JP3614962B2 - アンモニウムイオンを消去する方法及び試料中の特定成分を測定する方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アンモニウムイオンの消去方法、及び試料中の特定成分の測定方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、試料中の特定成分からアンモニウムイオンを発生させて発生したアンモニウムイオンに基づいて特定成分を測定する場合、試料中に当初から存在する内因性アンモニウムイオンを酵素反応により消去し、正確に該特定成分を測定する方法に関するものである。本発明は、特に、臨床検査において有効な方法である。
【０００２】
【従来の技術】
試料中の特定成分を測定するとき、試料等にアンモニウムイオンが存在すると、その特定成分を正確に測定できないことがある。例えば、試料中の特定成分からアンモニウムイオンを発生させ、そのアンモニウムイオンの量を測定することにより、該特定成分の量を測定する場合、その試料に当初からアンモニウムイオンが含まれているときは、該特定成分の量を正確に測定できにくい。
そのような特定成分として、尿素窒素、クレアチン、クレアチニン、ロイシンアミノペプチダーゼ、カルシウムイオン等が知られている。これらの成分は、以下の式のように、アンモニウムイオンを酵素反応により発生させて、測定できる。
【０００３】
【化１】
ウレアーゼによる尿素窒素の測定
（α−ＫＧはα−ケトグルタル酸を意味し、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型を意味する）
【０００４】
【化２】
【０００５】
【化３】
【０００６】
【化４】
【０００７】
【化５】
【０００８】
【化６】
【０００９】
一方、測定しようとする試料中にも、アンモニウムイオンが当初から存在することも多い。なお、本明細書では、このような試料中にあらかじめ存在するアンモニウムイオンを内因性アンモニウムイオンと記載することもある。それらの内因性アンモニウムイオンが存在すると、酵素反応によりアンモニウムイオンを発生させて特定成分を測定しようとするとき、試料中のアンモニウムイオンが測定値に正誤差を与えて、該成分を正確に測定することはできない。そのため、内因性アンモニウムイオンを、あらかじめ、消去しておくことが必要となる。一方、尿素窒素などの測定すべき試料中の生体成分は不安定であるため、測定はなるべく迅速に、しかもできるだけ温和な条件で行われるのが望ましい。この様な条件に適している内因性アンモニウムイオンの消去方法は、酵素を使用した方法である。そのような方法として、以下の式に示されるように、内因性アンモニウムイオンとα−ケトグルタル酸（以下α−ＫＧと記載することもある）とをグルタミン酸脱水素酵素（以下、ＧＬＤＨと記載することもある）の存在下、グルタミン酸に変換させて該アンモニウムイオンを消去する方法（ＧＬＤＨ法）が考えられる。
【００１０】
【化７】
【００１１】
この方法は、補酵素として、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（以下、ＮＡＤＨと記載することもある）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（以下、ＮＡＤＰＨと記載することもある）を使用しなければならない。しかし、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは２００〜４２０ｎｍの領域の波長に大きな吸収をもつ。なお、本明細書において、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈとは、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを表わすものとする。一方、中間体としてアンモニウムイオンを経由して特定成分を測定するときも、前記した反応式から明らかなように、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いており、従ってＮＡＤ（Ｐ）Ｈの反応前後のこの領域の波長における吸光度の増減を利用して測定することも多い。この場合、該特定成分を測定しようとすると、試料中の内因性アンモニウムイオンを消去するために用いたＮＡＤ（Ｐ）Ｈが残存し、そのためＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量が多くなり、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの干渉をうけ、測定可能な吸光度の範囲を越えてしまい、該特定成分の測定値が正確でなくなることがある。また、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ自身は、還元作用があるので、大量に使用すると、試料中の特定成分を測定する方法のうちでも特に酸化反応を利用して特定成分を測定しようとする方法に悪影響を与える。よって、従来のＧＬＤＨ法により内因性アンモニウムイオンを消去するときは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを大量に使用しなければならないので、ＧＬＤＨ法による消去方法は、使用しにくいという欠点がある。
【００１２】
一方、ＧＬＤＨ法の改良法で、かつ、少量のＮＡＤ（Ｐ）Ｈを使用する方法も、提案されている。すなわち、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが酸化されて生じるＮＡＤ（Ｐ）＋ を、グルタミン酸脱水素酵素（ＧＬＤＨ）以外の脱水素酵素（以下、共役脱水素酵素と記載することもある）とその基質の作用により、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈに再生することで、使用するＮＡＤ（Ｐ）Ｈを少量にする方法も知られている。このような共役脱水素酵素を用いる方法としては、以下の式に示すように、イソクエン酸及びイソクエン酸脱水素酵素を用いるイソクエン酸脱水素酵素法（特開昭６２−６７００）、グルコース及びグルコース脱水素酵素を用いるグルコース脱水素酵素法（特開平５−１０３６９７）が知られている。
【００１３】
【化８】
【００１４】
しかし、イソクエン酸脱水素酵素法においては、アンモニウムイオンの消去のための試薬、例えばイソクエン酸は、溶液中で安定性が悪い。そのため、試薬を溶解して長時間経過した後は、試料中の特定成分を正確に測定できないという問題点があった。
また、イソクエン酸脱水素酵素法に用いられるイソクエン酸脱水素酵素は、金属要求性なので、ＥＤＴＡ等のキレート化剤を添加することにより、反応が停止する。従ってこのキレート化剤を、特定成分の測定に用いる第２試薬に添加することにより、アンモニウムイオンの消去反応を停止させるとともに、目的とする特定成分の定量を行う方法が採用されている。一方、臨床検査分野では、一般に、血液を採取する際、血液を凝固をさせないためにＥＤＴＡやクエン酸等のキレート化剤を血液に添加し、カルシウムイオンをキレート化する。このような処理をした生体試料を測定するとき、上記のイソクエン酸脱水素酵素法では、イソクエン酸脱水素酵素の反応が阻害され、アンモニウムイオンの消去反応が阻害される可能性がある。また、試料中の特定成分として臨床的に意義があるロイシンアミノペプチダーゼを測定する際に、前記反応式で示したようにロイシンアミドを基質に用いる場合、内因性アンモニウムイオンの存在は測定誤差を及ぼすので、あらかじめ消去することが望ましいが、イソクエン酸脱水素酵素法を用いると、キレート化剤が試薬中に存在することになるので、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋で活性化されるロイシンアミノペプチダーゼの活性を阻害してしまう。さらに、前記反応式で示したようにトランスグルタミナーゼによって試料中の特定成分としてカルシウムイオンを定量しようとするときも、内因性のアンモニウムイオンを消去することが望ましいが、キレート化剤を利用するイソクエン酸脱水素酵素法を用いると、カルシウムイオンがキレート化されてしまうので、使用できない。このように、金属要求性の酵素を用い、かつ、アンモニウムイオンが反応中間体である試料中の特定成分の測定方法においては、内因性アンモニウムイオンの消去法としてイソクエン酸脱水素酵素法は適切ではない。
