
らの例を挙げると、基質としては、例えば、ＡＤＰ、尿
素窒素、クレアチン、クレアチニン、遊離脂肪酸、シア
ル酸、中性脂肪、リン脂質、アミノ酸などが例示され、
補欠分子族としては、例えば、ＴＰＰ、ピリドキサルリ
ン酸、テトラヒドロ葉酸などが例示され、活性化因子と
しては、例えば、マグネシウムイオン、カリウムイオ
ン、マンガンイオン、カルシウムイオン、ナトリウムイ
オン、クロルイオン、炭酸水素イオンなどが例示され、
酵素としては、例えば、ピルベートキナーゼ（ＰＫ）、
コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）、クレアチンホスフェー
トキナーゼ（ＣＰＫ）、マレートデヒドロゲナーゼ（Ｍ
ＤＨ）、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、アラ
ニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）又はアスパル
テートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）などが例示
される。これらの基質、酵素などを用いた酵素反応であ
り、ピルビン酸又はＮＡＤ（Ｐ）+類を生成する酵素反
応の例を下記に示す。なお、下記の酵素反応式中、酵素
反応によりＡＤＰに導いたものについては、以後、酵素
反応式３によりピルビン酸に導く。また、Ｐはリン酸残
基を意味する。
反応系を用いることにより、酵素反応式１及び２の酵素
反応の基質であるピルビン酸又はＮＡＤ（Ｐ）+類に導
くことができる。従って、これらの酵素反応系と酵素反
応式１及び２で示される酵素反応系を共役させることに
より、各種生体物質（基質、補欠分子族、活性化因子な
ど）量又は生体物質としての酵素の活性を、ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ類の生成量として測定することができる。これ
らの例を挙げると、基質としては、例えば、ＡＤＰ、尿
素窒素、クレアチン、クレアチニン、遊離脂肪酸、シア
ル酸、中性脂肪、リン脂質、アミノ酸などが例示され、
補欠分子族としては、例えば、ＴＰＰ、ピリドキサルリ
ン酸、テトラヒドロ葉酸などが例示され、活性化因子と
しては、例えば、マグネシウムイオン、カリウムイオ
ン、マンガンイオン、カルシウムイオン、ナトリウムイ
オン、クロルイオン、炭酸水素イオンなどが例示され、
酵素としては、例えば、ピルベートキナーゼ（ＰＫ）、
コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）、クレアチンホスフェー
トキナーゼ（ＣＰＫ）、マレートデヒドロゲナーゼ（Ｍ
ＤＨ）、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、アラ
ニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）又はアスパル
テートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）などが例示
される。これらの基質、酵素などを用いた酵素反応であ
り、ピルビン酸又はＮＡＤ（Ｐ）+類を生成する酵素反
応の例を下記に示す。なお、下記の酵素反応式中、酵素
反応によりＡＤＰに導いたものについては、以後、酵素
反応式３によりピルビン酸に導く。また、Ｐはリン酸残
基を意味する。
【００１４】
【化２】
【００１５】
【化３】
【００１６】
【化４】
【００１７】
【化５】
【００１８】
【化６】
【００１９】
【化７】
【００２０】
【化８】
【００２１】
【化９】
【００２２】本発明において、酵素反応を用いて生体物
質を測定する方法が、ピルビン酸とＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を
生成する酵素反応又はこの酵素反応を含む反応系からな
るとき、酵素反応式１及び２で示される酵素反応を、上
記酵素反応又は酵素反応系と共役させることにより、生
成したピルビン酸を消費できると共にＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類
の生成量を２倍とすることができる。この方法によれ
ば、生成したピルビン酸による反応阻害を回避すること
ができ、また２倍のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類が生成するので測
定精度の向上が図れるという効果を奏する。
質を測定する方法が、ピルビン酸とＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を
生成する酵素反応又はこの酵素反応を含む反応系からな
るとき、酵素反応式１及び２で示される酵素反応を、上
記酵素反応又は酵素反応系と共役させることにより、生
成したピルビン酸を消費できると共にＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類
の生成量を２倍とすることができる。この方法によれ
ば、生成したピルビン酸による反応阻害を回避すること
ができ、また２倍のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類が生成するので測
定精度の向上が図れるという効果を奏する。
【００２３】以下、本発明の生体物質の測定方法（基質
などの定量及び酵素活性）を例をもって具体的に説明す
るが、本発明の方法はこれらに限定されるものではな
い。 １）酵素反応系により生成したピルビン酸及び／又は内
因性のピルビン酸を、酵素反応式１及び２の酵素反応に
よりＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量として測定する方法。ピ
ルビン酸の測定法としては、ＬＤＨを用いるＮＡＤＨの
減少量測定法、パーオキシダーゼを用いた過酸化水素法
などが知られているが、本発明の方法は以下の点で優れ
ている。 ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量を測定するので定量限界が
高い。 ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の分子吸光係数が明確なため定量が
容易である。 ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成系は、血清等の検体中の還元
性物質の影響を受けない。 ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の発色は、他の色素（例えば、キノ
ン色素等）に比べて安定である。
などの定量及び酵素活性）を例をもって具体的に説明す
るが、本発明の方法はこれらに限定されるものではな
い。 １）酵素反応系により生成したピルビン酸及び／又は内
因性のピルビン酸を、酵素反応式１及び２の酵素反応に
よりＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量として測定する方法。ピ
ルビン酸の測定法としては、ＬＤＨを用いるＮＡＤＨの
減少量測定法、パーオキシダーゼを用いた過酸化水素法
などが知られているが、本発明の方法は以下の点で優れ
ている。 ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量を測定するので定量限界が
高い。 ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の分子吸光係数が明確なため定量が
容易である。 ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成系は、血清等の検体中の還元
性物質の影響を受けない。 ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の発色は、他の色素（例えば、キノ
ン色素等）に比べて安定である。
【００２４】２）酵素反応系により生成したＮＡＤ
（Ｐ）+類及び／又は内因性のＮＡＤ（Ｐ）+類を、酵素
反応式１及び２の酵素反応によりＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増
加量として測定する方法。ＮＡＤ（Ｐ）+類の測定法と
しては、種々の方法が知られているが、本発明の方法に
よれば上記１）に記載した効果と同じ効果が得られる。
（Ｐ）+類及び／又は内因性のＮＡＤ（Ｐ）+類を、酵素
反応式１及び２の酵素反応によりＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増
加量として測定する方法。ＮＡＤ（Ｐ）+類の測定法と
しては、種々の方法が知られているが、本発明の方法に
よれば上記１）に記載した効果と同じ効果が得られる。
【００２５】３）酵素反応式３の酵素反応と酵素反応式
１及び２の酵素反応とを組合せ、酵素反応系により生成
したＡＤＰ及び／又は内因性のＡＤＰを、ＮＡＤ（Ｐ）
Ｈ類の増加量として測定する方法。ＡＤＰの測定法とし
ては、ＰＫ、ＡＴＰ及びＰＥＰを併用したＬＤＨ法又は
ＰＯＰ法などが知られているが、本発明の方法によれば
上記１）に記載した効果と同じ効果が得られる。
１及び２の酵素反応とを組合せ、酵素反応系により生成
したＡＤＰ及び／又は内因性のＡＤＰを、ＮＡＤ（Ｐ）
Ｈ類の増加量として測定する方法。ＡＤＰの測定法とし
ては、ＰＫ、ＡＴＰ及びＰＥＰを併用したＬＤＨ法又は
ＰＯＰ法などが知られているが、本発明の方法によれば
上記１）に記載した効果と同じ効果が得られる。
【００２６】４）酵素反応式７又は８の酵素反応と、酵
素反応式３の酵素反応と、酵素反応式１及び２の酵素反
応とを組合せ、検体中のクレアチン又はクレアチニンを
