JPH0365160B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は尿素窒素の測定法に関する。更に詳細
には、本発明は尿素を含有する試料にα−ケトグ
ルタール酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
タイド（以下NADHという）もしくはニコチン
アミドアデニンジヌクレオタイドホスフエート
（以下NADPHという）及びグルタミン酸脱水素
酵素（以下GLDHという）を作用させ、次いで
ウレアーゼ及びウレアーゼ拮抗阻害剤としてのホ
ウ酸又はその塩を同時に加え試料中の尿素をウレ
アーゼで加水分解し、アンモニアの生成速度をα
−ケトグルタール酸、NADHもしくはNADPH
及びGLDHよりなる酵素共役系を用いてNADH
もしくはNADPHの減少速度から求め試料中の
尿素窒素を定量する方法である。 血精及び尿中の尿素窒素量は、種々の腎機能障
害及び肝実質障害時に変動することが知られてお
り、その障害度並びに予後の診断に関して極めて
重要な意義をもつために、最近では共存する妨害
物質の影響を受けない迅速、正確な定量方法が望
まてれいる。尿素窒素の従来の定量法としては、
例えば試料中の尿素をジアセチルモノオキシムと
直接反応させ、比色定量する方法があるが、反応
の特異性、再現性が好ましくない。また、ウレア
ーゼで尿素を特異的に加水分解し、生成するアン
モニア量を種々の検出方法にて定量する方法があ
るが、検体に共存するタンパク質やアモニア及び
グルタチオン等が測定値に影響し、好ましいとは
言難い。一方、α−ケトグルタール酸及び
NADHまたはNADPHの存在下、GLDHを作用
させてNADHまたはNADPHの減少量より、ア
ンモニア量を求める方法はアンモニアに対して特
異性の高い方法であるが、反応の終末端における
残存のNADHまたはNADPHの紫外部吸収を測
定するため、試料中に共存するアンモニア、試料
のにごり、紫外部に吸収を持つ種々の共存物質の
影響を受け、好ましい方法であるとは言い難く且
つNADHまたはNADPH濃度は、測定器の測定
可能な吸光度限界により制限されるため充分な
NADHまたはNADPHを加えられず、測定可能
な尿素窒素の濃度範囲が狭くなる欠点がある。 近年、臨床領域における自動分析機の急速な普
及に伴い、短時間での測定が可能であり、且つ共
存物質の影響を受けない反応速度法による尿素窒
素の定量法が望まれている。一般に、酵素の反応
速度にて、その酵素の基質となる物質を定量する
場合には、酵素の基質に対するKm値が測定系に
おける基質濃度より充分大きいことが必須条件と
なる。ウレアーゼを用いた尿素窒素の定量におい
ては、正常ヒト血清中の尿素濃度は３〜９ｍＭ
（尿素窒素として８〜25mg／dl）であるのに対し、
ウレアーゼの尿素に対するKm値は数ｍＭ程度と
小さいため、測定法としては終末点法が適当であ
つた。一方、反応速度法にて尿素窒素を定量する
際には、反応系における尿素濃度を低くするため
に試料を高倍率に希釈する必要があつた。しかし
ながら、このような反応速度法においては、検体
の希釈に伴う著しい感度の低下等の種々の問題の
ため、実際の日常分析に用いることは不可能であ
る。また、Km値そのものを適当な値に調節する
手段として、酵素（ウレアーゼ）に直接作用し酵
素の基質に対する親和性を調節する物質、即ち拮
抗阻害物質を用いる方法が報告されている（クリ
ニカルケミストリー、25巻、1721頁、1979年）。
この方法は拮抗阻害剤としてヒドロキシウレアを
用い、ウレアーゼに作用させ尿素窒素を定量す
る。しかしながらこの方法においては阻害剤とし
て用いるヒドロキシウレアは試薬として調製した
後の安定性に欠け、しかもアンモニアや尿素を含
まない高純度な市販の標品を得ることがむずかし
く、さらにその作用がウレアーゼ及び基質と混合
した時、時間に依存して変化する等の問題があつ
た。しかしながら、この方法に使用可能な拮抗阻
害剤としてはヒドロキシウレアだけが見出されて
いるに過ぎない。 そこで、本発明者らは公知方法の欠点を克服す
べく鋭意検討した結果、ウレアーゼの拮抗阻害剤
としてホウ酸又はその塩が有効であることを見出
本発明を完成した。 本発明を実施する場合、試料にα−ケトグルタ
ール酸、NADHまたはNADPHの存在下、PH７
〜８範囲でGLDHを作用させることにより試料
中に存在するアンモニアが処理できる。なお、こ
の反応は37℃で通常１〜２分あれば終了する。 次に、この反応液にウレアーゼ及びホウ酸又は
その塩を同時に加え、尿素を加水分解しアンモニ
アの生成速度を反応液中のα−ケトグルタール
酸、NADHまたはNADPH、GLDHを利用し、
この酵素共役系からNADHまたはNADPHの減
少速度を求め、尿素窒素量を求める。 本発明に使用されるα−ケトグルタール酸、
NADHもしくはNADPH、GLDHの各量は試料