【００１５】
一方、グルコース脱水素酵素法においても、該酵素法で基質として使用されるグルコースの影響により測定できる特定成分の範囲が限定される等の問題がある。
即ち、臨床検査分野用の自動分析装置を用いる場合、尿素窒素などと同時にグルコ−スを測定することが一般化されているので、グルコ−ス脱水素酵素法においては、基質として用いるグルコ−スがグルコ−スの測定系に影響を及ぼす可能性がある。そのため、この分野でのグルコース脱水素酵素法の使用は限定されてしまう。
また、グルコース脱水素酵素法の問題点のひとつに、グルコース脱水素酵素の阻害剤に適当なものがないことがあげられる。現に、特開平５−１０３６９７に記載されている阻害剤は、モノヨード酢酸であるが、モノヨード酢酸は、タンパク質、特に酵素のＳＨ基に特異的に反応する物質の一種で、アルコール脱水素酵素やホスホグリセルアルデヒド脱水素酵素等の、活性中心にＳＨ基をもつ酵素の活性を阻害してしまう物質であるため、このような阻害剤を用いると、試料中の特定成分の測定に利用する酵素が限定されてしまう。
したがって、試料中の特定成分を測定する方法で内因性アンモニウムイオンが存在すると特定成分を正確に測定できない場合において、使用に際して汎用性をもち、かつ、使用する試薬を溶解して長時間放置しても特定成分を正確に測定できる、内因性アンモニウムイオンの消去方法が求められていた。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、試料中の特定成分を測定する方法で、かつ、試料中に、アンモニウムイオンが当初から存在すると特定成分を正確に測定できない場合、あらかじめ、その試料中のアンモニウムイオンを消去する方法を提供することである。また、その場合、試料中のアンモニウムイオンを消去することにより、試料中の該特定成分を正確に測定する方法を提供することである。さらに、その方法において、入手しやすい試薬を用い、使用に際して汎用性をもち、かつ、用いる試薬を溶解して長時間放置しても特定成分を正確に測定できる方法を、提供することである。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記現状に鑑み、試料中にあらかじめ存在するアンモニウムイオンの影響を受けない、試料中の特定の生体成分の正確な測定方法で、かつ、測定試薬が安定な方法について、鋭意、検討した。その結果、驚くべきことに、内因性アンモニウムイオンにα−ケトグルタル酸とグルタミン酸脱水素酵素とを作用させて内因性アンモニウムイオンをグルタミン酸に変換させるグルタミン酸脱水素酵素による内因性アンモニウムイオンの消去法（ＧＬＤＨ法）において、ギ酸脱水素酵素（以下、ＦＤＨと記載することもある）を共役脱水素酵素として用いるＧＬＤＨ法の改良法により、使用する試薬を溶解して長時間放置しても、高濃度のアンモニウムイオンを消去でき、かつ、試料中の特定の生体成分が正確に測定できることを見い出した。本発明は、かかる知見により見い出されたものである。
【００１８】
本発明は、試料に、α−ケトグルタル酸、グルタミン酸脱水素酵素、ギ酸、ギ酸脱水素酵素、及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型を作用させて、当初から存在するアンモニウムイオンを消去する方法である。なお、このアンモニウムイオン消去方法をアンモニウムイオンの本発明消去方法と記載することもある。
また、本発明は、試料中の特定成分からアンモニウムイオンを発生させて試料中の特定成分を測定する方法において、あらかじめ、その試料に、α−ケトグルタル酸、グルタミン酸脱水素酵素、ギ酸、ギ酸脱水素酵素、及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型を作用させて、当初から存在するアンモニウムイオンを消去し、次いで、ギ酸脱水素酵素阻害剤の存在下、試料中の特定成分からアンモニウムイオンを発生させて試料中の特定成分を測定する方法である。なお、この試料中の特定成分を測定する方法を、本発明の特定成分測定方法と記載することもある。
本明細書において、特定成分とは、測定対象と決められた成分をいうものとする。
【００１９】
本発明の特定成分測定方法は、通常、試料中のアンモニウムイオンの消去反応、特定成分の測定反応の２段階反応により実施できる。
試料中のアンモニウムイオンの消去反応は、試料中のアンモニウムイオンを消去するための試薬であって、α−ケトグルタル酸、グルタミン酸脱水素酵素、ギ酸、ギ酸脱水素酵素、及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型を含む試薬を用いることにより実現できる。
本発明の特定成分測定方法は、試料中の特定成分を測定するキットであって、
ｉ）上記の試料中のアンモニウムイオンを消去するための試薬からなる第１試薬、及び
ｉｉ）試料中の特定成分よりアンモニウムイオンを発生させる試薬であって、かつ、ギ酸脱水素酵素阻害剤を含む第２試薬、
からなるキットを用いて実現できる。
この第１試薬は、溶液状態で安定である。したがって、第２試薬を安定な溶液にすると、本発明のキットは、液状試薬として使用できる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明のアンモニウムイオンの消去法は、従来のＧＬＤＨ法において、更に共役脱水素酵素としてギ酸脱水素酵素を用いるものであり、その方法を反応式で示すと以下のようになる。
【００２１】
【化９】
【００２２】
本明細書において、当初から存在するアンモニウムイオンとは、主に、測定処理前から試料中に存在していたアンモニウムイオン、すなわち、内因性アンモニウムイオンをいう。ただし、アンモニウムイオンの本発明消去反応に使用する試薬に混在していたアンモニウムイオンをも含めるものとする。
【００２３】
本発明の試料とは、特定成分を含むものであれば、特に限定しない。血清、血漿、尿等の生体試料及びそれらを処理した液、並びにそれらのモデルサンプルを例示できる。通常、試料は１〜１００μｌの量で使用する。
アンモニウムイオンの本発明消去反応は、通常、α−ケトグルタル酸、グルタミン酸脱水素酵素、ギ酸、ギ酸脱水素酵素、及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型を含む試薬を使用できる。通常、この試薬を第１試薬として、特定成分を測定するキット中に含むことができる。
【００２４】
本発明に用いられるグルタミン酸脱水素酵素（ＧＬＤＨ）の由来は、特に限定されないが、牛の肝臓や細菌由来のものが好ましい。第１試薬中のＧＬＤＨの濃度は好ましくは０．１〜１００ｕｎｉｔ／ｍｌ、さらに好ましくは１〜７０ｕｎｉｔ／ｍｌの範囲である。
【００２５】
第１試薬に用いられるα−ケトグルタル酸の量は、特に限定されないが、０．１〜５０ｍＭ、好ましくは１〜３０ｍＭである。
【００２６】
本発明に用いられるギ酸脱水素酵素（ＦＤＨ）の由来は特に限定されないが、細菌、エンドウ、インゲン豆、ニワトリ、牛の肝臓由来のものが好ましい。特に、細菌由来のものが好ましい。第１試薬に用いられるＦＤＨの濃度は好ましくは０．０１〜１００ｕｎｉｔ／ｍｌ、さらに好ましくは０．１〜５ｕｎｉｔ／ｍｌの範囲である。
【００２７】
第１試薬のギ酸の量は、特に限定されないが、１〜１０００ｍＭ、好ましくは２０〜１２０ｍＭである。
【００２８】
本発明に用いられるＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨの由来は特に限定されるものではない。ただし、ＧＬＤＨまたはＦＤＨがＮＡＤＨ依存性の場合は、補酵素としてＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ依存性の場合はＮＡＤＰＨを用いるとよい。第１試薬のＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの濃度は、特に限定されないが、好ましくは０．０１〜１０ｍＭ、さらに好ましくは０．１〜２ｍＭである。通常、第２試薬を添加したときＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を測定するための波長での吸光度が２を越えないように、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ濃度を選択する。