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量として測定する方法。クレア
チン又はクレアチニンの測定法としては、Creatinine a
midohydrolase(C1)-Creatine amidinohydrolase(C2)-Sa
rcosine oxidase(SOD)-POD系、C1-C2-SOD-Formaldehyde
dehydrogenase(FDH)系などが広く用いられているが、
本発明の方法によれば、上記１）に記載した効果に加
え、従来法に比べて共役系の酵素反応数が少ないという
利点を有する。
素反応式３の酵素反応と、酵素反応式１及び２の酵素反
応とを組合せ、検体中のクレアチン又はクレアチニンを
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量として測定する方法。クレア
チン又はクレアチニンの測定法としては、Creatinine a
midohydrolase(C1)-Creatine amidinohydrolase(C2)-Sa
rcosine oxidase(SOD)-POD系、C1-C2-SOD-Formaldehyde
dehydrogenase(FDH)系などが広く用いられているが、
本発明の方法によれば、上記１）に記載した効果に加
え、従来法に比べて共役系の酵素反応数が少ないという
利点を有する。
【００２７】５）酵素反応式４の酵素反応と、酵素反応
式３の酵素反応と、酵素反応式１及び２の酵素反応とを
組合せ、検体中の尿素窒素をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量
として測定する方法。尿素窒素の測定法としては、Glut
amate dehydrogenase (GLDH)-Urease法、PK-LDH-Urea a
midolyase法などが知られているが、本発明の方法によ
れば上記１）に記載した効果と同じ効果が得られ、更に
検体中のアンモニアの影響を受けることもない利点を有
する。
式３の酵素反応と、酵素反応式１及び２の酵素反応とを
組合せ、検体中の尿素窒素をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量
として測定する方法。尿素窒素の測定法としては、Glut
amate dehydrogenase (GLDH)-Urease法、PK-LDH-Urea a
midolyase法などが知られているが、本発明の方法によ
れば上記１）に記載した効果と同じ効果が得られ、更に
検体中のアンモニアの影響を受けることもない利点を有
する。
【００２８】６）酵素反応式１４の酵素反応と、酵素反
応式１及び２の酵素反応とを組合せ、検体中のシアル酸
をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量として測定する方法。シア
ル酸の測定法としては、LDH法、Pyruvate oxidase (PO
P)法、N-Acetyl-D-mannosamine dehydrogenase (AMDH)
法などが知られているが、本発明の方法によれば上記
１）に記載した効果と同じ効果が得られる。
応式１及び２の酵素反応とを組合せ、検体中のシアル酸
をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量として測定する方法。シア
ル酸の測定法としては、LDH法、Pyruvate oxidase (PO
P)法、N-Acetyl-D-mannosamine dehydrogenase (AMDH)
法などが知られているが、本発明の方法によれば上記
１）に記載した効果と同じ効果が得られる。
【００２９】７）酵素反応式１５の酵素反応と、酵素反
応式３の酵素反応と、酵素反応式１及び２の酵素反応と
を組合せ、検体中の中性脂肪をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加
量として測定する方法。中性脂肪の測定法としては、Li
poprotein lipase (LPL)により生成するグリセロールを
測定する方法に基づき、Glycerol kinase (GK)-Glycero
l-3-phosphateoxidase (GPO)法、Glycerol oxidase (GO
D)法、Glycerol dehydrogenase (GDH)法などが知られて
いるが、本発明の方法によれば上記１）に記載した効果
と同じ効果が得られる。
応式３の酵素反応と、酵素反応式１及び２の酵素反応と
を組合せ、検体中の中性脂肪をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加
量として測定する方法。中性脂肪の測定法としては、Li
poprotein lipase (LPL)により生成するグリセロールを
測定する方法に基づき、Glycerol kinase (GK)-Glycero
l-3-phosphateoxidase (GPO)法、Glycerol oxidase (GO
D)法、Glycerol dehydrogenase (GDH)法などが知られて
いるが、本発明の方法によれば上記１）に記載した効果
と同じ効果が得られる。
【００３０】８）酵素反応式１３の酵素反応と、酵素反
応式１及び２の酵素反応とを組合せ、検体中のＬＤＨの
酵素活性（乳酸からピルビン酸へ）をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類
の増加量として測定する方法。現在用いられているＬＤ
Ｈの測定法は、ピルビン酸やＮＡＤ（Ｐ）Ｈに対するＫ
ｍが小さいために生成物阻害を受けやすく、反応直線部
分が短いので正確に測定するには初速度を測定する必要
がある。それに対し、本発明の方法では下記の点で優れ
る。 反応生成物であるピルビン酸が酵素反応式１及び２の
酵素反応により消失するので、反応直線性が向上し、長
時間域での測定が可能となる。 １モルの乳酸から２モルのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類が生成す
るため感度が２倍になり、低活性の検体（特に、ＬＤＨ
のアイソザイム測定等）においても正確に測定すること
ができる利点を有する。
応式１及び２の酵素反応とを組合せ、検体中のＬＤＨの
酵素活性（乳酸からピルビン酸へ）をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類
の増加量として測定する方法。現在用いられているＬＤ
Ｈの測定法は、ピルビン酸やＮＡＤ（Ｐ）Ｈに対するＫ
ｍが小さいために生成物阻害を受けやすく、反応直線部
分が短いので正確に測定するには初速度を測定する必要
がある。それに対し、本発明の方法では下記の点で優れ
る。 反応生成物であるピルビン酸が酵素反応式１及び２の
酵素反応により消失するので、反応直線性が向上し、長
時間域での測定が可能となる。 １モルの乳酸から２モルのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類が生成す
るため感度が２倍になり、低活性の検体（特に、ＬＤＨ
のアイソザイム測定等）においても正確に測定すること
ができる利点を有する。
【００３１】９）酵素反応式１２の酵素反応と、酵素反
応式１及び２の酵素反応とを組合せ、検体中のＭＤＨの
酵素活性をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量として測定する方
法。現在、アイソザイム測定（電気泳動等）などによ
り、心筋梗塞や肝疾患の場合にＭＤＨが上昇することが
知られており臨床的に有用である。本発明の方法によれ
ば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成でＭＤＨ活性を測定するこ
とができ、また上記と同様に反応直線性が向上すると共
に２モルのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類が生成するので、感度の向
上が図れる。
応式１及び２の酵素反応とを組合せ、検体中のＭＤＨの
酵素活性をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量として測定する方
法。現在、アイソザイム測定（電気泳動等）などによ
り、心筋梗塞や肝疾患の場合にＭＤＨが上昇することが
知られており臨床的に有用である。本発明の方法によれ
ば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成でＭＤＨ活性を測定するこ
とができ、また上記と同様に反応直線性が向上すると共
に２モルのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類が生成するので、感度の向
上が図れる。
【００３２】１０）酵素反応式９の酵素反応と、酵素反
応式１及び２の酵素反応とを組合せ、検体中のＡＬＴの
酵素活性をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量として測定する方
法。現在使用されているＡＬＴの測定法は、ＡＬＴの作
用により生成したピルビン酸を測定するＬＤＨ法やＰＯ
Ｐ法であるが、本発明の方法によれば前記１）に記載し
た効果と同じ効果が得られる。
応式１及び２の酵素反応とを組合せ、検体中のＡＬＴの
酵素活性をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量として測定する方
法。現在使用されているＡＬＴの測定法は、ＡＬＴの作
用により生成したピルビン酸を測定するＬＤＨ法やＰＯ
Ｐ法であるが、本発明の方法によれば前記１）に記載し
た効果と同じ効果が得られる。
【００３３】１１）酵素反応式１０の酵素反応と、酵素
