JPH04271799A - クレアチニンを酵素により測定する方法および試薬 - Google Patents
クレアチニンを酵素により測定する方法および試薬Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、水性試料、特に血清お
よび尿のような生物学的由来物中のクレアチニンを酵素
により測定するための方法および試薬に関する。
よび尿のような生物学的由来物中のクレアチニンを酵素
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【０００２】
【従来の技術】血清および尿中のクレアチニン濃度の測
定は、臨床化学において、腎機能の診断のための重要な
方法の一つである。この目的のために同様に使用される
尿素測定に比べて、この方法は、栄養に応じて、特にタ
ンパク質に富んだ食物を供給により、血清および尿中の
クレアチニン濃度は実際に影響ないままであるという決
定的な利点を有する。
定は、臨床化学において、腎機能の診断のための重要な
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ンパク質に富んだ食物を供給により、血清および尿中の
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定的な利点を有する。
【０００３】もちろん、尿素に比べて、たとえば決定範
囲（標準値の上限、男、１．１０ｍｇ／ｄｌならびに女
０．９０ｍｇ／ｄｌ）内の血清中のクレアチニン濃度は
特にわずかである。従って、適当なクレアチニンテスト
の感度および選択性に関して、高い要求をする必要があ
る。
囲（標準値の上限、男、１．１０ｍｇ／ｄｌならびに女
０．９０ｍｇ／ｄｌ）内の血清中のクレアチニン濃度は
特にわずかである。従って、適当なクレアチニンテスト
の感度および選択性に関して、高い要求をする必要があ
る。
【０００４】これは、臨床学的実験室において標準試験
法として重要であるため、同時にできるかぎり少ない作
業手順で実施可能であるのが有利であり、特に自動分析
機を使用するのに適しているのが好ましい。
法として重要であるため、同時にできるかぎり少ない作
業手順で実施可能であるのが有利であり、特に自動分析
機を使用するのに適しているのが好ましい。
【０００５】今日なお慣用のクレアチニンの測定法はヤ
ッフェの方法に基づいており、この方法の場合、試料を
アルカリ性ピクリン酸溶液と混合し、クレアチニンとピ
クリン酸塩との反応により生じた色素を測定している。
ッフェの方法に基づいており、この方法の場合、試料を
アルカリ性ピクリン酸溶液と混合し、クレアチニンとピ
クリン酸塩との反応により生じた色素を測定している。
【０００６】しかし、この簡単な方法は一連の著しい欠
点がある。部分的に腐食性でかつ毒性の試薬を使用する
必要があるとともに、いわゆる「偽クレアチニン色素原
（Ｐｓｅｕｄｏ−Ｃｒｅａｔｉｎｉｎ−Ｃｈｒｏｍｏｇ
ｅｎ）」による特に陽性または陰性の障害である。自然
に血清または尿中に存在する成分、たとえばグルコース
、ピルベートおよびアセトアセテートのような５０を越
える色素原が文献に記載されている（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅ
ｍ．１９８０：２６，１１１９−１１２６）。ヤッフェ
法のこのような障害を避けるため、多数の変法が開発さ
れたが、これによっても前記障害は完全に取り除くこと
ができなかった。
点がある。部分的に腐食性でかつ毒性の試薬を使用する
必要があるとともに、いわゆる「偽クレアチニン色素原
（Ｐｓｅｕｄｏ−Ｃｒｅａｔｉｎｉｎ−Ｃｈｒｏｍｏｇ
ｅｎ）」による特に陽性または陰性の障害である。自然
に血清または尿中に存在する成分、たとえばグルコース
、ピルベートおよびアセトアセテートのような５０を越
える色素原が文献に記載されている（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅ
ｍ．１９８０：２６，１１１９−１１２６）。ヤッフェ
法のこのような障害を避けるため、多数の変法が開発さ
れたが、これによっても前記障害は完全に取り除くこと
ができなかった。
【０００７】クレアチニン測定の特異性を改善するため
、過去数年間に、視点がしだいに酵素によるテスト方法
に移行してきた。
、過去数年間に、視点がしだいに酵素によるテスト方法
に移行してきた。
【０００８】Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎ
ｖｅｓｔ．，ｓｕｐｐｌ．２９ｐ．１２６（１９７２）
には、完全に酵素によるクレアチニンテストが記載され
ており、その際、クレアチニン−アミドヒドロラーゼ（
ＥＣ ３．５．２．１０）を用いてクレアチニンをク
レアチンに変換し、最終的にＡＴＰおよびクレアチン−
キナーゼ（ＥＣ ２．７．３．２）を用いてクレアチ
ンホスフェートに変換し、生じたＡＴＰをピルベート−
キナーゼ（ＥＣ ２．７．１．４０）およびラクテー
ト−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．２７）と
の結合反応において、反応溶液中のＮＡＤＨ消費量に関
して、ＵＶ領域において測光的に測定している。
ｖｅｓｔ．，ｓｕｐｐｌ．２９ｐ．１２６（１９７２）
には、完全に酵素によるクレアチニンテストが記載され
ており、その際、クレアチニン−アミドヒドロラーゼ（
ＥＣ ３．５．２．１０）を用いてクレアチニンをク
レアチンに変換し、最終的にＡＴＰおよびクレアチン−
キナーゼ（ＥＣ ２．７．３．２）を用いてクレアチ
ンホスフェートに変換し、生じたＡＴＰをピルベート−
キナーゼ（ＥＣ ２．７．１．４０）およびラクテー
ト−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．２７）と
の結合反応において、反応溶液中のＮＡＤＨ消費量に関
して、ＵＶ領域において測光的に測定している。
【０００９】この方法は、クレアチニンにたいして特異
的であるが、しかしクレアチニン１分子あたりＮＡＤＨ
１分子を消費するにすぎないため、テストバッチ中でよ
り多くの試料容量を使用する場合でさえ（２００μｌ試
料／１０００μｌ試薬）、ＮＡＤＨの比較的低いモルの
吸光係数に基づき、比較的低い感度を示し、ひいては決
