JPS59151900A - 尿素窒素の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は尿素窒素の測定法に関する０更に詳細には９本
発明は尿素を含有する試料にα−ケトゲルタール酸、ニ
コチンアミドアテニンジヌクレオタイド（以下ＮＡＤＨ
という）もしくはニコチンアミドアデニンジヌクレオタ
イドホスフェート（以下ＮＡＤＰＨという）及びグルタ
ミン酸脱水素酵素（以下０ＬＤＨという）を作用させ１
次いでウレアーゼ及びウレアーゼ拮抗阻害剤としてのホ
ウ酸又はその塩を同時に加え試料中の尿素をウレアーゼ
で加水分解し、アンモニアの生成速度をα−ケトゲルタ
ール酸、ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨ及び０ＬＤＨより
なる酵素共役系を用いてＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨの
減少速度から求め試料中の尿素窒素を定量する方法であ
る。

血清及び尿中の尿素窒素量は９種々の腎機能障害及び肝
実質障害時に変動することが知られており、その障害度
並びに予後の診断に関して極めて重要な意義をもつため
に、最近では共存する妨害物質の影響を受けない迅速、
正確な定置方法が望まれている。尿素窒素の従来の定量
法としては９例えば試料中の尿素をジアセチルモノオキ
シムと直接反応させ、比色定量する方法があるが２反応
の特異性、再現性が好ましくない。また、ウレアーゼで
尿素を特異的に加水分解し、生成するアンモニア量を種
々の検出方法にて定量する方法があるが、検体に共存す
るタンパク質やアンモニア及びクルタチオン等が測定値
に影響し、好ましい方法とは言い難い。一方、α−ケト
ゲルタール酸及びＮ　Ａ、　］）　ＨまたはＮＡＤＰＨ
の存在下、　ＧＴ、ＤＩ−Ｉを作用させてＮ　Ａ　Ｄ　
ＨまたはＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｉ−Ｉの減少量より、アンモ
ニア量を求める方法はアンモニアに対して特異性の高い
方法であるが１反応の終末点における残存のＮ　Ａ　Ｄ
　Ｉ−ＩまたはＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｉ−Ｉの紫外部吸収を
引］］定するため。

試料中に共存するアンモニア量料のにごり、紫外部に吸
収を持つ種々の共存物質の影響を受け。

好ましい方法であるとは言い離く且っＮＡＤＨまたはＮ
　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈ９度は、測定器の測定可能な吸光度限
界により制限されるため充分なＮ　Ａ　Ｄ　ＨまたはＮ
ＡＤＰＨを加えられず、　測定可能な尿素窒素の濃度範
囲が狭くなる欠点がある。

近年、臨床領域における自動分析機の急速な普及に伴い
、短時間での測定が可能であり、且つ共存物質の影響を
受けない反応速度法による尿素窒素の定量法が望まれて
いる。一般に、酵素の反応速度にて、その酵素の基質と
なる物質を定量する場合には、酵素の基質に対するＫｍ
値が測定系における基質濃度より充分大きいことか必須
条件となる。ウレアーゼを用いた尿素窒素の定量におい
ては、正常ヒト血清中の尿素濃度は８〜９ｍＭ（尿素窒
素として８〜２５　ｍ９７ｄｅ　）であるのに対し、ウ
レアーゼの尿素に対するＫｍ値は数ｍＭ程度と小さいた
め、測定法としては終末点法が適当であった。一方９反
応速度法にて尿素窒素を定量する際には２反応系におけ
る尿素濃度を低くするために試料を高倍率に希釈する必
要があった。しかしながら、このような反応速度法にお
いては、検体の希釈に伴う著しい感度の低下等の種々の
問題のため、実際の日常分析に用いることは不可能であ
る。また、Ｋｍ値そのものを適当な値に調節する手段さ
して、酵素（ウレアーゼ）に直接作用し酵素の基質に対
する親和性を調節する物質、即ち拮抗阻害物質を用いる
方法が報告されている（クリニカルケミストリー、　２
５巻、　１７２１頁、　１９７９年）。