反応式１及び２の酵素反応とを組合せ、検体中のＡＳＴ
の酵素活性をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量として測定する
方法。現在使用されているＡＳＴの測定法は、ＡＳＴの
作用により生成したオキサロ酢酸を測定するMDH法とOxa
loacetate decarboxylase (OADC)-POP法であるが、本発
明の方法によれば前記１）に記載した効果と同じ効果が
得られる。
反応式１及び２の酵素反応とを組合せ、検体中のＡＳＴ
の酵素活性をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量として測定する
方法。現在使用されているＡＳＴの測定法は、ＡＳＴの
作用により生成したオキサロ酢酸を測定するMDH法とOxa
loacetate decarboxylase (OADC)-POP法であるが、本発
明の方法によれば前記１）に記載した効果と同じ効果が
得られる。
【００３４】１２）酵素反応式１及び２の酵素反応によ
り、検体中のマグネシウムイオンをＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の
増加量として測定する方法。マグネシウムイオンの測定
法としては、キシリジンブルー法、GK-G6PDH法などが知
られているが、本発明の方法による測定によれば上記
１）に記載した効果と同様な効果が得られる。
り、検体中のマグネシウムイオンをＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の
増加量として測定する方法。マグネシウムイオンの測定
法としては、キシリジンブルー法、GK-G6PDH法などが知
られているが、本発明の方法による測定によれば上記
１）に記載した効果と同様な効果が得られる。
【００３５】１３）酵素反応式３の酵素反応と、酵素反
応式１及び２の酵素反応とを組合せ、検体中のカリウム
イオンをＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量として測定する方
法。カリウムイオンの測定法としては炎光法、電極法等
が知られている。酵素反応式３の酵素反応は活性化因子
としてカリウムイオンを必要とするので、酵素反応式１
及び２の酵素反応と組合せることにより、検体中のカリ
ウムイオンを測定することができ、この方法によれば上
記１）に記載した効果と同様な効果が得られる。
応式１及び２の酵素反応とを組合せ、検体中のカリウム
イオンをＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量として測定する方
法。カリウムイオンの測定法としては炎光法、電極法等
が知られている。酵素反応式３の酵素反応は活性化因子
としてカリウムイオンを必要とするので、酵素反応式１
及び２の酵素反応と組合せることにより、検体中のカリ
ウムイオンを測定することができ、この方法によれば上
記１）に記載した効果と同様な効果が得られる。
【００３６】本発明において、酵素反応式１及び２で示
される酵素反応の基質及びＰＤＣ及びＡｌＤＨの使用量
としては酵素反応が円滑に進行する量であればよく、測
定対象となる生体物質の種類、検体中の含量、共役させ
る酵素反応の種類、反応時間及び温度などにより適宜調
整されるが、ＰＤＣ及びＡｌＤＨの濃度は０．１〜１０
０単位／ｍｌ程度、好ましくは０．５〜３０単位／ｍｌ
程度、より好ましくは１〜５単位／ｍｌ程度とされる。
ピルビン酸及びＮＡＤ（Ｐ）+類の濃度は、これらが測
定対象物質の酵素反応系から由来するときは当然にその
濃度となるが、基質として反応系に添加する場合には、
ピルビン酸の濃度は０．５〜１０ｍＭ程度、好ましくは
１〜５ｍＭ程度、ＮＡＤ（Ｐ）+類の濃度は１〜１０ｍ
Ｍ程度、好ましくは２〜５ｍＭ程度とされる。また、Ｔ
ＰＰの濃度としては、0.05〜１ｍＭ程度、好ましくは
０．１〜０．５ｍＭ程度とされ、Ｍｇ2+の濃度としては
０．１〜５ｍＭ程度、好ましくは０．５〜３ｍＭ程度と
される。
される酵素反応の基質及びＰＤＣ及びＡｌＤＨの使用量
としては酵素反応が円滑に進行する量であればよく、測
定対象となる生体物質の種類、検体中の含量、共役させ
る酵素反応の種類、反応時間及び温度などにより適宜調
整されるが、ＰＤＣ及びＡｌＤＨの濃度は０．１〜１０
０単位／ｍｌ程度、好ましくは０．５〜３０単位／ｍｌ
程度、より好ましくは１〜５単位／ｍｌ程度とされる。
ピルビン酸及びＮＡＤ（Ｐ）+類の濃度は、これらが測
定対象物質の酵素反応系から由来するときは当然にその
濃度となるが、基質として反応系に添加する場合には、
ピルビン酸の濃度は０．５〜１０ｍＭ程度、好ましくは
１〜５ｍＭ程度、ＮＡＤ（Ｐ）+類の濃度は１〜１０ｍ
Ｍ程度、好ましくは２〜５ｍＭ程度とされる。また、Ｔ
ＰＰの濃度としては、0.05〜１ｍＭ程度、好ましくは
０．１〜０．５ｍＭ程度とされ、Ｍｇ2+の濃度としては
０．１〜５ｍＭ程度、好ましくは０．５〜３ｍＭ程度と
される。
【００３７】本発明の方法は、酵素反応系に悪影響を及
ぼさない適当な緩衝液（例えば、トリス−ＨＣｌ緩衝
液、リン酸緩衝液、モノ又はジエタノールアミン緩衝液
等）を用いて行われる。また、測定手法は特に限定され
ず、エンドポイト法、レートアッセイ法などの適宜な手
法を用いることができる。なお、前述したように、ピル
ビン酸デヒドロゲナーゼ複合体を用いた方法において
は、検体中にＬＤＨが存在する場合には、ＬＤＨが測定
値に影響を与えるので、ＬＤＨの測定以外の場合には、
反応系にＬＤＨ阻害剤（例えば、オキサミン酸及びその
塩、蓚酸及びその塩等）を必ず添加する必要がある。し
かし、ＮＡＤＰ+はＬＤＨの基質とならないので、本発
明の方法においてＮＡＤＰ+を用いることにより、かか
る問題を解消することができる。測定対象である生体物
質を含有する検体としては、例えば、血清、血漿、尿、
髄液などが例示される。
ぼさない適当な緩衝液（例えば、トリス−ＨＣｌ緩衝
液、リン酸緩衝液、モノ又はジエタノールアミン緩衝液
等）を用いて行われる。また、測定手法は特に限定され
ず、エンドポイト法、レートアッセイ法などの適宜な手
法を用いることができる。なお、前述したように、ピル
ビン酸デヒドロゲナーゼ複合体を用いた方法において
は、検体中にＬＤＨが存在する場合には、ＬＤＨが測定
値に影響を与えるので、ＬＤＨの測定以外の場合には、
反応系にＬＤＨ阻害剤（例えば、オキサミン酸及びその
塩、蓚酸及びその塩等）を必ず添加する必要がある。し
かし、ＮＡＤＰ+はＬＤＨの基質とならないので、本発
明の方法においてＮＡＤＰ+を用いることにより、かか
る問題を解消することができる。測定対象である生体物
質を含有する検体としては、例えば、血清、血漿、尿、
髄液などが例示される。
【００３８】
【発明の効果】本発明の測定方法では、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
類の生成量に基づいて生体物質を測定するので測定限界
が高く、また分子吸光係数が明確になっているＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ類を測定するので、測定値の信頼性が高い。更
に、本発明の測定方法は、検体中の還元性物質などの影
響を受けないという利点を有する。従って、本発明によ
れば、生体物質を簡便にして高精度で測定することがで
き、自動分析にも容易に適用することができるという効
果を奏する。
類の生成量に基づいて生体物質を測定するので測定限界
が高く、また分子吸光係数が明確になっているＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ類を測定するので、測定値の信頼性が高い。更
に、本発明の測定方法は、検体中の還元性物質などの影
響を受けないという利点を有する。従って、本発明によ
れば、生体物質を簡便にして高精度で測定することがで
き、自動分析にも容易に適用することができるという効
果を奏する。
【００３９】
【実施例】以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。なお、以下の実施例において、ＰＤＣは大腸
菌由来を、ＡｌＤＨは酵母又は大腸菌由来を、ＰＫはブ
タ心臓由来を用いた。
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。なお、以下の実施例において、ＰＤＣは大腸
菌由来を、ＡｌＤＨは酵母又は大腸菌由来を、ＰＫはブ
タ心臓由来を用いた。
【００４０】実施例１ピルビン酸の定量 測定試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ５０ ｍＭ ｐＨ７．５ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＮＡＤＰ+ ２．５ｍＭ ＰＤＣ １．０単位／ｍｌ ＡｌＤＨ ２．０単位／ｍｌ 測定方法：ピルビン酸ナトリウムを約１３ｍＭの水溶
液に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作
成する。測定試薬１．０ｍｌに上記ピルビン酸サンプル
２０μｌを加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの
吸光度で、試薬ブランクを対照に測定する。図１に示す
ようにピルビン酸が定量的に測定できた。
液に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作
成する。測定試薬１．０ｍｌに上記ピルビン酸サンプル
２０μｌを加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの
吸光度で、試薬ブランクを対照に測定する。図１に示す
