JP2000262299A - グルコースデヒドロゲナーゼによるグルコースの定量方法およびグルコース定量用試薬 - Google Patents
グルコースデヒドロゲナーゼによるグルコースの定量方法およびグルコース定量用試薬Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】グルコースの定量法において、測定可能な範囲
が広く、高い濃度域にまで及び、高濃度グルコース検体
（例えば重篤な糖尿病等の患者の尿）であっても、希釈
せずに正確な定量が可能な測定法、並びに、その方法の
使用に適する試薬を提供する。 【解決手段】グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグル
コースの定量法であって、グルコースを含有する試料に
該酵素を、阻害剤としてホウ酸もしくはその塩の存在
下、補酵素ＮＡＤもしくはＮＡＤＰとともに作用させ、
その際生成するＮＡＤＨ量もしくはＮＡＤＰＨ量の増加
速度を測定する。拮抗阻害剤の添加により、見かけのＫ
ｍ値が増大し、高濃度域でのグルコースの定量が可能に
なる。
が広く、高い濃度域にまで及び、高濃度グルコース検体
（例えば重篤な糖尿病等の患者の尿）であっても、希釈
せずに正確な定量が可能な測定法、並びに、その方法の
使用に適する試薬を提供する。 【解決手段】グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグル
コースの定量法であって、グルコースを含有する試料に
該酵素を、阻害剤としてホウ酸もしくはその塩の存在
下、補酵素ＮＡＤもしくはＮＡＤＰとともに作用させ、
その際生成するＮＡＤＨ量もしくはＮＡＤＰＨ量の増加
速度を測定する。拮抗阻害剤の添加により、見かけのＫ
ｍ値が増大し、高濃度域でのグルコースの定量が可能に
なる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、グルコースの定量
方法、特に、臨床検査分野における例えば検尿などの試
料中のグルコース濃度を、酵素グルコースデヒドロゲナ
ーゼを用いて反応速度論に基づいて定量する方法、並び
に、その方法の使用に適する測定用試薬に関する。より
詳しくは、本発明は、グルコースを含有する試料にグル
コースデヒドロゲナーゼを作用させる際、グルコースデ
ヒドロゲナーゼの拮抗阻害剤としてホウ酸もしくはその
塩を使用し、グルコースデヒドロゲナーゼと基質（グル
コース）との親和力を小さくして見かけのＫｍ値を大き
くすることにより、試料中のグルコース濃度が高くと
も、そのグルコースを正確に定量することができるグル
コース濃度の測定方法に関する。
方法、特に、臨床検査分野における例えば検尿などの試
料中のグルコース濃度を、酵素グルコースデヒドロゲナ
ーゼを用いて反応速度論に基づいて定量する方法、並び
に、その方法の使用に適する測定用試薬に関する。より
詳しくは、本発明は、グルコースを含有する試料にグル
コースデヒドロゲナーゼを作用させる際、グルコースデ
ヒドロゲナーゼの拮抗阻害剤としてホウ酸もしくはその
塩を使用し、グルコースデヒドロゲナーゼと基質（グル
コース）との親和力を小さくして見かけのＫｍ値を大き
くすることにより、試料中のグルコース濃度が高くと
も、そのグルコースを正確に定量することができるグル
コース濃度の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】血清および尿などの体液中のグルコース
濃度は各種の疾患または病態を反映していることから、
ヒトの健康診断、特に成人病として発症率の高い糖尿病
の鑑別診断においては、グルコース濃度の検査は、必須
の検査項目となっている。ヒトの尿中のグルコース濃度
の基準値は、およそ２０ないし４０ｍｇ／ｄＬの範囲で
あり、測定値がその範囲に該当するとき、そのヒトは健
常であると判断される。しかるに、重篤な糖尿病とか腎
障害などを患っている患者にあっては、大量のグルコー
スが尿中に排泄されるため、尿中のグルコース濃度は約
１０ｇ／ｄＬの非常に高濃度にまで及ぶ。グルコース濃
度の測定法としては、従来より化学法と酵素法が知られ
ている。化学法としては、還元法（Ｓｏｍｏｇｙｉ−Ｎ
ｅｌｓｏｎ法）とか、酸化的縮合法（ｏ−トルイジンホ
ウ酸法）などが挙げられる。しかし、これらの方法は、
還元物質の影響を受ける、またグルコースに対する特異
性が低いなどの欠点があるため、一般に、化学法よりも
酵素法がより優れていると判断されている。酵素法とし
ては、従来、グルコースオキシダーゼ・ペルオキシダー
ゼ系を用いた測定法並びにヘキソキナーゼ・グルコース
６−リン酸デヒドロゲナーゼ系を用いた測定法が主に使