これらの消去のための試薬の量が少ないと反応が進みにくいことがあり、多いと試薬が無駄なことがあり、また、試料中の特性成分を測定できなくなることがある。
【００２９】
アンモニウムイオンの本発明消去反応において、反応溶液のｐＨは、好ましくは６〜１１、さらに好ましくは７〜１０である。ｐＨが６未満または１１を越えるときは、反応が進行しにくいことがある。該消去のための緩衝液は、Ｇｏｏｄ緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、硼酸緩衝液等を使用できる。該消去反応の温度は、通常、１０〜５０℃である。第１試薬の量は、適宜変えることができるが、通常、試料１容量に対し、２０〜２００容量が好ましい。
【００３０】
アンモニウムイオンの本発明消去反応は、α−ケトグルタル酸、ＧＬＤＨ、ＦＤＨ、ギ酸、及びＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを、上記した緩衝液に加えてアンモニウムイオンを消去するための試薬を調製し、この試薬を試料に添加して、上記した温度で数分間反応させることによって実施できる。尚、この試薬は、本発明の試料中の特定成分を測定するキットの構成要素である第１試薬として用いられる。本発明の第１試薬は、溶液状態において長期保存して安定であり、従って、測定キットの構成要素として極めて好ましいものである。
【００３１】
アンモニウムイオンの本発明消去反応は、内因性アンモニウムイオンが存在すると該特定成分を正確に測定できない場合に適用すると有効である。
【００３２】
本発明において、アンモニウムイオンを発生させてその試料中の特定成分を測定する方法としては、従来の技術の項で述べたように、ウレアーゼによる尿素窒素の測定、クレアチニンデイミナーゼによるクレアチニンの測定、クレアチニナーゼ及びクレアチナーゼによるクレアチニンの測定、クレアチナーゼによるクレアチンの測定、ロイシンアミドによるロイシンアミノペプチダーゼの測定、トランスグルタミナーゼによるカルシウムイオンの測定を例示できる。
【００３３】
ウレアーゼによる尿素窒素の測定方法に用いる試薬としては、ウレアーゼ、α−ＫＧ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧＬＤＨを含む試薬を用いることができる。
【００３４】
クレアチニンデイミナーゼによるクレアチニンの測定方法に用いる試薬としては、クレアチニンデイミナーゼ、α−ＫＧ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧＬＤＨを含む試薬を用いることができる。クレアチニナーゼ及びクレアチナーゼによるクレアチニンの測定は、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、ウレアーゼ、α−ＫＧ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧＬＤＨを含む試薬を用いることができる。
【００３５】
クレアチナーゼによるクレアチンの測定方法に用いる試薬としては、クレアチナーゼ、ウレアーゼ、α−ＫＧ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧＬＤＨを含む試薬を用いることができる。
【００３６】
ロイシンアミドによるロイシンアミノペプチダーゼの測定方法に用いる試薬としては、Ｌ−ロイシンアミド、α−ＫＧ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧＬＤＨを含む試薬を用いることができる。
【００３７】
トランスグルタミナーゼによるカルシウムイオンの測定方法に用いる試薬としては、ａｐｏ−トランスグルタミナーゼ、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン、α−ＫＧ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧＬＤＨを含む試薬を用いることができる。
通常、これらの特定成分の測定反応のための試薬を第２試薬として、試料中の特定成分を測定する本発明のキット中に含むことができる。ただし、これらの試薬の中で、アンモニウムイオンの本発明消去反応に含まれている成分、すなわちα−ＫＧ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、ＧＬＤＨに関しては、それぞれ、省略することができる。第２試薬の量は、適宜変えることができるが、通常、試料１容量に対し、５〜８０容量が好ましい。
【００３８】
これらの特定成分の測定に用いる試薬、すなわち、第２試薬の中には、ギ酸脱水素酵素阻害剤をいれておくことが好ましい。すなわち、ギ酸脱水素酵素阻害剤の存在下、試料中の特定成分を測定する方法が好ましい。なぜなら、試料中の内因性アンモニウムイオンの消去のための反応系におけるギ酸脱水素酵素によるＮＡＤ（Ｐ）＋ からＮＡＤ（Ｐ）Ｈへの反応は、試料中の特定成分を測定するための反応系の最終反応であるＮＡＤ（Ｐ）ＨからＮＡＤ（Ｐ）＋ への反応の逆反応となり、従って、内因性アンモニウムイオンの消去のための反応系で用いたギ酸脱水素酵素が、試料中の特定成分を測定するための反応系においてもそのまま存在すると、特定成分の測定値に誤差を与えてしまうからである。ギ酸脱水素酵素阻害剤としては、アジ化ナトリウム、銅等の重金属またはｐ−クロルメルクリ安息香酸を例示することができる。そのうち、反応性、毒性及び環境の面からアジ化ナトリウムが特に好ましい。
ギ酸脱水素酵素阻害剤の使用量は、試料中に残存していると考えられるギ酸脱水素酵素の量に応じて決定すればよい。
【００３９】
上記した特定成分を測定するために用いる各試薬は、従来採用されている公知の量を用い、公知の条件下で、試料中の特定成分と反応させて特定成分からアンモニウムイオンを発生させ、この発生したアンモニウムイオンに基づき特定成分を測定することができる。
実際に測定を実施するには、試薬に前記した内因性アンモニウムイオンを消去するための試薬を加えて消去反応を実施した後、そのまま上記の特定成分を測定するための各試薬を試料に添加して公知の方法に従って特定成分の測定を行うことができる。
【００４０】
アンモニウムイオンの本発明消去反応においては、α−ＫＧ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下、ＧＬＤＨの作用により、当初から存在しているアンモニウムイオンが消去される。
試料中の特定成分を測定するときは、アンモニウムイオンの本発明の消去反応により、当初から存在していたアンモニウムイオンが特定成分の測定に影響することを回避することができる。
また、この消去反応において、試薬の１つとして用いたＮＡＤ（Ｐ）ＨはＮＡＤ（Ｐ）＋ に変換されるが、本発明では、ＦＤＨ及びギ酸の作用により、その消去反応により生成したＮＡＤ（Ｐ）＋ をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに戻し、再利用することができる。したがって、使用するＮＡＤ（Ｐ）Ｈは少量ですみ、多量のＮＡＤ（Ｐ）Ｈが特定成分の測定に影響するのを回避することができる。
【００４１】
試料中の特定成分の量の測定は、その特定成分からアンモニウムイオンを発生させ、その発生したアンモニウムイオンの量を測定して行う。本発明において、ギ酸脱水素酵素阻害剤の存在下、試料中の特定成分からアンモニウムイオンを発生させて試料中の特定成分を測定するには、試料中の特定成分よりアンモニウムイオンを発生させる試薬であって、かつ、ギ酸脱水素酵素阻害剤を含む前記した第２試薬を、試料からアンモニウムイオンを消去した液に、そのまま、添加して行なうことができる。試薬中の特定成分から発生したアンモニウムイオンは、ＧＬＤＨ及びα−ＫＧの作用により、ＮＡＤ（Ｐ）ＨをＮＡＤ（Ｐ）＋ に変換させる。よって、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少量から、原理的には、発生したアンモニウムイオンを測定でき、したがって、試薬中の特定成分を測定できることになる。
