JPH0698031B2 - Ld−1アイソザイムの測定法および試薬 - Google Patents
Ld−1アイソザイムの測定法および試薬Info
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- JPH0698031B2 JPH0698031B2 JP63131306A JP13130688A JPH0698031B2 JP H0698031 B2 JPH0698031 B2 JP H0698031B2 JP 63131306 A JP63131306 A JP 63131306A JP 13130688 A JP13130688 A JP 13130688A JP H0698031 B2 JPH0698031 B2 JP H0698031B2
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- reagent
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
Description
【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明は、生物学的流体中に存在するLD−1アイソザイ
ムの測定方法およびそれに用いる試薬に関する。
ムの測定方法およびそれに用いる試薬に関する。
(従来の技術および発明が開発しようとする課題) 乳酸脱水素酵素(LDH)はヒト血漿および血清中に5種
のアイソザイムとして存在する。これらの酵素は2種の
サブユニット:「M型」(骨格筋中に広く分布する)お
よび「H型」(心臓中に広く分布する)からなる四量体
タンパク質である。これらのアイソザイムはもともと電
気泳動分離により同定されたものであり、陽極への相対
的移動度に基づいてLD−1、LD−2、LD−3、LD−4お
よびLD−5と呼ばれており、これらの中ではLD−1が最
も速い。それらアイソザイムのサブユニットの構成はそ
れぞれH4、H3M、H2M2、HM3およびM4である。
のアイソザイムとして存在する。これらの酵素は2種の
サブユニット:「M型」(骨格筋中に広く分布する)お
よび「H型」(心臓中に広く分布する)からなる四量体
タンパク質である。これらのアイソザイムはもともと電
気泳動分離により同定されたものであり、陽極への相対
的移動度に基づいてLD−1、LD−2、LD−3、LD−4お
よびLD−5と呼ばれており、これらの中ではLD−1が最
も速い。それらアイソザイムのサブユニットの構成はそ
れぞれH4、H3M、H2M2、HM3およびM4である。
各アイソザイムの量の比率は臓器間でかなり変化する
が、ある特定の臓器内では比較的一定であり、したがっ
て各臓器は特徴的なアイソザイム像を有している。たと
えば心臓および赤血球はLD−1およびLD−2の比率が高
く、肝臓および骨格筋はLD−5を優勢に有しており、肺
臓、腎臓および脳は混合物を有しているがLD−2、LD−
3およびLD−4が種々の程度に優勢である。疾患または
損傷臓器からのこれらの酵素の漏出は血清LDHの全量を
上昇させることになるため、血清のアイソザイム組成を
特徴付けることによりその漏出の原因である臓器を同定
するのに役立てることができる。したがって、血清LDH
およびそのアイソザイム組成を測定することは種々の疾
患状態の診断に有用である。
が、ある特定の臓器内では比較的一定であり、したがっ
て各臓器は特徴的なアイソザイム像を有している。たと
えば心臓および赤血球はLD−1およびLD−2の比率が高
く、肝臓および骨格筋はLD−5を優勢に有しており、肺
臓、腎臓および脳は混合物を有しているがLD−2、LD−
3およびLD−4が種々の程度に優勢である。疾患または
損傷臓器からのこれらの酵素の漏出は血清LDHの全量を
上昇させることになるため、血清のアイソザイム組成を
特徴付けることによりその漏出の原因である臓器を同定
するのに役立てることができる。したがって、血清LDH
およびそのアイソザイム組成を測定することは種々の疾
患状態の診断に有用である。
心筋梗塞の疑いを診断することが、LDHアイソザイムの
測定で最もしばしば行なわれている適用例である。これ
らのケースにおいて他のアイソザイムに比べてLD−1ア
イソザイムが増加していることが心筋障害の特性であ
り、それを確証するものとなる。というのは心臓がLD−
1アイソザイムを最も高い比率で含有しているからであ
る。
測定で最もしばしば行なわれている適用例である。これ
らのケースにおいて他のアイソザイムに比べてLD−1ア
イソザイムが増加していることが心筋障害の特性であ
り、それを確証するものとなる。というのは心臓がLD−
1アイソザイムを最も高い比率で含有しているからであ
る。
電気泳動がLDHアイソザイムを分離するのに用いられた
最初の方法であり、完全なアイソザイム像を得るのに現
在も広く用いられている。しかしながら、この方法は多
数の長い工程と高価な装置を必要とするという点で幾つ
かの欠点を有している。イオン交換カラムを用いた分離
法も開発されているが、これも欠点を有する。
最初の方法であり、完全なアイソザイム像を得るのに現
在も広く用いられている。しかしながら、この方法は多
数の長い工程と高価な装置を必要とするという点で幾つ