ようにピルビン酸が定量的に測定できた。
【００４１】実施例２ＡＤＰの定量 測定試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ５０ ｍＭ ｐＨ７．５ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＮＡＤＰ+ ２．５ｍＭ ＰＤＣ １．０単位／ｍｌ ＡｌＤＨ ２．０単位／ｍｌ ＰＥＰ １．２５ｍＭ ＰＫ ２．０単位／ｍｌ 測定方法：ＡＤＰカリウムを約１３ｍＭの水溶液に調
製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成す
る。測定試薬１．０ｍｌにＡＤＰサンプル２０μｌを加
え３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブ
ランクを対照に測定する。図２に示すようにＡＤＰが定
量的に測定できた。
製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成す
る。測定試薬１．０ｍｌにＡＤＰサンプル２０μｌを加
え３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブ
ランクを対照に測定する。図２に示すようにＡＤＰが定
量的に測定できた。
【００４２】実施例３クレアチンの定量 測定試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ７５ ｍＭ ｐＨ７．５ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＮＡＤＰ+ ２．５ｍＭ ＰＤＣ １．０単位／ｍｌ ＡｌＤＨ ２．０単位／ｍｌ ＰＥＰ １．２５ｍＭ ＰＫ ２．０単位／ｍｌ ＡＴＰ ２．０ｍＭ ＣＰＫ ２．０単位／ｍｌ（ウサギ筋肉由来） 測定方法：クレアチンを約１３ｍＭの水溶液に調製
し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成する。
測定試薬１．０ｍｌにクレアチンサンプル２０μｌを加
え３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブ
ランクを対照に測定する。図３に示すようにクレアチン
が定量的に測定できた。
し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成する。
測定試薬１．０ｍｌにクレアチンサンプル２０μｌを加
え３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブ
ランクを対照に測定する。図３に示すようにクレアチン
が定量的に測定できた。
【００４３】実施例４クレアチニンの定量 測定試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ７５ ｍＭ ｐＨ７．５ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＮＡＤＰ+ ２．５ｍＭ ＰＤＣ １．０単位／ｍｌ ＡｌＤＨ ２．０単位／ｍｌ ＰＥＰ １．２５ｍＭ ＰＫ ２．０単位／ｍｌ ＡＴＰ ２．０ｍＭ ＣＰＫ ２．０単位／ｍｌ（ウサギ筋肉由来） クレアチニンアミドヒドロラーゼ(C1) １００ 単位／ｍｌ（微生物由来） 測定方法：クレアチニンを約１４ｍＭの水溶液に調製
し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成する。
測定試薬１．０ｍｌにクレアチニンサンプル２０μｌを
加え３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を、試
薬ブランクを対照に測定する。図４に示すようにクレア
ニチンが定量的に測定できた。
し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成する。
測定試薬１．０ｍｌにクレアチニンサンプル２０μｌを
加え３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を、試
薬ブランクを対照に測定する。図４に示すようにクレア
ニチンが定量的に測定できた。
【００４４】実施例５ＮＡＤ+及びＮＡＤＰ+の定量 測定試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 １００ ｍＭ ｐＨ８．０ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＰＤＣ １．０単位／ｍｌ ＡｌＤＨ ２．０単位／ｍｌ ピルビン酸ナトリウム ４．０ｍＭ 測定方法：ＮＡＤ+及びＮＡＤＰ+をそれぞれ約１４ｍ
Ｍの水溶液に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサン
プルを作成する。測定試薬１．０ｍｌに、上記のＮＡＤ
+サンプル又はＮＡＤＰ+サンプルを２０μｌを加え３７
℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を、試薬ブラン
クを対照に測定する。図５及び図６に示すようにＮＡＤ
（Ｐ）+が定量的に測定できた。
Ｍの水溶液に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサン
プルを作成する。測定試薬１．０ｍｌに、上記のＮＡＤ
+サンプル又はＮＡＤＰ+サンプルを２０μｌを加え３７
℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を、試薬ブラン
クを対照に測定する。図５及び図６に示すようにＮＡＤ
（Ｐ）+が定量的に測定できた。
【００４５】実施例６ＬＤＨの測定 測定試薬 ジエタノールアミン緩衝液 ０．１５Ｍ ｐＨ８．０ 乳酸リチウム ３０ ｍＭ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＮＡＤ+ ２．５ｍＭ ＰＤＣ １．０単位／ｍｌ ＡｌＤＨ ２．０単位／ｍｌ 対照試薬 ジエタノールアミン緩衝液 ０．１５Ｍ ｐＨ８．０ 乳酸リチウム ３０ ｍＭ ＮＡＤ+ ２．５ｍＭ 測定方法：測定試薬２．８ｍｌにヒト由来ＬＤＨ（Ｌ
Ｄ−１）２００μｌを加え、３７℃、３４０ｎｍの吸光
度変化を記録し、１分間当りの吸光度変化量を試薬ブラ
ンク対照に計算する。同様に、対照試薬２．８ｍｌにヒ
ト由来ＬＤＨ（ＬＤ−１）２００μｌを、加え３７℃、
３４０ｎｍの吸光度変化を記録し、１分間当り吸光度変
化量を試薬ブランク対照に計算する。各測定試薬での反
応経過を図７に示し、また１分間当りの吸光度変化量を
表１に示す。
Ｄ−１）２００μｌを加え、３７℃、３４０ｎｍの吸光
度変化を記録し、１分間当りの吸光度変化量を試薬ブラ
ンク対照に計算する。同様に、対照試薬２．８ｍｌにヒ
ト由来ＬＤＨ（ＬＤ−１）２００μｌを、加え３７℃、
３４０ｎｍの吸光度変化を記録し、１分間当り吸光度変
化量を試薬ブランク対照に計算する。各測定試薬での反
応経過を図７に示し、また１分間当りの吸光度変化量を
表１に示す。
【００４６】
【表１】
【００４７】図７に示されるように、対照試薬での反応
においては直線部分が短く、その後、生成物（ピルビン
酸）阻害を受け反応が抑制される。それに対して、本発
明の測定方法においては、生成ピルビン酸の影響を回避
できるので直線部分が長く、また感度も高い。現在使用
されているＬＤＨ測定（乳酸→ピルビン酸)は対照試薬
のように初速度しか測定することができないが、ＰＤＣ
及びＡｌＤＨを共役させることにより長い範囲での測定
が可能であり感度が２倍に上昇する。ＬＤＨやＭＤＨの
ように、ＮＡＤ+又はＮＡＤＰ+を補酵素とし且つ反応系
を共役させることによりピルビン酸生成に導ける活性測
定法において、ＰＤＣ及びＡｌＤＨを共役させること
は、反応直線性の向上と感度の上昇が得られ、低活性の
ものの測定に有利である。
においては直線部分が短く、その後、生成物（ピルビン
酸）阻害を受け反応が抑制される。それに対して、本発
明の測定方法においては、生成ピルビン酸の影響を回避
できるので直線部分が長く、また感度も高い。現在使用
されているＬＤＨ測定（乳酸→ピルビン酸)は対照試薬
のように初速度しか測定することができないが、ＰＤＣ
及びＡｌＤＨを共役させることにより長い範囲での測定
が可能であり感度が２倍に上昇する。ＬＤＨやＭＤＨの
ように、ＮＡＤ+又はＮＡＤＰ+を補酵素とし且つ反応系
を共役させることによりピルビン酸生成に導ける活性測
定法において、ＰＤＣ及びＡｌＤＨを共役させること
は、反応直線性の向上と感度の上昇が得られ、低活性の
ものの測定に有利である。
【００４８】実施例７血中クレアチニンの測定 測定試薬 第１試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ７５ ｍＭ ｐＨ７．５ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＡｌＤＨ ２．０単位／ｍｌ ＮＡＤＰ+ ２．５ｍＭ ＰＤＣ １．０単位／ｍｌ ＰＥＰ １．２５ｍＭ ＰＫ ２．０単位／ｍｌ ＡＴＰ ２．０ｍＭ ＣＰＫ ２．０単位／ｍｌ（ウサギ筋肉由来） 第２試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ７５ ｍＭ ｐＨ７．５ Creatinine amidohydrolase １０００ 単位／ｍｌ 測定方法：血清５μｌに第１試薬３１５μｌを加え、
３７℃、５分間加温後、３４０ｎｍの吸光度（Ａ1）を
測定し、さらに第２試薬３５μｌを加え、３７℃、５分
間加温し、３４０ｎｍの吸光度（Ａ2）を測定する。Ａ2
とＡ1より吸光度変化量を計算する。血清検体に代え、
クレアチニン標準液（５ｍｇ／ｄｌ）及び精製水につい
ても同様に測定し、その値を用いて血中クレアチニン濃
