JPH10136997A - 生体物質の定量方法 - Google Patents
生体物質の定量方法Info
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- JPH10136997A JPH10136997A JP30061896A JP30061896A JPH10136997A JP H10136997 A JPH10136997 A JP H10136997A JP 30061896 A JP30061896 A JP 30061896A JP 30061896 A JP30061896 A JP 30061896A JP H10136997 A JPH10136997 A JP H10136997A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 アンモニアを生成する反応を触媒するＮ
ＡＤＰＨ非依存型酵素またはその基質である生体物質の
定量方法であって、ＮＡＤＰＨ依存型アミノ酸デヒドロ
ゲナーゼ、その基質であるα−ケト酸およびＮＡＤＰＨ
を添加して内因性および外因性アンモニアを消去し、次
いでフォスファターゼによりＮＡＤＰＨをＮＡＤＨに変
換してから、該ＮＡＤＰＨ非依存型酵素によるアンモニ
ア生成反応を行わせ、さらにＮＡＤＨ依存型アミノ酸デ
ヒドロゲナーゼを作用させ、ＮＡＤＨの減少量を指標に
して該生体物質を定量する方法。特に、アミノ酸デヒド
ロゲナーゼがグルタミン酸デヒドロゲナーゼである上記
方法。また、上記生体物質定量用の試薬。 【効果】 本発明の方法によれば、内因性および外因性
アンモニアの影響を排除でき、より高精度の測定が可
能。
ＡＤＰＨ非依存型酵素またはその基質である生体物質の
定量方法であって、ＮＡＤＰＨ依存型アミノ酸デヒドロ
ゲナーゼ、その基質であるα−ケト酸およびＮＡＤＰＨ
を添加して内因性および外因性アンモニアを消去し、次
いでフォスファターゼによりＮＡＤＰＨをＮＡＤＨに変
換してから、該ＮＡＤＰＨ非依存型酵素によるアンモニ
ア生成反応を行わせ、さらにＮＡＤＨ依存型アミノ酸デ
ヒドロゲナーゼを作用させ、ＮＡＤＨの減少量を指標に
して該生体物質を定量する方法。特に、アミノ酸デヒド
ロゲナーゼがグルタミン酸デヒドロゲナーゼである上記
方法。また、上記生体物質定量用の試薬。 【効果】 本発明の方法によれば、内因性および外因性
アンモニアの影響を排除でき、より高精度の測定が可
能。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、試料中の生体物質
を、それを基質とする酵素反応により（生体物質が酵素
の場合はそれが触媒する反応により）生じるアンモニア
を指標として測定する系において、試料中に含まれる内
因性および外因性のアンモニアの影響を回避することが
できる生体物質測定方法に関する。特に本発明は、補酵
素特異性の異なる少なくとも２種のアミノ酸デヒドロゲ
ナーゼとフォスファターゼとを組み合わせることによ
り、内因性および外因性アンモニアを消去してから上記
生体物質を測定する方法である。また、本発明は、上記
測定方法による生体物質の定量のための試薬に関する。
を、それを基質とする酵素反応により（生体物質が酵素
の場合はそれが触媒する反応により）生じるアンモニア
を指標として測定する系において、試料中に含まれる内
因性および外因性のアンモニアの影響を回避することが
できる生体物質測定方法に関する。特に本発明は、補酵
素特異性の異なる少なくとも２種のアミノ酸デヒドロゲ
ナーゼとフォスファターゼとを組み合わせることによ
り、内因性および外因性アンモニアを消去してから上記
生体物質を測定する方法である。また、本発明は、上記
測定方法による生体物質の定量のための試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】血清、尿などの生体試料中の尿素窒素や
クレアチニンなどの成分の測定方法として、それらを基
質としてアンモニアを生成する酵素を作用させ、生じた
アンモニア量を測定する方法が従来より利用されてい
る。しかしながら、試料中に最初から内因性または外因
性のアンモニアが存在すると、測定値に正誤差を生じる
ことになる。内因性または外因性アンモニアの影響を回
避する手段として、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以
下、ＧＤＨという）とイソクエン酸デヒドロゲナーゼ
（以下、ＩＣＤＨという）とを共役させてアンモニアを
消去する方法が知られている（臨床検査機器・試薬，第
14巻，第183-188 頁，1991年）。しかし、この方法はＩ
ＣＤＨの基質であるイソクエン酸が高価なため、商業的