用されている［Ｈａｎｓ Ｕ．Ｂ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｏｆＥｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ，ｖｏｌ．
３，１１９６−１２２７（１９７４）など参照］。
濃度は各種の疾患または病態を反映していることから、
ヒトの健康診断、特に成人病として発症率の高い糖尿病
の鑑別診断においては、グルコース濃度の検査は、必須
の検査項目となっている。ヒトの尿中のグルコース濃度
の基準値は、およそ２０ないし４０ｍｇ／ｄＬの範囲で
あり、測定値がその範囲に該当するとき、そのヒトは健
常であると判断される。しかるに、重篤な糖尿病とか腎
障害などを患っている患者にあっては、大量のグルコー
スが尿中に排泄されるため、尿中のグルコース濃度は約
１０ｇ／ｄＬの非常に高濃度にまで及ぶ。グルコース濃
度の測定法としては、従来より化学法と酵素法が知られ
ている。化学法としては、還元法（Ｓｏｍｏｇｙｉ−Ｎ
ｅｌｓｏｎ法）とか、酸化的縮合法（ｏ−トルイジンホ
ウ酸法）などが挙げられる。しかし、これらの方法は、
還元物質の影響を受ける、またグルコースに対する特異
性が低いなどの欠点があるため、一般に、化学法よりも
酵素法がより優れていると判断されている。酵素法とし
ては、従来、グルコースオキシダーゼ・ペルオキシダー
ゼ系を用いた測定法並びにヘキソキナーゼ・グルコース
６−リン酸デヒドロゲナーゼ系を用いた測定法が主に使
用されている［Ｈａｎｓ Ｕ．Ｂ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｏｆＥｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ，ｖｏｌ．
３，１１９６−１２２７（１９７４）など参照］。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかし、これら両測定
法は、ともに、複数の酵素を使用するものであって、そ
の反応系が複雑であり、簡便な測定法とは言い難い。そ
の上、グルコースオキシダーゼ・ペルオキシダーゼ系を
用いた測定法にあっては、過酸化水素の呈色系が測定液
中の共存物質の影響を受けやすく、とりわけ溶存酸素の
濃度が全反応を律速するものとなるとき、グルコース濃
度の測定が困難になる。他方、ヘキソキナーゼ・グルコ
ース６−リン酸デヒドロゲナーゼ系を用いた測定法にあ
っては、反応終末端において残存する還元型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと表わす
こともある。）もしくは還元型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドホスフェート（以下、ＮＡＤＰＨと表わ
すこともある。）の紫外部吸収を測定する方法であるた
め、試料中の種々の共存物質のうち、紫外部に吸収域を
もつものの影響を受ける。その上、ＮＡＤＨもしくはＮ
ＡＤＰＨの濃度については、光学測定器の測定可能な吸
光度限界によって、その測定可能な濃度範囲が一定の範
囲に制限されるため、この測定法によるグルコース濃度
の測定可能な濃度範囲は、低い濃度レベルの狭い範囲に
限られるという欠点がある。
法は、ともに、複数の酵素を使用するものであって、そ
の反応系が複雑であり、簡便な測定法とは言い難い。そ
の上、グルコースオキシダーゼ・ペルオキシダーゼ系を
用いた測定法にあっては、過酸化水素の呈色系が測定液
中の共存物質の影響を受けやすく、とりわけ溶存酸素の
濃度が全反応を律速するものとなるとき、グルコース濃
度の測定が困難になる。他方、ヘキソキナーゼ・グルコ
ース６−リン酸デヒドロゲナーゼ系を用いた測定法にあ
っては、反応終末端において残存する還元型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと表わす
こともある。）もしくは還元型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドホスフェート（以下、ＮＡＤＰＨと表わ
すこともある。）の紫外部吸収を測定する方法であるた
め、試料中の種々の共存物質のうち、紫外部に吸収域を
もつものの影響を受ける。その上、ＮＡＤＨもしくはＮ
ＡＤＰＨの濃度については、光学測定器の測定可能な吸
光度限界によって、その測定可能な濃度範囲が一定の範
囲に制限されるため、この測定法によるグルコース濃度
の測定可能な濃度範囲は、低い濃度レベルの狭い範囲に
限られるという欠点がある。
【０００４】また、酵素グルコースデヒドロゲナーゼを
用いたヒト血清中のグルコースの定量法も、有効な測定
法のひとつとして提案されている。正常ヒト血清中のグ
ルコース濃度は６５〜１０５ｍｇ／ｄＬ（３．６５．８
ｍＭ）程度であるのに対して、グルコースデヒドロゲナ