この方法は拮抗阻害剤さしてヒドロキンウレアを用い、
ウレアーゼに作用させ尿素窒素を定量する。しかしなが
らこの方法においては阻害剤として用いるヒドロキシウ
レアは試薬として調製した後の安定性に欠け、しかもア
ンモニアや尿素を金談ない高純度な市販の標品を得るこ
とがむずかしく、さらにその作用がウレアーゼ及び基質
と混合した時１時間に依存して変化する等の問題があっ
た。しかしながら、この方法に使用可能な拮抗阻害剤と
してはヒドロキシウレアだけが見出されているに過ぎな
い。

そこで１本発明者らは公知方法の欠点を克服すべく鋭意
検討した結果、ウレアーゼの拮抗阻害剤としてホウ酸又
はその塩が有効であることを見出し本発明を完成した。

本発明を実施する場合、試料にα−ケトゲルタール酸、
ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨの存在下。

ｐＨ７〜８範囲で０ＬＤＨを作用させることにより試料
中に共存するアンモニアが処理云きる。

なお、この反応は８７℃で通常１〜２分あれば終了する
。

次に、この反応液にウレアーゼ及びホウ酸又はその塩を
同時に加え、尿素を加水分解しアンモニアの生成速度を
反応液中のα−ケトゲルタール酸、ＮＡＤＨまたはＮＡ
ＤＰＨ，０ＬＤＨを利用し、この酵素共役系からＮＡＤ
ＨまたはＮＡＤＰＨの減少速度を求め、尿素窒素量を求
める。

本発明に使用されるα−ケトクルクール酸。

ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＩ−Ｉ、Ｃ＋ＬＤＨの容量は
試料中にあらかじめ共存しているアンモニア量及び尿素
量により異なるが１例えば検体として血清２５μｌを使
用する時は中性〜弱アルカリ性の緩衝液２ｍｌにα−ケ
トゲルタール酸４ｍｐ、ＮＡＤＰＨＯ，＋ｍ９，０ＬＤ
Ｈ１５単位程度含まれているのが好ましい。一方、ウレ
アーゼ及びホウ酸又はその塩は前記同様の緩衝液１　ｍ
ｌにウレアーゼは０７単位程度あれば良く、この時のホ
ウ酸本反応系に用いるホウ酸又はその塩は、ウレアーゼ
及び基質と混合した後の時間にかかわらず作用即ち阻害
率は一定であり、その阻害定数は０．２ｍＭと小さいた
め、２ｍＭ程度のホウ酸又はその塩の存在下では、ウレ
アーゼの尿素に対するＫ　＋ｎ値は１１倍程度となる。

　この事実は次の阻害剤の速度反応式の関係より明らか
である。

存在しない時のＫｍ値、ＣＩ）：阻害剤濃度。

■ぐ■：阻害定数を表わす。） なお、ホウ酸又はその塩濃度を増加させることによりＫ
ｍ値を大きくすることも可能である。

従って高濃度の尿素を含む検体の測定においても検体を
希釈することなく、正確且つ高感度に測定するこ吉がで
きる。

本発明で使用するホウ酸塩はホウ酸すｌ−ＩＪウム、ホ
ウ酸カリウム等が挙げられる。また、α−ケトゲルター
ル酸、ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨ。

Ｇ　Ｌ　Ｄ　ＨはｐＨ７〜８範囲の通常使用されている
緩衝液に溶解し一液とし、一方つレアーセ、ホウ酸又は
その塩も同様に緩衝液に溶解しておき使用すると便利で
ある。なお、緩衝液としては通常使用されているもので
あれはいずれも使用可能である。

一方、０ＬＤＨは細菌由来と動物由来とがあり、ＮＡＤ
Ｈを使用する場合は動物由来を７Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈを
使用する場合は細菌由来を選択することが必要である。

尿素を含む試料出しては例えは体液即ち血液、血清、血
漿、尿、すい液。

腹こう液等、また透析液等尿素を含むものであれは使用
できる。

以上のように本発明は検体に共存するアンモニアをあら
かじめ処理するので、内因性のアンモニアの影響を受け
ない。さらにＮ　Ａ、　Ｄ　ＨまたはＮＡＤＰＨの減少
速度として測定するため。