かの欠点を有している。イオン交換カラムを用いた分離
法も開発されているが、これも欠点を有する。
LDHアイソザイムの分析の別の試みは、アイソザイムの
あるものを選択的に阻害もしくは変性させて該処理に抵
抗性のアイソザイムの相対比を定量しようとするもので
ある。その例としては、尿素、熱および高いpHを用いて
「M型」サブユニットを最も多く含有するものから順番
に不活化する方法;高い基質レベル(ピルビン酸または
乳酸)を用いて「H型」サブユニットを選択的に阻害す
る方法;およびα−ケト酪酸を「H型」サブユニットに
特異的な基質として用いる方法がある。
あるものを選択的に阻害もしくは変性させて該処理に抵
抗性のアイソザイムの相対比を定量しようとするもので
ある。その例としては、尿素、熱および高いpHを用いて
「M型」サブユニットを最も多く含有するものから順番
に不活化する方法;高い基質レベル(ピルビン酸または
乳酸)を用いて「H型」サブユニットを選択的に阻害す
る方法;およびα−ケト酪酸を「H型」サブユニットに
特異的な基質として用いる方法がある。
米国特許第4,250,255号明細書には、まず全LDH活性を測
定し、ついで試料をイオン性両親媒体で処理することに
よりアイソザイムを選択的に阻害する方法が記載されて
いる。処理した試料はついで酵素活性を測定し、最初の
測定値から差し引く。その差がアイソザイムの活性であ
る。
定し、ついで試料をイオン性両親媒体で処理することに
よりアイソザイムを選択的に阻害する方法が記載されて
いる。処理した試料はついで酵素活性を測定し、最初の
測定値から差し引く。その差がアイソザイムの活性であ
る。
(課題を解決するための手段) 本発明は上記各方法に代わる方法、およびそれに用いる
試薬を提供するものであり、生物学的流体中のLD−1ア
イソザイムを高い特異性でもって測定する方法および試
薬である。
試薬を提供するものであり、生物学的流体中のLD−1ア
イソザイムを高い特異性でもって測定する方法および試
薬である。
(発明の構成および効果) 本発明は、カオトロピック剤(chaotropic agents)をL
DHアッセイシステム中に導入することによる、生物学的
流体中のLD−1アイソザイムを迅速かつ特異的に測定す
る方法である。本発明による生物学的流体中のLD−1ア
イソザイム活性の測定法は、カオトロピック剤の存在下
で生物学的流体とLDHアッセイ試薬との反応混合物を調
製するという単一の工程からなるものである。該反応混
合物中に存在するLD−1の活性はついで測定することが
できる。カオトロピック剤は反応混合物中で約0.1〜約
5モル溶液、さらに好ましくは約0.6〜約1モル溶液を
形成するのに充分な量で存在する。とりわけ好ましいカ
オトロピック剤は過塩素酸ナトリウムである。LDHアッ
セイ試薬はバッファー、乳酸、NADおよび色原体、また
はバッファー、ピルビン酸、NADHおよび色原体からな
る。
DHアッセイシステム中に導入することによる、生物学的
流体中のLD−1アイソザイムを迅速かつ特異的に測定す
る方法である。本発明による生物学的流体中のLD−1ア
イソザイム活性の測定法は、カオトロピック剤の存在下
で生物学的流体とLDHアッセイ試薬との反応混合物を調
製するという単一の工程からなるものである。該反応混
合物中に存在するLD−1の活性はついで測定することが
できる。カオトロピック剤は反応混合物中で約0.1〜約
5モル溶液、さらに好ましくは約0.6〜約1モル溶液を
形成するのに充分な量で存在する。とりわけ好ましいカ
オトロピック剤は過塩素酸ナトリウムである。LDHアッ
セイ試薬はバッファー、乳酸、NADおよび色原体、また
はバッファー、ピルビン酸、NADHおよび色原体からな
る。
本発明の他の態様において、本発明はLD−1アッセイ試
薬に関するものであり、これはバッファー、LDH基質、
色原体およびカオトロピック剤からなる。LDH基質とし
ては乳酸、ピルビン酸、NAD、NADH、またはそれらの類
似化合物が挙げられる。色原体はまたNADであってよ
い。好ましくはカオトロープ剤は過塩素酸ナトリウムで
あり、これは約0.1〜約5モル溶液、好ましくは約0.6〜
約1モル溶液を形成するのに充分な量で存在する。
薬に関するものであり、これはバッファー、LDH基質、
色原体およびカオトロピック剤からなる。LDH基質とし
ては乳酸、ピルビン酸、NAD、NADH、またはそれらの類
似化合物が挙げられる。色原体はまたNADであってよ
い。好ましくはカオトロープ剤は過塩素酸ナトリウムで
あり、これは約0.1〜約5モル溶液、好ましくは約0.6〜
約1モル溶液を形成するのに充分な量で存在する。
本発明のアッセイ法および試薬システムによれば生物学
的流体中のLD−1を選択的にアッセイすることが可能で
あり、いかなるレベルのLD−1においても迅速さ、操作
性および正確さにおいて改良をもたらすものである。
的流体中のLD−1を選択的にアッセイすることが可能で
あり、いかなるレベルのLD−1においても迅速さ、操作
性および正確さにおいて改良をもたらすものである。
本発明はまた、生物学的流体中のLD−1を選択的にアッ
セイするための試薬に関する。生物学的流体には血液、
血漿、血清、脊髄液および尿が含まれる。本発明の試薬
では過塩素酸ナトリウムなどのカオトロピック剤を用い