ーゼのグルコースに対するＫｍ値は数ｍＭ程度と小さい
ものであるため、グルコースデヒドロゲナーゼを用いた
グルコース定量においては、終末点法が適当な測定法と
して従来採用されていた。しかしながら、ヒト尿中のグ
ルコース濃度については、その基準値は２０〜４０ｍｇ
／ｄＬ程度であるが、重篤な糖尿病もしくは腎障害など
を患う患者にあっては、尿中のグルコース濃度が大変高
い濃度に及ぶため、そのような患者の尿試料（つまり高
濃度グルコース試料）を測定するときには、試料を希釈
して、グルコース濃度を低下させる必要があった。しか
し、この希釈操作は煩雑なものであり、しかも、希釈の
精度および回数が誤差範囲として、最終的な測定値に与
える影響も大きく、無視し得ないものである。
用いたヒト血清中のグルコースの定量法も、有効な測定
法のひとつとして提案されている。正常ヒト血清中のグ
ルコース濃度は６５〜１０５ｍｇ／ｄＬ（３．６５．８
ｍＭ）程度であるのに対して、グルコースデヒドロゲナ
ーゼのグルコースに対するＫｍ値は数ｍＭ程度と小さい
ものであるため、グルコースデヒドロゲナーゼを用いた
グルコース定量においては、終末点法が適当な測定法と
して従来採用されていた。しかしながら、ヒト尿中のグ
ルコース濃度については、その基準値は２０〜４０ｍｇ
／ｄＬ程度であるが、重篤な糖尿病もしくは腎障害など
を患う患者にあっては、尿中のグルコース濃度が大変高
い濃度に及ぶため、そのような患者の尿試料（つまり高
濃度グルコース試料）を測定するときには、試料を希釈
して、グルコース濃度を低下させる必要があった。しか
し、この希釈操作は煩雑なものであり、しかも、希釈の
精度および回数が誤差範囲として、最終的な測定値に与
える影響も大きく、無視し得ないものである。
【０００５】本発明は、上述した従来事情を考慮してな
されたものであって、その課題とするところは、とくに
臨床領域におけるグルコースの定量において、測定可能
な濃度範囲が広く、たとえ高濃度の尿検体であっても希
釈せずに測定が可能であり、汎用する自動分析機への適
用性に優れたグルコースの定量方法、並びに、その方法
に好適に使用されるグルコース定量用試薬を提供するこ
とにある。本発明のその他の課題は、特許請求の範囲を
含む明細書の記載並びに図面を参照することにより、理
解される。
されたものであって、その課題とするところは、とくに
臨床領域におけるグルコースの定量において、測定可能
な濃度範囲が広く、たとえ高濃度の尿検体であっても希
釈せずに測定が可能であり、汎用する自動分析機への適
用性に優れたグルコースの定量方法、並びに、その方法
に好適に使用されるグルコース定量用試薬を提供するこ
とにある。本発明のその他の課題は、特許請求の範囲を
含む明細書の記載並びに図面を参照することにより、理
解される。
【０００６】
【課題を解決するための手段】一般に、酵素の反応速度
論に基づいて、その酵素の基質となる物質を定量する場
合には、酵素の基質に対するＫｍ値が測定系における基
質濃度よりも充分により大きいことが必須の条件とな
る。しかるに、上述した、グルコースデヒドロゲナーゼ
を用いたグルコースの定量法にあっては、グルコースデ
ヒドロゲナーゼのグルコースに対するＫｍ値が低すぎる
ため、そのＫｍ値を適当な高い値に調節することが必要
とされる。Ｋｍ値を高い値に調節する手段として、当該
酵素に対する拮抗阻害剤を反応系に添加する方法があ
る。この方法を採択すれば、見かけのＫｍ値が定量可能
な高い値にまで上昇し、グルコース濃度の測定範囲を高
濃度域にまで広げることができ、よって、尿検体も希釈
しないで測定することが可能になる。本発明者らは、上
記の技術的課題を解決するべく鋭意研究した結果、グル
コースデヒドロゲナーゼの拮抗阻害剤としてホウ酸もし
くはその塩を採用すると、グルコース濃度の高い尿検体
であっても、希釈しないでグルコース濃度を正確に測定
することができ、有効なグルコース定量法を確立するこ
とができることを見出し、本発明を完成した。
論に基づいて、その酵素の基質となる物質を定量する場
合には、酵素の基質に対するＫｍ値が測定系における基
質濃度よりも充分により大きいことが必須の条件とな
る。しかるに、上述した、グルコースデヒドロゲナーゼ
を用いたグルコースの定量法にあっては、グルコースデ
ヒドロゲナーゼのグルコースに対するＫｍ値が低すぎる
ため、そのＫｍ値を適当な高い値に調節することが必要
とされる。Ｋｍ値を高い値に調節する手段として、当該
酵素に対する拮抗阻害剤を反応系に添加する方法があ
る。この方法を採択すれば、見かけのＫｍ値が定量可能
な高い値にまで上昇し、グルコース濃度の測定範囲を高
濃度域にまで広げることができ、よって、尿検体も希釈
しないで測定することが可能になる。本発明者らは、上
記の技術的課題を解決するべく鋭意研究した結果、グル