に用いる場合試薬を安価で提供できないという欠点を有
する。また、上記方法に代えてグルタミン酸合成酵素
（以下、ＧＳという）を用いてアンモニアを消去する方
法も報告されている（特開平1-187096号，特開平7-5109
4 号）。この場合、アンモニア消去後キレート剤により
ＧＳの反応を停止させてから目的の生体物質の測定を行
うが、反応停止が不完全な場合は測定値に負誤差を生じ
る。ＧＳの反応を完全に停止させるためには、予め特定
量のキレート剤の共存下でＧＳを作用させた後さらに多
量のキレート剤を添加する必要があり煩雑であった。
クレアチニンなどの成分の測定方法として、それらを基
質としてアンモニアを生成する酵素を作用させ、生じた
アンモニア量を測定する方法が従来より利用されてい
る。しかしながら、試料中に最初から内因性または外因
性のアンモニアが存在すると、測定値に正誤差を生じる
ことになる。内因性または外因性アンモニアの影響を回
避する手段として、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以
下、ＧＤＨという）とイソクエン酸デヒドロゲナーゼ
（以下、ＩＣＤＨという）とを共役させてアンモニアを
消去する方法が知られている（臨床検査機器・試薬，第
14巻，第183-188 頁，1991年）。しかし、この方法はＩ
ＣＤＨの基質であるイソクエン酸が高価なため、商業的
に用いる場合試薬を安価で提供できないという欠点を有
する。また、上記方法に代えてグルタミン酸合成酵素
（以下、ＧＳという）を用いてアンモニアを消去する方
法も報告されている（特開平1-187096号，特開平7-5109
4 号）。この場合、アンモニア消去後キレート剤により
ＧＳの反応を停止させてから目的の生体物質の測定を行
うが、反応停止が不完全な場合は測定値に負誤差を生じ
る。ＧＳの反応を完全に停止させるためには、予め特定
量のキレート剤の共存下でＧＳを作用させた後さらに多
量のキレート剤を添加する必要があり煩雑であった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、安価
で且つより簡便に内因性および外因性アンモニアの影響
を排除できる高精度な生体物質測定方法を提供すること
である。
で且つより簡便に内因性および外因性アンモニアの影響
を排除できる高精度な生体物質測定方法を提供すること
である。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＮＡＤＰＨ依存型
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、ＮＡＤＰＨ−Ｇ
ＤＨという）の作用により試料中の内因性および外因性
アンモニアを消去した後、フォスファターゼによってＮ
ＡＤＰＨを脱リン酸化してＮＡＤＰＨ−ＧＤＨの反応を
停止させ、さらに測定対象の生体物質から酵素反応によ
り生成されるアンモニアにＮＡＤＨ依存型グルタミン酸
デヒドロゲナーゼ（以下、ＮＡＤＨ−ＧＤＨという）を
作用させ、ＮＡＤＨの減少量を測定することにより測定
対象の生体物質を定量するという反応系を確立して本発
明を完成するに至った。
を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＮＡＤＰＨ依存型
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、ＮＡＤＰＨ−Ｇ
ＤＨという）の作用により試料中の内因性および外因性
アンモニアを消去した後、フォスファターゼによってＮ
ＡＤＰＨを脱リン酸化してＮＡＤＰＨ−ＧＤＨの反応を
停止させ、さらに測定対象の生体物質から酵素反応によ
り生成されるアンモニアにＮＡＤＨ依存型グルタミン酸
デヒドロゲナーゼ（以下、ＮＡＤＨ−ＧＤＨという）を
作用させ、ＮＡＤＨの減少量を測定することにより測定
対象の生体物質を定量するという反応系を確立して本発
明を完成するに至った。
【０００５】
【発明の実施の形態】すなわち、本発明は、アンモニア
を生成する反応を触媒するＮＡＤＰＨ非依存型酵素また
はその基質である生体物質の定量方法であって、検体に
ＮＡＤＰＨ依存型アミノ酸デヒドロゲナーゼ、その基質
となるα−ケト酸およびＮＡＤＰＨを添加して、予め検
体中に存在するアンモニアを消去し、次いでフォスファ
ターゼを添加してＮＡＤＰＨをＮＡＤＨに変換してか
ら、該ＮＡＤＰＨ非依存型酵素の基質または該ＮＡＤＰ
Ｈ非依存型酵素を添加してアンモニアを生成させる工程
を経ることを特徴とする方法である。
を生成する反応を触媒するＮＡＤＰＨ非依存型酵素また
はその基質である生体物質の定量方法であって、検体に