て「M型」のサブユニットを1個またはそれ以上含有す
るLDHアイソザイムを選択的に変性させ、それによって
酵素活性を失わせる。本発明の試薬はまた、残ったLDH
活性、すなわちLD−1による活性を同時に測定するのに
必要な化学物質をも含んでいる。全LDHと同様にLD−1
を定量することは、心筋梗塞を診断し、また他の臓器か
らのLDHの漏出に関連する疾患からこの疾患を識別する
のに有用であることが示された。
セイするための試薬に関する。生物学的流体には血液、
血漿、血清、脊髄液および尿が含まれる。本発明の試薬
では過塩素酸ナトリウムなどのカオトロピック剤を用い
て「M型」のサブユニットを1個またはそれ以上含有す
るLDHアイソザイムを選択的に変性させ、それによって
酵素活性を失わせる。本発明の試薬はまた、残ったLDH
活性、すなわちLD−1による活性を同時に測定するのに
必要な化学物質をも含んでいる。全LDHと同様にLD−1
を定量することは、心筋梗塞を診断し、また他の臓器か
らのLDHの漏出に関連する疾患からこの疾患を識別する
のに有用であることが示された。
本発明の試薬の基本的な原理は、水溶液中に存在すると
きのあるタンパク質の正常な構造連関をカオトロピック
剤が選択的に崩壊させることができることにある。一般
にカオトロピック剤は大きな直径、負の電荷および低い
電荷密度を有する無機イオンであり、タンパク質の二次
構造および三次構造を変化させるのに用いられる。カオ
トロピック剤はまたホフマイスター順列または離液順列
として知られている。カオトロピック剤には大きな部分
モルイオン容積(ml/モルの単位で表される)を有する
アニオン、とりわけ30ml/モル以上の容積を有するアニ
オンが含まれる。その例としてはTcO4 -、ClO4 -、Re
O4 -、BV4 -、SeCN-、SO3F-、SSCN-およびI-が挙げられる
(ウォルフ(Wolff,J.)およびモーリー(Maurey,J.
R.)のBiochem Biophys Acta 69、48〜58(1963)参
照)。
きのあるタンパク質の正常な構造連関をカオトロピック
剤が選択的に崩壊させることができることにある。一般
にカオトロピック剤は大きな直径、負の電荷および低い
電荷密度を有する無機イオンであり、タンパク質の二次
構造および三次構造を変化させるのに用いられる。カオ
トロピック剤はまたホフマイスター順列または離液順列
として知られている。カオトロピック剤には大きな部分
モルイオン容積(ml/モルの単位で表される)を有する
アニオン、とりわけ30ml/モル以上の容積を有するアニ
オンが含まれる。その例としてはTcO4 -、ClO4 -、Re
O4 -、BV4 -、SeCN-、SO3F-、SSCN-およびI-が挙げられる
(ウォルフ(Wolff,J.)およびモーリー(Maurey,J.
R.)のBiochem Biophys Acta 69、48〜58(1963)参
照)。
一般にカオトロピック剤は、生物学的試料と試薬とから
なる全反応混合物中で約0.1〜約5モル溶液を形成する
に充分な量で生物学的試料中で用いられる。カオトロピ
ック剤は約0.6〜約1.0モル溶液の量で存在するのが好ま
しい。カオトロピック剤が生物学的流体中に含まれるこ
とにより、「M型」サブユニットを1個またはそれ以上
含有するすべてのLDHアイソザイム(LD−2からLD−5
まで)が直ちに不活化される。LD−1は安定なままであ
るのでLDHアッセイ試薬により同時に測定することがで
きる。
なる全反応混合物中で約0.1〜約5モル溶液を形成する
に充分な量で生物学的試料中で用いられる。カオトロピ
ック剤は約0.6〜約1.0モル溶液の量で存在するのが好ま
しい。カオトロピック剤が生物学的流体中に含まれるこ
とにより、「M型」サブユニットを1個またはそれ以上
含有するすべてのLDHアイソザイム(LD−2からLD−5
まで)が直ちに不活化される。LD−1は安定なままであ
るのでLDHアッセイ試薬により同時に測定することがで
きる。
好ましいカオトロピック剤はは過塩素酸ナトリウム(Na
ClO4)である。過塩素酸ナトリウムは基質(乳酸または
ピルビン酸)とLD−1とのあいだの親和性を下げること
ができる。そうして下がった反応速度は一層の基質を添
加することにより逆転させることができる。たとえば約
0.6〜約1.0モル溶液の過塩素酸ナトリウムと約0.05〜約
0.5モル溶液の乳酸との組合わせはLD−1の特異的な試
薬であり、LD−1の迅速で正確な測定をすることができ
る。
ClO4)である。過塩素酸ナトリウムは基質(乳酸または
ピルビン酸)とLD−1とのあいだの親和性を下げること
ができる。そうして下がった反応速度は一層の基質を添
加することにより逆転させることができる。たとえば約
0.6〜約1.0モル溶液の過塩素酸ナトリウムと約0.05〜約
0.5モル溶液の乳酸との組合わせはLD−1の特異的な試
薬であり、LD−1の迅速で正確な測定をすることができ
る。
本発明の他の実施態様においては、LDHをアッセイする
ように設計された試薬システムのためにLD−1以外のア
イソザイムを選択的に除去する方法が提供される。一般
にこの方法には試薬にカオトロピック剤を加えることが
含まれており、それによりLD−2からLD−5までのアイ
ソザイムが不活化されてLD−1の定量が可能となる。一