コースデヒドロゲナーゼの拮抗阻害剤としてホウ酸もし
くはその塩を採用すると、グルコース濃度の高い尿検体
であっても、希釈しないでグルコース濃度を正確に測定
することができ、有効なグルコース定量法を確立するこ
とができることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】したがって、本発明は、より明確には、酵
素グルコースデヒドロゲナーゼを用いて試料中のグルコ
ースを定量する方法であって、グルコースを含有する試
料に、グルコースデヒドロゲナーゼ阻害剤としてホウ酸
もしくはその塩の存在下、補酵素としてニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤと表わすことも
ある。）もしくはニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドホスフェート（以下、ＮＡＤＰと表わすこともあ
る。）とともにグルコースデヒドロゲナーゼを作用さ
せ、その際生成する還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（ＮＡＤＨ）もしくは還元型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）の
量増加速度を測定することを特徴とする、グルコースの
定量方法に関する。また、本発明は、上記の定量方法の
使用に適する試薬、つまり、酵素グルコースデヒドロゲ
ナーゼ、補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（ＮＡＤ）もしくはニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドホスフェート（ＮＡＤＰ）およびグルコースデヒド
ロゲナーゼ阻害剤ホウ酸もしくはその塩を含有する溶液
よりなる、グルコース定量用試薬にも関する。
素グルコースデヒドロゲナーゼを用いて試料中のグルコ
ースを定量する方法であって、グルコースを含有する試
料に、グルコースデヒドロゲナーゼ阻害剤としてホウ酸
もしくはその塩の存在下、補酵素としてニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤと表わすことも
ある。）もしくはニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドホスフェート（以下、ＮＡＤＰと表わすこともあ
る。）とともにグルコースデヒドロゲナーゼを作用さ
せ、その際生成する還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（ＮＡＤＨ）もしくは還元型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）の
量増加速度を測定することを特徴とする、グルコースの
定量方法に関する。また、本発明は、上記の定量方法の
使用に適する試薬、つまり、酵素グルコースデヒドロゲ
ナーゼ、補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（ＮＡＤ）もしくはニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドホスフェート（ＮＡＤＰ）およびグルコースデヒド
ロゲナーゼ阻害剤ホウ酸もしくはその塩を含有する溶液
よりなる、グルコース定量用試薬にも関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明に従う酵素グルコースデヒ
ドロゲナーゼを用いたグルコースの定量法は、グルコー
スを含有する試料にグルコースデヒドロゲナーゼを作用
させると、同時に、その系に共存する補酵素のＮＡＤも
しくはＮＡＤＰが水素還元されてＮＡＤＨもしくはＮＡ
ＤＰＨが生じるが、そのときのＮＡＤＨ量（濃度）もし
くはＮＡＤＰＨ量（濃度）の増加速度を例えば紫外部に
おける吸光度の時間変化値にて測定するというものであ
る。そして、本発明の特徴的な事項は、グルコースデヒ
ドロゲナーゼ阻害剤としてホウ酸もしくはその塩を用い
て、グルコースデヒドロゲナーゼのグルコースに対する
反応を拮抗阻害させることにより、グルコースデヒドロ
ゲナーゼのグルコースに対する見かけのＫｍ値をより大
きな値に変え、高濃度のグルコースを含有する検体であ
っても、希釈を必要とせずに、グルコースの正確な定量
を可能にした点にある。本発明の方法の実施にあたり、
酵素グルコースデヒドロゲナーゼの濃度並びに阻害剤ホ
ウ酸もしくはその塩の濃度は、各々、試料中に含まれる
基質グルコースの濃度により決定される。すなわち、高
濃度のグルコースを含む検体の定量において見かけのＫ