ＮＡＤＰＨ依存型アミノ酸デヒドロゲナーゼ、その基質
となるα−ケト酸およびＮＡＤＰＨを添加して、予め検
体中に存在するアンモニアを消去し、次いでフォスファ
ターゼを添加してＮＡＤＰＨをＮＡＤＨに変換してか
ら、該ＮＡＤＰＨ非依存型酵素の基質または該ＮＡＤＰ
Ｈ非依存型酵素を添加してアンモニアを生成させる工程
を経ることを特徴とする方法である。
【０００６】本発明において、生体物質とは、血清、尿
などの生体試料中に含まれる物質をいい、例えば、尿
素、クレアチニン、クレアチン、グアニンデアミナーゼ
などがある。
などの生体試料中に含まれる物質をいい、例えば、尿
素、クレアチニン、クレアチン、グアニンデアミナーゼ
などがある。
【０００７】本発明において、アンモニアを生成する反
応を触媒するＮＡＤＰＨ非依存型酵素とは、ＮＡＤＰＨ
またはＮＡＤＰを補酵素として利用しない酵素を意味す
る。また、該酵素はＮＡＤＨまたはＮＡＤを補酵素とし
て利用しない酵素であることが好ましい。生体物質に作
用してアンモニアを生成させるＮＡＤＰＨ非依存型酵素
としては、ウレアーゼ、クレアチニンデイミナーゼ、グ
アニンデアミナーゼ、Ｌ−アスパラギンアミドヒドロラ
ーゼ、Ｌ−グルタミンアミドヒドロラーゼ、シトシンア
ミノヒドロラーゼ、シチジンアミノヒドロラーゼ、アデ
ニンアミノヒドロラーゼ、アデノシンアミノヒドロラー
ゼ、ＡＭＰアミノヒドロラーゼなどが挙げられる。ま
た、これらの酵素の基質となる生体物質としては、それ
ぞれ尿素、クレアチニン、グアニン、Ｌ−アスパラギ
ン、Ｌ−グルタミン、シトシン、シチジン、アデニン、
アデノシン、ＡＭＰ等が挙げられる。
応を触媒するＮＡＤＰＨ非依存型酵素とは、ＮＡＤＰＨ
またはＮＡＤＰを補酵素として利用しない酵素を意味す
る。また、該酵素はＮＡＤＨまたはＮＡＤを補酵素とし
て利用しない酵素であることが好ましい。生体物質に作
用してアンモニアを生成させるＮＡＤＰＨ非依存型酵素
としては、ウレアーゼ、クレアチニンデイミナーゼ、グ
アニンデアミナーゼ、Ｌ−アスパラギンアミドヒドロラ
ーゼ、Ｌ−グルタミンアミドヒドロラーゼ、シトシンア
ミノヒドロラーゼ、シチジンアミノヒドロラーゼ、アデ
ニンアミノヒドロラーゼ、アデノシンアミノヒドロラー
ゼ、ＡＭＰアミノヒドロラーゼなどが挙げられる。ま
た、これらの酵素の基質となる生体物質としては、それ
ぞれ尿素、クレアチニン、グアニン、Ｌ−アスパラギ
ン、Ｌ−グルタミン、シトシン、シチジン、アデニン、
アデノシン、ＡＭＰ等が挙げられる。
【０００８】本発明において使用されるＮＡＤＰＨ依存
型アミノ酸デヒドロゲナーゼは、補酵素としてＮＡＤＰ
ＨまたはＮＡＤＰを特異的に利用するもので、ＮＡＤＨ
およびＮＡＤを利用できないものであれば特に制限され
ないが、例えば、ＮＡＤＰＨ依存型グルタミン酸デヒド
ロゲナーゼ（ＮＡＤＰＨ−ＧＤＨ）、ＮＡＤＰＨ依存型
バリンデヒドロゲナーゼなどが例示され、好ましくは、
細菌や酵母由来のＮＡＤＰＨ−ＧＤＨ等が例示される。
ＮＡＤＰＨ依存型アミノ酸デヒドロゲナーゼの濃度は試
料中の内因性および外因性アンモニアを消去するのに適
した濃度であれば特に制限されないが、好ましくは０．
５〜１０Ｕ／ｍＬの範囲で用いられる。
型アミノ酸デヒドロゲナーゼは、補酵素としてＮＡＤＰ
ＨまたはＮＡＤＰを特異的に利用するもので、ＮＡＤＨ
およびＮＡＤを利用できないものであれば特に制限され
ないが、例えば、ＮＡＤＰＨ依存型グルタミン酸デヒド
ロゲナーゼ（ＮＡＤＰＨ−ＧＤＨ）、ＮＡＤＰＨ依存型
バリンデヒドロゲナーゼなどが例示され、好ましくは、
細菌や酵母由来のＮＡＤＰＨ−ＧＤＨ等が例示される。
ＮＡＤＰＨ依存型アミノ酸デヒドロゲナーゼの濃度は試
料中の内因性および外因性アンモニアを消去するのに適
した濃度であれば特に制限されないが、好ましくは０．
５〜１０Ｕ／ｍＬの範囲で用いられる。
【０００９】ＮＡＤＰＨ依存型アミノ酸デヒドロゲナー
ゼは、図１に示される反応系の反応１の可逆反応を触媒
する。試料中の内因性または外因性アンモニアを除くに
は、試料に該酵素の他、α−ケト酸およびＮＡＤＰＨを
加えて正反応を進行させればよい。
ゼは、図１に示される反応系の反応１の可逆反応を触媒
する。試料中の内因性または外因性アンモニアを除くに
は、試料に該酵素の他、α−ケト酸およびＮＡＤＰＨを
加えて正反応を進行させればよい。
【００１０】本発明に使用されるα−ケト酸はＮＡＤＰ
Ｈ依存型アミノ酸デヒドロゲナーゼの基質となるもので
あり、例えば、ＮＡＤＰＨ−ＧＤＨを用いる場合、α−
ケト酸はα−ケトグルタル酸（以下、α−ＫＧという）
であり、ＮＡＤＰＨ−バリンデヒドロゲナーゼでは２−
オキソイソバレレートである。α−ケト酸の濃度は試料
中の内因性および外因性アンモニアを消去するのに適し