度を算出する。対照法としてJaffe法を用いた市販の試
薬を用いて、同じ検体を測定した。その結果を表２に示
す。表２に示されるようによい相関性(Y=1.02X-0.22)を
示した。
３７℃、５分間加温後、３４０ｎｍの吸光度（Ａ1）を
測定し、さらに第２試薬３５μｌを加え、３７℃、５分
間加温し、３４０ｎｍの吸光度（Ａ2）を測定する。Ａ2
とＡ1より吸光度変化量を計算する。血清検体に代え、
クレアチニン標準液（５ｍｇ／ｄｌ）及び精製水につい
ても同様に測定し、その値を用いて血中クレアチニン濃
度を算出する。対照法としてJaffe法を用いた市販の試
薬を用いて、同じ検体を測定した。その結果を表２に示
す。表２に示されるようによい相関性(Y=1.02X-0.22)を
示した。
【００４９】
【表２】
【００５０】実施例８血中尿素窒素の測定 測定試薬 第１試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ７５ ｍＭ ｐＨ８．０ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＡｌＤＨ ２．０単位／ｍｌ ＮＡＤＰ+ ２．５ｍＭ ＰＤＣ １．０単位／ｍｌ ＰＥＰ １．２５ｍＭ ＰＫ ２．０単位／ｍｌ ＡＴＰ ２．０ｍＭ ＫＣｌ １０ ｍＭ ＫａＨＣＯ3 ８．０ｍＭ 第２試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ７５ ｍＭ ｐＨ８．０ ウレアアミドリアーゼ ３０ 単位／ｍｌ 測定方法：血清３μｌに第１試薬３６０μｌを加え、
３７℃、５分間加温後、３４０ｎｍの吸光度（Ａ1）を
測定し、さらに第２試薬４０μｌを加え、３７℃、５分
間加温し、３４０ｎｍの吸光度（Ａ2）を測定する。Ａ2
とＡ1より吸光度変化量を計算する。血清検体に代え、
尿素窒素標準液（３０ｍｇ／ｄｌ）及び精製水について
も同様に測定し、その値を用いて血中尿素窒素濃度を算
出する。対照法としてＧＬＤＨ−ウレアーゼ法を用いた
市販の試薬を用いて同じ検体を測定した。その結果を表
３に示す。表３に示されるようによい相関性(Y=0.97X+
0.12)を示した。
３７℃、５分間加温後、３４０ｎｍの吸光度（Ａ1）を
測定し、さらに第２試薬４０μｌを加え、３７℃、５分
間加温し、３４０ｎｍの吸光度（Ａ2）を測定する。Ａ2
とＡ1より吸光度変化量を計算する。血清検体に代え、
尿素窒素標準液（３０ｍｇ／ｄｌ）及び精製水について
も同様に測定し、その値を用いて血中尿素窒素濃度を算
出する。対照法としてＧＬＤＨ−ウレアーゼ法を用いた
市販の試薬を用いて同じ検体を測定した。その結果を表
３に示す。表３に示されるようによい相関性(Y=0.97X+
0.12)を示した。
【００５１】
【表３】
【００５２】実施例９血中シアル酸の測定 測定試薬 第１試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ７５ ｍＭ ｐＨ７．５ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＡｌＤＨ ２．０単位／ｍｌ ＮＡＤＰ+ ２．５ｍＭ ＰＤＣ １．０単位／ｍｌ Neuraminidase (ND) ２．０単位／ｍｌ 第２試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ７５ ｍＭ ｐＨ７．５ N-Acetylneuraminate aldolase (NAL) ２００単位／ｍｌ 測定方法：血清７μｌに第１試薬３１５μｌを加え、
３７℃、５分間加温後、３４０ｎｍの吸光度（Ａ1）を
測定し、さらに第２試薬３５μｌを加え、３７℃、５分
間加温し、３４０ｎｍの吸光度（Ａ2）を測定する。Ａ2
とＡ1より吸光度変化量を計算する。血清検体に代え、
シアル酸標準液［Ｎ−アセチルノイラミン酸(NANA)１０
０ｍｇ／ｄｌ］及び精製水についても同様に測定し、そ
の値を用いて血中シアル酸濃度を算出する。対照法とし
てＮＤ−ＮＡＬ−ＬＤＨ法を用いた市販品を用いて、同
じ検体について測定した。その結果を表４に示す。表４
に示されるようによい相関性(Y=1.00X-0.31)を示した。
３７℃、５分間加温後、３４０ｎｍの吸光度（Ａ1）を
測定し、さらに第２試薬３５μｌを加え、３７℃、５分
間加温し、３４０ｎｍの吸光度（Ａ2）を測定する。Ａ2
とＡ1より吸光度変化量を計算する。血清検体に代え、
シアル酸標準液［Ｎ−アセチルノイラミン酸(NANA)１０
０ｍｇ／ｄｌ］及び精製水についても同様に測定し、そ
の値を用いて血中シアル酸濃度を算出する。対照法とし
てＮＤ−ＮＡＬ−ＬＤＨ法を用いた市販品を用いて、同
じ検体について測定した。その結果を表４に示す。表４
に示されるようによい相関性(Y=1.00X-0.31)を示した。
【００５３】
【表４】
【００５４】実施例１０血中中性脂肪の測定 測定試薬 第１試薬 リン酸緩衝液 ５０ ｍＭ ｐＨ７．５ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＡｌＤＨ ２．０単位／ｍｌ ＮＡＤＰ+ ２．５ｍＭ ＰＤＣ １．０単位／ｍｌ ＰＥＰ １．２５ｍＭ ＰＫ ２．０単位／ｍｌ ＡＴＰ ２．０ｍＭ ＧＫ １．０単位／ｍｌ トライトンＸ−１００ ０．０３％（Ｗ／Ｖ） 第２試薬 リン酸緩衝液 ５０ ｍＭ ｐＨ７．５ リポプロテイン リパーゼ １５００ 単位／ｍｌ 測定方法：血清５μｌに第１試薬３６０μｌを加え、
３７℃、５分間加温後、３４０ｎｍの吸光度（Ａ1）を
測定し、さらに第２試薬４０μｌを加え、３７℃、５分
間加温し、３４０ｎｍの吸光度（Ａ2）を測定する。Ａ2
とＡ1より吸光度変化量を計算する。血清検体に代え、
ＴＧ標準液（２００ｍｇ／ｄｌ）及び精製水についても
同様に測定し、その値を用いて血中中性脂肪濃度を算出
する。対照法としてＬＰＬ−ＧＫ−ＧＰＯ法を用いた市
販の試薬を用いて、同じ検体を測定した。その結果を表
５に示す。表５に示されるようによい相関性(Y=1.00X+
1.21)を示した。
３７℃、５分間加温後、３４０ｎｍの吸光度（Ａ1）を
測定し、さらに第２試薬４０μｌを加え、３７℃、５分
間加温し、３４０ｎｍの吸光度（Ａ2）を測定する。Ａ2
とＡ1より吸光度変化量を計算する。血清検体に代え、
ＴＧ標準液（２００ｍｇ／ｄｌ）及び精製水についても
同様に測定し、その値を用いて血中中性脂肪濃度を算出
する。対照法としてＬＰＬ−ＧＫ−ＧＰＯ法を用いた市
販の試薬を用いて、同じ検体を測定した。その結果を表
５に示す。表５に示されるようによい相関性(Y=1.00X+
1.21)を示した。
【００５５】
【表５】
【００５６】実施例１１血中ＬＤＨの測定 測定試薬 第１試薬 ジエタノールアミン緩衝液 ０．３Ｍ ｐＨ８．８ Ｌ−Lactate ７５ ｍＭ ＴＰＰ ０．３ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．５ｍＭ ＰＤＣ １．０単位／ｍｌ ＡｌＤＨ ２．０単位／ｍｌ 第２試薬 ジエタノールアミン緩衝液 ０．３Ｍ ｐＨ８．８ ＮＡＤ+ ３０ ｍＭ 対照試薬 第１試薬 ジエタノールアミン緩衝液 ０．３Ｍ ｐＨ８．８ Ｌ−Lactate ７５ ｍＭ 第２試薬 ジエタノールアミン緩衝液 ０．３Ｍ ｐＨ８．８ ＮＡＤ+ ３０ ｍＭ 測定方法：血清８μｌに第１試薬３２０μｌを加え、
３７℃、５分間加温後、第２試薬８０μｌを加え３７℃
で１分から５分の反応直線部分の１分間当りの３４０ｎ
ｍの吸光度変化を測定する。同様に、精製水でも操作
し、検体の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化量を算
出する。対照試薬も同様に操作するが、第２試薬添加
後、３７℃で３０秒から２分までの反応直線部分(初速
度)の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化量を算出す
る。その結果を表６に示す。表６に示されるようによい
相関性（Y=2.03X）を示した。
３７℃、５分間加温後、第２試薬８０μｌを加え３７℃
で１分から５分の反応直線部分の１分間当りの３４０ｎ
ｍの吸光度変化を測定する。同様に、精製水でも操作
し、検体の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化量を算
出する。対照試薬も同様に操作するが、第２試薬添加
後、３７℃で３０秒から２分までの反応直線部分(初速
度)の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化量を算出す
る。その結果を表６に示す。表６に示されるようによい
相関性（Y=2.03X）を示した。
【００５７】
【表６】
【００５８】実施例１２血中ＭＤＨの測定 測定試薬 第１試薬 モノエタノールアミン緩衝液 ０．３Ｍ ｐＨ８．８ ＮＡＤ+ ７．０ｍＭ ＴＰＰ ０．３ｍＭ ＭｇＣｌ3 １．５ｍＭ ＰＤＣ １．０単位／ｍｌ ＡｌＤＨ ２．０単位／ｍｌ オキサミン酸カリウム ３５ ｍＭ 第２試薬 モノエタノールアミン緩衝液 ０．３Ｍ ｐＨ８．８ Ｌ−Malate ０．２Ｍ オキサロ酢酸脱炭酸酵素 ５０単位／ｍｌ 対照試薬 第１試薬 モノエタノールアミン緩衝液 ０．３Ｍ ｐＨ８．８ ＮＡＤ+ ７．０ｍＭ 第２試薬 モノエタノールアミン緩衝液 ０．３Ｍ ｐＨ８．８ Ｌ−Malate ０．２Ｍ 測定方法：血清１４μｌに第１試薬２８０μｌを加
え、３７℃、５分間加温する（この時、内因性のピルビ
ン酸の消去を行う）。その後、第２試薬７０μｌを加え
３７℃で１分から５分の反応直線部分の１分間当りの３
４０ｎｍの吸光度変化を測定する。同様に、精製水でも
操作し、検体の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化量
を算出する。対照試薬も同様に操作し、検体の１分間当
