JP5808616B2 - 干渉物質の影響を抑制する方法 - Google Patents

Description

本発明は、干渉物質の影響を抑制し、生体成分を測定する試薬及び方法に関する。

臨床検査では、しばしば、乳び、溶血、ビリルビンを高濃度に含む検体を測定する場合があるが、これらの干渉物質により測定値に誤差を生じる場合がある。例えば、ビュレット法を用いた総タンパク質の定量試薬では、これらの干渉物質の色調が測定波長と重なるため誤差を生じる。

現在の臨床検査の分野で普及している自動分析装置では、測定に関与する成分を第１試薬、第２試薬の２つに分けることができる。このような方法は２試薬系とよばれる。２試薬系においては、第１試薬を用いて試薬盲検の吸光度を測定し、次に第２試薬を加えて測定した吸光度から試薬盲検吸光度を差し引いて測定することにより、検体中の乳び、溶血等の色調による干渉物質の影響が回避できる。

しかしながら、２試薬系の試薬においても影響を回避できない場合がある。
例えば、第１試薬のｐＨと、第１試薬と第２試薬混合後のｐＨが異なることにより、測定波長での吸光度が変化してしまうような物質は２試薬系においてもその影響を回避することができない。

このような試薬として、ヘキソキナーゼ（以下ＨＫと略する。）またはグルコキナーゼ（以下ＧｌｃＫと略する。）とグルコース−６−リン酸脱水素酵素（以下Ｇ６ＰＤＨと略する。）を用い、生成する還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下ＮＡＤＰＨと略する。）の３４０ｎｍの吸光度変化を測定する、グルコース測定用試薬（特許文献１）がある。この測定用試薬では、第１試薬のｐＨが７．５〜９．５であり、第２試薬のｐＨが３〜５であり、液状試薬にした場合、試薬中性分の安定性、各酵素の至適ｐＨの観点から第１試薬、第２試薬のｐＨを全く同じくすることは困難であると考えられている。
ここでＨＫまたはＧｌｃＫを用いたグルコース測定用試薬の反応式は以下の通りである。

前記の式中でＡＴＰはアデノシン−５’−三リン酸、ＡＤＰはアデノシン−５’−二リン酸、ＮＡＤＰ^＋は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸である。

本発明者は、本明細書の実施例でも説明するが、非ステロイド性抗炎症薬としてよく用いられるアセチルサリチル酸の代謝物であるサリチル尿酸が検体に存在すると、ＨＫを用いたグルコース測定用試薬では、試薬ｐＨの変化でグルコース非依存的に測定波長である３４０ｎｍの吸光度がサリチル尿酸により変化し、グルコースの測定誤差を生じてしまうことを見出した。更に、サリチル尿酸がｐＨ６．５〜９．０付近でｐＨの上昇に伴いＨＫまたはＧｌｃＫを用いたグルコース測定用試薬の測定波長である３４０ｎｍ付近の吸光度が増大することを突き止めた。

このような物質では第１試薬反応時のｐＨと第２試薬混合後のｐＨが、第１試薬＞第１試薬＋第２試薬であるような試薬では負誤差、第１試薬＜第１試薬＋第２試薬であるような試薬では正誤差を生じることとなる。

グルコース測定においては糖尿病のスクリーニング検査として尿中のグルコース濃度の測定は重要であるが、サリチル尿酸は主に尿中に排泄されるために、尿中では高濃度となり、より顕著に測定誤差を生じることとなり、正確な診断の妨げとなる。

特許第３３１０２９５号明細書

従って、本発明の課題は、ｐＨ変化により吸収スペクトルが変化するような干渉物質の影響を回避した試薬を提供することにある。

本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、試薬ｐＨの変化により吸収スペクトルが変化するような干渉物質の影響を回避した試薬組成を見出した。