般にLDHアッセイ試薬にはバッファー、LDH基質(乳酸、
ピルビン酸、NAD、NADHまたはそれらの類似化合物)お
よび場合により色原体や指示染料が含まれている。基本
的なLDHアッセイ試薬は当該技術分野でよく知られてい
るのでここでは詳しく述べないことにする。本発明に用
いることができる市販のLDHアッセイ試薬としてはA−G
ent LDH−L(アボット・ラボラトリーズ)、リキッド
シュタット(Liquid−Stat)LD−LVV(ベックマン(Bec
kman))、ファストケム(Fast Chem)LDH−L(BM
C)、LDH−L−S V.R.(カリバイオケム(Calibioche
m))、C−Zyme LDH(カウンター(Counter))、カロ
リメトリックス(Colorimetrix)(ダウケミカル(Dow
Chemical))、LDH−L(フィッシャー(Fisher))、
ウルトラザイム(Ultrazyme)(ハルレコ(Harlec
o))、HMA LDH−VV(ハイセル(Hycel))、スピンケ
ム(Spin Chem)LDH−L(SKI)およびLDH(L−P)
(ワーシントン(Worthington))を挙げることができ
る。
ように設計された試薬システムのためにLD−1以外のア
イソザイムを選択的に除去する方法が提供される。一般
にこの方法には試薬にカオトロピック剤を加えることが
含まれており、それによりLD−2からLD−5までのアイ
ソザイムが不活化されてLD−1の定量が可能となる。一
般にLDHアッセイ試薬にはバッファー、LDH基質(乳酸、
ピルビン酸、NAD、NADHまたはそれらの類似化合物)お
よび場合により色原体や指示染料が含まれている。基本
的なLDHアッセイ試薬は当該技術分野でよく知られてい
るのでここでは詳しく述べないことにする。本発明に用
いることができる市販のLDHアッセイ試薬としてはA−G
ent LDH−L(アボット・ラボラトリーズ)、リキッド
シュタット(Liquid−Stat)LD−LVV(ベックマン(Bec
kman))、ファストケム(Fast Chem)LDH−L(BM
C)、LDH−L−S V.R.(カリバイオケム(Calibioche
m))、C−Zyme LDH(カウンター(Counter))、カロ
リメトリックス(Colorimetrix)(ダウケミカル(Dow
Chemical))、LDH−L(フィッシャー(Fisher))、
ウルトラザイム(Ultrazyme)(ハルレコ(Harlec
o))、HMA LDH−VV(ハイセル(Hycel))、スピンケ
ム(Spin Chem)LDH−L(SKI)およびLDH(L−P)
(ワーシントン(Worthington))を挙げることができ
る。
LDHアッセイは以下に示す一般的な反応に基づく。
この方法は可逆反応からなっており、乳酸が酵素により
ピルビン酸に変えられ、それと同時にNAD(ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド)がNADH(還元NAD)に還
元される。したがって可逆反応の場合には、340nmにお
ける吸光度の上昇速度として測定されるNADHの生成また
はNADへの酸化速度は試料中におけるLDH活性に比例す
る。
ピルビン酸に変えられ、それと同時にNAD(ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド)がNADH(還元NAD)に還
元される。したがって可逆反応の場合には、340nmにお
ける吸光度の上昇速度として測定されるNADHの生成また
はNADへの酸化速度は試料中におけるLDH活性に比例す
る。
本発明による方法は選択的な不活化とLDH−1活性の同
時アッセイを提供するものである。全手順に必要な時間
は、アボットVP重クロム酸アナライザーおよびアボット
スペクトラム診断システム(アボット・ラボラトリー
ズ、ノース・シカゴ、イリノイ)では典型的なLDH全ア
ッセイに必要な時間、すなわち4分間のみである。アボ
ットVPおよびアボットスペクトラム装置のような重クロ
ム酸フィルターや340/380nmでの検出器を用いた自動臨
床アナライザーは、本発明の試薬を用いてアッセイを行
うのに非常に適している。一般的には試薬1ml当たり血
清10〜20μを37℃で加えるが、アボット装置では血清
2.5〜5.0μおよび試薬0.25mlを用い、血清LDHおよびL
DH−1活性を10〜1000ユニット/(U/L)の範囲で正
確に測定することができる。
時アッセイを提供するものである。全手順に必要な時間
は、アボットVP重クロム酸アナライザーおよびアボット
スペクトラム診断システム(アボット・ラボラトリー
ズ、ノース・シカゴ、イリノイ)では典型的なLDH全ア
ッセイに必要な時間、すなわち4分間のみである。アボ
ットVPおよびアボットスペクトラム装置のような重クロ
ム酸フィルターや340/380nmでの検出器を用いた自動臨
床アナライザーは、本発明の試薬を用いてアッセイを行
うのに非常に適している。一般的には試薬1ml当たり血
清10〜20μを37℃で加えるが、アボット装置では血清
2.5〜5.0μおよび試薬0.25mlを用い、血清LDHおよびL
DH−1活性を10〜1000ユニット/(U/L)の範囲で正
確に測定することができる。