定範囲内での比較的低い精度を示す。
的であるが、しかしクレアチニン１分子あたりＮＡＤＨ
１分子を消費するにすぎないため、テストバッチ中でよ
り多くの試料容量を使用する場合でさえ（２００μｌ試
料／１０００μｌ試薬）、ＮＡＤＨの比較的低いモルの
吸光係数に基づき、比較的低い感度を示し、ひいては決
定範囲内での比較的低い精度を示す。
【００１０】さらに、試料中でクレアチンおよび／また
はピルベートが高濃度である場合、ＮＡＤＨに関して非
特異的な過剰消費を起し、ひいては、場合により誤った
低いクレアチニン量が生じてしまう。
はピルベートが高濃度である場合、ＮＡＤＨに関して非
特異的な過剰消費を起し、ひいては、場合により誤った
低いクレアチニン量が生じてしまう。
【００１１】さらに、自動分析機についての適合性も、
比較的緩慢な反応進行のため著しく限定されてしまう。
比較的緩慢な反応進行のため著しく限定されてしまう。
【００１２】もう一つの、同様のクレアチニンに対する
特異的なテスト原理は、クレアチニンを、クレアチニン
−イミノヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ． ３．５．４．２１
）を用いて１−メチルヒダントインとＮＨ４＋とに分解
し、生じたＮＨ４＋を、結合したグルタメート−デヒド
ロゲナーゼ反応におけるＮＡＤＨ減少について、ＵＶ領
域において測光的に測定している（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ
．１９８２：２８，１４６１−１４６４）。
特異的なテスト原理は、クレアチニンを、クレアチニン
−イミノヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ． ３．５．４．２１
）を用いて１−メチルヒダントインとＮＨ４＋とに分解
し、生じたＮＨ４＋を、結合したグルタメート−デヒド
ロゲナーゼ反応におけるＮＡＤＨ減少について、ＵＶ領
域において測光的に測定している（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ
．１９８２：２８，１４６１−１４６４）。
【００１３】比較的早く反応が進行するため、この方法
は自動分析機を使用するのに適しているが、その測定感
度および精度に関しては、同様に、クレアチニン１分子
あたりのＮＡＤＨ１分子の消費にすぎず、最初に述べた
ＵＶテストについてと同様の制限が通用する。
は自動分析機を使用するのに適しているが、その測定感
度および精度に関しては、同様に、クレアチニン１分子
あたりのＮＡＤＨ１分子の消費にすぎず、最初に述べた
ＵＶテストについてと同様の制限が通用する。
【００１４】前記した酵素によるクレアチニンテストの
主な欠点、つまり少なすぎる検出感度ひいては高すぎる
非精密さは、酵素のクレアチニン−アミドヒドロラーゼ
（Ｅ．Ｃ． ３．５．２．１０）およびクレアチン−
アミドヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．３．３）（Ｃｌ
ｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９８４：３０，９６８）または酵素
のクレアチニン−イミノヒドロラーゼ、ＡＴＰ−依存性
１−メチルヒダントイナーゼおよびＮ−カルバモイルサ
ルコシン−アミドヒドロラーゼ（Ａｎａｌ．Ｌｅｔｔｅ
ｒ １９８８：２１，１００９−１０１７）を用いて
クレアチニンをサルコシンに分解した場合に回避するこ
とができる。生じたサルコシンは、サルコシン−オキシ
ダーゼ（Ｅ．Ｃ．１．５．３．１）の存在で、特にＨ２
Ｏ２に変換させ、これをたとえばペルオキシダーゼ（Ｅ
．Ｃ．１．１１．１．７）の存在で、たとえば２，４，
６−トリブロモ−３−ヒドロキシ安息香酸を４−アミノ
アンチプリン（４−ＡＡＰ）または３−メチル−２−ベ
ンゾ−（２´−スルホ）−トリアゾリノン−ヒドラゾン
（ＭＢＴＨ−Ｓ）と酸化カプリングさせることにより感
応的方法で測色により測定することができる。
主な欠点、つまり少なすぎる検出感度ひいては高すぎる
非精密さは、酵素のクレアチニン−アミドヒドロラーゼ
（Ｅ．Ｃ． ３．５．２．１０）およびクレアチン−
アミドヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．３．３）（Ｃｌ
ｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９８４：３０，９６８）または酵素
のクレアチニン−イミノヒドロラーゼ、ＡＴＰ−依存性
１−メチルヒダントイナーゼおよびＮ−カルバモイルサ
ルコシン−アミドヒドロラーゼ（Ａｎａｌ．Ｌｅｔｔｅ
ｒ １９８８：２１，１００９−１０１７）を用いて
クレアチニンをサルコシンに分解した場合に回避するこ
とができる。生じたサルコシンは、サルコシン−オキシ
ダーゼ（Ｅ．Ｃ．１．５．３．１）の存在で、特にＨ２
Ｏ２に変換させ、これをたとえばペルオキシダーゼ（Ｅ
．Ｃ．１．１１．１．７）の存在で、たとえば２，４，
６−トリブロモ−３−ヒドロキシ安息香酸を４−アミノ
アンチプリン（４−ＡＡＰ）または３−メチル−２−ベ
ンゾ−（２´−スルホ）−トリアゾリノン−ヒドラゾン
（ＭＢＴＨ−Ｓ）と酸化カプリングさせることにより感
応的方法で測色により測定することができる。
【００１５】しかし、この表示系は、色形成と共に負に
干渉するたとえばアスコルビン酸、ビリルビンならびに
特定の薬品［Ｃａ−ドベシレート（Ｃａ−Ｄｏｂｅｓｉ
ｌａｔ）、α−メチルドーパ（α−Ｍｅｔｈｙｌｄｏｐ
ａ）のような還元性の試料成分に対して障害が多い。
干渉するたとえばアスコルビン酸、ビリルビンならびに
特定の薬品［Ｃａ−ドベシレート（Ｃａ−Ｄｏｂｅｓｉ
ｌａｔ）、α−メチルドーパ（α−Ｍｅｔｈｙｌｄｏｐ
ａ）のような還元性の試料成分に対して障害が多い。
【００１６】これに対して、ＮＡＤＨ−もしくはＮＡＤ
ＰＨ−依存性デヒドロゲナーゼ−表示反応に基づく測定
方法は、このような物質に対して不活性である。
ＰＨ−依存性デヒドロゲナーゼ−表示反応に基づく測定
方法は、このような物質に対して不活性である。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】従って、Ｈ２Ｏ２−可
視化に基づく表示系を用いたテストの利点、つまり試料