た濃度であれば特に制限されないが、好ましくは５〜５
０ｍＭの範囲で用いられる。
Ｈ依存型アミノ酸デヒドロゲナーゼの基質となるもので
あり、例えば、ＮＡＤＰＨ−ＧＤＨを用いる場合、α−
ケト酸はα−ケトグルタル酸（以下、α−ＫＧという）
であり、ＮＡＤＰＨ−バリンデヒドロゲナーゼでは２−
オキソイソバレレートである。α−ケト酸の濃度は試料
中の内因性および外因性アンモニアを消去するのに適し
た濃度であれば特に制限されないが、好ましくは５〜５
０ｍＭの範囲で用いられる。
【００１１】本発明に使用されるＮＡＤＰＨの濃度は試
料中の内因性および外因性アンモニアを消去するのに適
した濃度であれば特に制限されないが、好ましくは０．
３〜１．５ｍＭの範囲で用いられる。
料中の内因性および外因性アンモニアを消去するのに適
した濃度であれば特に制限されないが、好ましくは０．
３〜１．５ｍＭの範囲で用いられる。
【００１２】ＮＡＤＰＨ依存型アミノ酸デヒドロゲナー
ゼの反応は、内因性および外因性アンモニアを完全に消
去するのに適当な条件で行えばよいが、好ましくは３０
〜４０℃で３０〜３００秒間反応させる。アンモニアが
完全に消去されたことは、ＮＡＤＰＨの減少を３４０ｎ
ｍでの吸光度変化を経時的に測定することにより判別で
きる。
ゼの反応は、内因性および外因性アンモニアを完全に消
去するのに適当な条件で行えばよいが、好ましくは３０
〜４０℃で３０〜３００秒間反応させる。アンモニアが
完全に消去されたことは、ＮＡＤＰＨの減少を３４０ｎ
ｍでの吸光度変化を経時的に測定することにより判別で
きる。
【００１３】本発明に用いられるフォスファターゼは、
リン酸モノエステルを加水分解して脱リン酸化するもの
であれば特に限定されず、反応液のｐＨや反応温度など
に応じて適宜選択できる。好ましくは、細菌や動物組織
由来のアルカリフォスファターゼ、特に仔ウシ小腸由来
のアルカリフォスファターゼ（ＣＩＡＰ）が挙げられ
る。フォスファターゼの作用により、反応液中のＮＡＤ
ＰＨおよびＮＡＤＰはＮＡＤＨおよびＮＡＤに変換され
る（図１の反応２）。この反応によってＮＡＤＰＨ依存
型アミノ酸デヒドロゲナーゼの反応は停止されるので、
続くアンモニア生成反応において測定値に負誤差を生じ
ることはない。フォスファターゼの濃度は反応液中のＮ
ＡＤＰＨを完全にＮＡＤＨに変換するに適した濃度であ
れば特に制限はないが、好適には１〜２００Ｕ／ｍＬの
範囲で用いられる。
リン酸モノエステルを加水分解して脱リン酸化するもの
であれば特に限定されず、反応液のｐＨや反応温度など
に応じて適宜選択できる。好ましくは、細菌や動物組織
由来のアルカリフォスファターゼ、特に仔ウシ小腸由来
のアルカリフォスファターゼ（ＣＩＡＰ）が挙げられ
る。フォスファターゼの作用により、反応液中のＮＡＤ
ＰＨおよびＮＡＤＰはＮＡＤＨおよびＮＡＤに変換され
る（図１の反応２）。この反応によってＮＡＤＰＨ依存
型アミノ酸デヒドロゲナーゼの反応は停止されるので、
続くアンモニア生成反応において測定値に負誤差を生じ
ることはない。フォスファターゼの濃度は反応液中のＮ
ＡＤＰＨを完全にＮＡＤＨに変換するに適した濃度であ
れば特に制限はないが、好適には１〜２００Ｕ／ｍＬの
範囲で用いられる。
【００１４】アンモニア生成反応は、測定対象となる生
体物質が該反応を触媒するＮＡＤＰＨ非依存型酵素の場
合はその基質である物質を、測定対象となる生体物質が
該反応の基質の場合は該ＮＡＤＰＨ非依存型酵素を試料
に添加することにより行う（図１の反応３）。例えば、
測定対象が尿素窒素の場合はウレアーゼ、クレアチニン
の場合はクレアチニンデイミナーゼ、グアニンデアミナ
ーゼの場合はグアニンを添加すればよい。添加されるＮ
ＡＤＰＨ非依存型酵素およびその基質である生体物質の
濃度は特に限定されないが、好ましくは、それぞれ１５
〜３００Ｕ／ｍＬおよび１００〜２００ｍＭの範囲で用
いられる。
体物質が該反応を触媒するＮＡＤＰＨ非依存型酵素の場
合はその基質である物質を、測定対象となる生体物質が
該反応の基質の場合は該ＮＡＤＰＨ非依存型酵素を試料
に添加することにより行う（図１の反応３）。例えば、
測定対象が尿素窒素の場合はウレアーゼ、クレアチニン
の場合はクレアチニンデイミナーゼ、グアニンデアミナ
ーゼの場合はグアニンを添加すればよい。添加されるＮ
ＡＤＰＨ非依存型酵素およびその基質である生体物質の
濃度は特に限定されないが、好ましくは、それぞれ１５
〜３００Ｕ／ｍＬおよび１００〜２００ｍＭの範囲で用
いられる。
【００１５】目的とする生体物質の定量は、上記反応に
より生成されるアンモニア量を直接的または間接的に測
定し、その測定値を指標として行うことができる。より