本発明の方法によれば、血清の分離および装置上の試料
カップ中へのアリコートを除いて、アッセイに先立って
試料を操作する必要がない。アッセイの結果はLDH全量
と同じ単位で得られ、未希釈血清についての結果であ
る。さらに計算する必要はない。またアッセイ前の希釈
のような試料の操作の必要がないので、本発明のアッセ
イ法は非常に高い正確さのレベルを達成するものであ
る。
カップ中へのアリコートを除いて、アッセイに先立って
試料を操作する必要がない。アッセイの結果はLDH全量
と同じ単位で得られ、未希釈血清についての結果であ
る。さらに計算する必要はない。またアッセイ前の希釈
のような試料の操作の必要がないので、本発明のアッセ
イ法は非常に高い正確さのレベルを達成するものであ
る。
LDH−2からLDH−5までのアイソザイムを不活化するこ
とに加えて、カオトロピック剤はLDH−1の乳酸、ピル
ビン酸およびそれらの類似化合物に対する親和性を減少
させる。その結果、同量のLDH−1について等しい反応
速度を得るためには、カオトロピック剤が存在しない場
合に比べてカオトロピック剤が存在する場合には一層高
い乳酸濃度が要求される(その他については同等であ
り、反応の方向は乳酸→ピルビン酸である)。同じ理由
により、ピルビン酸、シュウ酸および高い乳酸レベルに
より生じる阻害もまた減少する。したがって高いレベル
の基質(たとえば乳酸、ピルビン酸)を含有するLDH−
1に特異的な本発明の試薬では、反応時間枠を通じて高
い基質濃度が得られること、および同じ時間枠のあいだ
に生じる生成物阻害のレベルが低いことから優れた直線
性が得られるであろう。この現象のもう一つの利点は、
凝固阻止管に集められシュウ酸塩を含有する試料中にお
いて妨害がないことである。
とに加えて、カオトロピック剤はLDH−1の乳酸、ピル
ビン酸およびそれらの類似化合物に対する親和性を減少
させる。その結果、同量のLDH−1について等しい反応
速度を得るためには、カオトロピック剤が存在しない場
合に比べてカオトロピック剤が存在する場合には一層高
い乳酸濃度が要求される(その他については同等であ
り、反応の方向は乳酸→ピルビン酸である)。同じ理由
により、ピルビン酸、シュウ酸および高い乳酸レベルに
より生じる阻害もまた減少する。したがって高いレベル
の基質(たとえば乳酸、ピルビン酸)を含有するLDH−
1に特異的な本発明の試薬では、反応時間枠を通じて高
い基質濃度が得られること、および同じ時間枠のあいだ
に生じる生成物阻害のレベルが低いことから優れた直線
性が得られるであろう。この現象のもう一つの利点は、
凝固阻止管に集められシュウ酸塩を含有する試料中にお
いて妨害がないことである。
本発明の試薬およびアッセイ法のさらに別の利点は、ア
ッセイに必要な試料容量を最小にできることである。こ
れまでの免疫学的方法やクロマトグラフ法では200〜100
0μの血清試料が必要であり、そのすべてがアッセイ
で使い尽くされる。本発明のアッセイ法では3.0ml容の
キュベットが必要であるとして最大100μの試料が手
動アッセイで必要なだけであり、自動アッセイでは一般
に2.5〜5.0mlの試薬が必要なだけである。自動アッセイ
では50〜100μの試料が試料カップ中にある必要があ
るが、未使用の試料は他のアッセイに利用される。
ッセイに必要な試料容量を最小にできることである。こ
れまでの免疫学的方法やクロマトグラフ法では200〜100
0μの血清試料が必要であり、そのすべてがアッセイ
で使い尽くされる。本発明のアッセイ法では3.0ml容の
キュベットが必要であるとして最大100μの試料が手
動アッセイで必要なだけであり、自動アッセイでは一般
に2.5〜5.0mlの試薬が必要なだけである。自動アッセイ
では50〜100μの試料が試料カップ中にある必要があ
るが、未使用の試料は他のアッセイに利用される。
つぎに本発明を実施例に基づきさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例1 LDH−1に特異的なLDHアッセイ試薬を調製した。まず、
試薬粉末を混ぜ合わせ、粉末1g当たり水30mlで再構成し
たときに各活性成分の濃度が以下のようになるようにし
た。
試薬粉末を混ぜ合わせ、粉末1g当たり水30mlで再構成し
たときに各活性成分の濃度が以下のようになるようにし
た。
L−乳酸およびNADは基質であり、トリスおよびグルタ
ミン酸は得られた溶液のpHを8.7に緩衝する。溶液中のN
ADの安定性を増すためにNa2EDTAが全粉末重量の1%を
占めていてもよい。必要な粉末の全重量を得るために塩
化ナトリウムを充填剤として用いてもよい。
ミン酸は得られた溶液のpHを8.7に緩衝する。溶液中のN
ADの安定性を増すためにNa2EDTAが全粉末重量の1%を
占めていてもよい。必要な粉末の全重量を得るために塩
化ナトリウムを充填剤として用いてもよい。
第2に、希釈溶液を調製した。この溶液は水中に過塩素
酸ナトリウム0.825MおよびL−乳酸0.165Mを含有し、水
酸化ナトリウムを添加することによりpH9.0に調節して
ある。
酸ナトリウム0.825MおよびL−乳酸0.165Mを含有し、水
酸化ナトリウムを添加することによりpH9.0に調節して
ある。
第3に、水よりはむしろ希釈液30ml当たりに上記粉末1.