中の低い被分析物の濃度でも良好な測定感度および精密
さを、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−依存性デヒドロゲナーゼ反応に
基づく検出法、たとえば非特異的な還元性の試料成分、
たとえばアスコルビン酸、ビリルビン、Ｃａ−ドベシレ
ートおよびα−メチルドーパに対する障害の少なさと組
み合わせ、同時に自動分析機について良好な適合性があ
るようなクレアチニンを特異的に酵素により測定する方
法が必要となった。
視化に基づく表示系を用いたテストの利点、つまり試料
中の低い被分析物の濃度でも良好な測定感度および精密
さを、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−依存性デヒドロゲナーゼ反応に
基づく検出法、たとえば非特異的な還元性の試料成分、
たとえばアスコルビン酸、ビリルビン、Ｃａ−ドベシレ
ートおよびα−メチルドーパに対する障害の少なさと組
み合わせ、同時に自動分析機について良好な適合性があ
るようなクレアチニンを特異的に酵素により測定する方
法が必要となった。
【００１８】さらに、この方法は、クレアチニン−測定
に関して、試料から内生的クレアチンおよびピルバート
による不利な影響を排除するのが好ましい。
に関して、試料から内生的クレアチンおよびピルバート
による不利な影響を排除するのが好ましい。
【００１９】
【課題を解決するための手段】前記課題は、本発明によ
り、試料中に含まれるクレアチニンを、クレアチニン−
イミノヒドロラーゼを用いて１−メチルヒダントインと
、第一の分子ＮＨ３とに変換し、生じた１−メチルヒダ
ントインを、ＡＴＰ依存性１−メチルヒダントイナーゼ
およびＮ−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラー
ゼを用いてサルコシン、ＣＯ２、及び代にの分子のＮＨ
３に変換し、生じた両方の分子のＮＨ３を一緒に測定す
ることを特徴とする水溶液中のクレアチニンを酵素によ
り測定する方法により解決される。この測定は、グルタ
メート−デヒドロゲナーゼおよびＮＡＤＨもしくはＮＡ
ＤＰＨの存在で、ＮＨ３をα−ケトグルタレートと反応
させることにより行うのが有利であり、その際グルタメ
ートが生成し、ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨの消費量を
特に測光的に測定する。
り、試料中に含まれるクレアチニンを、クレアチニン−
イミノヒドロラーゼを用いて１−メチルヒダントインと
、第一の分子ＮＨ３とに変換し、生じた１−メチルヒダ
ントインを、ＡＴＰ依存性１−メチルヒダントイナーゼ
およびＮ−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラー
ゼを用いてサルコシン、ＣＯ２、及び代にの分子のＮＨ
３に変換し、生じた両方の分子のＮＨ３を一緒に測定す
ることを特徴とする水溶液中のクレアチニンを酵素によ
り測定する方法により解決される。この測定は、グルタ
メート−デヒドロゲナーゼおよびＮＡＤＨもしくはＮＡ
ＤＰＨの存在で、ＮＨ３をα−ケトグルタレートと反応
させることにより行うのが有利であり、その際グルタメ
ートが生成し、ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨの消費量を
特に測光的に測定する。
【００２０】本発明の方法は、この種の公知のクレアチ
ニン測定方法と比較して同様の試料容量対試薬容量の割
合において、検出感度を二倍にすることができ、精度を
改善し、同時にＨ２Ｏ２を介して進行する塩素滴定検出
法の欠点、たとえば非特異性の還元する試料成分による
障害を回避することができる。
ニン測定方法と比較して同様の試料容量対試薬容量の割
合において、検出感度を二倍にすることができ、精度を
改善し、同時にＨ２Ｏ２を介して進行する塩素滴定検出
法の欠点、たとえば非特異性の還元する試料成分による
障害を回避することができる。
【００２１】さらに、試料からの内生的クレアチンもし
くはピルベートはクレアチニン測定に関して影響を及ぼ
さない。それというのもこれらの物質を介して検出反応
は進行しないためである。
くはピルベートはクレアチニン測定に関して影響を及ぼ
さない。それというのもこれらの物質を介して検出反応
は進行しないためである。
【００２２】血清および尿のような試料材料は、常に痕
跡量の内生的アンモニウムイオンを有しているため、正
確なクレアチニン測定をのための特に有利な実施態様は
、分析すべき試料を、第１工程でα−ケトグルタレート
、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、ＧｌＤＨ、ＮＭＨａｓｅならびに、
場合によりＣＳＨａｓｅと反応させ、完全に終了した後
に最初のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ消費量を測定し、引き続き第２
工程でＣＲＩＭＩ、ＡＴＰならびに、場合によりＣＳＨ
ａｓｅを用いてさらに反応させ、第２のＮＡＨ（Ｐ）Ｈ
消費量を測定し、試料中のクレアチニン含量を第２の反
応工程におけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ消費量から算定すること
よりなる（段階測定、Ｅ１／Ｅ２方法）。
跡量の内生的アンモニウムイオンを有しているため、正
確なクレアチニン測定をのための特に有利な実施態様は
、分析すべき試料を、第１工程でα−ケトグルタレート
、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、ＧｌＤＨ、ＮＭＨａｓｅならびに、
場合によりＣＳＨａｓｅと反応させ、完全に終了した後
に最初のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ消費量を測定し、引き続き第２
工程でＣＲＩＭＩ、ＡＴＰならびに、場合によりＣＳＨ
ａｓｅを用いてさらに反応させ、第２のＮＡＨ（Ｐ）Ｈ
消費量を測定し、試料中のクレアチニン含量を第２の反
応工程におけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ消費量から算定すること
よりなる（段階測定、Ｅ１／Ｅ２方法）。
【００２３】第２の反応工程において、選択したもしく