すなわち、本発明は、以下の発明を提供する：
［１］３４０ｎｍを検出波長とすることが可能であり、検体と第１試薬との混合後の吸光度と、更に第２試薬を混合後の吸光度測定を行い、少なくとも前記２つの吸光度差より定量を行う生体成分の測定用試薬であって、第１試薬のｐＨと、第１試薬と第２試薬混合時のｐＨの差が０．１５以内であることを特徴とする、生体成分の測定試薬。
［２］第１試薬のｐＨと、第１試薬と第２試薬混合時のｐＨの差が０．１０以内である、［１］の生体成分の測定試薬。
［３］第１試薬のｐＨが６．０〜９．５である、［１］又は［２］の生体成分の測定試薬。
［４］前記生体成分が、グルコース、総コレステロール、中性脂肪、又は無機リンである、［１］〜［３］のいずれかの生体成分の測定試薬。
［５］ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼを用いる、［１］〜［４］のいずれかのグルコース測定試薬。
［６］３４０ｎｍを検出波長とすることが可能であり、検体と第１試薬との混合後の吸光度と、更に第２試薬を混合後の吸光度測定を行い、少なくとも前記２つの吸光度差より定量を行う生体成分の測定方法であって、第１試薬のｐＨと、第１試薬と第２試薬混合時のｐＨの差が０．１５以内であることを特徴とする、ｐＨ依存的な吸光度変化を起こす干渉物質の影響を抑制する方法。
［７］第１試薬のｐＨと、第１試薬と第２試薬混合時のｐＨの差が０．１０以内である、［７］の方法。
［８］第１試薬のｐＨが６．０〜９．５である、［６］又は［７］の方法。
［９］前記生体成分が、グルコース、総コレステロール、中性脂肪、又は無機リンである、［６］〜［８］のいずれかの方法。
［１０］干渉物質がサリチル尿酸である、［６］〜［９］のいずれかの方法。
［１１］ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼを用いる、［６］〜［１０］のいずれかのグルコース測定方法。

本発明の試薬及び方法を用いることにより、容易に干渉物質の影響を抑制し、高精度に生体成分を測定することができる。このことにより、臨床検査の場において、薬剤などの影響を受けず、誤差を含まない正確な生体成分の測定値を提供することができる。

各ｐＨにおけるサリチル尿酸の吸収スペクトルを示すグラフである。 各ｐＨにおけるサリチル尿酸の３４０ｎｍ吸光度を示すグラフである。

本発明は、３４０ｎｍを検出波長とすることが可能であり、検体と第１試薬との混合後の吸光度と、更に第２試薬を混合後の吸光度測定を行い、少なくとも前記２つの吸光度差より定量を行う生体成分の測定方法に利用可能である。
本発明の吸光度の測定波長は、検体中の測定対象の生体成分以外の吸光度に影響を与える干渉物質が、ｐＨの変化により測定値に影響を与える該測定波長であれば良いが、本発明は３４０ｎｍを測定波長とする生体成分の測定方法に使用できるので好ましい。
本発明の試薬は、第１試薬のｐＨと、第１試薬と第２試薬混合時のｐＨの差が０．１５以内であれば良く、好ましくは０．１０以内、特に好ましくは０．０５以内である。このようにすることで、干渉物質の影響を抑制することができる。

本明で使用できる検体は、前記干渉物質を含む可能性があれば限定しないが、尿、血液（全血・血清・血漿）が挙げられる。特に、尿はサリチル尿酸などの薬物の代謝物である干渉物質の影響が起こりやすいため好ましい。

本発明で測定できる生体成分は、３４０ｎｍを検出波長とすることが可能であり、検体と第１試薬との混合後の吸光度と、更に第２試薬を混合後の吸光度測定を行い、少なくとも前記２つの吸光度差より定量を行えるものであり、前記干渉物質を含む可能性があるものである。具体的には、グルコース、総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）、中性脂肪（トリグリセライド：ＴＧ）、無機リン（ＩＰ）等が挙げられる。
特にヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼを用いるグルコース測定は、ｐＨを変更することが難しいと考えられていたため、本発明の効果が適用できることは好ましい。