ｍ値を適当な基準にまで高めるべく、酵素および阻害剤
の添加量はそれぞれ調節され、通常、ＮＡＤＨもしくは
ＮＡＤＰＨの紫外部吸収の測定に用いる吸光度計の実行
感度（つまり、単位時間当たりの吸光度の変化値ΔＡｂ
ｓ／ｍｉｎ）に基づいて、最適な条件が設定される。一
例を挙げると、グルコース１ｇ／ｄＬの標準液を用い、
実行感度（ΔＡｂｓ／ｍｉｎ）を得るには、グルコース
デヒドロゲナーゼ０．８ｕ／ｍＬ添加のときで、阻害剤
ホウ酸の添加量は１６０ｍＭ程度に調節される。本発明
の方法に使用されるＮＡＤもしくはＮＡＤＰの添加量
は、試料中のグルコース量（濃度）に相応して適宜変更
される。例えば、グルコース１ｇ／ｄＬの標準液を検体
として測定した場合において、ＮＡＤは３ｍＭ以上含ま
れているのが好都合であることを本発明者は確認してい
る。また、本発明に係る反応系および定量用試薬に使用
する緩衝液としては、酵素による定量技術において通常
使用されている緩衝液であれば、いずれも利用可能であ
る。緩衝液には、周知の各種の安定剤、賦活剤などを同
時に添加することも可能である。
ドロゲナーゼを用いたグルコースの定量法は、グルコー
スを含有する試料にグルコースデヒドロゲナーゼを作用
させると、同時に、その系に共存する補酵素のＮＡＤも
しくはＮＡＤＰが水素還元されてＮＡＤＨもしくはＮＡ
ＤＰＨが生じるが、そのときのＮＡＤＨ量（濃度）もし
くはＮＡＤＰＨ量（濃度）の増加速度を例えば紫外部に
おける吸光度の時間変化値にて測定するというものであ
る。そして、本発明の特徴的な事項は、グルコースデヒ
ドロゲナーゼ阻害剤としてホウ酸もしくはその塩を用い
て、グルコースデヒドロゲナーゼのグルコースに対する
反応を拮抗阻害させることにより、グルコースデヒドロ
ゲナーゼのグルコースに対する見かけのＫｍ値をより大
きな値に変え、高濃度のグルコースを含有する検体であ
っても、希釈を必要とせずに、グルコースの正確な定量
を可能にした点にある。本発明の方法の実施にあたり、
酵素グルコースデヒドロゲナーゼの濃度並びに阻害剤ホ
ウ酸もしくはその塩の濃度は、各々、試料中に含まれる
基質グルコースの濃度により決定される。すなわち、高
濃度のグルコースを含む検体の定量において見かけのＫ
ｍ値を適当な基準にまで高めるべく、酵素および阻害剤
の添加量はそれぞれ調節され、通常、ＮＡＤＨもしくは
ＮＡＤＰＨの紫外部吸収の測定に用いる吸光度計の実行
感度（つまり、単位時間当たりの吸光度の変化値ΔＡｂ
ｓ／ｍｉｎ）に基づいて、最適な条件が設定される。一
例を挙げると、グルコース１ｇ／ｄＬの標準液を用い、
実行感度（ΔＡｂｓ／ｍｉｎ）を得るには、グルコース
デヒドロゲナーゼ０．８ｕ／ｍＬ添加のときで、阻害剤
ホウ酸の添加量は１６０ｍＭ程度に調節される。本発明
の方法に使用されるＮＡＤもしくはＮＡＤＰの添加量
は、試料中のグルコース量（濃度）に相応して適宜変更
される。例えば、グルコース１ｇ／ｄＬの標準液を検体
として測定した場合において、ＮＡＤは３ｍＭ以上含ま
れているのが好都合であることを本発明者は確認してい
る。また、本発明に係る反応系および定量用試薬に使用
する緩衝液としては、酵素による定量技術において通常
使用されている緩衝液であれば、いずれも利用可能であ
る。緩衝液には、周知の各種の安定剤、賦活剤などを同
時に添加することも可能である。
【０００９】
【実施例】以下、本発明の最良の実施形態と思われる実
施例を説明することにより、本発明をより明確なものに
する。
施例を説明することにより、本発明をより明確なものに
する。
【００１０】本例は、実際の臨床検体（希釈しない尿）
の代わりに、濃度既知のグルコース標準液各種を対象と
して酵素グルコースデヒドロゲナーゼをＮＡＤとともに
作用させ、生じるＮＡＤＨの濃度を紫外部における単位
時間当たりの吸光度変化値（ΔＡｂｓ／ｍｉｎ）で以っ
て表わすことにより、グルコース濃度と酵素の反応速度
との関係を調べたものである。両者の間に一次関数の関
係が現われているとき、グルコース濃度の正確な測定が
可能であると認められる。 −標準試料 グルコース濃度１〜１０ｇ／ｄＬの標準液１０種を作製
した。これら標準液は、１ｇ／ｄＬより、１ｇ／ｄＬの
等間隔で濃度が増加する１０種の試料よりなる。最もグ
ルコース濃度が高い標準液は、１０ｇ／ｄＬの標準液で
ある。 −試薬 次の組成より成る試薬１ａ、１ｂおよび１ｃ（阻害剤試
薬）と、試薬２ａおよび２ｂ（酵素試薬）をそれぞれ作
製した。 上記の各濃度に必要な量のホウ酸および塩化ナトリウム
をそれぞれ、１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチルアミ
ノメタン）緩衝液に溶解し、次いで希塩酸を添加して、
最終ｐＨが８．０になるように調製した。 上記の各濃度に必要な量のホウ酸ナトリウムおよび塩化