0gを溶解させることによりヒトLD−1に特異的な試薬を
調製した。この再構成試薬は全LDHアッセイ試薬と同じ
アッセイ形態、試料および装置に用いたが、得られた測
定酵素活性はLD−1アイソザイムにのみよるものであっ
た。さらに活性ユニットは、水で再構成した同じ粉末で
同量の純粋LD−1をアッセイすれば得られるであろうも
のに正比例する。
0gを溶解させることによりヒトLD−1に特異的な試薬を
調製した。この再構成試薬は全LDHアッセイ試薬と同じ
アッセイ形態、試料および装置に用いたが、得られた測
定酵素活性はLD−1アイソザイムにのみよるものであっ
た。さらに活性ユニットは、水で再構成した同じ粉末で
同量の純粋LD−1をアッセイすれば得られるであろうも
のに正比例する。
実施例2 既存の粉末または液体LDHアッセイ試薬から他のLD−1
アッセイ試薬を調製することができる。そのような希釈
溶液の正確な組成は、最適化研究により次のようにして
得ることができる。LDHおよびLD−1の上昇したものを
含む一群のヒト血清試料を得、LD−1測定のための確立
された免疫学的方法、電気泳動法およびクロマトグラフ
法(すなわち比較法)によりLD−1レベルを測定する。
データは、異なる濃度のL−乳酸および/または過塩素
酸ナトリウムを含有(すなわち実験条件)する種々の溶
液で既存のLDHアッセイ試薬を再構成することにより得
たものと相関させる。
アッセイ試薬を調製することができる。そのような希釈
溶液の正確な組成は、最適化研究により次のようにして
得ることができる。LDHおよびLD−1の上昇したものを
含む一群のヒト血清試料を得、LD−1測定のための確立
された免疫学的方法、電気泳動法およびクロマトグラフ
法(すなわち比較法)によりLD−1レベルを測定する。
データは、異なる濃度のL−乳酸および/または過塩素
酸ナトリウムを含有(すなわち実験条件)する種々の溶
液で既存のLDHアッセイ試薬を再構成することにより得
たものと相関させる。
過塩素酸ナトリウムは0.1〜約5モル溶液、好ましくは
0.5〜約1.5モル溶液であり、L−乳酸は約0〜約0.5モ
ル溶液の範囲であってよい。LD−1比較法の結果を一次
回帰分析により各実験条件と比較し、各比較について傾
き、切片および相関係数の値を得る。そのような分析か
ら最適LD−1アッセイ試薬は、傾きと相関係数とがそれ
ぞれ1にほぼ等しく、切片の値が0にほぼ等しい希釈組
成を選択することにより得ることができる。上記手順に
より、既存の全LDHのための粉末または凍結乾燥試薬をL
D−1アイソザイムの選択アッセイのために容易に適合
させることができる。全LDHアッセイおよびLD−1アッ
セイの両方によりヒト試料から得られた結果は容易に組
み合わせてLD−1:LDH比とすることができるが、この値
は従来より診断的に有用な値であるとされてきている。
本発明のLD−1アッセイ法はまた、他のヒトLDHアイソ
ザイムまたはサブユニット組成のアッセイと組み合わせ
て幾つかの他の、または残るすべてのLDHアイソザイム
を測定するようにすることもできる。カオトロピック剤
はまた他の臨床的に重要な酵素のアイソザイムを選択的
にアッセイするために用いることもできる。
0.5〜約1.5モル溶液であり、L−乳酸は約0〜約0.5モ
ル溶液の範囲であってよい。LD−1比較法の結果を一次
回帰分析により各実験条件と比較し、各比較について傾
き、切片および相関係数の値を得る。そのような分析か
ら最適LD−1アッセイ試薬は、傾きと相関係数とがそれ
ぞれ1にほぼ等しく、切片の値が0にほぼ等しい希釈組
成を選択することにより得ることができる。上記手順に
より、既存の全LDHのための粉末または凍結乾燥試薬をL
D−1アイソザイムの選択アッセイのために容易に適合
させることができる。全LDHアッセイおよびLD−1アッ
セイの両方によりヒト試料から得られた結果は容易に組
み合わせてLD−1:LDH比とすることができるが、この値
は従来より診断的に有用な値であるとされてきている。
本発明のLD−1アッセイ法はまた、他のヒトLDHアイソ
ザイムまたはサブユニット組成のアッセイと組み合わせ
て幾つかの他の、または残るすべてのLDHアイソザイム
を測定するようにすることもできる。カオトロピック剤
はまた他の臨床的に重要な酵素のアイソザイムを選択的
にアッセイするために用いることもできる。
実施例3 本実施例は、LD−1アッセイのための本発明の試薬およ
びアッセイ法と血清LD−1の単離のための標準的な手順
(イソミューン(Isomune)−LD、ロッシュ・ダイアグ
ノスティック・システムズ(Roche Diagnostic System
s)、ナットリー・ニュー・ジャージー)とのあいだの
優れた相関を示すものである。102個の血清試料を集
め、各試料からのアリコートをイソミューン−LD手順で
処理し、アボットA−Agent、LDHアッセイ試薬を用い、
5μおよび10μの試料それぞれ2本ずつをそれぞれ
アボットVPおよびアボットスペクトラム臨床アナライザ
ーでアッセイした。未処理の試料アリコート2本ずつも
また、実施例1で調製した本発明のLD−1アッセイ試薬
を用い同じ臨床アナライザーでアッセイした(それぞれ
2.5μおよび5.0μを用いた)。
びアッセイ法と血清LD−1の単離のための標準的な手順
(イソミューン(Isomune)−LD、ロッシュ・ダイアグ
ノスティック・システムズ(Roche Diagnostic System
s)、ナットリー・ニュー・ジャージー)とのあいだの
優れた相関を示すものである。102個の血清試料を集
め、各試料からのアリコートをイソミューン−LD手順で
処理し、アボットA−Agent、LDHアッセイ試薬を用い、
5μおよび10μの試料それぞれ2本ずつをそれぞれ
アボットVPおよびアボットスペクトラム臨床アナライザ
ーでアッセイした。未処理の試料アリコート2本ずつも
また、実施例1で調製した本発明のLD−1アッセイ試薬
を用い同じ臨床アナライザーでアッセイした(それぞれ
2.5μおよび5.0μを用いた)。
イソミューン−LD手順によるLD−1の単離は次のように
して行った。すなわち試料のアリコートに抗LD−5