【００４２】
しかし、第２試薬の添加後、初めのうちは、ＦＤＨ活性が残っているので、ＧＬＤＨにより変換されたＮＡＤ（Ｐ）＋ は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈに戻ることもある。したがって、第２試薬の添加後、初めのうちは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少量からは、発生したアンモニウムイオンを正確に測定しずらい。
しかしながら、ギ酸脱水素酵素阻害剤の作用によりＦＤＨ活性が実質上無くなると、ＧＬＤＨにより変換されたＮＡＤ（Ｐ）＋ は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈに戻らなくなる。その結果、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの単位時間当たりの減少量は、特定成分から発生したアンモニウムイオンの量にのみ依存してくる。したがって、ＦＤＨ活性が実質上無くなったとき、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの単位時間当たりの減少量を測定して、すなわち、試料中の特定成分を正確に測定できる。
また、本発明の特定成分測定方法は、測定時間が短いので、試料の量と試薬量の少量化により、簡単に自動分析装置に適用できる方法である。
【００４３】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。
実施例１ アンモニウムイオン１０ｍｇ／ｄｌ及び尿素窒素５０ｍｇ／ｄｌを含む試料の試料中の尿素窒素の測定
【００４４】
試料： 試料は、アンモニウムイオン１０ｍｇ／ｄｌ及び尿素窒素５０ｍｇ／ｄｌを含む水溶液を用いた。
【００４５】
第１試薬： 第１試薬は、
を含み、かつ、ｐＨ８．０の水溶液を用いた。
【００４６】
第２試薬： 第２試薬は、
を含み、かつ、ｐＨ８．０の水溶液を用いた。
【００４７】
測定：試料０．０５ｍｌに第１試薬２．００ｍｌを加え、３７℃、５分間加温した後、第２試薬２．００ｍｌを加えて３７℃で１分間放置した後、３４０ｎｍにて２分間、吸光度の変化（時間当たりの吸光度変化量）を測定する。あらかじめ作成した検量線より、試料中の尿素窒素の濃度を求める。結果を後述する表１に示す。この試薬で測定すると、試料に内因性アンモニウムイオン１０ｍｇ／ｄｌが存在するにも拘らず、正確に、尿素窒素を測定できる。
【００４８】
実施例２ アンモニウムイオン２０ｍｇ／ｄｌ及び尿素窒素５０ｍｇ／ｄｌを含む試料の試料中の尿素窒素の測定
アンモニウムイオン２０ｍｇ／ｄｌ及び尿素窒素５０ｍｇ／ｄｌを含む水溶液からなる試料を、実施例１の第１試薬及び第２試薬を用い、実施例１と同様に測定した。結果を表１に示す。この試薬で測定すると、試料に内因性アンモニウムイオン２０ｍｇ／ｄｌが存在するにも拘らず、正確に、尿素窒素を測定できる。
【００４９】
実施例３ アンモニウムイオン３０ｍｇ／ｄｌ及び尿素窒素５０ｍｇ／ｄｌを含む試料の試料中の尿素窒素の測定
アンモニウムイオン３０ｍｇ／ｄｌ及び尿素窒素５０ｍｇ／ｄｌを含む水溶液からなる試料を、実施例１の第１試薬及び第２試薬を用い、実施例１と同様に測定した。結果を表１に示す。この試薬で測定すると、試料に内因性アンモニウムイオン３０ｍｇ／ｄｌが存在するにも拘らず、正確に、尿素窒素を測定できる。
【００５０】
比較例１〜３ ギ酸及びＦＤＨを第１試薬に入れない場合の試料中の尿素窒素の測定
試料： 比較例１、２または３は、それぞれ、実施例１、２または３と同様の試料を使用した。
【００５１】
第１試薬： 第１試薬は、
を含み、かつ、ｐＨ８．０の水溶液を用いた。
【００５２】
第２試薬： 第２試薬は、
を含み、かつ、ｐＨ８．０の水溶液を用いた。
【００５３】
測定： 比較例の第１試薬及び第２試薬を用い、実施例１〜３の試料を、実施例１と同様に操作し、比較例１〜３の結果を得た。それを表１に示す。アンモニウムイオンが増加するに従い、見掛上、尿素窒素の量が増加する現象が観察される。
【００５４】
【表１】
実施例１〜３は、ＦＤＨおよびギ酸を含む
【００５５】
実施例４ 試薬溶解液を１週間放置した場合の、本発明のギ酸脱水素酵素法による試料中の尿素窒素の測定
試料： 試料１は、尿素窒素濃度５０ｍｇ／ｄｌの水溶液を用いた。試料２は、尿素窒素濃度５０ｍｇ／ｄｌ及びアンモニウムイオン濃度３００ｍｇ／ｄｌを含む水溶液を用いた。
【００５６】
試薬： 第１試薬は、
を含み、かつ、ｐＨ８．０の水溶液を用いた。
【００５７】
第２試薬は、
を含み、かつ、ｐＨ８．０の水溶液を用いた。
【００５８】
試薬は、調製した第１試薬及び第２試薬を３０℃で７日放置したものを使用した。一方、対照として、調製したての第１試薬及び第２試薬を用いた。
【００５９】
測定： 試料０．０２ｍｌに第１試薬を２．００ｍｌ加え、３７℃、５分間加温した後、第２試薬０．５０ｍｌ加えて３７℃で１分間放置した後、２分間吸光度の変化（時間当たりの変化量）を３４０ｎｍにて測定する。あらかじめ作成した検量線より、試料中の尿素窒素の濃度を求める。結果を後述する表２に示す。ギ酸脱水素酵素法では、試薬溶解液を長時間放置しても、尿素窒素を正確に測定することができることが判明した。
【００６０】
比較例４ 試薬溶解液を１週間放置した場合の、従来のイソクエン酸脱水素酵素法による試料中の尿素窒素の測定
試料： 試料１及び試料２は、実施例４と同様のものを用いた。
試薬： 第１試薬は、
を含み、かつ、ｐＨ８．０の水溶液を用いた。第２試薬は、実施例４と同様なものを用いた。試薬は、調製した第１試薬及び第２試薬を３０℃で７日放置したものを使用した。一方、対照として、調製したての第１試薬及び第２試薬を用いた。
【００６１】
測定： 試料０．０２ｍｌに第１試薬を２．００ｍｌ加え、３７℃、５分間加温した後、第２試薬０．５０ｍｌ加えて３７℃で１分間放置した後、２分間吸光度の変化（時間当たりの変化量）を３４０ｎｍにて測定する。あらかじめ作成した検量線より、試料中の尿素窒素の濃度を求める。結果を表２に示す。イソクエン酸脱水素酵素法では、試薬溶解液を長時間放置すると、アンモニウムイオンの存在下では、尿素窒素を測定できないことが判明した。
【００６２】
【表２】
【００６３】
実施例５ アンモニウムイオンの消去能
本発明の内因性アンモニウムイオンを消去するための試薬のアンモニウムイオンの消去能を調べるため、下記の組成の水溶液２ｍｌに０．１Ｍ塩化アンモニウム水溶液または生理食塩水を０．０２ｍｌ添加し、３４０ｎｍの波長で５分間吸光度を測定した。その時の吸光度の変化の様子を図１に示す。
試薬は、
を含み、かつ、ｐＨ８．０の水溶液を用いた。
図１から、本発明の内因性アンモニウムイオンを消去するための試薬を加えることによって、５分後にはアンモニウムイオンを完全に消去できることが判明した。
【００６４】
【発明の効果】
本発明によれば、本発明で用いる測定試薬を溶解して長時間経過した場合であっても安定であり、従ってそれらの測定試薬を用いることによって、測定時に誤差を与えやすい、試料中の内因性のアンモニウムイオンを効率良く消去することができ、試料中の特定成分を正確に精度良く測定することができる。特に、本発明によれば、試料中にあらかじめ存在する高濃度のアンモニウムイオンを短時間で消去でき、試料中の特定成分を正確に精度良く測定することができる。また、臨床検査で繁用されている生化学自動分析装置でも測定することができる。したがって、臨床検査に寄与すること大である。
【図面の簡単な説明】
【図１】生理食塩水と０．１Ｍ塩化アンモニウム水溶液を試料とし、これらに本発明の内因性アンモニウムイオンを消去するため試薬を添加したときの３４０ｎｍにおける吸光度の変化の様子を示す。縦軸に吸光度、横軸に時間を表わす。
【発明の属する技術分野】