は分析装置から定めることができるインキュベーション
イターバルに応じて完全な基質の反応が得られていない
場合に、終点測定の代わりに、いわゆる動力学的な「ｆ
ｉｘｅｄ−ｔｉｍｅ」法で作業することができる。その
際、テストにおけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ消費量と試料中のク
レアチニン濃度との直線的関係を保証するために、この
反応速度論を一次もしくは擬一次反応により行わねばな
らない。 本発明の方法において、２つの異なる分解進行工程から
のクレアチニンからの両方のＮＨ３分子は、相互にＧｌ
ＤＨ−指示薬反応にとって使い古されているため、この
場合、ＣＲＩＭＩ反応かまたはＧｌＤＨ反応がテストバ
ッチにおける速度測定工程を示すことが必要である。
は分析装置から定めることができるインキュベーション
イターバルに応じて完全な基質の反応が得られていない
場合に、終点測定の代わりに、いわゆる動力学的な「ｆ
ｉｘｅｄ−ｔｉｍｅ」法で作業することができる。その
際、テストにおけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ消費量と試料中のク
レアチニン濃度との直線的関係を保証するために、この
反応速度論を一次もしくは擬一次反応により行わねばな
らない。 本発明の方法において、２つの異なる分解進行工程から
のクレアチニンからの両方のＮＨ３分子は、相互にＧｌ
ＤＨ−指示薬反応にとって使い古されているため、この
場合、ＣＲＩＭＩ反応かまたはＧｌＤＨ反応がテストバ
ッチにおける速度測定工程を示すことが必要である。
【００２４】本発明の方法のもう一つの実施態様におい
て、いわゆる試料−／試料空値法を用いて作業すること
ができる；この試料空値に対して、全試薬からＣＲＩＭ
Ｉを除き（空値試料）、一方で全試薬を用いた試料をお
よび他方で空値試薬を用いた試料をインキュベートする
際に、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ消費量の差から試料中のクレアチ
ニン濃度を計算する。
て、いわゆる試料−／試料空値法を用いて作業すること
ができる；この試料空値に対して、全試薬からＣＲＩＭ
Ｉを除き（空値試料）、一方で全試薬を用いた試料をお
よび他方で空値試薬を用いた試料をインキュベートする
際に、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ消費量の差から試料中のクレアチ
ニン濃度を計算する。
【００２５】本発明のもう一つの対象は、クレアチニン
を酵素により測定するための試薬において、水性緩衝液
中で、クレアチニン−イミノヒドロラーゼ、Ｎ−カルバ
モイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ、ＡＴＰ依存性
１メチルヒダントイン−ヒドロラーゼ、ＡＴＰ、Ｍｇ＋
＋および場合によりグルタメート−デヒドロゲナーゼ、
ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、α−ケトグルタレートなら
びに、場合により酵素活性剤、たとえばＡＤＰおよびＫ
＋塩を含有することを特徴とするクレアチニンを酵素に
より測定するための試薬である。
を酵素により測定するための試薬において、水性緩衝液
中で、クレアチニン−イミノヒドロラーゼ、Ｎ−カルバ
モイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ、ＡＴＰ依存性
１メチルヒダントイン−ヒドロラーゼ、ＡＴＰ、Ｍｇ＋
＋および場合によりグルタメート−デヒドロゲナーゼ、
ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、α−ケトグルタレートなら
びに、場合により酵素活性剤、たとえばＡＤＰおよびＫ
＋塩を含有することを特徴とするクレアチニンを酵素に
より測定するための試薬である。
【００２６】クレアチニンをサルコシンにする反応の間
に生じるアンモニアを、前記したように、α−ケトグル
タレートをグルタメート−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ
１．４．１．３）を用いて酵素的に反応させてグルタメ
ートにし、その際ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨを酸化し
てＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋にすることにより測定す
るのが有利である。
に生じるアンモニアを、前記したように、α−ケトグル
タレートをグルタメート−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ
１．４．１．３）を用いて酵素的に反応させてグルタメ
ートにし、その際ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨを酸化し
てＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋にすることにより測定す
るのが有利である。
【００２７】しかしアンモニアの測定は、原則的に他の
方法を用いて行うこともでき、しかしその際測定方法の
選択はタンパク質の存在下でアンモニア検出を害さない
ことに注意しなければならない。このような方法に関し
ては、Ｍｅｔｈｏｄｅｎ ｄｅｒ ｅｎｚｙｍａｔ
ｉｓｈｅｎ Ａｎａｌｙｓｅ，Ｂａｎｄ ＩＩ，第
３版，１９７４，Ｈ．Ｕ．Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ，Ｖｅｒ
ｌａｇ ＣｈｅｍｉｅＷｅｉｎｈｅｉｍに記載されて
いる。
方法を用いて行うこともでき、しかしその際測定方法の
選択はタンパク質の存在下でアンモニア検出を害さない
ことに注意しなければならない。このような方法に関し
ては、Ｍｅｔｈｏｄｅｎ ｄｅｒ ｅｎｚｙｍａｔ
ｉｓｈｅｎ Ａｎａｌｙｓｅ，Ｂａｎｄ ＩＩ，第
３版，１９７４，Ｈ．Ｕ．Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ，Ｖｅｒ
ｌａｇ ＣｈｅｍｉｅＷｅｉｎｈｅｉｍに記載されて
いる。
【００２８】特に、ｐＨ指示薬、たとえばブロモフェノ
ールブルーを用いたＮＨ３検出も可能であり、Ｃｌｉｎ