簡便により高感度な測定結果を得るには、アンモニアに
ＮＡＤＨ依存型アミノ酸デヒドロゲナーゼおよびその基
質となるα−ケト酸を作用させ（図１の反応４）、ＮＡ
ＤＨの減少量を分光学的に測定することが特に好まし
い。
より生成されるアンモニア量を直接的または間接的に測
定し、その測定値を指標として行うことができる。より
簡便により高感度な測定結果を得るには、アンモニアに
ＮＡＤＨ依存型アミノ酸デヒドロゲナーゼおよびその基
質となるα−ケト酸を作用させ（図１の反応４）、ＮＡ
ＤＨの減少量を分光学的に測定することが特に好まし
い。
【００１６】以上のとおり、本発明は、上記ＮＡＤＰＨ
非依存型酵素の反応により生成するアンモニアに、さら
にＮＡＤＨ依存型アミノ酸デヒドロゲナーゼおよびその
基質となるα−ケト酸を作用させ、ＮＡＤＨの減少量を
測定することを特徴とする生体物質の定量方法である。
ＮＡＤＨは上記フォスファターゼの反応により生成され
たものをそのまま利用することができる。
非依存型酵素の反応により生成するアンモニアに、さら
にＮＡＤＨ依存型アミノ酸デヒドロゲナーゼおよびその
基質となるα−ケト酸を作用させ、ＮＡＤＨの減少量を
測定することを特徴とする生体物質の定量方法である。
ＮＡＤＨは上記フォスファターゼの反応により生成され
たものをそのまま利用することができる。
【００１７】本発明に使用されるＮＡＤＨ依存型アミノ
酸デヒドロゲナーゼは、補酵素としてＮＡＤＨまたはＮ
ＡＤを特異的に利用するものであれば特に制限されない
が、好ましくはＮＡＤＰＨ依存型アミノ酸デヒドロゲナ
ーゼと同じアミノ酸を基質とするものである。この場
合、反応液中に残存するα−ケト酸をそのまま利用する
こともできる。ＮＡＤＰＨ依存型およびＮＡＤＨ依存型
アミノ酸デヒドロゲナーゼがともにグルタミン酸デヒド
ロゲナーゼである組み合わせが特に好ましい例として挙
げられる。ＮＡＤＨ−ＧＤＨはカビ、植物、細菌に分布
するが、好ましくは細菌由来のものが例示される。ＮＡ
ＤＨ依存型アミノ酸デヒドロゲナーゼの濃度はアンモニ
アを消去するのに適した濃度であれば特に制限はない
が、好ましくは０．０３〜０．１Ｕ／ｍＬの範囲で用い
られる。また基質となるα−ケト酸は添加後の濃度が５
〜１００ｍＭの範囲になるように添加することが好まし
い。
酸デヒドロゲナーゼは、補酵素としてＮＡＤＨまたはＮ
ＡＤを特異的に利用するものであれば特に制限されない
が、好ましくはＮＡＤＰＨ依存型アミノ酸デヒドロゲナ
ーゼと同じアミノ酸を基質とするものである。この場
合、反応液中に残存するα−ケト酸をそのまま利用する
こともできる。ＮＡＤＰＨ依存型およびＮＡＤＨ依存型
アミノ酸デヒドロゲナーゼがともにグルタミン酸デヒド
ロゲナーゼである組み合わせが特に好ましい例として挙
げられる。ＮＡＤＨ−ＧＤＨはカビ、植物、細菌に分布
するが、好ましくは細菌由来のものが例示される。ＮＡ
ＤＨ依存型アミノ酸デヒドロゲナーゼの濃度はアンモニ
アを消去するのに適した濃度であれば特に制限はない
が、好ましくは０．０３〜０．１Ｕ／ｍＬの範囲で用い
られる。また基質となるα−ケト酸は添加後の濃度が５
〜１００ｍＭの範囲になるように添加することが好まし
い。
【００１８】フォスファターゼによるＮＡＤＰＨの脱リ
ン酸化は極めて速く進行するので、フォスファターゼ、
ＮＡＤＰＨ非依存型酵素およびＮＡＤＨ依存型アミノ酸
デヒドロゲナーゼを同時に試料に添加することができ
る。該反応は３０〜４０℃で１２０〜３００秒間行うの
が好ましい。
ン酸化は極めて速く進行するので、フォスファターゼ、
ＮＡＤＰＨ非依存型酵素およびＮＡＤＨ依存型アミノ酸
デヒドロゲナーゼを同時に試料に添加することができ
る。該反応は３０〜４０℃で１２０〜３００秒間行うの
が好ましい。
【００１９】ＮＡＤＨの減少量は、３４０ｎｍでの吸光
度変化を調べることにより測定することができる。
度変化を調べることにより測定することができる。
【００２０】また、本発明は、本発明の生体物質の定量
方法を簡便に実施するための生体物質定量試薬である。
方法を簡便に実施するための生体物質定量試薬である。
【００２１】すなわち、本発明は、ＮＡＤＰＨ依存型ア
ミノ酸デヒドロゲナーゼ、その基質となるα−ケト酸お
よびＮＡＤＰＨを含む第１試薬、並びにフォスファター
ゼおよびアンモニアを生成する反応を触媒するＮＡＤＰ
Ｈ非依存型酵素の基質または該ＮＡＤＰＨ非依存型酵素
を含む第２試薬からなる、該ＮＡＤＰＨ非依存型酵素ま
たはその基質である生体物質の定量試薬である。
ミノ酸デヒドロゲナーゼ、その基質となるα−ケト酸お
よびＮＡＤＰＨを含む第１試薬、並びにフォスファター
ゼおよびアンモニアを生成する反応を触媒するＮＡＤＰ
Ｈ非依存型酵素の基質または該ＮＡＤＰＨ非依存型酵素