本発明の測定試薬は、少なくとも第１試薬のｐＨと、第１試薬と第２試薬混合時のｐＨの差が小さければ良く、そのように試薬を調製すること以外は、公知の測定試薬と同様に実施することができる。以下、ＨＫまたはＧｌｃＫを用いた２試薬系で行うグルコース測定用試薬を例として、具体的に説明する。

第１試薬としては、好ましくは２５℃前後のｐＨが６．０〜９．５、より好ましくはｐＨ６．５〜８．０に緩衝能を持つ緩衝剤を含む。このような緩衝剤としては、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下Ｔｒｉｓと略する。）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（以下ＨＥＰＥＳと略する。）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、Ｂｉｓ（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸、２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸、２−モルフォリノエタンスルホン酸、３−モルフォリノプロパンスルホン酸、２−ヒドロキシ−３−モルフォリノプロパンスルホン酸、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸、２−ヒドロキシ−Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン等が挙げられるが、これに限定されるものではない。当業者であれば過度な試行錯誤なく、第１試薬と第２試薬の組み合わせにおいて、第１試薬のｐＨと、第１試薬と第２試薬混合時のｐＨ差が０．１５以下となるような緩衝剤濃度、ｐＨを選択することができる。

第１試薬としては、例えば、緩衝剤、ＨＫまたはＧｌｃＫ、Ｇ６ＰＤＨ、ＡＴＰ、ＮＡＤＰ^＋または酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤ^＋と略する。）、マグネシウム塩等を含むことができる。さらに、試薬構成成分中のｐＨを変動させる成分の影響を回避するために、例えば、カルシウム、アルミニウム、マグネシウム、コバルト、銅、鉄、ランタン、マンガン、亜鉛、ストロンチウム、ニッケル等の塩を適宜加えることができる。その他、必要に応じて界面活性剤、防腐剤、キレート剤、塩類等を適宜加えることができる。緩衝剤濃度としては、第１試薬は、２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、更に好ましくは、１００ｍｍｏｌ／Ｌ以上である。

第２試薬としては、例えば、緩衝剤、ＨＫまたはＧｌｃＫ、Ｇ６ＰＤＨ、ＡＴＰ、ＮＡＤＰ^＋またはＮＡＤ^＋、マグネシウム塩等を含むことができ、さらに必要に応じて界面活性剤、防腐剤、キレート剤、塩類等を含むことができる。緩衝剤濃度としては、第２試薬は、１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは２０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。

第１試薬あるいは第２試薬の構成は、当業者であれば、目的に応じて適宜設定することができる。例えば、反応に必要な成分の内、少なくとも１つの必須成分を第１試薬から除き、同必須成分を第２試薬に含有させるように、構成させることができる。

本発明の試薬は、本発明の方法に使用することができる。
すなわち、検体と前記第１試薬との混合後の吸光度と、更に前記第２試薬を混合後の吸光度測定を行い、少なくとも前記２つの吸光度差より定量を行い、容易に干渉物質の影響を抑制し、高精度に生体成分を測定することができる。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

《実施例１：サリチル尿酸の影響の確認》
ヘキソキナーゼを利用したエンドポイント法によるグルコース測定試薬において、サリチル尿酸の影響を確認した。比較例として、特許第３３１０２９５号明細書に開示されている組成を使用し、実施例として、第１試薬ｐＨと第１試薬と第２試薬混合後のｐＨ差を無くした組成を用意した。
尿中のサリチル尿酸は、例えば、アスピリン服用後３時間で約４ｍｍｏｌ／Ｌ存在し、その後減少していくことがわかっている。よって、４ｍｍｏｌ／Ｌサリチル尿酸の存在下でも精度良く測定できるか検討した。

