JP5955220B2 - 糖化ヘモグロビンの測定方法 - Google Patents
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Description
[2] 過酸化水素の測定が、過酸化水素測定試薬により行われる、[1]記載の測定方法。
[3] 過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である[2]記載の測定方法。
[4] ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である[3]記載の測定方法。
[5] フェノチアジン系色原体が、10−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンである[4]記載の測定方法。
[8] 過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である[7]記載の測定試薬。
[9] ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である[8]記載の測定試薬。
[10] フェノチアジン系色原体が、10−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンである[9]記載の測定試薬。
[13] ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である[12]記載の測定キット。
[14] フェノチアジン系色原体が、10−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンである[13]記載の測定キット。
[18] フェノチアジン系色原体が、10−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンである[17]記載の方法。
本発明の、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素とを、後述の一般式(I)で表わされるピリジニウム塩、後述の一般式(II)で表わされるホスホニウム塩、後述の一般式(III)で表わされるイミダゾリウム塩、及び、後述の一般式(IV)で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも1種の存在下に反応させ、得られる反応生成物にフルクトシルペプチド酸化酵素を作用させ、生成する過酸化水素を測定することを特徴とする方法である。
具体的には、以下の工程を含む測定方法である。
(2)工程(1)で得られる反応生成物にフルクトシルペプチド酸化酵素を作用させ、過酸化水素を生成させる工程;
(3)工程(2)で生成した過酸化水素を測定する工程;及び、
(4)既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン濃度との関係を表す検量線に、工程(3)で測定した過酸化水素量を照らし合わせて、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度を決定する工程。
(1)ヘモグロビン含有試料中の総ヘモグロビン(すなわち、ヘモグロビンと糖化ヘモグロビンを合わせた総ヘモグロビン)量を測定する工程;
(2)ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素とを、後述の一般式(I)で表わされるピリジニウム塩、後述の一般式(II)で表わされるホスホニウム塩、後述の一般式(III)で表わされるイミダゾリウム塩、及び、後述の一般式(IV)で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも1種を含む水性媒体中で反応させる工程;
(3)工程(2)で得られる反応生成物にフルクトシルペプチド酸化酵素を作用させ、過酸化水素を生成させる工程;
(4)工程(3)で生成した過酸化水素を測定する工程;
(5)既知量の糖化ヘモグロビンを用いて予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン量との関係を表す検量線に、工程(4)で測定した過酸化水素量を照らし合わせて、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量を測定する工程;及び、
(6)工程(1)で測定した総ヘモグロビン量と、工程(5)で測定した糖化ヘモグロビン量から、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量の総ヘモグロビン量に対する割合を算出する工程。
本発明の、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬は、タンパク質分解酵素、フルクトシルペプチド酸化酵素、及び、化合物(I)、化合物(II)、化合物(III)及び化合物(IV)からなる群より選ばれる少なくとも1種を含む試薬であり、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定方法に用いられる。本発明の測定試薬は、さらに、過酸化水素測定試薬を含んでいてもよい。