ナトリウムをそれぞれ、１００ｍＭトリス（ヒドロキシ
メチルアミノメタン）緩衝液に溶解し、次いで希塩酸を
添加して、最終ｐＨが８．０になるように調製した。試
薬１ｃ（比較）：塩化ナトリウム ５００ｍＭ上記の
各濃度に必要な量の塩化ナトリウムを１００ｍＭトリス
（ヒドロキシメチルアミノメタン）緩衝液に溶解し、次
いで希塩酸を添加して、最終ｐＨが８．０になるように
調製した。 試薬２ａ： グルコースデヒドロゲナーゼ ３．３ｕ／ｍＬ 塩化ナトリウム ５００ｍＭ ＮＡＤ ４０ｍＭ 上記の各含有量に必要な量のグルコースデヒドロゲナー
ゼ、塩化ナトリウムおよびＮＡＤをそれぞれ、１００ｍ
Ｍトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）緩衝液に溶
解し、次いで希塩酸を添加して、最終ｐＨが８．０にな
るように調製した。 試薬２ｂ（比較）：グルコースデヒドロゲナーゼ ０．４ｕ／ｍＬ 塩化ナトリウム ５００ｍＭ ＮＡＤ ４０ｍＭ 上記の各含有量に必要な量のグルコースデヒドロゲナー
ゼ、塩化ナトリウムおよびＮＡＤをそれぞれ、１００ｍ
Ｍトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）緩衝液に溶
解し、次いで希塩酸を添加して、最終ｐＨが８．０にな
るように調製した。 −測定 試薬１ａまたは１ｂと試薬２ａとを自動分析装置Ｈ７１
５０形（株式会社日立製作所製）に組み入れ、反応速度
法に従いグルコースの定量を行なった。すなわち、グル
コースの各標準液１０μＬに３００μＬの試薬１ａまた
は１ｂを添加し、３７℃で５分間加温した後、さらに１
００μＬの試薬２ａを添加し、紫外部（３４０ｎｍ）に
おける単位時間当たりの吸光度変化値（ΔＡｂｓ／ｍｉ
ｎ）を測定した。また、比較のため、試薬１ａ、１ｂに
代えて試薬１ｃ、また試薬２ａに代えて試薬２ｂを用い
て、上記と同様の操作を行ない、グルコース濃度（ｇ／
ｄＬ）と紫外部（３４０ｎｍ）における単位時間（毎
分）当たりの吸光度変化値（ΔＡｂｓ／ｍｉｎ）との関
係を調べた。
の代わりに、濃度既知のグルコース標準液各種を対象と
して酵素グルコースデヒドロゲナーゼをＮＡＤとともに
作用させ、生じるＮＡＤＨの濃度を紫外部における単位
時間当たりの吸光度変化値（ΔＡｂｓ／ｍｉｎ）で以っ
て表わすことにより、グルコース濃度と酵素の反応速度
との関係を調べたものである。両者の間に一次関数の関
係が現われているとき、グルコース濃度の正確な測定が
可能であると認められる。 −標準試料 グルコース濃度１〜１０ｇ／ｄＬの標準液１０種を作製
した。これら標準液は、１ｇ／ｄＬより、１ｇ／ｄＬの
等間隔で濃度が増加する１０種の試料よりなる。最もグ
ルコース濃度が高い標準液は、１０ｇ／ｄＬの標準液で
ある。 −試薬 次の組成より成る試薬１ａ、１ｂおよび１ｃ（阻害剤試
薬）と、試薬２ａおよび２ｂ（酵素試薬）をそれぞれ作
製した。 上記の各濃度に必要な量のホウ酸および塩化ナトリウム
をそれぞれ、１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチルアミ
ノメタン）緩衝液に溶解し、次いで希塩酸を添加して、
最終ｐＨが８．０になるように調製した。 上記の各濃度に必要な量のホウ酸ナトリウムおよび塩化
ナトリウムをそれぞれ、１００ｍＭトリス（ヒドロキシ
メチルアミノメタン）緩衝液に溶解し、次いで希塩酸を
添加して、最終ｐＨが８．０になるように調製した。試
薬１ｃ（比較）：塩化ナトリウム ５００ｍＭ上記の
各濃度に必要な量の塩化ナトリウムを１００ｍＭトリス
（ヒドロキシメチルアミノメタン）緩衝液に溶解し、次
いで希塩酸を添加して、最終ｐＨが８．０になるように
調製した。 試薬２ａ： グルコースデヒドロゲナーゼ ３．３ｕ／ｍＬ 塩化ナトリウム ５００ｍＭ ＮＡＤ ４０ｍＭ 上記の各含有量に必要な量のグルコースデヒドロゲナー
ゼ、塩化ナトリウムおよびＮＡＤをそれぞれ、１００ｍ
Ｍトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）緩衝液に溶
解し、次いで希塩酸を添加して、最終ｐＨが８．０にな
るように調製した。 試薬２ｂ（比較）：グルコースデヒドロゲナーゼ ０．４ｕ／ｍＬ 塩化ナトリウム ５００ｍＭ ＮＡＤ ４０ｍＭ 上記の各含有量に必要な量のグルコースデヒドロゲナー
ゼ、塩化ナトリウムおよびＮＡＤをそれぞれ、１００ｍ
Ｍトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）緩衝液に溶
解し、次いで希塩酸を添加して、最終ｐＨが８．０にな
るように調製した。 −測定 試薬１ａまたは１ｂと試薬２ａとを自動分析装置Ｈ７１
５０形（株式会社日立製作所製）に組み入れ、反応速度
法に従いグルコースの定量を行なった。すなわち、グル