本発明は、アンモニウムイオンの消去方法、及び試料中の特定成分の測定方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、試料中の特定成分からアンモニウムイオンを発生させて発生したアンモニウムイオンに基づいて特定成分を測定する場合、試料中に当初から存在する内因性アンモニウムイオンを酵素反応により消去し、正確に該特定成分を測定する方法に関するものである。本発明は、特に、臨床検査において有効な方法である。
【０００２】
【従来の技術】
試料中の特定成分を測定するとき、試料等にアンモニウムイオンが存在すると、その特定成分を正確に測定できないことがある。例えば、試料中の特定成分からアンモニウムイオンを発生させ、そのアンモニウムイオンの量を測定することにより、該特定成分の量を測定する場合、その試料に当初からアンモニウムイオンが含まれているときは、該特定成分の量を正確に測定できにくい。
そのような特定成分として、尿素窒素、クレアチン、クレアチニン、ロイシンアミノペプチダーゼ、カルシウムイオン等が知られている。これらの成分は、以下の式のように、アンモニウムイオンを酵素反応により発生させて、測定できる。
【０００３】
【化１】
ウレアーゼによる尿素窒素の測定
【０００４】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
一方、測定しようとする試料中にも、アンモニウムイオンが当初から存在することも多い。なお、本明細書では、このような試料中にあらかじめ存在するアンモニウムイオンを内因性アンモニウムイオンと記載することもある。それらの内因性アンモニウムイオンが存在すると、酵素反応によりアンモニウムイオンを発生させて特定成分を測定しようとするとき、試料中のアンモニウムイオンが測定値に正誤差を与えて、該成分を正確に測定することはできない。そのため、内因性アンモニウムイオンを、あらかじめ、消去しておくことが必要となる。一方、尿素窒素などの測定すべき試料中の生体成分は不安定であるため、測定はなるべく迅速に、しかもできるだけ温和な条件で行われるのが望ましい。この様な条件に適している内因性アンモニウムイオンの消去方法は、酵素を使用した方法である。そのような方法として、以下の式に示されるように、内因性アンモニウムイオンとα−ケトグルタル酸（以下α−ＫＧと記載することもある）とをグルタミン酸脱水素酵素（以下、ＧＬＤＨと記載することもある）の存在下、グルタミン酸に変換させて該アンモニウムイオンを消去する方法（ＧＬＤＨ法）が考えられる。
【００１０】
【化７】
この方法は、補酵素として、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（以下、ＮＡＤＨと記載することもある）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（以下、ＮＡＤＰＨと記載することもある）を使用しなければならない。しかし、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは２００〜４２０ｎｍの領域の波長に大きな吸収をもつ。なお、本明細書において、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈとは、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを表わすものとする。一方、中間体としてアンモニウムイオンを経由して特定成分を測定するときも、前記した反応式から明らかなように、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いており、従ってＮＡＤ（Ｐ）Ｈの反応前後のこの領域の波長における吸光度の増減を利用して測定することも多い。この場合、該特定成分を測定しようとすると、試料中の内因性アンモニウムイオンを消去するために用いたＮＡＤ（Ｐ）Ｈが残存し、そのためＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量が多くなり、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの干渉をうけ、測定可能な吸光度の範囲を越えてしまい、該特定成分の測定値が正確でなくなることがある。また、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ自身は、還元作用があるので、大量に使用すると、試料中の特定成分を測定する方法のうちでも特に酸化反応を利用して特定成分を測定しようとする方法に悪影響を与える。よって、従来のＧＬＤＨ法により内因性アンモニウムイオンを消去するときは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを大量に使用しなければならないので、ＧＬＤＨ法による消去方法は、使用しにくいという欠点がある。
【００１２】
一方、ＧＬＤＨ法の改良法で、かつ、少量のＮＡＤ（Ｐ）Ｈを使用する方法も、提案されている。すなわち、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが酸化されて生じるＮＡＤ（Ｐ）＋ を、グルタミン酸脱水素酵素（ＧＬＤＨ）以外の脱水素酵素（以下、共役脱水素酵素と記載することもある）とその基質の作用により、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈに再生することで、使用するＮＡＤ（Ｐ）Ｈを少量にする方法も知られている。このような共役脱水素酵素を用いる方法としては、以下の式に示すように、イソクエン酸及びイソクエン酸脱水素酵素を用いるイソクエン酸脱水素酵素法（特開昭６２−６７００）、グルコース及びグルコース脱水素酵素を用いるグルコース脱水素酵素法（特開平５−１０３６９７）が知られている。
【００１３】
【化８】
しかし、イソクエン酸脱水素酵素法においては、アンモニウムイオンの消去のための試薬、例えばイソクエン酸は、溶液中で安定性が悪い。そのため、試薬を溶解して長時間経過した後は、試料中の特定成分を正確に測定できないという問題点があった。
また、イソクエン酸脱水素酵素法に用いられるイソクエン酸脱水素酵素は、金属要求性なので、ＥＤＴＡ等のキレート化剤を添加することにより、反応が停止する。従ってこのキレート化剤を、特定成分の測定に用いる第２試薬に添加することにより、アンモニウムイオンの消去反応を停止させるとともに、目的とする特定成分の定量を行う方法が採用されている。一方、臨床検査分野では、一般に、血液を採取する際、血液を凝固をさせないためにＥＤＴＡやクエン酸等のキレート化剤を血液に添加し、カルシウムイオンをキレート化する。このような処理をした生体試料を測定するとき、上記のイソクエン酸脱水素酵素法では、イソクエン酸脱水素酵素の反応が阻害され、アンモニウムイオンの消去反応が阻害される可能性がある。また、試料中の特定成分として臨床的に意義があるロイシンアミノペプチダーゼを測定する際に、前記反応式で示したようにロイシンアミドを基質に用いる場合、内因性アンモニウムイオンの存在は測定誤差を及ぼすので、あらかじめ消去することが望ましいが、イソクエン酸脱水素酵素法を用いると、キレート化剤が試薬中に存在することになるので、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋で活性化されるロイシンアミノペプチダーゼの活性を阻害してしまう。さらに、前記反応式で示したようにトランスグルタミナーゼによって試料中の特定成分としてカルシウムイオンを定量しようとするときも、内因性のアンモニウムイオンを消去することが望ましいが、キレート化剤を利用するイソクエン酸脱水素酵素法を用いると、カルシウムイオンがキレート化されてしまうので、使用できない。このように、金属要求性の酵素を用い、かつ、アンモニウムイオンが反応中間体である試料中の特定成分の測定方法においては、内因性アンモニウムイオンの消去法としてイソクエン酸脱水素酵素法は適切ではない。
【００１５】
一方、グルコース脱水素酵素法においても、該酵素法で基質として使用されるグルコースの影響により測定できる特定成分の範囲が限定される等の問題がある。