中にあらかじめ共存しているアンモニア量及び尿
素量により異なるが、例えば検体として血清25μ
を使用する時には中性〜弱アルカリ性の緩衝液
２mlにα−ケトグルタール酸４mg、NADPH0.4
mg、GLDH15単位程度含まれているのが好まし
い。一方、ウレアーゼ及びホウ酸又はその塩は前
期同様の緩衝液１mlにウレアーゼは0.7単位程度
あれば良く、この時のホウ酸又はその塩は0.20mg
〜１mgあれば充分である。 本反応系に用いるホウ酸又はその塩は、ウレア
ーゼ及び気質と混合した後の時間にかかわらず作
用即ち阻害率は一定であり、その阻害定数は0.2
ｍＭと小さいため、２ｍＭ程度のホウ酸又は塩の
存在下では、ウレアーゼの尿素に対するKm値は
11倍程度となる。その事実は次の阻害剤の速度反
応の関係により明らかである。 Km＝Km′（１＋〔Ｉ〕／KI） （但し、Kmb′：阻害剤が存在しない時のKm
値、〔Ｉ〕：阻害剤濃度、KI：阻害剤定数をい表
わす。） なお、ホウ酸又はその塩濃度を増加させること
によりKm値を大きくすること持可能である。従
つて高濃度の尿素を含む検体の測定にいても検体
を希釈することなく、正確且つ高感度に測定する
ことができる。 本発明で使用するホウ酸塩はホウ酸ナトリウ
ム、ホウ酸カリウム等が挙げられる。また、α−
ケトグルタール酸、NADHもしくはNADPH、
GLDHはPH７〜８範囲の通常使用されている緩
衝液に溶解し一液とし、一方ウレアーゼ、ホウ酸
又はその塩も同様に緩衝液に溶解しておき使用す
ると便利である。なお、緩衝液としては通常使用
されているものであればいずれも使用可能であ
る。 一方、GLDHは細菌由来と動物由来とがあり、
NADHを使用する場合は動物由来を、NADPH
を使用する場合は細菌由来を選択することが必要
である。尿素を含む試料としては例えば体液即ち
血液、血清、血漿、尿、ずい液、腹こう液等、ま
た透析液等尿素を含むものであれば使用できる。 以上のように本発明に検体に共存するアンモニ
アをあらかじめ処理するので、内因性のアンモニ
アの影響を受けない。さらにNADHまたは
NADPHの減少速度として測定するため、測定
に要する時間は短く且つ還元物質及び紫外部に吸
収をもつ検体中の共存物質等の影響はほとんど受
けない。その上、ウレアーゼ拮抗阻害剤であるホ
ウ酸又はその塩はウレアーゼ及び基質と混合して
も阻害率は変わることがなく、高濃度の尿素まで
正確に定量できるため、従来法では好ましい結果
が得られなかつた透析患者血清等における尿素窒
素の測定に極めて有用である。 次に実施例により本発明を詳細に透析する。 実施例 １ (1) 試薬 反応液１ グルタミン酸脱水素酵素 750単位 NADPH 24mg α−ケトグルタール酸 219mg トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）
310mg 上記成分を精製水100mlに溶解し、最終PHが
7.8になるように希塩酸にて調整する。 反応液２ アレアーゼ 70単位 ほう酸 87mg EDTA−2Na 111mg トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）
810mg 上記成分を精製水100mlに溶解し、最終PHが
7.8になるように希塩酸にて調整する。 (2) 測定操作 試験官に反応液１を２ml、正常ヒト血清に下
記表の如く尿素水溶液を10対１の比率で添加混
合した検体25μを加え、87℃３分間保温す
る。次に、これに反応液２の１mlを加え87℃に
保ちながら、反応液２の添加後１分後から
340nｍにおける１分間の吸光度変化を測定す
る。別に既知濃度の検体を用いて検量線を作成
し、これを用いて尿素窒素濃度を求める。 結 果

【表】 素窒素値 窒素濃度
＊ 計算値＝

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 尿素を含有する試料にα−ケトグルタール
   酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオタイドも
   しくはニコチンアミドアデニンジヌクレオタイド
   ホスフエート及びグルタミン酸脱水素酵素を作用
   させ、次いでウレアーゼ及びウレアーゼ拮抗阻害
   剤としてのホウ酸又はその塩を同時に加えウレア
   ーゼで尿素をアンモニアに変換させα−ケトグル
   タール酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオタ
   イドもしくはニコチンアミドアデニンジヌクレオ
   タイドホスフエートの存在下グルタミン酸脱水素
   酵素で処理しニコチンアミドアデニンジヌクレオ
   タイドもしくはニコチンアミドアデニンジヌクレ
   オタイドホスフエートの減少速度を測定すること
   を特徴とする尿素窒素の測定法。