水性媒体としては、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。
本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬は、キットの形態で保存、流通及び使用されてよい。本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キットは、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法に用いられる。本発明の測定キットとしては、例えば2試薬系のキット、3試薬系のキット等が挙げられ、2試薬系キットが好ましい。
本発明は、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法に関する。本発明のロイコ型色原体含有水溶液の保存方法により、水溶液中でロイコ型色原体が安定に保存される。本発明において、ロイコ型色原体が水溶液中で安定に保存されるとは、水溶液中でロイコ型色原体が熱に対して安定であるか、又は、光に対して安定であることを意味するが、好ましくは、熱及び光に対して安定であることを意味する。本発明のロイコ型色原体含有水溶液の保存方法においては、化合物(I)、化合物(II)、化合物(III)及び化合物(IV)からなる群より選ばれる少なくとも1種が、ロイコ型色原体含有水溶液に添加される。化合物(I)、化合物(II)、化合物(III)及び化合物(IV)としては、前述の化合物(I)、化合物(II)、化合物(III)及び化合物(IV)が挙げられる。
尚、本実施例、比較例及び試験例においては、下記メーカーの試薬及び酵素を使用した。
第一試薬
Bis−Tris(pH6.0) 10mmol/L
C12py 2.0g/L
酢酸カルシウム1水和物 10mmol/L
サーモリシン 1200kU/L
DA−67 20μmol/L
第二試薬
ADA(pH7.0) 50mmol/L
FPOX−CE 12kU/L
ペルオキシダーゼ 120kU/L
第一試薬
Bis−Tris(pH6.0) 10mmol/L
C16py 0.35g/L
酢酸カルシウム1水和物 10mmol/L
サーモリシン 1200kU/L
DA−67 20μmol/L
第二試薬
ADA(pH7.0) 50mmol/L
FPOX−CE 12kU/L
ペルオキシダーゼ 120kU/L
第一試薬
Bis−Tris(pH6.0) 10mmol/L
C12TBP 0.8g/L
酢酸カルシウム1水和物 10mmol/L
サーモリシン 1200kU/L
DA−67 20μmol/L
第二試薬
ADA(pH7.0) 50mmol/L
FPOX−CE 12kU/L
ペルオキシダーゼ 120kU/L
第一試薬
Bis−Tris(pH6.0) 10mmol/L
C16TBP 0.2g/L
酢酸カルシウム1水和物 10mmol/L
サーモリシン 1200kU/L
DA−67 20μmol/L
第二試薬
ADA(pH7.0) 50mmol/L
FPOX−CE 12kU/L
ペルオキシダーゼ 120kU/L
第一試薬
Bis−Tris(pH6.0) 10mmol/L
C12MBI 0.5g/L
酢酸カルシウム1水和物 10mmol/L
サーモリシン 1200kU/L
DA−67 20μmol/L
第二試薬
ADA(pH7.0) 50mmol/L
FPOX−CE 12kU/L
ペルオキシダーゼ 120kU/L
第一試薬
Bis−Tris(pH6.0) 10mmol/L
フィレットQ 0.5g/L
酢酸カルシウム1水和物 10mmol/L
サーモリシン 1200kU/L
DA−67 20μmol/L
第二試薬
ADA(pH7.0) 50mmol/L
FPOX−CE 12kU/L
ペルオキシダーゼ 120kU/L
以下の第一試薬及び第二試薬からなるHbA1c測定用キットを調製した。
第一試薬
Bis−Tris(pH6.0) 10mmol/L
酢酸カルシウム1水和物 10mmol/L
サーモリシン 1200kU/L
DA−67 20μmol/L
第二試薬
ADA(pH7.0) 50mmol/L
FPOX−CE 12kU/L
ペルオキシダーゼ 120kU/L
実施例7における実施例1のキットの代わりに、比較例1のキットを用いる以外は実施例7と同様の方法により、各試料に対する反応吸光度を算出した。
第1図に示す通り、C12pyを含まない比較例1のキットにおいては、HbA1c濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出されないのに対して、C12pyを含む実施例1のキットにおいては、HbA1c濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出された。従って、実施例1のキットを用いることにより、試料中のHbA1cを測定できることが明らかとなった。