を含む第２試薬からなる、該ＮＡＤＰＨ非依存型酵素ま
たはその基質である生体物質の定量試薬である。
【００２２】例えば、上記ＮＡＤＰＨ非依存型酵素また
はその基質である生体物質の定量試薬として下記組成を
含む第１および第２試薬からなるものが挙げられる。 第１試薬： ＮＡＤＰＨ依存型アミノ酸デヒドロゲナーゼ ０．５〜１０Ｕ／ｍＬ ＮＡＤＰＨ依存型アミノ酸デヒドロゲナーゼ の基質となるα−ケト酸 ５〜５０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３〜１．５ｍＭ 第２試薬： フォスファターゼ １〜２００Ｕ／ｍＬ ＮＡＤＰＨ非依存型酵素の基質 １００〜２００ｍＭ （またはＮＡＤＰＨ非依存型酵素 １５〜３００Ｕ／ｍＬ）
はその基質である生体物質の定量試薬として下記組成を
含む第１および第２試薬からなるものが挙げられる。 第１試薬： ＮＡＤＰＨ依存型アミノ酸デヒドロゲナーゼ ０．５〜１０Ｕ／ｍＬ ＮＡＤＰＨ依存型アミノ酸デヒドロゲナーゼ の基質となるα−ケト酸 ５〜５０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３〜１．５ｍＭ 第２試薬： フォスファターゼ １〜２００Ｕ／ｍＬ ＮＡＤＰＨ非依存型酵素の基質 １００〜２００ｍＭ （またはＮＡＤＰＨ非依存型酵素 １５〜３００Ｕ／ｍＬ）
【００２３】本発明のアンモニアを生成する反応を触媒
するＮＡＤＰＨ非依存型酵素またはその基質である生体
物質の定量試薬は、第２試薬にさらにＮＡＤＨ依存型ア
ミノ酸デヒドロゲナーゼおよびその基質となるα−ケト
酸を含むものがより好ましい。また、該ＮＡＤＨ依存型
アミノ酸デヒドロゲナーゼはＮＡＤＰＨ依存型アミノ酸
デヒドロゲナーゼと同じアミノ酸を基質とすることが望
ましく、その場合は第１試薬中のα−ケト酸をそのまま
利用することもできる。ＮＡＤＨ依存型アミノ酸デヒド
ロゲナーゼの濃度としては、好ましくは０．０３〜０．
１Ｕ／ｍＬである。
するＮＡＤＰＨ非依存型酵素またはその基質である生体
物質の定量試薬は、第２試薬にさらにＮＡＤＨ依存型ア
ミノ酸デヒドロゲナーゼおよびその基質となるα−ケト
酸を含むものがより好ましい。また、該ＮＡＤＨ依存型
アミノ酸デヒドロゲナーゼはＮＡＤＰＨ依存型アミノ酸
デヒドロゲナーゼと同じアミノ酸を基質とすることが望
ましく、その場合は第１試薬中のα−ケト酸をそのまま
利用することもできる。ＮＡＤＨ依存型アミノ酸デヒド
ロゲナーゼの濃度としては、好ましくは０．０３〜０．
１Ｕ／ｍＬである。
【００２４】本発明のアンモニアを生成する反応を触媒
するＮＡＤＰＨ非依存型酵素またはその基質である生体
物質の定量試薬は、より好ましくはＮＡＤＰＨ依存型お
よびＮＡＤＨ依存型アミノ酸デヒドロゲナーゼがともに
グルタミン酸デヒドロゲナーゼであるものが例示され
る。
するＮＡＤＰＨ非依存型酵素またはその基質である生体
物質の定量試薬は、より好ましくはＮＡＤＰＨ依存型お
よびＮＡＤＨ依存型アミノ酸デヒドロゲナーゼがともに
グルタミン酸デヒドロゲナーゼであるものが例示され
る。
【００２５】本発明のアンモニアを生成する反応を触媒
するＮＡＤＰＨ非依存型酵素またはその基質である生体
物質の定量試薬のより好ましい例として、下記組成を含
む第１および第２試薬からなるウレアーゼまたは尿素窒
素の定量試薬が挙げられる。 第１試薬： ＮＡＤＰＨ−ＧＤＨ ０．５〜１０Ｕ／ｍＬ α−ケトグルタル酸 ５〜５０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３〜１．５ｍＭ 第２試薬： フォスファターゼ １〜２００Ｕ／ｍＬ 尿素 １００〜２００ｍＭ （またはウレアーゼ １５〜３００Ｕ／ｍＬ） ＮＡＤＨ−ＧＤＨ ０．０３〜０．１Ｕ／ｍＬ
するＮＡＤＰＨ非依存型酵素またはその基質である生体
物質の定量試薬のより好ましい例として、下記組成を含
む第１および第２試薬からなるウレアーゼまたは尿素窒
素の定量試薬が挙げられる。 第１試薬： ＮＡＤＰＨ−ＧＤＨ ０．５〜１０Ｕ／ｍＬ α−ケトグルタル酸 ５〜５０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３〜１．５ｍＭ 第２試薬： フォスファターゼ １〜２００Ｕ／ｍＬ 尿素 １００〜２００ｍＭ （またはウレアーゼ １５〜３００Ｕ／ｍＬ） ＮＡＤＨ−ＧＤＨ ０．０３〜０．１Ｕ／ｍＬ
【００２６】本発明の生体物質定量試薬は、必要に応じ
てさらに緩衝液やプロテアーゼ阻害剤などの成分を適宜
含んでいてもよい。
てさらに緩衝液やプロテアーゼ阻害剤などの成分を適宜
含んでいてもよい。
【００２７】
【実施例】以下に、実施例を示して本発明をより具体的