（１）試薬調製
以下の組成の第１試薬および第２試薬を調製した。
第１試薬
１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）
５０ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化カリウム
２．５ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化マグネシウム
２．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ
２．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ
１．５Ｕ／ｍＬ ＨＫ
１．２Ｕ／ｍＬ Ｇ６ＰＤＨ
第２試薬
２５ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸マグネシウム（ｐＨ６．５）
２．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ
８ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＡＤＰ^＋

比較例として特許第３３１０２９５号明細書に開示されている下記の処方の試薬を調製した。
第１試薬
６２．５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９．０）
３１．２５ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化カリウム
１８．２５ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化マグネシウム
２．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ
２．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ
１Ｕ／ｍＬ ＧｌｃＫ
１Ｕ／ｍＬ Ｇ６ＰＤＨ
第２試薬
１２０ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）
２．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ
２．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＡＤＰ^＋

（２）試薬ｐＨの測定
実施例および比較例の各第１試薬の２５℃におけるｐＨと、実施例及び比較例の各第１試薬２．４ｍＬにそれぞれの第２試薬０．６ｍＬを混合したものの２５℃におけるｐＨを測定した。測定結果を表１に示す。

（３）サリチル尿酸の影響
前記（１）で調製した、実施例および比較例の各々の第１試薬および第２試薬を測定に用いた。測定操作は、まず、検体２μＬに第１試薬２４０μＬを加え、３７℃で４分間加温した後、主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍで吸光度（第１点目）を測定した。さらに、３７℃で１分間加温後、第２試薬６０μＬを加え、３７℃で４分間保温した後に、主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍで吸光度（第２点目）を測定し、第２点目と第１点目の吸光度変化量を求めた。あらかじめ検体に生理食塩水と既知濃度（２００ｍｇ／ｄＬ）のグルコース水溶液を用い、上記方法により検量線を作成した。次にグルコース濃度を求めたい検体を測定し、作成した検量線よりグルコース濃度を求めた。検体としては、２０ｍｇ／ｄＬのグルコースを含むサリチル尿酸無添加尿で、２０ｍｇ／ｄＬのグルコースを含むサリチル尿酸添加尿（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）を５段階希釈したものを用いた。

グルコース濃度の測定結果を表２に示す。第１試薬ｐＨと、第１試薬と第２試薬混合後のｐＨ差が少ない実施例の試薬では、比較例に対し、サリチル尿酸の影響が顕著に軽減した。

サリチル尿酸の影響の原因を調べるために、１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ９．０、８．５、８．０、７．５、７．０、６．５）溶液２．４ｍＬに１０ｍｍｏｌ／Ｌサリチル尿酸０．０４ｍＬを添加し、吸収スペクトルを測定した。
各ｐＨにおけるサリチル尿酸の吸収スペクトルを図１に、各ｐＨにおけるサリチル尿酸の３４０ｎｍ吸光度を図２に示す。
サリチル尿酸が混在することで、グルコース濃度に非依存的な吸光度の変化が起きてしまうこと、更に、それはサリチル尿酸がｐＨによって測定波長での吸光度が変化してしまうため、第１試薬ｐＨと、第１試薬と第２試薬混合後のｐＨの差が大きいと、非依存的な吸光度の変化が起きてしまうことが判った。

《実施例２：第１試薬ｐＨと、第１試薬と第２試薬混合後のｐＨの差の検討》
実施例１の実施例の条件の内、第２試薬のｐＨを表３に示すように４Ｎ水酸化ナトリウムで調製したこと以外は、実施例の条件と同様に行った。
表３に第１試薬（Ｒ１）と第２試薬（Ｒ２）混合後のｐＨと、第１試薬とのｐＨの差を示す。
また、それぞれの条件下でのグルコース濃度の測定結果を表４に示す。ｐＨ差が、−０．０４９では、サリチル尿酸が４ｍｍｏｌ／Ｌ混在していても誤差無く正確に測定することができ、更に１０ｍｍｏｌ／Ｌ混在していても、約５％の誤差範囲で精度良く測定できることが判った。また、ｐＨ差が、−０．０８では、サリチル尿酸が４ｍｍｏｌ／Ｌ混在していても、約５％の誤差範囲で精度良く測定でき、更に、８ｍｍｏｌ／Ｌ混在していても、約１０％の誤差範囲で精度良く測定できることが判った。また、ｐＨ差が、−０．１３６では、サリチル尿酸が２ｍｍｏｌ／Ｌ混在していても、約５％の誤差範囲で精度良く測定でき、更に、６ｍｍｏｌ／Ｌ混在していても、約１０％の誤差範囲で精度良く測定できることが判った。