第2図に示す通り、C16pyを含まない比較例1のキットにおいては、HbA1c濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出されないのに対して、C16pyを含む実施例2のキットにおいては、HbA1c濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出された。従って、実施例2のキットを用いることにより、試料中のHbA1cを測定できることが明らかとなった。
第3図に示す通り、C12TBPを含まない比較例1のキットにおいては、HbA1c濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出されないのに対して、C12TBPを含む実施例3のキットにおいては、HbA1c濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出された。従って、実施例3のキットを用いることにより、試料中のHbA1cを測定できることが明らかとなった。
第4図に示す通り、C16TBPを含まない比較例1のキットにおいては、HbA1c濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出されないのに対して、C16TBPを含む実施例4のキットにおいては、HbA1c濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出された。従って、実施例4のキットを用いることにより、試料中のHbA1cを測定できることが明らかとなった。
第5図が示す通り、C12MBIを含まない比較例1のキットにおいては、HbA1c濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出されないのに対して、C12MBIを含む実施例5のキットにおいては、HbA1c濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出された。従って、実施例5のキットを用いることにより、試料中のHbA1cを測定できることが明らかとなった。
第6図が示す通り、フィレットQを含まない比較例1のキットにおいては、HbA1c濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出されないのに対して、フィレットQを含む実施例6のキットにおいては、HbA1c濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出された。従って、実施例6のキットを用いることにより、試料中のHbA1cを測定できることが明らかとなった。
第一試薬
MES(pH6.0) 10mmol/L
C16py 0.35g/L
酢酸カルシウム1水和物 10mmol/L
アクチナーゼAS 450kU/L
DA−67 20μmol/L
第二試薬
ADA(pH7.0) 50mmol/L
FPOX−CE 12kU/L
ペルオキシダーゼ 120kU/L
以下の第一試薬及び第二試薬からなるHbA1c測定用キットを調製した。
第一試薬
MES(pH6.0) 10mmol/L
酢酸カルシウム1水和物 10mmol/L
アクチナーゼAS 450kU/L
DA−67 20μmol/L
第二試薬
ADA(pH7.0) 50mmol/L
FPOX−CE 12kU/L
ペルオキシダーゼ 120kU/L
反応セルへ、各試料9.6μLと、実施例1のキットの第一試薬120μLとを添加し、37℃で5分間加温し(第一反応)、反応液の吸光度(E1)を主波長660nm、副波長800nmで測定し、次いでこの反応液に第二試薬40μLを添加しさらに37℃で5分間加温し(第二反応)、反応液の吸光度(E2)を主波長660nm、副波長800nmで測定し、E2からE1を差し引き、吸光度差△Eを算出した。各試料におけるHbA1c濃度と△Eとの関係を第7図に示す。
実施例14における実施例13のキットの代わりに、比較例3のキットを用いる以外は実施例14と同様の方法により、各試料に対する反応吸光度を算出した。
第7図に示す通り、C16pyを含まない比較例3のキットにおいては、HbA1c濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出されないのに対して、C16pyを含む実施例13のキットにおいては、HbA1c濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出された。従って、実施例13のキットを用いることにより、試料中のHbA1cを測定できることが明らかとなった。
第一試薬
Bis−Tris(pH7.0) 10mmol/L
C12py 1.6g/L
塩化カルシウム2水和物 10mmol/L
サーモリシン 1200kU/L
DA−67 20μmol/L
第二試薬
ADA(pH7.0) 50mmol/L
FPOX−CE 12kU/L
ペルオキシダーゼ 120kU/L
第一試薬
Bis−Tris(pH7.0) 10mmol/L
C12TBP 0.8g/L
塩化カルシウム2水和物 10mmol/L
サーモリシン 1200kU/L
DA−67 20μmol/L
第二試薬
ADA(pH7.0) 50mmol/L
FPOX−CE 12kU/L
ペルオキシダーゼ 120kU/L
第一試薬
Bis−Tris(pH7.0) 10mmol/L
C12MBI 0.9g/L
塩化カルシウム2水和物 10mmol/L