りの３４０ｎｍの吸光度変化量を算出する。その結果を
表７に示す。表７に示されるように、よい相関性(Y=1.9
9X)を示した。
え、３７℃、５分間加温する（この時、内因性のピルビ
ン酸の消去を行う）。その後、第２試薬７０μｌを加え
３７℃で１分から５分の反応直線部分の１分間当りの３
４０ｎｍの吸光度変化を測定する。同様に、精製水でも
操作し、検体の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化量
を算出する。対照試薬も同様に操作し、検体の１分間当
りの３４０ｎｍの吸光度変化量を算出する。その結果を
表７に示す。表７に示されるように、よい相関性(Y=1.9
9X)を示した。
【００５９】
【表７】
【００６０】実施例１３血中ＭＤＨ測定の再現性 測定試薬 実施例１２に同じ。 測定方法 実施例１２に同じ。同一検体について、１０回測定す
る。その結果を表８に示す。表８に示されるように、高
感度となることにより、再現性もよくなる。
る。その結果を表８に示す。表８に示されるように、高
感度となることにより、再現性もよくなる。
【００６１】
【表８】
【００６２】実施例１４血中ＡＬＴの測定 測定試薬 第１試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ０．１Ｍ ｐＨ７．５ Ｌ−アラニン ３５０ ｍＭ ＮＡＤＰ+ ３．０ｍＭ ＴＰＰ ０．３ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．５ｍＭ ＰＤＣ １．０単位／ｍｌ ＡｌＤＨ ２．０単位／ｍｌ 第２試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ０．１Ｍ ｐＨ７．５ α−ケトグルタル酸 ５０ ｍＭ 測定方法：血清１５μｌに第１試薬３５０μｌを加
え、３７℃、５分間加温する（この時、内因性のピルビ
ン酸の消去を行う）。その後、第２試薬１００μｌを加
え３７℃で１分から５分の反応直線部分の１分間当りの
３４０ｎｍの吸光度変化を測定する。同様に、精製水で
も操作し、検体の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化
量を算出する。また、ＮＡＤＰＨの見かけの分子吸光係
数を用いて求めたFactor(4984)を乗じ、ＡＬＴ活性（Ｉ
Ｕ／Ｌ）を導く。対照法としてＬＤＨ法を用いた市販の
試薬を用いてＡＬＴ活性（ＩＵ／Ｌ）を求める。その結
果を表９に示す。表９に示されるようによい相関性(Y=
1.02X-0.23)を示した。
え、３７℃、５分間加温する（この時、内因性のピルビ
ン酸の消去を行う）。その後、第２試薬１００μｌを加
え３７℃で１分から５分の反応直線部分の１分間当りの
３４０ｎｍの吸光度変化を測定する。同様に、精製水で
も操作し、検体の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化
量を算出する。また、ＮＡＤＰＨの見かけの分子吸光係
数を用いて求めたFactor(4984)を乗じ、ＡＬＴ活性（Ｉ
Ｕ／Ｌ）を導く。対照法としてＬＤＨ法を用いた市販の
試薬を用いてＡＬＴ活性（ＩＵ／Ｌ）を求める。その結
果を表９に示す。表９に示されるようによい相関性(Y=
1.02X-0.23)を示した。
【００６３】
【表９】
【００６４】実施例１５血中ＡＳＴの測定 測定試薬 第１試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ０．１Ｍ ｐＨ７．８ Ｌ−アスパラギン酸 ２７０ ｍＭ ＮＡＤＰ+ ３．０ｍＭ ＴＰＰ ０．３ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．５ｍＭ ＰＤＣ １．０単位／ｍｌ ＡｌＤＨ ２．０単位／ｍｌ 第２試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ０．１Ｍ ｐＨ７．８ α−ケトグルタル酸 ５０ ｍＭ 測定方法：血清１５μｌに第１試薬３５０μｌを加
え、３７℃、５分間加温する（この時、内因性のピルビ
ン酸の消去を行う）。その後、第２試薬１００μｌを加
え３７℃で１分から５分の反応直線部分の１分間当りの
３４０ｎｍの吸光度変化を測定する。同様に、精製水で
も操作し、検体の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化
量を算出する。また、ＮＡＤＰＨの見かけの分子吸光係
数を用いて求めたFactor(4984)を乗じ、ＡＳＴ活性（Ｉ
Ｕ／Ｌ）を導く。対照法としてＭＤＨ法を用いた市販の
試薬を用いてＡＳＴ活性（ＩＵ／Ｌ）を求める。その結
果を表１０に示す。表１０に示されるようによい相関性
(Y=1.00X+0.31)を示した。
え、３７℃、５分間加温する（この時、内因性のピルビ
ン酸の消去を行う）。その後、第２試薬１００μｌを加
え３７℃で１分から５分の反応直線部分の１分間当りの
３４０ｎｍの吸光度変化を測定する。同様に、精製水で
も操作し、検体の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化
量を算出する。また、ＮＡＤＰＨの見かけの分子吸光係
数を用いて求めたFactor(4984)を乗じ、ＡＳＴ活性（Ｉ
Ｕ／Ｌ）を導く。対照法としてＭＤＨ法を用いた市販の
試薬を用いてＡＳＴ活性（ＩＵ／Ｌ）を求める。その結
果を表１０に示す。表１０に示されるようによい相関性
(Y=1.00X+0.31)を示した。
【００６５】
【表１０】
【００６６】実施例１６ピルビン酸の定量 （チオ−ＮＡＤ+を用いた例） 測定試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ５０ ｍＭ ｐＨ７．５ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＡｌＤＨ ２．０単位／ｍｌ チオ−ＮＡＤ+ ２．５ｍＭ ＰＤＣ １．０単位／ｍｌ 測定方法：ピルビン酸ナトリウムを約１３ｍＭの水溶
液に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作
成する。測定試薬１．０ｍｌに上記ピルビン酸サンプル
１０μｌを加え、３７℃、５分間加温後の４０５ｎｍの
吸光度で、試薬ブランクを対照に測定する。図８に示す
ようにピルビン酸が定量的に測定できた。
液に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作
成する。測定試薬１．０ｍｌに上記ピルビン酸サンプル
１０μｌを加え、３７℃、５分間加温後の４０５ｎｍの
吸光度で、試薬ブランクを対照に測定する。図８に示す
ようにピルビン酸が定量的に測定できた。
【００６７】実施例１７チオ−ＮＡＤ+の定量 測定試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 １００ ｍＭ ｐＨ８．０ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＡｌＤＨ ２．０単位／ｍｌ ＰＤＣ １．０単位／ｍｌ ピルビン酸ナトリウム ４．０ｍＭ 測定方法：チオ−ＮＡＤ+を約７ｍＭの水溶液に調製
し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成する。
測定試薬１．０ｍｌにチオ−ＮＡＤ+サンプル１０μｌ
を加え、３７℃、５分間加温後の４０５ｎｍの吸光度
を、試薬ブランクを対照に測定する。図９に示すように
チオ−ＮＡＤ+が定量的に測定できた。
し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成する。
測定試薬１．０ｍｌにチオ−ＮＡＤ+サンプル１０μｌ
を加え、３７℃、５分間加温後の４０５ｎｍの吸光度
を、試薬ブランクを対照に測定する。図９に示すように
チオ−ＮＡＤ+が定量的に測定できた。
【００６８】実施例１８血中尿素窒素の測定 （チオ−ＮＡＤＰ+を使用する方法） 測定試薬 第１試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ７５ ｍＭ ｐＨ８．０ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＡｌＤＨ ２．０単位／ｍｌ チオ−ＮＡＤＰ+ ２．５ｍＭ ＰＤＣ １．０単位／ｍｌ ＰＥＰ １．２５ｍＭ ＰＫ ２．０単位／ｍｌ ＡＴＰ ２．０ｍＭ ＫＣｌ １０ ｍＭ ＫａＨＣＯ3 ８．０ｍＭ 第２試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ７５ ｍＭ ｐＨ８．０ ウレアアミドリアーゼ ３０ 単位／ｍｌ 測定方法：血清５μｌに第１試薬３６０μｌを加え、
３７℃、５分間加温後、４３６ｎｍの吸光度（Ａ1）を
測定し、さらに第２試薬４０μｌを加え、３７℃、５分
間加温し、４３６ｎｍの吸光度（Ａ2）を測定する。Ａ1
とＡ2より吸光度変化量を計算する。血清検体に代え、
尿素窒素標準液（３０ｍｇ／ｄｌ）及び精製水について
も同様に測定し、その値を用いて血中尿素窒素濃度を算
出する。対照法としてＧＬＤＨ−ウレアーゼ法を用いた
市販の試薬を用いて同じ検体を測定した。その結果を表
１１に示す。表１１に示されるようによい相関性(Y=1.0
1X-0.28)を示した。
３７℃、５分間加温後、４３６ｎｍの吸光度（Ａ1）を
測定し、さらに第２試薬４０μｌを加え、３７℃、５分
間加温し、４３６ｎｍの吸光度（Ａ2）を測定する。Ａ1
とＡ2より吸光度変化量を計算する。血清検体に代え、
尿素窒素標準液（３０ｍｇ／ｄｌ）及び精製水について
も同様に測定し、その値を用いて血中尿素窒素濃度を算
出する。対照法としてＧＬＤＨ−ウレアーゼ法を用いた
市販の試薬を用いて同じ検体を測定した。その結果を表