本発明の生体成分の測定試薬（例えば、グルコース測定用試薬）を用いると、サリチル尿酸の様な生体成分の測定値に干渉を与える物質を含む検体においても正確な測定を行えるようになり、より正確な診断に寄与することができる。

Claims (7)

1. ３４０ｎｍを検出波長として、サリチル尿酸を含む検体と第１試薬との混合後の吸光度と、更に第２試薬を混合後の吸光度測定を行い、少なくとも前記２つの吸光度差より定量を行うグルコース測定試薬であって、ｐＨ依存的な吸光度変化を起こす干渉物質の影響を抑制するグルコース測定試薬であり、第１試薬のｐＨと、第１試薬と第２試薬混合時のｐＨの差が０．１５以内であり、前記干渉物質がサリチル尿酸であり、ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼを用いることを特徴とする、グルコース測定試薬。
2. ３４０ｎｍを検出波長として、サリチル尿酸を含む検体と第１試薬との混合後の吸光度と、更に第２試薬を混合後の吸光度測定を行い、少なくとも前記２つの吸光度差より定量を行うグルコース測定試薬であって、ｐＨ依存的な吸光度変化を起こす干渉物質の影響を抑制するグルコース測定試薬であり、第１試薬のｐＨと、第１試薬と第２試薬混合時のｐＨの差が０．１５以内であり、前記干渉物質がサリチル尿酸であり、ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼを用いることを特徴とする、グルコース測定試薬（但し、第１試薬及び第２試薬のｐＨが７．５であり、且つ、下記理化学的性質（Ａ）〜（Ｄ）を有するクロベロマイセス・フラジリスＩＦＯ １７７７菌株由来のヘキソキナーゼを含む測定試薬を除く：
   （Ａ）安定性；３７℃、７日間において、少なくとも８０％以上の残存活性を有する。
   （Ｂ）基質特異性；グルコース、フラクトースに対して高い反応性を示し、グルコースに対する反応性を１００％としたとき、フラクトースに対する反応度合いは１８９．４である。
   （Ｃ）分子量；６０，０００（ゲル濾過クロマトグラフィー）
   （Ｄ）等電点；ＰＩ＝４．７０（クロマトフォーカシング））。
3. 第１試薬のｐＨと、第１試薬と第２試薬混合時のｐＨの差が０．１０以内である、請求項１又は２に記載のグルコース測定試薬。
4. 第１試薬のｐＨが６．０〜９．５である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のグルコース測定試薬。
5. ３４０ｎｍを検出波長として、サリチル尿酸を含む検体と第１試薬との混合後の吸光度と、更に第２試薬を混合後の吸光度測定を行い、少なくとも前記２つの吸光度差より定量を行うグルコース測定において、ｐＨ依存的な吸光度変化を起こす干渉物質の影響を抑制するグルコース測定方法であって、第１試薬のｐＨと、第１試薬と第２試薬混合時のｐＨの差が０．１５以内であり、前記干渉物質がサリチル尿酸であり、ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼを用いることを特徴とする、前記方法。
6. 第１試薬のｐＨと、第１試薬と第２試薬混合時のｐＨの差が０．１０以内である、請求項５に記載の方法。
7. 第１試薬のｐＨが６．０〜９．５である、請求項５又は６に記載の方法。

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