即ち、臨床検査分野用の自動分析装置を用いる場合、尿素窒素などと同時にグルコ−スを測定することが一般化されているので、グルコ−ス脱水素酵素法においては、基質として用いるグルコ−スがグルコ−スの測定系に影響を及ぼす可能性がある。そのため、この分野でのグルコース脱水素酵素法の使用は限定されてしまう。
また、グルコース脱水素酵素法の問題点のひとつに、グルコース脱水素酵素の阻害剤に適当なものがないことがあげられる。現に、特開平５−１０３６９７に記載されている阻害剤は、モノヨード酢酸であるが、モノヨード酢酸は、タンパク質、特に酵素のＳＨ基に特異的に反応する物質の一種で、アルコール脱水素酵素やホスホグリセルアルデヒド脱水素酵素等の、活性中心にＳＨ基をもつ酵素の活性を阻害してしまう物質であるため、このような阻害剤を用いると、試料中の特定成分の測定に利用する酵素が限定されてしまう。
したがって、試料中の特定成分を測定する方法で内因性アンモニウムイオンが存在すると特定成分を正確に測定できない場合において、使用に際して汎用性をもち、かつ、使用する試薬を溶解して長時間放置しても特定成分を正確に測定できる、内因性アンモニウムイオンの消去方法が求められていた。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、試料中の特定成分を測定する方法で、かつ、試料中に、アンモニウムイオンが当初から存在すると特定成分を正確に測定できない場合、あらかじめ、その試料中のアンモニウムイオンを消去する方法を提供することである。また、その場合、試料中のアンモニウムイオンを消去することにより、試料中の該特定成分を正確に測定する方法を提供することである。さらに、その方法において、入手しやすい試薬を用い、使用に際して汎用性をもち、かつ、用いる試薬を溶解して長時間放置しても特定成分を正確に測定できる方法を、提供することである。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記現状に鑑み、試料中にあらかじめ存在するアンモニウムイオンの影響を受けない、試料中の特定の生体成分の正確な測定方法で、かつ、測定試薬が安定な方法について、鋭意、検討した。その結果、驚くべきことに、内因性アンモニウムイオンにα−ケトグルタル酸とグルタミン酸脱水素酵素とを作用させて内因性アンモニウムイオンをグルタミン酸に変換させるグルタミン酸脱水素酵素による内因性アンモニウムイオンの消去法（ＧＬＤＨ法）において、ギ酸脱水素酵素（以下、ＦＤＨと記載することもある）を共役脱水素酵素として用いるＧＬＤＨ法の改良法により、使用する試薬を溶解して長時間放置しても、高濃度のアンモニウムイオンを消去でき、かつ、試料中の特定の生体成分が正確に測定できることを見い出した。本発明は、かかる知見により見い出されたものである。
【００１８】
本発明は、試料に、α−ケトグルタル酸、グルタミン酸脱水素酵素、ギ酸、ギ酸脱水素酵素、及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型を作用させて、当初から存在するアンモニウムイオンを消去する方法である。なお、このアンモニウムイオン消去方法をアンモニウムイオンの本発明消去方法と記載することもある。
また、本発明は、試料中の特定成分からアンモニウムイオンを発生させて試料中の特定成分を測定する方法において、あらかじめ、その試料に、α−ケトグルタル酸、グルタミン酸脱水素酵素、ギ酸、ギ酸脱水素酵素、及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型を作用させて、当初から存在するアンモニウムイオンを消去し、次いで、ギ酸脱水素酵素阻害剤の存在下、試料中の特定成分からアンモニウムイオンを発生させて試料中の特定成分を測定する方法である。なお、この試料中の特定成分を測定する方法を、本発明の特定成分測定方法と記載することもある。
本明細書において、特定成分とは、測定対象と決められた成分をいうものとする。
【００１９】
本発明の特定成分測定方法は、通常、試料中のアンモニウムイオンの消去反応、特定成分の測定反応の２段階反応により実施できる。
試料中のアンモニウムイオンの消去反応は、試料中のアンモニウムイオンを消去するための試薬であって、α−ケトグルタル酸、グルタミン酸脱水素酵素、ギ酸、ギ酸脱水素酵素、及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型を含む試薬を用いることにより実現できる。
本発明の特定成分測定方法は、試料中の特定成分を測定するキットであって、
ｉ）上記の試料中のアンモニウムイオンを消去するための試薬からなる第１試薬、及び
ｉｉ）試料中の特定成分よりアンモニウムイオンを発生させる試薬であって、かつ、ギ酸脱水素酵素阻害剤を含む第２試薬、
からなるキットを用いて実現できる。
この第１試薬は、溶液状態で安定である。したがって、第２試薬を安定な溶液にすると、本発明のキットは、液状試薬として使用できる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明のアンモニウムイオンの消去法は、従来のＧＬＤＨ法において、更に共役脱水素酵素としてギ酸脱水素酵素を用いるものであり、その方法を反応式で示すと以下のようになる。
【００２１】
【化９】
本明細書において、当初から存在するアンモニウムイオンとは、主に、測定処理前から試料中に存在していたアンモニウムイオン、すなわち、内因性アンモニウムイオンをいう。ただし、アンモニウムイオンの本発明消去反応に使用する試薬に混在していたアンモニウムイオンをも含めるものとする。
【００２３】
本発明の試料とは、特定成分を含むものであれば、特に限定しない。血清、血漿、尿等の生体試料及びそれらを処理した液、並びにそれらのモデルサンプルを例示できる。通常、試料は１〜１００μｌの量で使用する。
アンモニウムイオンの本発明消去反応は、通常、α−ケトグルタル酸、グルタミン酸脱水素酵素、ギ酸、ギ酸脱水素酵素、及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型を含む試薬を使用できる。通常、この試薬を第１試薬として、特定成分を測定するキット中に含むことができる。
【００２４】
本発明に用いられるグルタミン酸脱水素酵素（ＧＬＤＨ）の由来は、特に限定されないが、牛の肝臓や細菌由来のものが好ましい。第１試薬中のＧＬＤＨの濃度は好ましくは０．１〜１００ｕｎｉｔ／ｍｌ、さらに好ましくは１〜７０ｕｎｉｔ／ｍｌの範囲である。
【００２５】
第１試薬に用いられるα−ケトグルタル酸の量は、特に限定されないが、０．１〜５０ｍＭ、好ましくは１〜３０ｍＭである。
【００２６】
本発明に用いられるギ酸脱水素酵素（ＦＤＨ）の由来は特に限定されないが、細菌、エンドウ、インゲン豆、ニワトリ、牛の肝臓由来のものが好ましい。特に、細菌由来のものが好ましい。第１試薬に用いられるＦＤＨの濃度は好ましくは０．０１〜１００ｕｎｉｔ／ｍｌ、さらに好ましくは０．１〜５ｕｎｉｔ／ｍｌの範囲である。
【００２７】
第１試薬のギ酸の量は、特に限定されないが、１〜１０００ｍＭ、好ましくは２０〜１２０ｍＭである。
【００２８】
本発明に用いられるＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨの由来は特に限定されるものではない。ただし、ＧＬＤＨまたはＦＤＨがＮＡＤＨ依存性の場合は、補酵素としてＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ依存性の場合はＮＡＤＰＨを用いるとよい。第１試薬のＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの濃度は、特に限定されないが、好ましくは０．０１〜１０ｍＭ、さらに好ましくは０．１〜２ｍＭである。通常、第２試薬を添加したときＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を測定するための波長での吸光度が２を越えないように、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ濃度を選択する。
これらの消去のための試薬の量が少ないと反応が進みにくいことがあり、多いと試薬が無駄なことがあり、また、試料中の特性成分を測定できなくなることがある。
【００２９】