コースの各標準液１０μＬに３００μＬの試薬１ａまた
は１ｂを添加し、３７℃で５分間加温した後、さらに１
００μＬの試薬２ａを添加し、紫外部（３４０ｎｍ）に
おける単位時間当たりの吸光度変化値（ΔＡｂｓ／ｍｉ
ｎ）を測定した。また、比較のため、試薬１ａ、１ｂに
代えて試薬１ｃ、また試薬２ａに代えて試薬２ｂを用い
て、上記と同様の操作を行ない、グルコース濃度（ｇ／
ｄＬ）と紫外部（３４０ｎｍ）における単位時間（毎
分）当たりの吸光度変化値（ΔＡｂｓ／ｍｉｎ）との関
係を調べた。
【００１１】−結果 測定の結果を図１にまとめて示す。図１中、○印は、阻
害剤としてホウ酸を使用した場合を表わし、△印は、阻
害剤としてホウ酸ナトリウムを使用した場合を表わし、
そして×印は、阻害剤を使用しない場合を表わす。図１
よりわかるように、阻害剤を添加した反応系と添加しな
い反応系とを対比することにより、阻害剤としてホウ酸
もしくはホウ酸ナトリウムを添加した反応系にあって
は、グルコース濃度（ｇ／ｄＬ）と単位時間当たりの吸
光度変化値（ΔＡｂｓ／ｍｉｎ）との間に、精度のよい
一次関数の関係が認められる。従って、酵素グルコース
デヒドロゲナーゼの拮抗阻害剤としてホウ酸もしくはホ
ウ酸ナトリウムを用いる測定法により、１〜１０ｇ／ｄ
Ｌのグルコース濃度が高い検体であっても、希釈せず
に、感度良く、グルコースの正確な定量が可能であるこ
とが判明した。
害剤としてホウ酸を使用した場合を表わし、△印は、阻
害剤としてホウ酸ナトリウムを使用した場合を表わし、
そして×印は、阻害剤を使用しない場合を表わす。図１
よりわかるように、阻害剤を添加した反応系と添加しな
い反応系とを対比することにより、阻害剤としてホウ酸
もしくはホウ酸ナトリウムを添加した反応系にあって
は、グルコース濃度（ｇ／ｄＬ）と単位時間当たりの吸
光度変化値（ΔＡｂｓ／ｍｉｎ）との間に、精度のよい
一次関数の関係が認められる。従って、酵素グルコース
デヒドロゲナーゼの拮抗阻害剤としてホウ酸もしくはホ
ウ酸ナトリウムを用いる測定法により、１〜１０ｇ／ｄ
Ｌのグルコース濃度が高い検体であっても、希釈せず
に、感度良く、グルコースの正確な定量が可能であるこ
とが判明した。
【００１２】
【発明の効果】以上説明したように、本発明の方法によ
れば、とくに臨床領域においてグルコースの定量を行な
うとき、グルコースの測定可能な濃度範囲が広く、高い
濃度域にまで及び、たとえ高濃度グルコース検体であっ
ても、希釈せずに正確な定量が可能であるという効果が
得られる。例えば重篤な糖尿病もしくは腎障害などを患
う患者の尿検体をも、希釈しないで、グルコース濃度の
正確な測定を為しうる。さらに、本発明の方法は、その
実施にあたって特別な装置および設備が不要であり、汎
用する自動分析機への適用性にも優れているという利点
を有する。また、本発明のグルコース定量用試薬によれ
ば、上記の本発明に係るグルコース定量方法に好適に使
用することができるところの試薬組成物が提供される。
れば、とくに臨床領域においてグルコースの定量を行な
うとき、グルコースの測定可能な濃度範囲が広く、高い
濃度域にまで及び、たとえ高濃度グルコース検体であっ
ても、希釈せずに正確な定量が可能であるという効果が
得られる。例えば重篤な糖尿病もしくは腎障害などを患
う患者の尿検体をも、希釈しないで、グルコース濃度の
正確な測定を為しうる。さらに、本発明の方法は、その
実施にあたって特別な装置および設備が不要であり、汎
用する自動分析機への適用性にも優れているという利点
を有する。また、本発明のグルコース定量用試薬によれ
ば、上記の本発明に係るグルコース定量方法に好適に使
用することができるところの試薬組成物が提供される。
【図１】図１は、試料中のグルコース濃度と該試料につ
いて３４０ｎｍにて測定された単位時間当たりの吸光度
変化値（ΔＡｂｓ／ｍｉｎ）との関係を示すグラフであ
る。
いて３４０ｎｍにて測定された単位時間当たりの吸光度
変化値（ΔＡｂｓ／ｍｉｎ）との関係を示すグラフであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 合田 保 茨城県笠間市稲田字弥六内３−５ 株式会 社カイノス笠間研究所内 Ｆターム(参考） 2G045 AA16 AA25 BB60 CB03 DA31 FA11 FA27 FB01 GC10 GC30 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ64 QQ68 QR04 QR42 QR50 QR65 QR67 QX01
Claims (2)
- 【請求項１】酵素グルコースデヒドロゲナーゼを用いて
試料中のグルコースを定量する方法であって、グルコー
スを含有する試料に、グルコースデヒドロゲナーゼ阻害