サーモリシン 1200kU/L
DA−67 20μmol/L
第二試薬
ADA(pH7.0) 50mmol/L
FPOX−CE 12kU/L
ペルオキシダーゼ 120kU/L
測定キットとして、総ヘモグロビン測定用キットであるヘモグロビンB−テストワコー(SLS−ヘモグロビン法)(和光純薬工業社製)を用いて、検体として、ヘモグロビンB−テストワコーに付属の標準品(ヘモグロビン濃度:15.3mg/mL)を用いて測定を行い、ヘモグロビン濃度と吸光度との関係を示す検量線を作成した。
ラテックス免疫凝集法によりHbA1c濃度が2.77μmol/L、6.33μmol/Lと値付けされている2つの血球画分について、実施例15のHbA1c測定用キットを用いて測定し、各血球画分に対する吸光度を測定した。当該血球画分の代わりに生理食塩水を用いて、生理食塩水に対するHbA1c濃度を測定した。当該血球画分に対するそれぞれの吸光度から、生理食塩水に対する吸光度を差し引いて算出した値を、当該血球画分に対するブランク補正吸光度とした。当該血球画分に対するブランク補正吸光度と、生理食塩水に対するブランク補正吸光度(0 Abs)とから、HbA1c濃度(μmol/L)と吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。
各試料に対して、25℃、3000rpmで5分間遠心分離を行い、血球画分を得た。各血球画分について、ヘモグロビンB−テストワコーを用いて測定し、得られた測定値と(1)の検量線とから、各血球画分中のヘモグロビン濃度(μmol/L)を決定した。
各血球画分について、本発明の測定キットを用いて測定し、得られた測定値と(2)の検量線とから、各血球画分中のHbA1c濃度(μmol/L)を決定した。
上記(3)で決定した各血球画分におけるヘモグロビン濃度(μmol/L)と、上記(4)で決定した各血球画分におけるHbA1c濃度(μmol/L)とから、以下の式により、日本糖尿病学会(Japan Diabetes Society;JDS)値のHbA1c(%)を算出した。
上記(5)でのHbA1c(%)の決定に使用した血球画分と同一の血球画分を用いて、各血球画分中のHbA1c(%)を、デタミナーL HbA1c(協和メデックス社製)を用いる免疫測定法により、デタミナーL HbA1cの添付文書に記載の方法に従って決定した。
本発明の測定方法を用いて、上記(5)で決定したHbA1c(%)と、免疫測定法を用いて、上記(6)で決定したHbA1c(%)とから、本発明の測定方法と免疫測定法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。
その結果、両測定法間の相関係数が0.994となり、両測定法間に良好な相関関係が認められた。従って、実施例15のキットを用いる本発明の測定方法により、試料中のHbA1cを正確に測定できることが明らかとなった。
以下の組成からなるDA−67含有水溶液を調製した。
<DA−67含有水溶液>
Bis−Tris(pH7.0) 10mmol/L
DA−67 20μmol/L
界面活性剤(第1表参照) 0.5%
上記組成のDA−67含有水溶液を5℃で7日間保存したもの、及び、30℃で7日間保存したものをDA−67安定性測定用試料として用いた。
以下の組成からなるDA−67安定性測定用試薬を調製した。
<DA−67安定性測定用試薬>
Bis−Tris(pH7.0) 10mmol/L
BSA 0.005%
調製直後のDA−67含有水溶液30μLに(2)で調製したDA−67安定化測定用試薬120μLを添加し、37℃で5分間加温した後の溶液の吸光度(E直後)を、主波長660nm、副波長800nmで日立7170S形自動分析装置にて測定した。調製直後のDA−67含有水溶液の代わりに、(2)のDA−67安定化測定用試薬を用いて同様の測定を行い、吸光度(Eブランク)を測定した。E直後からEブランクを差し引き、調製直後のDA−67含有水溶液に対する吸光度(△E直後)とした。
Claims (14)
- ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素とを、以下の一般式(I)で表わされるピリジニウム塩、以下の一般式(II)で表わされるホスホニウム塩、以下の一般式(III)で表わされるイミダゾリウム塩、及び、以下の一般式(IV)で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも1種の糖化ヘモグロビンの変性剤の存在下に反応させ、得られる反応生成物にフルクトシルペプチド酸化酵素を作用させ、生成する過酸化水素を測定することを特徴とする、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。
(式中、R1は、炭素数8〜20の非置換のアルキル、又は、炭素数8〜20の非置換のアルケニルを表し、Raは、水素原子又はメチルを表し、nは、1〜5の整数を表し、X−は、1価のアニオンを表す。)
(式中、R2は、炭素数8〜20の非置換のアルキルを表し、R3〜R5は、同一又は異なって、炭素数1〜4の非置換のアルキルを表し、Y−は、1価のアニオンを表す。)