アンモニウムイオンの本発明消去反応において、反応溶液のｐＨは、好ましくは６〜１１、さらに好ましくは７〜１０である。ｐＨが６未満または１１を越えるときは、反応が進行しにくいことがある。該消去のための緩衝液は、Ｇｏｏｄ緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、硼酸緩衝液等を使用できる。該消去反応の温度は、通常、１０〜５０℃である。第１試薬の量は、適宜変えることができるが、通常、試料１容量に対し、２０〜２００容量が好ましい。
【００３０】
アンモニウムイオンの本発明消去反応は、α−ケトグルタル酸、ＧＬＤＨ、ＦＤＨ、ギ酸、及びＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを、上記した緩衝液に加えてアンモニウムイオンを消去するための試薬を調製し、この試薬を試料に添加して、上記した温度で数分間反応させることによって実施できる。尚、この試薬は、本発明の試料中の特定成分を測定するキットの構成要素である第１試薬として用いられる。本発明の第１試薬は、溶液状態において長期保存して安定であり、従って、測定キットの構成要素として極めて好ましいものである。
【００３１】
アンモニウムイオンの本発明消去反応は、内因性アンモニウムイオンが存在すると該特定成分を正確に測定できない場合に適用すると有効である。
【００３２】
本発明において、アンモニウムイオンを発生させてその試料中の特定成分を測定する方法としては、従来の技術の項で述べたように、ウレアーゼによる尿素窒素の測定、クレアチニンデイミナーゼによるクレアチニンの測定、クレアチニナーゼ及びクレアチナーゼによるクレアチニンの測定、クレアチナーゼによるクレアチンの測定、ロイシンアミドによるロイシンアミノペプチダーゼの測定、トランスグルタミナーゼによるカルシウムイオンの測定を例示できる。
【００３３】
ウレアーゼによる尿素窒素の測定方法に用いる試薬としては、ウレアーゼ、α−ＫＧ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧＬＤＨを含む試薬を用いることができる。
【００３４】
クレアチニンデイミナーゼによるクレアチニンの測定方法に用いる試薬としては、クレアチニンデイミナーゼ、α−ＫＧ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧＬＤＨを含む試薬を用いることができる。クレアチニナーゼ及びクレアチナーゼによるクレアチニンの測定は、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、ウレアーゼ、α−ＫＧ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧＬＤＨを含む試薬を用いることができる。
【００３５】
クレアチナーゼによるクレアチンの測定方法に用いる試薬としては、クレアチナーゼ、ウレアーゼ、α−ＫＧ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧＬＤＨを含む試薬を用いることができる。
【００３６】
ロイシンアミドによるロイシンアミノペプチダーゼの測定方法に用いる試薬としては、Ｌ−ロイシンアミド、α−ＫＧ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧＬＤＨを含む試薬を用いることができる。
【００３７】
トランスグルタミナーゼによるカルシウムイオンの測定方法に用いる試薬としては、ａｐｏ−トランスグルタミナーゼ、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン、α−ＫＧ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧＬＤＨを含む試薬を用いることができる。
通常、これらの特定成分の測定反応のための試薬を第２試薬として、試料中の特定成分を測定する本発明のキット中に含むことができる。ただし、これらの試薬の中で、アンモニウムイオンの本発明消去反応に含まれている成分、すなわちα−ＫＧ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、ＧＬＤＨに関しては、それぞれ、省略することができる。第２試薬の量は、適宜変えることができるが、通常、試料１容量に対し、５〜８０容量が好ましい。
【００３８】
これらの特定成分の測定に用いる試薬、すなわち、第２試薬の中には、ギ酸脱水素酵素阻害剤をいれておくことが好ましい。すなわち、ギ酸脱水素酵素阻害剤の存在下、試料中の特定成分を測定する方法が好ましい。なぜなら、試料中の内因性アンモニウムイオンの消去のための反応系におけるギ酸脱水素酵素によるＮＡＤ（Ｐ）＋ からＮＡＤ（Ｐ）Ｈへの反応は、試料中の特定成分を測定するための反応系の最終反応であるＮＡＤ（Ｐ）ＨからＮＡＤ（Ｐ）＋ への反応の逆反応となり、従って、内因性アンモニウムイオンの消去のための反応系で用いたギ酸脱水素酵素が、試料中の特定成分を測定するための反応系においてもそのまま存在すると、特定成分の測定値に誤差を与えてしまうからである。ギ酸脱水素酵素阻害剤としては、アジ化ナトリウム、銅等の重金属またはｐ−クロルメルクリ安息香酸を例示することができる。そのうち、反応性、毒性及び環境の面からアジ化ナトリウムが特に好ましい。
ギ酸脱水素酵素阻害剤の使用量は、試料中に残存していると考えられるギ酸脱水素酵素の量に応じて決定すればよい。
【００３９】
上記した特定成分を測定するために用いる各試薬は、従来採用されている公知の量を用い、公知の条件下で、試料中の特定成分と反応させて特定成分からアンモニウムイオンを発生させ、この発生したアンモニウムイオンに基づき特定成分を測定することができる。
実際に測定を実施するには、試薬に前記した内因性アンモニウムイオンを消去するための試薬を加えて消去反応を実施した後、そのまま上記の特定成分を測定するための各試薬を試料に添加して公知の方法に従って特定成分の測定を行うことができる。
【００４０】
アンモニウムイオンの本発明消去反応においては、α−ＫＧ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下、ＧＬＤＨの作用により、当初から存在しているアンモニウムイオンが消去される。
試料中の特定成分を測定するときは、アンモニウムイオンの本発明の消去反応により、当初から存在していたアンモニウムイオンが特定成分の測定に影響することを回避することができる。
また、この消去反応において、試薬の１つとして用いたＮＡＤ（Ｐ）ＨはＮＡＤ（Ｐ）＋ に変換されるが、本発明では、ＦＤＨ及びギ酸の作用により、その消去反応により生成したＮＡＤ（Ｐ）＋ をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに戻し、再利用することができる。したがって、使用するＮＡＤ（Ｐ）Ｈは少量ですみ、多量のＮＡＤ（Ｐ）Ｈが特定成分の測定に影響するのを回避することができる。
【００４１】
試料中の特定成分の量の測定は、その特定成分からアンモニウムイオンを発生させ、その発生したアンモニウムイオンの量を測定して行う。本発明において、ギ酸脱水素酵素阻害剤の存在下、試料中の特定成分からアンモニウムイオンを発生させて試料中の特定成分を測定するには、試料中の特定成分よりアンモニウムイオンを発生させる試薬であって、かつ、ギ酸脱水素酵素阻害剤を含む前記した第２試薬を、試料からアンモニウムイオンを消去した液に、そのまま、添加して行なうことができる。試薬中の特定成分から発生したアンモニウムイオンは、ＧＬＤＨ及びα−ＫＧの作用により、ＮＡＤ（Ｐ）ＨをＮＡＤ（Ｐ）＋ に変換させる。よって、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少量から、原理的には、発生したアンモニウムイオンを測定でき、したがって、試薬中の特定成分を測定できることになる。
【００４２】
しかし、第２試薬の添加後、初めのうちは、ＦＤＨ活性が残っているので、ＧＬＤＨにより変換されたＮＡＤ（Ｐ）＋ は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈに戻ることもある。したがって、第２試薬の添加後、初めのうちは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少量からは、発生したアンモニウムイオンを正確に測定しずらい。