測定に要する時間は短く且つ還元物質及び紫外部に吸収
をもつ検体中の共存物質等の影響はほとんど受けない。

その上、ウレアーゼ拮抗阻害剤であるホウ酸又はその塩
はウレアーゼ及び基質と混合しても阻害率は変ることが
なく、高濃度の尿素まで正確に定量できるため、従来法
では好ましい結果が得られなかった透析患者血清等にお
ける尿素窒素の測定に極めて有用である。

次に実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例１ （１）試薬 反応液１ クルタミン酸脱水素酵素　　　　７５０単位Ｎ　Ａ、　
Ｄ　Ｐ　Ｉ−（、２４ｍｇ α−ケトタルクール酸　　　　　　２１９　ｍ９トリス
（ヒドロキンメチルアミノメタン）３１０ｍ９上記成分
を精製水１００　ｍｌに溶解し、最終ｐＨが７８になる
ように希塩酸にて調整する。

反応液２ ウレアーゼ　　　　　　　　　　　７０単位ホウ酸　　
　　　　　　　　　８７即 ＥＤｉ’Ａ　−２Ｎａ　　　　　　　　１１１ｍ９トリ
ス（ヒドロキシメチルアミノメタン）　８１０■上記成
分を精製水１００ｍ１に溶解し、最終ｐＨが７．８にな
るように希塩酸にて調整する。

（２）測定操作 試鹸管に反応液１を２ｍｌ、正常ヒト血清に下記表の如
く尿素水溶液をｌＯ対ｌの比率で添加混合した検体２５
μｌを加え、８７℃８分間保温する。次に、これに反応
液２の１ｍｌを加え８７℃尾保ちながら１反応液２の添
加後１分後から８４０　ｎｍにおける１分間の吸光度変
化を測定ｒる。別に既知濃度の検体を用いて検量線を作
成し、これを用いて尿素窒素濃度を求める。

結果 ｌｌ （但し、正常ヒト血清の尿素窒素値は１６０ｎθｌであ
る） 以上の結果より高値の尿素窒素まで正確に測定できるこ
とか明らかである。

（参考） 拮抗阻害剤の存在下での反応速度式は 一般の速度式は ここで近似的に阻害剤か存在する時の見かけのＫｍ（直
は 実施例２゜ （１）試薬 実施例１の反応液２のホウ酸に変え、ホウ酸すＩ−ＩＪ
ウム２ＢＩｎ９を使用した以外は実施例１と全く同−試
薬及び濃度のものを使用した。

（２）標準液の作成 尿素４０■、８０ｒｖ、１２０ダ、１６０■、ｎ。

■を１００ｍのメスフラスコに各々正確に秤量し加え、
標線まで蒸留水を入れ溶解し各濃度の標準液を作成する
。

（３）検量線の作成 実施例１の測定操作のうち、検体の代りに各々の標準液
２５μｌを使用した以外は全く同様に操作し、各々の濃
度の吸光度を求める。

結果 図に示しである如く直線性が得られた〇

【図面の簡単な説明】

拮抗阻害剤を使用した場合としない場合の各々の検量線
を示す。図中Ｈで印したものが拮抗阻害剤としてホウ酸
を使用した時、Ｎ−込で印したものがホウ酸ナトリウム
を使用した時。 一方、Ｘ−−Ｘで印したものか拮抗阻害剤を使用しない
時の各々の検量線である。 図 Ａ’ｆｆｉ 嫁 が

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 尿素を含有する試料にα−ケトクルタール酸。 ニコチンアミドアデニンジヌクレオタイドもしくはニコ
   ヂンアミドアテニンジヌクレオタイドホスフェート及び
   グルタミン酸脱水素酵素を作用させ２次いでウレアーゼ
   及びウレアーゼ拮抗阻害剤としてのホウ酸又はその塩を
   同時に加えウレアーゼで尿素をアンモニアに変換させα
   −ケトグルクール酸、ニコチンアミドアテニンジヌクレ
   オクイドもしくはニコチンアミトアテニンジヌクレオタ
   イドホスフェートの存在ドクルクミン酸脱水素酵素で処
   理しニコチンアミドアテニンジヌクレオタイドもしくは
   ニコチンアミドアデニンジヌクレオタイトホヌフェ−１
   ・の減少速度を測定することを特徴とする尿素窒素の測
   定法