１１に示す。表１１に示されるようによい相関性(Y=1.0
1X-0.28)を示した。
【００６９】
【表１１】
【００７０】実施例１９ピルビン酸の定量 （３−アセチル−ＮＡＤ+を使用する
方法） 測定試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ５０ ｍＭ ｐＨ７．５ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＡｌＤＨ ２．０単位／ｍｌ ３−アセチル−ＮＡＤ+ ２．５ｍＭ ＰＤＣ １．０単位／ｍｌ 測定方法：ピルビン酸ナトリウムを約１３ｍＭの水溶
液に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作
成する。測定試薬１．０ｍｌに上記ピルビン酸サンプル
２０μｌを加え、３７℃、１０分間加温後の３４０ｎｍ
の吸光度で、試薬ブランクを対照に測定する。図１０に
示すようにピルビン酸が定量的に測定できた。
方法） 測定試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ５０ ｍＭ ｐＨ７．５ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＡｌＤＨ ２．０単位／ｍｌ ３−アセチル−ＮＡＤ+ ２．５ｍＭ ＰＤＣ １．０単位／ｍｌ 測定方法：ピルビン酸ナトリウムを約１３ｍＭの水溶
液に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作
成する。測定試薬１．０ｍｌに上記ピルビン酸サンプル
２０μｌを加え、３７℃、１０分間加温後の３４０ｎｍ
の吸光度で、試薬ブランクを対照に測定する。図１０に
示すようにピルビン酸が定量的に測定できた。
【００７１】実施例２０ピルビン酸の定量 （デアミノ−ＮＡＤ+を使用する方
法） 測定試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ５０ ｍＭ ｐＨ７．５ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＡｌＤＨ ２．０単位／ｍｌ デアミノ−ＮＡＤ+ ２．５ｍＭ ＰＤＣ １．０単位／ｍｌ 測定方法：ピルビン酸ナトリウムを約１３ｍＭの水溶
液に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作
成する。測定試薬１．０ｍｌに上記ピルビン酸サンプル
２０μｌを加え、３７℃、２０分間加温後の３４０ｎｍ
の吸光度で、試薬ブランクを対照に測定する。図１１に
示すようにピルビン酸が定量的に測定できた。
法） 測定試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ５０ ｍＭ ｐＨ７．５ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＡｌＤＨ ２．０単位／ｍｌ デアミノ−ＮＡＤ+ ２．５ｍＭ ＰＤＣ １．０単位／ｍｌ 測定方法：ピルビン酸ナトリウムを約１３ｍＭの水溶
液に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作
成する。測定試薬１．０ｍｌに上記ピルビン酸サンプル
２０μｌを加え、３７℃、２０分間加温後の３４０ｎｍ
の吸光度で、試薬ブランクを対照に測定する。図１１に
示すようにピルビン酸が定量的に測定できた。
【００７２】実施例２１マグネシウムイオンの定量 測定試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ５０ ｍＭ ｐＨ７．５ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＡｌＤＨ ２．０単位／ｍｌ ＮＡＤＰ+ ２．５ｍＭ ＰＤＣ １．０単位／ｍｌ ピルビン酸ナトリウム ４．０ｍＭ 測定方法：塩化マグネシウムを約１０ｍＭの水溶液に
調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成す
る。測定試薬１．０ｍｌに上記塩化マグネシウムサンプ
ル１０μｌを加え、３７℃での２〜５分時の３４０ｎｍ
における１分間当りの吸光度変化量を試薬ブランクを対
照に測定する。図１２に示すようにマグネシウムイオン
が定量的に測定できた。
調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成す
る。測定試薬１．０ｍｌに上記塩化マグネシウムサンプ
ル１０μｌを加え、３７℃での２〜５分時の３４０ｎｍ
における１分間当りの吸光度変化量を試薬ブランクを対
照に測定する。図１２に示すようにマグネシウムイオン
が定量的に測定できた。
【００７３】実施例２２カリウムイオンの定量 測定試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ５０ ｍＭ ｐＨ７．５ ＴＰＰ ０．２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．０ｍＭ ＡＤＰ ３．０ｍＭ ＡｌＤＨ ２．０単位／ｍｌ ＮＡＤＰ+ ２．５ｍＭ ＰＥＰ １．０ｍＭ ＰＫ ０．１単位／ｍｌ ＰＤＣ １．０単位／ｍｌ 測定方法：塩化カリウムを約１０ｍＭの水溶液に調製
し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成する。
測定試薬１．０ｍｌに上記塩化カリウムサンプル１０μ
ｌを加え、３７℃での２〜５分時の３４０ｎｍにおける
１分間当りの吸光度変化量を試薬ブランクを対照に測定
する。図１３に示すようにカリウムイオンが定量的に測
定できた。
し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成する。
測定試薬１．０ｍｌに上記塩化カリウムサンプル１０μ
ｌを加え、３７℃での２〜５分時の３４０ｎｍにおける
１分間当りの吸光度変化量を試薬ブランクを対照に測定
する。図１３に示すようにカリウムイオンが定量的に測
定できた。
【００７４】実施例２３血中コリンエステラーゼの測定 測定試薬 第１試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ０．１ Ｍ ｐＨ８．０ ＴＰＰ ０．２ ｍＭ ＭｇＣｌ2 １２．５ ｍＭ ＡｌＤＨ ２．０ 単位／ｍｌ ＮＡＤＰ+ ３．０ ｍＭ ＰＤＣ １．０ 単位／ｍｌ ＰＥＰ １．２５ｍＭ ＰＫ ５．０ 単位／ｍｌ ＡＴＰ １．２５ｍＭ ＫＣｌ ０．２ Ｍ システイン １５ ｍＭ コリンキナーゼ １ 単位／ｍｌ（酵母由来） 第２試薬 トリス−ＨＣｌ緩衝液 ７５ ｍＭ ｐＨ７．５ ｏ−ヒドロキシベンゾイルコリン ５ ｍＭ 測定方法：検体４μｌに第１試薬２８０μｌを加え、
３７℃、５分間加温する。つぎに第２試薬７０μｌを加
え、３７℃で１分〜５分の反応直線部分の１分間当りの
３４０ｎｍの吸光度変化量（Ａ）を求める。検体の代り
に精製水を用い、同様な操作を行い、１分間当りの３４
０ｎｍの吸光度変化量を（Ｂ）を求め、下式によりコリ
ンエステラーゼ活性値（Ｕ／Ｌ）を算出する。 ここで、検体としてコリンエステラーゼを高値に含む血
清を１／１０、１／５、２／５、３／５、４／５、５／
５に希釈して用い、検量線を作成した。その結果を図１
４に示す。図１４に示されるように良好な直線性に示し
た。次に、対照法として、ＤＭＢＴ（２，３−ジメトキ
シベンゾイルチオコリンヨーダイト）を用いた市販の試
薬を用いて、同じ検体についてコリンエステラーゼ活性
値（Ｕ／Ｌ）を求めた。その結果を表１２に示す。表１
２に示されるように、よい相関性［相関係数（ｒ）＝
０．９９９］を示した。
３７℃、５分間加温する。つぎに第２試薬７０μｌを加
え、３７℃で１分〜５分の反応直線部分の１分間当りの
３４０ｎｍの吸光度変化量（Ａ）を求める。検体の代り
に精製水を用い、同様な操作を行い、１分間当りの３４
０ｎｍの吸光度変化量を（Ｂ）を求め、下式によりコリ
ンエステラーゼ活性値（Ｕ／Ｌ）を算出する。 ここで、検体としてコリンエステラーゼを高値に含む血
清を１／１０、１／５、２／５、３／５、４／５、５／
５に希釈して用い、検量線を作成した。その結果を図１
４に示す。図１４に示されるように良好な直線性に示し
た。次に、対照法として、ＤＭＢＴ（２，３−ジメトキ
シベンゾイルチオコリンヨーダイト）を用いた市販の試
薬を用いて、同じ検体についてコリンエステラーゼ活性
値（Ｕ／Ｌ）を求めた。その結果を表１２に示す。表１
２に示されるように、よい相関性［相関係数（ｒ）＝
０．９９９］を示した。
【００７５】
【表１２】
【図１】本発明の方法によるピルビン酸の測定の検量線
を示す図である（ＮＡＤ（Ｐ）+類としてＮＡＤＰ+を使
用）。
を示す図である（ＮＡＤ（Ｐ）+類としてＮＡＤＰ+を使
用）。
【図２】本発明の方法によるＡＤＰの測定の検量線を示
す図である（ＮＡＤ（Ｐ）+類としてＮＡＤＰ+を使
用）。
す図である（ＮＡＤ（Ｐ）+類としてＮＡＤＰ+を使
用）。
【図３】本発明の方法によるクレアチンの測定の検量線
を示す図である（ＮＡＤ（Ｐ）+類としてＮＡＤＰ+を使
用）。
を示す図である（ＮＡＤ（Ｐ）+類としてＮＡＤＰ+を使
用）。
【図４】本発明の方法によるクレアチニンの測定の検量
線を示す図である（ＮＡＤ（Ｐ）+類としてＮＡＤＰ+を
使用）。
線を示す図である（ＮＡＤ（Ｐ）+類としてＮＡＤＰ+を
使用）。
【図５】本発明の方法によるＮＡＤ+の測定の検量線を
示す図である。
示す図である。
【図６】本発明の方法によるＮＡＤＰ+の測定の検量線
を示す図である。
を示す図である。
【図７】本発明の方法及び従来法によるＬＤＨの測定例
を示す図である。
を示す図である。
【図８】本発明の方法によるピルビン酸の測定の検量線
を示す図である（ＮＡＤ（Ｐ）+類としてチオ−ＮＡＤ+
を使用）。