．Ｃｈｅｍ．２９（１９８３）６４５−６４９に記載さ
れている。このため試薬成分（グルタメート−デヒドロ
ゲナーゼなし）が吸引可能な材料（たとえばゼラチン）
からなる反応層中に存在し、この材料は半透膜により指
示薬層と分離されている。反応層に血清を添加する場合
、ＮＨ３が生じ、これは半透膜により拡散することがで
き、指示薬と反応する。引き続き、指示薬の変色に基づ
き、ＨＮ３量ひいてはクレアチニン量を測定することが
できる（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ，２９（１９８３）６４５
−６４９参照）。
ールブルーを用いたＮＨ３検出も可能であり、Ｃｌｉｎ
．Ｃｈｅｍ．２９（１９８３）６４５−６４９に記載さ
れている。このため試薬成分（グルタメート−デヒドロ
ゲナーゼなし）が吸引可能な材料（たとえばゼラチン）
からなる反応層中に存在し、この材料は半透膜により指
示薬層と分離されている。反応層に血清を添加する場合
、ＮＨ３が生じ、これは半透膜により拡散することがで
き、指示薬と反応する。引き続き、指示薬の変色に基づ
き、ＨＮ３量ひいてはクレアチニン量を測定することが
できる（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ，２９（１９８３）６４５
−６４９参照）。
【００２９】内生的ＮＨ３の含量は、液体媒体中での測
定方法に応じて、反応層中でＣＲＩＭＩなしの（および
グルタメート−デヒドロゲナーゼなしの）全試薬を用い
て測定することができる。
定方法に応じて、反応層中でＣＲＩＭＩなしの（および
グルタメート−デヒドロゲナーゼなしの）全試薬を用い
て測定することができる。
【００３０】緩衝させた水溶液のｐＨ値は、ｐＨ７．０
〜９．０、有利にｐＨ７．３〜８．７、特に有利にｐＨ
７．０〜８．４にある。ｐＨ値を調節するためには、前
記したｐＨ範囲内で十分に緩衝能力のある物質、たとえ
ばホスフェート、ＴＲＩＳ、トリエタノールアミンまた
はＴＥＳが挙げられる。とくにＴＲＩＳ緩衝液が有利で
ある。この緩衝液の濃度は通常は２０〜５００ｍｍｏｌ
、有利に５０〜２００ｍｍｏｌ、特に有利に７５〜１５
０ｍｍｏｌである。
〜９．０、有利にｐＨ７．３〜８．７、特に有利にｐＨ
７．０〜８．４にある。ｐＨ値を調節するためには、前
記したｐＨ範囲内で十分に緩衝能力のある物質、たとえ
ばホスフェート、ＴＲＩＳ、トリエタノールアミンまた
はＴＥＳが挙げられる。とくにＴＲＩＳ緩衝液が有利で
ある。この緩衝液の濃度は通常は２０〜５００ｍｍｏｌ
、有利に５０〜２００ｍｍｏｌ、特に有利に７５〜１５
０ｍｍｏｌである。
【００３１】クレアチニン−イミノヒドロラーゼは０．
２〜２０Ｕ／ｍｌ、有利に０．５〜１０Ｕ／ｍｌ、特に
０．４〜２Ｕ／ｍｌで使用することができる。
２〜２０Ｕ／ｍｌ、有利に０．５〜１０Ｕ／ｍｌ、特に
０．４〜２Ｕ／ｍｌで使用することができる。
【００３２】１−メチルヒダントイナーゼは通常は０．
１〜１０Ｕ／ｍｌ、有利に０．２〜５Ｕ／ｍｌ、特に０
．４〜２Ｕ／ｍｌで使用することができる。
１〜１０Ｕ／ｍｌ、有利に０．２〜５Ｕ／ｍｌ、特に０
．４〜２Ｕ／ｍｌで使用することができる。
【００３３】Ｎ−カルボキシルサルコシン−アミドヒド
ロラーゼの触媒的濃度は、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ、特に
１〜１５Ｕ／ｍｌ、特に有利に２〜１０Ｕ／ｍｌの値が
有利である。
ロラーゼの触媒的濃度は、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ、特に
１〜１５Ｕ／ｍｌ、特に有利に２〜１０Ｕ／ｍｌの値が
有利である。
【００３４】グルタメート−デヒドロゲナーゼの場合、
通常は、反応混合物１ｍｌあたり１０〜２００Ｕ、有利
に２０〜１５０Ｕ、特に４０〜１２５Ｕで使用される。
通常は、反応混合物１ｍｌあたり１０〜２００Ｕ、有利
に２０〜１５０Ｕ、特に４０〜１２５Ｕで使用される。
【００３５】ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの濃度は１５０
〜４００μｍｏｌ／ｌ、有利に２００〜３５０μｍｏｌ
／ｌである。
〜４００μｍｏｌ／ｌ、有利に２００〜３５０μｍｏｌ
／ｌである。
【００３６】α−ケトグルタレートは１〜３０ｍｍｏｌ
／ｌ、有利に５〜２０ｍｍｏｌ／ｌ、特に８〜１７ｍｍ
ｏｌ／ｌで使用するのが有利である。
／ｌ、有利に５〜２０ｍｍｏｌ／ｌ、特に８〜１７ｍｍ
ｏｌ／ｌで使用するのが有利である。
【００３７】ＡＴＰの濃度は、０．０５〜５０ｍｍｏｌ
／ｌ、有利に０．５〜２０ｍｍｏｌ／ｌ、特に１〜１５
ｍｍｏｌ／ｌが有利であるである。
／ｌ、有利に０．５〜２０ｍｍｏｌ／ｌ、特に１〜１５
ｍｍｏｌ／ｌが有利であるである。
【００３８】Ｍｇ＋＋は水溶性塩の形で、たとえばＭｇ
Ｃｌ２またはＭｇアスパルテートの形で０．１〜５０ｍ
ｍｏｌ／ｌ、有利に０．５〜２０ｍｍｏｌ／ｌ、特に１
〜１０ｍｍｏｌ／ｌの濃度で使用される。
Ｃｌ２またはＭｇアスパルテートの形で０．１〜５０ｍ
ｍｏｌ／ｌ、有利に０．５〜２０ｍｍｏｌ／ｌ、特に１
〜１０ｍｍｏｌ／ｌの濃度で使用される。
【００３９】１−メチルヒダントイナーゼの活性度を上
昇させるため、Ｋ−塩たとえば特にＫＣｌを添加するの
が有利であり、その際この濃度は２〜２００ｍｍｏｌ／
ｌ、有利に５〜１５０ｍｍｏｌ／ｌ、特に１０〜１００
ｍｍｏｌ／ｌである。
昇させるため、Ｋ−塩たとえば特にＫＣｌを添加するの
が有利であり、その際この濃度は２〜２００ｍｍｏｌ／
ｌ、有利に５〜１５０ｍｍｏｌ／ｌ、特に１０〜１００
ｍｍｏｌ／ｌである。
【００４０】グルタメート−デヒドロゲナーゼ活性は、
ＡＤＰを添加することにより上昇させることができる。 ＡＤＰ濃度は、０．０５〜２ｍｍｏｌ／ｌ、有利に０．
１〜１．５ｍｍｏｌ／ｌ、特に０．３〜１ｍｍｏｌ／ｌ
の値が有利である。
ＡＤＰを添加することにより上昇させることができる。 ＡＤＰ濃度は、０．０５〜２ｍｍｏｌ／ｌ、有利に０．
１〜１．５ｍｍｏｌ／ｌ、特に０．３〜１ｍｍｏｌ／ｌ
の値が有利である。
【００４１】前記成分のほかに、試薬はなお保存剤のよ
うな助剤、たとえばＮａ−アジド、界面活性剤およびト
リグリセリドにより濁った試料を透明にするためのリパ
ーゼを含有していてもよい。
うな助剤、たとえばＮａ−アジド、界面活性剤およびト
リグリセリドにより濁った試料を透明にするためのリパ
ーゼを含有していてもよい。
【００４２】この試薬成分は、さらに測定方法の理由か
ら、たとえば安定のために、２種類以上の緩衝させた水
溶液中で部分的に相互に分離して存在していてもよく、
特にクレアチニン−イミノヒドロラーゼ（内生的試料Ｎ
Ｈ４＋含量に関する場合により必要なテストの障害除去
の点で）は、ＡＴＰ（場合によるＮＭＨａｓｅの非特異
的ＡＴＰａｓｅ副活性のため）と一緒に、残りの成分と
分離することができる。活性もしくは濃度は、この場合
、分離した溶液を混合して完全な試薬にした後に、前記
した値になるように調節することができる。
ら、たとえば安定のために、２種類以上の緩衝させた水
溶液中で部分的に相互に分離して存在していてもよく、
特にクレアチニン−イミノヒドロラーゼ（内生的試料Ｎ
Ｈ４＋含量に関する場合により必要なテストの障害除去
の点で）は、ＡＴＰ（場合によるＮＭＨａｓｅの非特異
的ＡＴＰａｓｅ副活性のため）と一緒に、残りの成分と
分離することができる。活性もしくは濃度は、この場合
、分離した溶液を混合して完全な試薬にした後に、前記
した値になるように調節することができる。
【００４３】
【実施例】本発明を、図１および２と共に、次の実施例
につき詳説する。
につき詳説する。
【００４４】次の省略形および類語を使用した：ＣＲＩ
ＭＩ：クレアチニン−イミノヒドロラーゼＮＭＨａｓｅ
：ＡＴＰ依存性１−メチルヒドロラーゼＣＳＨａｓｅ：
Ｎ−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ ＧｌＤＨ：グルタメート−デヒドロゲナーゼα−ＫＧ：
α−ケトグルタレート−Ｎａ２ＴＲＩＳ：トリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタンＴＥＳ：２−｛［トリス−
（ヒドロキシメチル）メチル−］｝アミノ−エタンスル
ホン酸。
ＭＩ：クレアチニン−イミノヒドロラーゼＮＭＨａｓｅ
：ＡＴＰ依存性１−メチルヒドロラーゼＣＳＨａｓｅ：
Ｎ−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ ＧｌＤＨ：グルタメート−デヒドロゲナーゼα−ＫＧ：
α−ケトグルタレート−Ｎａ２ＴＲＩＳ：トリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタンＴＥＳ：２−｛［トリス−
（ヒドロキシメチル）メチル−］｝アミノ−エタンスル
ホン酸。
【００４５】例１
酵素によるクレアチニン測定：終点法（Ｅｎｄｐｕｎｋ
ｔｍｅｔｈｏｄｅ）（試料−／試料空値法）による手作
業での実施１．１ 試薬１： 試薬１： 成分
試薬中の濃度 ────
─────────────────────────
─ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）
１００ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ
１００
ｍｍｏｌ／ｌ α−ＫＧ
１０ｍｍｏｌ
／ｌ ＭｇＣｌ２
５ｍｍｏｌ／ｌ
ＮＡＤＨ
２５０μｍｏｌ／ｌ ＡＤ
Ｐ
５００μｍｏｌ／ｌ ＣＳＨａｓｅ
５Ｕ／ｍｌ ＮＭＨａｓｅ
０．５Ｕ／ｍｌ
ＧｌＤＨ
６０Ｕ／ｍｌ ─────
─────────────────────────
試料２： 成分
試薬中の濃度 ──
─────────────────────────
─── ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）
１００ｍｍｏｌ／ｌ ＡＴＰ
９０ｍｍｏｌ／ｌ ＣＲＩＭＩ
２０Ｕ／
ｍｌ ─────────────────────
─────────１．２ 試料材料：２、４、６、
８および１０ｍｇ／ｄｌを有するクレアチニン水溶液 １．３ テスト実施： Ｔ＝２５℃；波長３６５ｎｍ；層厚＝１０ｍｍ空気に対
して測定。
ｔｍｅｔｈｏｄｅ）（試料−／試料空値法）による手作
業での実施１．１ 試薬１： 試薬１： 成分
試薬中の濃度 ────
─────────────────────────
─ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）
１００ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ
１００
ｍｍｏｌ／ｌ α−ＫＧ
１０ｍｍｏｌ
／ｌ ＭｇＣｌ２
５ｍｍｏｌ／ｌ
ＮＡＤＨ
２５０μｍｏｌ／ｌ ＡＤ
Ｐ
５００μｍｏｌ／ｌ ＣＳＨａｓｅ
５Ｕ／ｍｌ ＮＭＨａｓｅ
０．５Ｕ／ｍｌ
ＧｌＤＨ
６０Ｕ／ｍｌ ─────
─────────────────────────
試料２： 成分
試薬中の濃度 ──
─────────────────────────
─── ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）
１００ｍｍｏｌ／ｌ ＡＴＰ
９０ｍｍｏｌ／ｌ ＣＲＩＭＩ
２０Ｕ／
ｍｌ ─────────────────────
─────────１．２ 試料材料：２、４、６、
８および１０ｍｇ／ｄｌを有するクレアチニン水溶液 １．３ テスト実施： Ｔ＝２５℃；波長３６５ｎｍ；層厚＝１０ｍｍ空気に対
して測定。
【００４６】キュベットにピペットでいれた ───
─────────────────────────
── 試料
試料空値（ＰＬＷ
） ──────────────────────
──────── 試薬１ ２．００
ｍｌ ２．００ｍｌ
試薬２ ０．４０ｍｌ 蒸留水
０．４０ｍｌ ────────────
────────────────── 混合し、Ｅ
１試料およびＥ１ＰＬＷを測定、次に添加した： ─
─────────────────────────
──── 試料 ０．１０ｍｌ
０．１０ｍｌ ───
─────────────────────────
──新たに混合し、１５分間インキュベートし、次いで
Ｅ２試料およびＥ２ＰＬＷを測定した Ｅ＝（Ｅ１試料−Ｅ２試料）−（Ｅ１ＰＬＷ−Ｅ２ＰＬ
Ｗ）測定した吸光値（Ｅ）の試料中のクレアチニン濃度
への依存性を図１に記載した。
─────────────────────────
── 試料
試料空値（ＰＬＷ
） ──────────────────────
──────── 試薬１ ２．００
ｍｌ ２．００ｍｌ
試薬２ ０．４０ｍｌ 蒸留水
０．４０ｍｌ ────────────
────────────────── 混合し、Ｅ
１試料およびＥ１ＰＬＷを測定、次に添加した： ─
─────────────────────────
──── 試料 ０．１０ｍｌ
０．１０ｍｌ ───
─────────────────────────
──新たに混合し、１５分間インキュベートし、次いで
Ｅ２試料およびＥ２ＰＬＷを測定した Ｅ＝（Ｅ１試料−Ｅ２試料）−（Ｅ１ＰＬＷ−Ｅ２ＰＬ
Ｗ）測定した吸光値（Ｅ）の試料中のクレアチニン濃度
への依存性を図１に記載した。
【００４７】この例は、本発明の方法を用いた場合、公
知の酵素によるクレアチニンＵＶテストと比べて、実際
に２倍の検出感度が達成されることを示した。
知の酵素によるクレアチニンＵＶテストと比べて、実際
に２倍の検出感度が達成されることを示した。
【００４８】例１に従って、ｍｇクレアチニン／ｄｌあ
たり、試料前テスト混合物２．５ｍｌ中の試料１００μ
ｌを使用した場合、実験に基づき、平均的に２５．４ｍ
Ｅの吸光値（回帰直線の上昇）が達成され（理論値：２
４．７ｍＥ）、同様の試料−／前テスト混合物−容量比
のもとで、今まで公知のクレアチニン−ＵＶテストに対
して、３６５ｎｍでのＮＡＤ（Ｐ）Ｈのモル吸光係数か
ら、１２．３ｍＥの値が純粋に理論的に算定された。
たり、試料前テスト混合物２．５ｍｌ中の試料１００μ
ｌを使用した場合、実験に基づき、平均的に２５．４ｍ
Ｅの吸光値（回帰直線の上昇）が達成され（理論値：２
４．７ｍＥ）、同様の試料−／前テスト混合物−容量比
のもとで、今まで公知のクレアチニン−ＵＶテストに対
して、３６５ｎｍでのＮＡＤ（Ｐ）Ｈのモル吸光係数か
ら、１２．３ｍＥの値が純粋に理論的に算定された。
【００４９】例２
酵素によるクレアチニン測定：動力学的「ｆｉｘｅｄ−
ｔｉｍｅ」法（Ｅ１−／Ｅ２−法）によるＨＩＴＡＣＨ
Ｉ ７０４ スペクトロメータにより自動的に実施 ２．１ 試薬： 試薬１ 成分
試薬中の濃度──────
─────────────────────────
── ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）
１００ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ
１５ｍｍｏｌ／ｌ α−ＫＧ
１５ｍｍ
ｏｌ／ｌ ＮＡＤＨ
３５０μｍｏｌ
ＣＳＨａｓｅ
８Ｕ／ｍｌ ＮＭＨａｓｅ
１Ｕ／ｍｌ ＧｌＤＨ
９０Ｕ／
ｍｌ───────────────────────
────────── 試薬２： 成分
試薬中の濃度──────
─────────────────────────
── ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）
１００ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２
３
０ｍｍｏｌ／ｌ ＡＴＰ
３０ｍｍ
ｏｌ／ｌ ＣＲＩＭＩ
１５Ｕ／ｍｌ───
─────────────────────────
─────２．２ 試料材料：１、２、３、４、５、
６、８、１０、１２および１５ｍｇ／ｄｌを有するクレ
アチニン水溶液 ２．３ テスト実施： Ｔ＝３７℃；波長（ビクロメートにより測定）３４０／
４１５ｎｍ；層厚７ｍｍ 試料１４μｌを試薬１ ３５０μｌと混合し、５分間
インキュベートし、次いで試薬２ ５０μｌをピペッ
トで添加し、第１９番および第３２番の測定周期（つま
り、試料２の添加後、５１．４秒と３０４秒）の間の吸
光度の変化を測定した。
ｔｉｍｅ」法（Ｅ１−／Ｅ２−法）によるＨＩＴＡＣＨ
Ｉ ７０４ スペクトロメータにより自動的に実施 ２．１ 試薬： 試薬１ 成分
試薬中の濃度──────
─────────────────────────
── ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）
１００ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ
１５ｍｍｏｌ／ｌ α−ＫＧ
１５ｍｍ
ｏｌ／ｌ ＮＡＤＨ
３５０μｍｏｌ
ＣＳＨａｓｅ
８Ｕ／ｍｌ ＮＭＨａｓｅ
１Ｕ／ｍｌ ＧｌＤＨ
９０Ｕ／
ｍｌ───────────────────────
────────── 試薬２： 成分
試薬中の濃度──────
─────────────────────────
── ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）
１００ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２
３
０ｍｍｏｌ／ｌ ＡＴＰ
３０ｍｍ
ｏｌ／ｌ ＣＲＩＭＩ
１５Ｕ／ｍｌ───
─────────────────────────
─────２．２ 試料材料：１、２、３、４、５、
６、８、１０、１２および１５ｍｇ／ｄｌを有するクレ
アチニン水溶液 ２．３ テスト実施： Ｔ＝３７℃；波長（ビクロメートにより測定）３４０／
４１５ｎｍ；層厚７ｍｍ 試料１４μｌを試薬１ ３５０μｌと混合し、５分間
インキュベートし、次いで試薬２ ５０μｌをピペッ
トで添加し、第１９番および第３２番の測定周期（つま
り、試料２の添加後、５１．４秒と３０４秒）の間の吸
光度の変化を測定した。
【００５０】試料中のクレアチニン濃度の吸光度の変化
の依存性を図２に示した。
の依存性を図２に示した。
【００５１】これにより、本発明による、酵素によるク
レアチニン測定のための方法は、原則として自動分析装
置の適用にも適していることが示された。
レアチニン測定のための方法は、原則として自動分析装
置の適用にも適していることが示された。
Claims (5)
- 【請求項１】 試料中に含まれるクレアチニンを、ク
レアチニン−イミノヒドロラーゼを用いて、１−メチル
ヒダントインと、第１の分子ＮＨ３に変換して水溶液中
のクレアチニンを酵素により測定する方法において、生
じた１−メチルヒダントインを、ＡＴＰ依存性１−メチ
ルヒダントイナーゼと、Ｎ−カルバモイルサルコシン−
アミドヒドロラーゼとを用いてサルコシンと、ＣＯ２と
、第２の分子ＮＨ３とに変換し、生じた両方の分子ＮＨ
３を一緒に測定することを特徴とするクレアチニンを酵