(式中、R6は、炭素数8〜20の非置換のアルキル、又は、炭素数8〜20の非置換のアルケニルを表し、R8は、置換若しくは非置換のメチルを表し、R7 は、水素原子又はメチルを表し、R9、R10は、いずれも水素原子を表し、Z−は、1価のアニオンを表す。)
(式中、R11は、炭素数8〜20の非置換のアルキル、又は、炭素数8〜20の非置換のアルケニルを表し、W−は、1価のアニオンを表す。) - 過酸化水素の測定が、過酸化水素測定試薬により行われる、請求項1記載の測定方法。
- 過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である請求項2記載の測定方法。
- ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である請求項3記載の測定方法。
- フェノチアジン系色原体が、10−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンである請求項4記載の測定方法。
- ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定するための試薬であって、タンパク質分解酵素、フルクトシルペプチド酸化酵素、及び、以下の一般式(I)で表わされるピリジニウム塩、以下の一般式(II)で表わされるホスホニウム塩、以下の一般式(III)で表わされるイミダゾリウム塩、及び、以下の一般式(IV)で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも1種の糖化ヘモグロビンの変性剤を含むことを特徴とする糖化ヘモグロビン測定試薬。
(式中、R1は、炭素数8〜20の非置換のアルキル、又は、炭素数8〜20の非置換のアルケニルを表し、Raは、水素原子又はメチルを表し、nは、1〜5の整数を表し、X−は、1価のアニオンを表す。)
(式中、R2は、炭素数8〜20の非置換のアルキルを表し、R3〜R5は、同一又は異なって、炭素数1〜4の非置換のアルキルを表し、Y−は、1価のアニオンを表す。)
(式中、R6は、炭素数8〜20の非置換のアルキル、又は、炭素数8〜20の非置換のアルケニルを表し、R8は、置換若しくは非置換のメチルを表し、R7 は、水素原子又はメチルを表し、R9、R10は、いずれも水素原子を表し、Z−は、1価のアニオンを表す。)
(式中、R11は、炭素数8〜20の非置換のアルキル、又は、炭素数8〜20の非置換のアルケニルを表し、W−は、1価のアニオンを表す。) - さらに、過酸化水素測定試薬を含む、請求項6記載の測定試薬。
- 過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である請求項7記載の測定試薬。
- ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である請求項8記載の測定試薬。
- フェノチアジン系色原体が、10−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンである請求項9記載の測定試薬。
- ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定するためのキットであって、タンパク質分解酵素、及び、以下の一般式(I)で表わされるピリジニウム塩、以下の一般式(II)で表わされるホスホニウム塩、以下の一般式(III)で表わされるイミダゾリウム塩、及び、以下の一般式(IV)で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも1種の糖化ヘモグロビンの変性剤を含む第1試薬と、フルクトシルペプチド酸化酵素を含む第2試薬とを含むことを特徴とする糖化ヘモグロビン測定キット。
(式中、R1は、炭素数8〜20の非置換のアルキル、又は、炭素数8〜20の非置換のアルケニルを表し、Raは、水素原子又はメチルを表し、nは、1〜5の整数を表し、X−は、1価のアニオンを表す。)
(式中、R2は、炭素数8〜20の非置換のアルキルを表し、R3〜R5は、同一又は異なって、炭素数1〜4の非置換のアルキルを表し、Y−は、1価のアニオンを表す。)
(式中、R6は、炭素数8〜20の非置換のアルキル、又は、炭素数8〜20の非置換のアルケニルを表し、R8は、置換若しくは非置換のメチルを表し、R7 は、水素原子又はメチルを表し、R9、R10は、いずれも水素原子を表し、Z−は、1価のアニオンを表す。)
(式中、R11は、炭素数8〜20の非置換のアルキル、又は、炭素数8〜20の非置換のアルケニルを表し、W−は、1価のアニオンを表す。) - さらに、ペルオキシダーゼ及びロイコ型色原体を、それぞれ第1試薬と第2試薬、又は、第2試薬と第1試薬に含む、請求項11記載の測定キット。
- ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である請求項12記載の測定キット。
- フェノチアジン系色原体が、10−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンである請求項13記載の測定キット。
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