に説明するが、これらは単なる例示であって、何ら本発
明を限定するものではない。なお、実施例において用い
た酵素はすべて東洋紡製、ＮＡＤＰＨおよびα−ケトグ
ルタル酸はナカライテスク製である。
に説明するが、これらは単なる例示であって、何ら本発
明を限定するものではない。なお、実施例において用い
た酵素はすべて東洋紡製、ＮＡＤＰＨおよびα−ケトグ
ルタル酸はナカライテスク製である。
【００２８】実施例１ 試料中に含まれる尿素の定量 試料中の尿素濃度を下記組成を有する第１試薬および第
２試薬を用いて定量した。 第１試薬： トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２１ｍＭ α−ケトグルタル酸 ８ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．６ｍＭ ＮＡＤＰＨ−ＧＤＨ（Proteus sp. 由来） ２Ｕ／ｍＬ 第２試薬： トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２１ｍＭ α−ケトグルタル酸 ８ｍＭ アルカリフォスファターゼ（仔ウシ小腸由来） １００Ｕ／ｍＬ ウレアーゼ（ナタマメ由来） ３０Ｕ／ｍＬ ＮＡＤＨ−ＧＤＨ（Pseudomonas sp. 由来） ０．０７Ｕ／ｍＬ
２試薬を用いて定量した。 第１試薬： トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２１ｍＭ α−ケトグルタル酸 ８ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．６ｍＭ ＮＡＤＰＨ−ＧＤＨ（Proteus sp. 由来） ２Ｕ／ｍＬ 第２試薬： トリス緩衝液（ｐＨ８．５） ２１ｍＭ α−ケトグルタル酸 ８ｍＭ アルカリフォスファターゼ（仔ウシ小腸由来） １００Ｕ／ｍＬ ウレアーゼ（ナタマメ由来） ３０Ｕ／ｍＬ ＮＡＤＨ−ＧＤＨ（Pseudomonas sp. 由来） ０．０７Ｕ／ｍＬ
【００２９】測定方法： １００ｍｇ／ｄＬ尿素水溶液および塩化アンモニウム１
５ｍｇ／ｄＬを含む１００ｍｇ／ｄＬ尿素水溶液の５段
階希釈液を試料とし、各５μＬを採取し、これに第１試
薬を１８０μＬ添加し、３７℃で５分間加温した後、さ
らに第２試薬を６０μＬ加えて単位時間あたりの３４０
ｎｍにおける吸光度変化を測定した。ブランクには尿素
水溶液の代わりに蒸留水を用いた。
５ｍｇ／ｄＬを含む１００ｍｇ／ｄＬ尿素水溶液の５段
階希釈液を試料とし、各５μＬを採取し、これに第１試
薬を１８０μＬ添加し、３７℃で５分間加温した後、さ
らに第２試薬を６０μＬ加えて単位時間あたりの３４０
ｎｍにおける吸光度変化を測定した。ブランクには尿素
水溶液の代わりに蒸留水を用いた。
【００３０】図２に尿素水溶液の希釈直線性、図３に塩
化アンモニウムを含む尿素水溶液の希釈直線性を示す。
また、図４に試料として塩化アンモニウム１５ｍｇ／ｄ
Ｌを含む１００ｍｇ／ｄＬ尿素水溶液を用いた場合の３
４０ｎｍでの吸光度変化の様子を示す。図３および４か
ら明らかなように、第１試薬に含まれるＮＡＤＰＨ−Ｇ
ＤＨの作用により、試料中に最初から含まれるアンモニ
アが消去され、さらに第２試薬の添加により、試料中の
尿素濃度が精度よく測定することができる。
化アンモニウムを含む尿素水溶液の希釈直線性を示す。
また、図４に試料として塩化アンモニウム１５ｍｇ／ｄ
Ｌを含む１００ｍｇ／ｄＬ尿素水溶液を用いた場合の３
４０ｎｍでの吸光度変化の様子を示す。図３および４か
ら明らかなように、第１試薬に含まれるＮＡＤＰＨ−Ｇ
ＤＨの作用により、試料中に最初から含まれるアンモニ
アが消去され、さらに第２試薬の添加により、試料中の
尿素濃度が精度よく測定することができる。
【００３１】
【発明の効果】本発明の生体物質の定量方法によれば、
内因性および外因性のアンモニアまたはアミノ酸が含ま
れる試料についても定量的な測定が可能となる。
内因性および外因性のアンモニアまたはアミノ酸が含ま
れる試料についても定量的な測定が可能となる。
【図１】本発明の生体物質定量方法の原理となる反応系
を示す図である。
を示す図である。
【図２】１００ｍｇ／ｄＬ尿素水溶液の希釈直線性を示
す図である。
す図である。
【図３】塩化アンモニウム１５ｍｇ／ｄＬを含む１００
ｍｇ／ｄＬ尿素水溶液の希釈直線性を示す図である。
ｍｇ／ｄＬ尿素水溶液の希釈直線性を示す図である。
【図４】塩化アンモニウム１５ｍｇ／ｄＬを含む１００
ｍｇ／ｄＬ尿素水溶液を用いた場合の３４０ｎｍでの吸
光度変化を示す図である。
ｍｇ／ｄＬ尿素水溶液を用いた場合の３４０ｎｍでの吸