素により測定する方法。 - 【請求項２】 生じた両方の分子ＮＨ３を、グルタメ
ート−デヒドロゲナーゼならびにＮＡＤＨまたはＮＡＤ
ＰＨの存在で、α−ケトグルタレートを用いてグルタレ
ートに変換し、ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨの消費量を
測定する請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 最初の試料（空値）において、クレア
チニン−イミノヒドロラーゼの不在で、溶液の内生的Ｎ
Ｈ３含量を測定し、別の試料中の内生的ＮＨ３を測定し
、クレアチニン量の計算の際に考慮する請求項１または
２記載の方法。 - 【請求項４】 水溶液中のクレアチニンを酵素により
測定するための試薬において、クレアチニン−イミノヒ
ドロラーゼ、ＡＴＰ依存性１−メチルヒダントイナーゼ
、Ｎ−カルボニルサルコシン−アミドヒドロラーゼ、Ａ
ＴＰ、Ｍｇ＋＋および緩衝物質を含有することを特徴と
するクレアチニンを酵素により測定するための試薬。 - 【請求項５】 クレアチニン−イミノヒドロラーゼ０
．２〜２０Ｕ／ｍｌ、１−メチルヒダントイナーゼ０．
１〜１０Ｕ／ｍｌ、Ｎ−カルバモイルサルコシン−アミ
ドヒドロラーゼ０．５〜２０Ｕ／ｍｌ、ＡＴＰ０．０５
〜５０ｍｍｏｌ／ｌ、Ｍｇ２＋イオン０．１〜５０ｍｍ
ｏｌ／ｌおよび緩衝物質２０〜５００ｍｍｏｌ／ｌを含
有し、その際試薬のｐＨ値が７．０〜９．０である請求
項４記載の試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4000668.9 | 1990-01-11 | ||
| DE4000668A DE4000668A1 (de) | 1990-01-11 | 1990-01-11 | Verfahren und reagenz zur enzymatischen bestimmung von creatinin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04271799A true JPH04271799A (ja) | 1992-09-28 |
| JPH0755160B2 JPH0755160B2 (ja) | 1995-06-14 |
Family
ID=6397905
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3001197A Expired - Lifetime JPH0755160B2 (ja) | 1990-01-11 | 1991-01-09 | クレアチニンを酵素により測定する方法および試薬 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0437254B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0755160B2 (ja) |
| AT (1) | ATE132198T1 (ja) |
| DE (2) | DE4000668A1 (ja) |
| ES (1) | ES2084047T3 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4021571A1 (de) * | 1990-07-06 | 1992-01-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | N-methylhydantoinase, kloniert |
| DE4029844A1 (de) * | 1990-09-20 | 1992-03-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Carbamoylsarcosinhydrolase, kloniert |
| CN1757755B (zh) * | 2004-10-10 | 2010-04-07 | 王尔中 | 肌酐含量测定方法及肌酐诊断试剂盒 |
| CN113008822B (zh) * | 2021-03-10 | 2022-04-22 | 江西农业大学 | 反刍动物瘤胃液中丙酮酸肌酸降解率的测定方法 |
-
1990
- 1990-01-11 DE DE4000668A patent/DE4000668A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-01-09 AT AT91100241T patent/ATE132198T1/de active
- 1991-01-09 DE DE59107134T patent/DE59107134D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-01-09 ES ES91100241T patent/ES2084047T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-09 EP EP91100241A patent/EP0437254B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-09 JP JP3001197A patent/JPH0755160B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ANAL LETT=1988 * |
| CLIN CHEM=1982 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE59107134D1 (de) | 1996-02-08 |
| JPH0755160B2 (ja) | 1995-06-14 |
| EP0437254B1 (de) | 1995-12-27 |
| DE4000668A1 (de) | 1991-07-18 |
| EP0437254A3 (en) | 1993-04-07 |
| ES2084047T3 (es) | 1996-05-01 |
| ATE132198T1 (de) | 1996-01-15 |
| EP0437254A2 (de) | 1991-07-17 |
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