(M4)血清(ヤギ)を加え、混合し、周囲温度で5分間
インキュベートした。つぎに第二の抗体懸濁液(ロバ)
をアリコートに加え、混合し、周囲温度でさらに5分間
インキュベートし、ついで遠心分離にかけた。ついで従
来の試薬、この場合はアボットのA−Agent LDH−Lを
用いてアッセイしLD−1アイソザイム活性を測定した。
して行った。すなわち試料のアリコートに抗LD−5
(M4)血清(ヤギ)を加え、混合し、周囲温度で5分間
インキュベートした。つぎに第二の抗体懸濁液(ロバ)
をアリコートに加え、混合し、周囲温度でさらに5分間
インキュベートし、ついで遠心分離にかけた。ついで従
来の試薬、この場合はアボットのA−Agent LDH−Lを
用いてアッセイしLD−1アイソザイム活性を測定した。
本発明のアッセイ法は、実施例1で調製した本発明の試
薬を各未処理アリコートと単に組合わせ、臨床アナライ
ザー上でアッセイを行うだけでLD−1濃度の測定に用い
ることができた。アボットVP上で2.5μの試料を、ま
たアボットスペクトラム上で5.0μの試料をアッセイ
するために約250μの試薬を用いた。
薬を各未処理アリコートと単に組合わせ、臨床アナライ
ザー上でアッセイを行うだけでLD−1濃度の測定に用い
ることができた。アボットVP上で2.5μの試料を、ま
たアボットスペクトラム上で5.0μの試料をアッセイ
するために約250μの試薬を用いた。
コンピューターで処理したプログラムにより各臨床装置
上で行った2つの手順のあいだの相関を測定し、結果を
グラフに示した。アボットVP上で行ったアッセイについ
てのグラフは第1図に、アボットスペクトラム上で行っ
たアッセイについてのグラフは第2図にそれぞれ示す。
本発明のLD−1アッセイの結果はグラフのY軸上に、従
来の多工程標準アッセイの結果はグラフのX軸上に示し
た。完全な相関では切片0、傾き1.0でグラフを2分す
る。相関の結果は以下の通りであった。
上で行った2つの手順のあいだの相関を測定し、結果を
グラフに示した。アボットVP上で行ったアッセイについ
てのグラフは第1図に、アボットスペクトラム上で行っ
たアッセイについてのグラフは第2図にそれぞれ示す。
本発明のLD−1アッセイの結果はグラフのY軸上に、従
来の多工程標準アッセイの結果はグラフのX軸上に示し
た。完全な相関では切片0、傾き1.0でグラフを2分す
る。相関の結果は以下の通りであった。
第1表の結果は、従来の多工程手順(まずLD−1を血清
試料から単離し、ついでLD−1活性を測定する)と本発
明の試薬およびアッセイ法(単離とLD−1活性の測定を
同時に行う)とのあいだに優れた相関があることを示し
ている。
試料から単離し、ついでLD−1活性を測定する)と本発
明の試薬およびアッセイ法(単離とLD−1活性の測定を
同時に行う)とのあいだに優れた相関があることを示し
ている。
第1図は、アボットVP臨床装置上での、本発明のLD−1
アッセイ法により行ったLD−1アッセイの結果と従来の
多工程標準アッセイ法により行ったLD−1アッセイの結
果とのあいだの相関を示すグラフ、第2図は、アボット
スペクトラム臨床装置上での、本発明のLD−1アッセイ
法により行ったLD−1アッセイの結果と従来の多工程標
準アッセイ法により行ったLD−1アッセイの結果とのあ
いだの相関を示すグラフである。
アッセイ法により行ったLD−1アッセイの結果と従来の
多工程標準アッセイ法により行ったLD−1アッセイの結
果とのあいだの相関を示すグラフ、第2図は、アボット
スペクトラム臨床装置上での、本発明のLD−1アッセイ
法により行ったLD−1アッセイの結果と従来の多工程標
準アッセイ法により行ったLD−1アッセイの結果とのあ
いだの相関を示すグラフである。
Claims (10)
- 【請求項1】(a)カオトロピック剤の存在下に生物学
的流体とLDHアッセイ試薬との反応混合物を調製し、そ
の際、該LDHアッセイ試薬はバッファー、LDH基質および
色原体からなり、ついで (b)該反応混合物中に存在するLD−1の活性を測定す
る ことを特徴とする、生物学的流体中のLD−1アイソザイ
ム活性の測定方法。 - 【請求項2】前記カオトロピック剤が約0.1〜約5モル
溶液の量で存在する特許請求の範囲第(1)項記載の方
法。 - 【請求項3】前記カオトロピック剤が反応混合物中で約
0.6〜約1モル溶液を形成するのに充分な量で存在する
特許請求の範囲第(1)項記載の方法。 - 【請求項4】前記カオトロピック剤が過塩素酸ナトリウ
ムである特許請求の範囲第(2)項記載の方法。 - 【請求項5】前記試薬がバッファー、乳酸、NADおよび
色原体からなる特許請求の範囲第(1)項記載の方法。 - 【請求項6】前記試薬がバッファー、ピルビン酸、NADH
および色原体からなる特許請求の範囲第(1)項記載の
方法。 - 【請求項7】バッファー、LDH基質、色原体およびカオ
トロピック剤からなるLD−1アッセイ試薬。 - 【請求項8】前記基質が乳酸、ピルビン酸、NAD、NADH
またはそれらの類似化合物である特許請求の範囲第
(7)項記載の試薬。 - 【請求項9】前記色原体がNADである特許請求の範囲第
(7)項記載の試薬。 - 【請求項10】前記カオトロピック剤が過塩素酸ナトリ
ウムである特許請求の範囲第(7)項記載の試薬。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US5510787A | 1987-05-28 | 1987-05-28 | |
US55107 | 1987-05-28 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6463397A JPS6463397A (en) | 1989-03-09 |
JPH0698031B2 true JPH0698031B2 (ja) | 1994-12-07 |
Family
ID=21995651