光度変化を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 西矢 芳昭 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内 (72)発明者 川村 良久 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内 (72)発明者 野中 浦雄 静岡県沼津市大平1126−９ (72)発明者 渡部 聡 静岡県伊東市荻478−57 (72)発明者 北川 俊之 静岡県沼津市西島町19−３
Claims (8)
- 【請求項１】 アンモニアを生成する反応を触媒するＮ
ＡＤＰＨ非依存型酵素またはその基質である生体物質の
定量方法であって、検体にＮＡＤＰＨ依存型アミノ酸デ
ヒドロゲナーゼ、その基質となるα−ケト酸およびＮＡ
ＤＰＨを添加して、予め検体中に存在するアンモニアを
消去し、次いでフォスファターゼを添加してＮＡＤＰＨ
をＮＡＤＨに変換してから、該ＮＡＤＰＨ非依存型酵素
の基質または該ＮＡＤＰＨ非依存型酵素を添加してアン
モニアを生成させる工程を経ることを特徴とする方法。 - 【請求項２】 生成するアンモニアに、さらにＮＡＤＨ
依存型アミノ酸デヒドロゲナーゼおよびその基質となる
α−ケト酸を作用させ、ＮＡＤＨの減少量を測定するこ
とを特徴とする請求項１記載の生体物質の定量方法。 - 【請求項３】 ＮＡＤＰＨ依存型アミノ酸デヒドロゲナ
ーゼがＮＡＤＰＨ依存型グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
であり、ＮＡＤＨ依存型アミノ酸デヒドロゲナーゼがＮ
ＡＤＨ依存型グルタミン酸デヒドロゲナーゼであり、α
−ケト酸がα−ケトグルタル酸である請求項２記載の生
体物質の定量方法。 - 【請求項４】 ＮＡＤＰＨ非依存型酵素がウレアーゼ、
クレアチニンデイミナーゼまたはグアニンデアミナーゼ
であり、それらの基質が尿素、クレアチニンまたはグア
ニンである請求項１〜３のいずれかに記載の定量方法。 - 【請求項５】 ＮＡＤＰＨ依存型アミノ酸デヒドロゲナ
ーゼ、その基質となるα−ケト酸およびＮＡＤＰＨを含
む第１試薬、並びにフォスファターゼおよびアンモニア
を生成する反応を触媒するＮＡＤＰＨ非依存型酵素また
はその基質を含む第２試薬からなる生体物質定量試薬。 - 【請求項６】 第２試薬にさらにＮＡＤＰＨ依存型アミ
ノ酸デヒドロゲナーゼと同じアミノ酸を基質とするＮＡ
ＤＨ依存型アミノ酸デヒドロゲナーゼを含む請求項５記
載の生体物質定量試薬。 - 【請求項７】 ＮＡＤＰＨ依存型アミノ酸デヒドロゲナ
ーゼがＮＡＤＰＨ依存型グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
であり、ＮＡＤＨ依存型アミノ酸デヒドロゲナーゼがＮ
ＡＤＨ依存型グルタミン酸デヒドロゲナーゼであり、α
−ケト酸がα−ケトグルタル酸である請求項６記載の生
体物質定量試薬。 - 【請求項８】 ＮＡＤＰＨ非依存型酵素がウレアーゼ、
クレアチニンデイミナーゼまたはグアニンデアミナーゼ
であり、それらの基質が尿素、クレアチニンまたはグア
ニンである請求項５〜７のいずれかに記載の定量試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30061896A JPH10136997A (ja) | 1996-11-12 | 1996-11-12 | 生体物質の定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30061896A JPH10136997A (ja) | 1996-11-12 | 1996-11-12 | 生体物質の定量方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10136997A true JPH10136997A (ja) | 1998-05-26 |
Family
ID=17887034
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30061896A Pending JPH10136997A (ja) | 1996-11-12 | 1996-11-12 | 生体物質の定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10136997A (ja) |
-
1996
- 1996-11-12 JP JP30061896A patent/JPH10136997A/ja active Pending
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