剤としてホウ酸もしくはその塩の存在下、補酵素として
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートとともに
グルコースデヒドロゲナーゼを作用させ、その際生成す
る還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしく
は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフ
ェートの量増加速度を測定することを特徴とする、グル
コースの定量方法。 - 【請求項２】酵素グルコースデヒドロゲナーゼ、補酵素
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートおよびグ
ルコースデヒドロゲナーゼ阻害剤ホウ酸もしくはその塩
を含有する溶液よりなる、グルコース定量用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11401499A JP4217815B2 (ja) | 1999-03-17 | 1999-03-17 | グルコースデヒドロゲナーゼによるグルコースの定量方法およびグルコース定量用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| JP11401499A JP4217815B2 (ja) | 1999-03-17 | 1999-03-17 | グルコースデヒドロゲナーゼによるグルコースの定量方法およびグルコース定量用試薬 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000262299A true JP2000262299A (ja) | 2000-09-26 |
| JP4217815B2 JP4217815B2 (ja) | 2009-02-04 |
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ID=14626902
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP11401499A Expired - Fee Related JP4217815B2 (ja) | 1999-03-17 | 1999-03-17 | グルコースデヒドロゲナーゼによるグルコースの定量方法およびグルコース定量用試薬 |
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| JP (1) | JP4217815B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006107094A1 (ja) * | 2005-03-31 | 2006-10-12 | Shino-Test Corporation | グルコースの測定方法及び測定試薬 |
| JP2012211810A (ja) * | 2011-03-31 | 2012-11-01 | Cci Corp | 測定精度を向上させたバイオセンサ |
| CN103088108A (zh) * | 2012-11-16 | 2013-05-08 | 李立和 | 葡萄糖脱氢酶法检测葡萄糖的试剂盒及制备方法 |
| CN110726842A (zh) * | 2018-07-17 | 2020-01-24 | 上海瀚联诊断科技有限公司 | 一种葡萄糖质控液 |
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|---|---|---|---|---|
| JP5808616B2 (ja) * | 2011-09-01 | 2015-11-10 | 株式会社Ｌｓｉメディエンス | 干渉物質の影響を抑制する方法 |
-
1999
- 1999-03-17 JP JP11401499A patent/JP4217815B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| WO2006107094A1 (ja) * | 2005-03-31 | 2006-10-12 | Shino-Test Corporation | グルコースの測定方法及び測定試薬 |
| JP5286511B2 (ja) * | 2005-03-31 | 2013-09-11 | 株式会社シノテスト | グルコースの測定方法及び測定試薬 |
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| JP4217815B2 (ja) | 2009-02-04 |
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