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63131306A Expired - Lifetime JPH0698031B2 (ja) | 1987-05-28 | 1988-05-26 | Ld−1アイソザイムの測定法および試薬 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0292838B1 (ja) |
JP (1) | JPH0698031B2 (ja) |
AT (1) | ATE80665T1 (ja) |
AU (1) | AU611438B2 (ja) |
CA (1) | CA1320418C (ja) |
DE (1) | DE3874611T2 (ja) |
ES (1) | ES2036234T3 (ja) |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6242208B1 (en) | 1988-07-15 | 2001-06-05 | International Reagents Corporation | LDH1 assay |
JPH0775556B2 (ja) * | 1988-07-15 | 1995-08-16 | 国際試薬株式会社 | Ldhアイソザイムのldh▲下1▼の分別定量法 |
AU605417B2 (en) * | 1989-04-18 | 1991-01-10 | John Lysaght (Australia) Limited | A structural spacer |
DE69016265T2 (de) * | 1989-06-09 | 1995-09-28 | Abbott Lab | Verfahren zur Bestimmung von Isoenzymen. |
IE920779A1 (en) * | 1991-03-13 | 1992-09-23 | Du Pont | Selective stabilization of lactate dehydrogenase isoenzyme¹ld1 by high molecular weight polyols |
US20060014136A1 (en) * | 2004-07-14 | 2006-01-19 | Inimex Pharmaceuticals, Inc. | Method of screening for protection from microbial infection |
CN114381494B (zh) * | 2021-12-01 | 2023-12-22 | 天津中成佳益生物科技有限公司 | 一种乳酸脱氢酶同工酶1的检测试剂及检测方法 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3388044A (en) * | 1965-12-07 | 1968-06-11 | Warner Lambert Pharmaceutical | Process for differentiating the isoenzymes of lactic dehydrogenase |
DE2513407A1 (de) * | 1975-03-26 | 1976-10-14 | Schmidt Karlheinz | Ein verfahren zur differenzierung der leber- und herzspezifischen lactatdehydrogenase im blutserum |
US4250255A (en) * | 1977-07-11 | 1981-02-10 | Eastman Kodak Company | Assay method for isoenzyme activity |
-
1988
- 1988-05-17 ES ES198888107865T patent/ES2036234T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-05-17 DE DE8888107865T patent/DE3874611T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-05-17 AT AT88107865T patent/ATE80665T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-05-17 EP EP88107865A patent/EP0292838B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-05-25 AU AU16593/88A patent/AU611438B2/en not_active Ceased
- 1988-05-26 JP JP63131306A patent/JPH0698031B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-05-27 CA CA000567989A patent/CA1320418C/en not_active Expired - Fee Related
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Publication number | Publication date |
---|---|
ES2036234T3 (es) | 1993-05-16 |
EP0292838B1 (en) | 1992-09-16 |
AU611438B2 (en) | 1991-06-13 |
DE3874611D1 (de) | 1992-10-22 |
AU1659388A (en) | 1988-12-01 |
DE3874611T2 (de) | 1993-04-15 |
ATE80665T1 (de) | 1992-10-15 |
EP0292838A1 (en) | 1988-11-30 |
CA1320418C (en) | 1993-07-20 |
JPS6463397A (en) | 1989-03-09 |
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