しかしながら、ギ酸脱水素酵素阻害剤の作用によりＦＤＨ活性が実質上無くなると、ＧＬＤＨにより変換されたＮＡＤ（Ｐ）＋ は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈに戻らなくなる。その結果、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの単位時間当たりの減少量は、特定成分から発生したアンモニウムイオンの量にのみ依存してくる。したがって、ＦＤＨ活性が実質上無くなったとき、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの単位時間当たりの減少量を測定して、すなわち、試料中の特定成分を正確に測定できる。
また、本発明の特定成分測定方法は、測定時間が短いので、試料の量と試薬量の少量化により、簡単に自動分析装置に適用できる方法である。
【００４３】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。
実施例１ アンモニウムイオン１０ｍｇ／ｄｌ及び尿素窒素５０ｍｇ／ｄｌを含む試料の試料中の尿素窒素の測定
【００４４】
試料： 試料は、アンモニウムイオン１０ｍｇ／ｄｌ及び尿素窒素５０ｍｇ／ｄｌを含む水溶液を用いた。
【００４５】
第１試薬： 第１試薬は、
【００４６】
第２試薬： 第２試薬は、
【００４７】
測定：試料０．０５ｍｌに第１試薬２．００ｍｌを加え、３７℃、５分間加温した後、第２試薬２．００ｍｌを加えて３７℃で１分間放置した後、３４０ｎｍにて２分間、吸光度の変化（時間当たりの吸光度変化量）を測定する。あらかじめ作成した検量線より、試料中の尿素窒素の濃度を求める。結果を後述する表１に示す。この試薬で測定すると、試料に内因性アンモニウムイオン１０ｍｇ／ｄｌが存在するにも拘らず、正確に、尿素窒素を測定できる。
【００４８】
実施例２ アンモニウムイオン２０ｍｇ／ｄｌ及び尿素窒素５０ｍｇ／ｄｌを含む試料の試料中の尿素窒素の測定
アンモニウムイオン２０ｍｇ／ｄｌ及び尿素窒素５０ｍｇ／ｄｌを含む水溶液からなる試料を、実施例１の第１試薬及び第２試薬を用い、実施例１と同様に測定した。結果を表１に示す。この試薬で測定すると、試料に内因性アンモニウムイオン２０ｍｇ／ｄｌが存在するにも拘らず、正確に、尿素窒素を測定できる。
【００４９】
実施例３ アンモニウムイオン３０ｍｇ／ｄｌ及び尿素窒素５０ｍｇ／ｄｌを含む試料の試料中の尿素窒素の測定
アンモニウムイオン３０ｍｇ／ｄｌ及び尿素窒素５０ｍｇ／ｄｌを含む水溶液からなる試料を、実施例１の第１試薬及び第２試薬を用い、実施例１と同様に測定した。結果を表１に示す。この試薬で測定すると、試料に内因性アンモニウムイオン３０ｍｇ／ｄｌが存在するにも拘らず、正確に、尿素窒素を測定できる。
【００５０】
比較例１〜３ ギ酸及びＦＤＨを第１試薬に入れない場合の試料中の尿素窒素の測定
試料： 比較例１、２または３は、それぞれ、実施例１、２または３と同様の試料を使用した。
【００５１】
第１試薬： 第１試薬は、
【００５２】
第２試薬： 第２試薬は、
【００５３】
測定： 比較例の第１試薬及び第２試薬を用い、実施例１〜３の試料を、実施例１と同様に操作し、比較例１〜３の結果を得た。それを表１に示す。アンモニウムイオンが増加するに従い、見掛上、尿素窒素の量が増加する現象が観察される。
【００５４】
【表１】
【００５５】
実施例４ 試薬溶解液を１週間放置した場合の、本発明のギ酸脱水素酵素法による試料中の尿素窒素の測定
試料： 試料１は、尿素窒素濃度５０ｍｇ／ｄｌの水溶液を用いた。試料２は、尿素窒素濃度５０ｍｇ／ｄｌ及びアンモニウムイオン濃度３００ｍｇ／ｄｌを含む水溶液を用いた。
【００５６】
試薬： 第１試薬は、
【００５７】
第２試薬は、
【００５８】
試薬は、調製した第１試薬及び第２試薬を３０℃で７日放置したものを使用した。一方、対照として、調製したての第１試薬及び第２試薬を用いた。
【００５９】
測定： 試料０．０２ｍｌに第１試薬を２．００ｍｌ加え、３７℃、５分間加温した後、第２試薬０．５０ｍｌ加えて３７℃で１分間放置した後、２分間吸光度の変化（時間当たりの変化量）を３４０ｎｍにて測定する。あらかじめ作成した検量線より、試料中の尿素窒素の濃度を求める。結果を後述する表２に示す。ギ酸脱水素酵素法では、試薬溶解液を長時間放置しても、尿素窒素を正確に測定することができることが判明した。
【００６０】
比較例４ 試薬溶解液を１週間放置した場合の、従来のイソクエン酸脱水素酵素法による試料中の尿素窒素の測定
試料： 試料１及び試料２は、実施例４と同様のものを用いた。
試薬： 第１試薬は、
【００６１】
測定： 試料０．０２ｍｌに第１試薬を２．００ｍｌ加え、３７℃、５分間加温した後、第２試薬０．５０ｍｌ加えて３７℃で１分間放置した後、２分間吸光度の変化（時間当たりの変化量）を３４０ｎｍにて測定する。あらかじめ作成した検量線より、試料中の尿素窒素の濃度を求める。結果を表２に示す。イソクエン酸脱水素酵素法では、試薬溶解液を長時間放置すると、アンモニウムイオンの存在下では、尿素窒素を測定できないことが判明した。
【００６２】
【表２】
実施例５ アンモニウムイオンの消去能
本発明の内因性アンモニウムイオンを消去するための試薬のアンモニウムイオンの消去能を調べるため、下記の組成の水溶液２ｍｌに０．１Ｍ塩化アンモニウム水溶液または生理食塩水を０．０２ｍｌ添加し、３４０ｎｍの波長で５分間吸光度を測定した。その時の吸光度の変化の様子を図１に示す。
試薬は、
図１から、本発明の内因性アンモニウムイオンを消去するための試薬を加えることによって、５分後にはアンモニウムイオンを完全に消去できることが判明した。
【００６４】
【発明の効果】
本発明によれば、本発明で用いる測定試薬を溶解して長時間経過した場合であっても安定であり、従ってそれらの測定試薬を用いることによって、測定時に誤差を与えやすい、試料中の内因性のアンモニウムイオンを効率良く消去することができ、試料中の特定成分を正確に精度良く測定することができる。特に、本発明によれば、試料中にあらかじめ存在する高濃度のアンモニウムイオンを短時間で消去でき、試料中の特定成分を正確に精度良く測定することができる。また、臨床検査で繁用されている生化学自動分析装置でも測定することができる。したがって、臨床検査に寄与すること大である。
【図面の簡単な説明】
【図１】生理食塩水と０．１Ｍ塩化アンモニウム水溶液を試料とし、これらに本発明の内因性アンモニウムイオンを消去するため試薬を添加したときの３４０ｎｍにおける吸光度の変化の様子を示す。縦軸に吸光度、横軸に時間を表わす。
Claims (4)
- 試料中の特定成分からアンモニウムイオンを発生させて試料中の特定成分を測定する方法において、あらかじめ、その試料に、α−ケトグルタル酸、グルタミン酸脱水素酵素、ギ酸、ギ酸脱水素酵素、及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型を作用させて、試料中に当初から存在するアンモニウムイオンを消去し、次いで、ギ酸脱水素酵素阻害剤の存在下、試料中の特定成分からアンモニウムイオンを発生させて試料中の特定成分を測定する方法。
- ギ酸脱水素酵素阻害剤がアジ化ナトリウムである請求項１記載の試料中の特定成分を測定する方法。
- 試料中の特定成分を測定するキットであって、
ｉ）試料中のアンモニウムイオンを消去するための第１試薬であって、α−ケトグルタル酸、グルタミン酸脱水素酵素、ギ酸、ギ酸脱水素酵素、及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型を含む第１試薬、及び
ｉｉ）試料中の特定成分よりアンモニウムイオンを発生させる試薬であって、かつ、ギ酸脱水素酵素阻害剤を含む第２試薬、
からなるキット。 - 第１試薬及び第２試薬が液状の形態にある、請求項３記載のキット。
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