を示す図である（ＮＡＤ（Ｐ）+類としてチオ−ＮＡＤ+
を使用）。
【図９】本発明の方法によるチオ−ＮＡＤ+の測定の検
量線を示す図である。
量線を示す図である。
【図１０】本発明の方法によるピルビン酸の測定の検量
線を示す図である（ＮＡＤ（Ｐ）+類として３−アセチ
ル−ＮＡＤ+を使用）。
線を示す図である（ＮＡＤ（Ｐ）+類として３−アセチ
ル−ＮＡＤ+を使用）。
【図１１】本発明の方法によるピルビン酸の測定の検量
線を示す図である（ＮＡＤ（Ｐ）+類としてデアミノ−
ＮＡＤ+を使用）。
線を示す図である（ＮＡＤ（Ｐ）+類としてデアミノ−
ＮＡＤ+を使用）。
【図１２】本発明の方法によるマグネシウムイオンの測
定の検量線を示す図である（ＮＡＤ（Ｐ）+類としてＮ
ＡＤＰ+を使用）。
定の検量線を示す図である（ＮＡＤ（Ｐ）+類としてＮ
ＡＤＰ+を使用）。
【図１３】本発明の方法によるカリウムイオンの測定の
検量線を示す図である（ＮＡＤ（Ｐ）+類としてＮＡＤ
Ｐ+を使用）。
検量線を示す図である（ＮＡＤ（Ｐ）+類としてＮＡＤ
Ｐ+を使用）。
【図１４】本発明の方法による血中コリンエステラーゼ
活性の測定例を示す図である（ＮＡＤ（Ｐ）+類として
ＮＡＤＰ+を使用）。
活性の測定例を示す図である（ＮＡＤ（Ｐ）+類として
ＮＡＤＰ+を使用）。
Claims (3)
- 【請求項１】 酵素反応を用いて生体物質を測定す
る方法において、ピルビン酸脱炭酸酵素及びアルデヒド
脱水素酵素の存在下、酸化型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（リン酸）類［以下、ＮＡＤ（Ｐ）+類と
いう］を還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（リン酸）類［以下、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類という］に還元
する反応を用い、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量に基づいて
生体物質を測定することを特徴とする生体物質の測定方
法。 - 【請求項２】 検体に、被検物質よりピルビン酸を
生成させる試薬、ＮＡＤ（Ｐ）+類、ピルビン酸脱炭酸
酵素及びアルデヒド脱水素酵素を反応させ、生成するＮ
ＡＤ（Ｐ）Ｈ類量に基づいて被検物質を測定する請求項
１記載の生体物質の測定方法。 - 【請求項３】 酵素反応を用いて生体物質を測定す
る方法において、当該方法がピルビン酸とＮＡＤ（Ｐ）
Ｈ+類を生成する酵素反応又はこの酵素反応を含む反応
系からなるとき、ピルビン酸脱炭酸酵素及びアルデヒド
脱水素酵素の存在下、ＮＡＤ（Ｐ）+類をＮＡＤ（Ｐ）
Ｈ類に還元する反応を、上記酵素反応又は酵素反応系と
共役させることにより、生成したピルビン酸を消費する
と共にＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量を増加させ、ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ類の生成量に基づいて生体物質を測定すること
を特徴とする生体物質の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17599693A JP3586737B2 (ja) | 1993-06-22 | 1993-06-22 | 生体物質の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17599693A JP3586737B2 (ja) | 1993-06-22 | 1993-06-22 | 生体物質の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH078297A true JPH078297A (ja) | 1995-01-13 |
| JP3586737B2 JP3586737B2 (ja) | 2004-11-10 |
Family
ID=16005889
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17599693A Expired - Fee Related JP3586737B2 (ja) | 1993-06-22 | 1993-06-22 | 生体物質の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3586737B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011103825A (ja) * | 2009-11-19 | 2011-06-02 | Nitto Boseki Co Ltd | Ａｄｐの測定方法およびａｄｐ測定用キット |
-
1993
- 1993-06-22 JP JP17599693A patent/JP3586737B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011103825A (ja) * | 2009-11-19 | 2011-06-02 | Nitto Boseki Co Ltd | Ａｄｐの測定方法およびａｄｐ測定用キット |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3586737B2 (ja) | 2004-11-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4361611B2 (ja) | 酵素活性および代謝産物の測定におけるｎａｄｐｈ類似体およびｎａｄｈ類似体の使用 | |
| EP0575610B1 (en) | Highly sensitive determination of ammonia, alpha-amino acid or alpha-keto acid and composition therefor | |
| US4241179A (en) | Method for determining a transaminase in a biological fluid and reagent combination for use in the method | |
| JP3588124B2 (ja) | 補酵素還元システムにより安定化されている試薬 | |
| JPH0220239B2 (ja) | ||
| JP3586737B2 (ja) | 生体物質の測定方法 | |
| JPH0686693A (ja) | 生体物質の測定方法 | |
| US5716797A (en) | Stable two-part reagent for the measurement of creatine kinase activity | |
| JP3036711B2 (ja) | 乳酸またはピルビン酸の高感度定量法および定量用組成物 | |
| JP2818696B2 (ja) | Ｎａｄｈキナーゼを用いる高感度定量法 | |
| JPH06277097A (ja) | 血清中の二酸化炭素の測定のための安定な単一液体試薬 | |
| JP2000232898A (ja) | 物質の定量方法および定量試薬 | |
| JP3034988B2 (ja) | イソクエン酸またはα−ケトグルタル酸の高感度定量法および定量用組成物 | |
| JP3159274B2 (ja) | 尿素窒素測定用組成物 | |
| JP3566976B2 (ja) | 生体成分中の測定対象の測定方法 | |
| AU710552B2 (en) | Reagent stabilized using coenzyme reduction system | |
| US20070048813A1 (en) | Agent for assaying analyte of patient by enzyme | |
| JP3674018B2 (ja) | 共役脱水素酵素反応の停止剤、停止方法および特定物質の測定方法 | |
| JP2980811B2 (ja) | アンモニウムイオンの定量方法 | |
| JPH08242893A (ja) | クレアチンキナーゼ活性測定用液状試薬 | |
| JPH05219991A (ja) | 酵素反応利用定量分析方法 | |
| JPH10136997A (ja) | 生体物質の定量方法 | |
| JPH06335400A (ja) | イオン化カルシウムの測定法 | |
| JP2000041698A (ja) | クレアチンキナーゼの活性測定用組成物及びクレアチンキナーゼの活性測定方法 | |
| JPH0220297A (ja) | コリンエステラーゼ活性の定量法及び定量用試薬 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20040309 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20040409 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Effective date: 20040722 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 |
|
| R150 | Certificate of patent (=grant) or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Year of fee payment: 6 Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100820 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |