JP6236318B2 - 糖化ヘモグロビンの測定方法、測定試薬、及び、測定キット - Google Patents

糖化ヘモグロビンの測定方法、測定試薬、及び、測定キット Download PDF

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Description

本発明は、糖化ヘモグロビンの測定方法、測定試薬、及び、測定キットに関する。
糖化ヘモグロビンは、ヘモグロビンにグルコースが結合した糖化物である。ヘモグロビンはα鎖、β鎖からなる四量体の構造を取っているが、β鎖のＮ末端が糖化したものはヘモグロビンＡ１ｃ（以下、HbA1cとも記す）と呼ばれ、血糖値が高い程、増加することから、糖尿病マーカーとして、臨床検査において測定されている。
糖化ヘモグロビンの測定方法としては、HPLC法等のクロマトグラフィ法、電気泳動法、ラテックス免疫凝集法など抗体を利用する免疫測定法、糖化タンパク質に作用する酵素と、糖化ペプチド及び／又は糖化アミノ酸に作用する酵素とを用いる酵素測定法等が知られている。
糖化ヘモグロビンの酵素測定法としては、先ず、ヘモグロビン含有試料中のヘモグロビンを変性剤により変性させ、変性したヘモグロビンにタンパク質分解酵素を作用させ、次いで生成した糖化ペプチドに糖化ペプチド酸化酵素を作用させ、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下に、酸化発色型色原体と反応させて色素に導き、生成した色素の吸光度から糖化ヘモグロビンを測定する方法（吸光度法）等が知られている。
しかしながら、この吸光度法による糖化ヘモグロビンの測定においては、試料中に大量に存在するヘモグロビンの影響が問題となる。この問題に対する解決手段としては、例えば、カチオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤を用いる方法（特許文献１）、スルホン化合物及び／又はニトロ化合物を用いる方法（特許文献２、特許文献３）、テトラゾリウム化合物を用いる方法（特許文献４）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩類等の特定の陰イオン系界面活性剤を用いる方法（特許文献５）等が知られている。
しかしながら、これらの方法においても、必ずしもヘモグロビンの影響が回避される訳ではなく、ヘモグロビンの影響を受けない、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの正確な測定方法が求められている。
また、レドックス反応に基づく基質及び酵素の測定方法において、還元剤、特にアスコルビン酸の妨害回避のために、ヨウ素酸塩を用いる方法が知られている（特許文献６）。しかしながら、ヘモグロビンの影響回避のためにヨウ素酸塩等のハロゲン酸化物を用いることは知られていない。
特開平３−０１０６９６号公報 ＷＯ２００３／１０７０１１パンフレット 特開２００７−１４７６３０号公報 特開２０００−２１０１００号公報 ＷＯ２００５／０４９８５８パンフレット 特開昭５６−１５１３５８号公報
本発明の目的は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを、ヘモグロビンの影響を受けることなく、正確、かつ、高感度に測定するための方法及び試薬を提供することにある。
本発明者らは鋭意検討したところ、界面活性剤存在下に、ヘモグロビン含有試料にタンパク質分解酵素を作用させた後、フルクトシルペプチド酸化酵素を作用させる反応において、当該反応をハロゲン酸化物存在下に行い、生成した過酸化水素を測定することにより、ヘモグロビンの影響を受けることなく、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを正確、かつ、高感度に測定できる、という知見を見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１８］に関する。
［１］ ヘモグロビン含有試料に、界面活性剤存在下に、タンパク質分解酵素を作用させた後、フルクトシルペプチド酸化酵素を作用させる反応において、当該反応をハロゲン酸化物存在下に行い、生成した過酸化水素を測定することを特徴とする、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。
［２］ ハロゲン酸化物が、ヨウ素酸若しくはその塩、臭素酸若しくはその塩、及び、過ヨウ素酸若しくはその塩からなる群より選ばれるハロゲン酸化物である、［１］記載の方法。
［３］ 界面活性剤が、カチオン性界面活性剤である、［１］又は［２］記載の方法。
［４］ カチオン性界面活性剤が、以下の一般式(I)で表わされるピリジニウム塩、以下の一般式(II)で表わされるホスホニウム塩、及び、以下の一般式(III)で表わされる第四級アンモニウム塩からなる群より選ばれるカチオン性界面活性剤である、［３］記載の方法。
Figure 0006236318
（式中、Ｒ１は、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒａは、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｎは、１〜５の整数を表し、Ｘ−は、１価のアニオンを表す。）
Figure 0006236318
（式中、Ｒ２〜Ｒ５は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ−は、１価のアニオンを表す。）
Figure 0006236318
（式中、Ｒ６〜Ｒ９は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｚ−は、１価のアニオンを表す。）
［５］ 過酸化水素の測定が、過酸化水素測定試薬により行われる、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］ 過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である［５］記載の方法。
［７］ ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定するための試薬であって、タンパク質分解酵素、フルクトシルペプチド酸化酵素、ハロゲン酸化物、及び、界面活性剤を含むことを特徴とする糖化ヘモグロビン測定試薬。
［８］ ハロゲン酸化物が、ヨウ素酸若しくはその塩、臭素酸若しくはその塩、及び、過ヨウ素酸若しくはその塩からなる群より選ばれるハロゲン酸化物である、［７］記載の試薬。
［９］ 界面活性剤が、カチオン性界面活性剤である、［７］又は［８］記載の試薬。
［１０］ カチオン性界面活性剤が、以下の一般式(I)で表わされるピリジニウム塩、以下の一般式(II)で表わされるホスホニウム塩、及び、以下の一般式(III)で表わされる第四級アンモニウム塩からなる群より選ばれるカチオン性界面活性剤である、［９］記載の試薬。
Figure 0006236318
（式中、Ｒ１は、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒａは、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｎは、１〜５の整数を表し、Ｘ−は、１価のアニオンを表す。）
Figure 0006236318
（式中、Ｒ２〜Ｒ５は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ−は、１価のアニオンを表す。）
Figure 0006236318
（式中、Ｒ６〜Ｒ９は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｚ−は、１価のアニオンを表す。）
［１１］ さらに、過酸化水素測定試薬を含む、［７］〜［１０］のいずれかに記載の試薬。
［１２］ 過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である［１１］記載の試薬。
［１３］ ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定するためのキットであって、タンパク質分解酵素、ハロゲン酸化物、及び、界面活性剤を含む第１試薬と、フルクトシルペプチド酸化酵素を含む第２試薬とを含むことを特徴とする糖化ヘモグロビン測定キット。
［１４］ ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定するためのキットであって、タンパク質分解酵素、及び、界面活性剤を含む第１試薬と、フルクトシルペプチド酸化酵素、及び、ハロゲン酸化物を含む第２試薬とを含むことを特徴とする糖化ヘモグロビン測定キット。
［１５］ ハロゲン酸化物が、ヨウ素酸若しくはその塩、臭素酸若しくはその塩、及び、過ヨウ素酸若しくはその塩からなる群より選ばれるハロゲン酸化物である、［１３］又は［１４］記載のキット。
［１６］ 界面活性剤が、カチオン性界面活性剤である、［１３］〜［１５］のいずれかに記載のキット。
［１７］ カチオン性界面活性剤が、以下の一般式(I)で表わされるピリジニウム塩、以下の一般式(II)で表わされるホスホニウム塩、及び、以下の一般式(III)で表わされる第四級アンモニウム塩からなる群より選ばれるカチオン性界面活性剤である、［１６］記載のキット。
Figure 0006236318
（式中、Ｒ１は、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒａは、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｎは、１〜５の整数を表し、Ｘ−は、１価のアニオンを表す。）
Figure 0006236318
（式中、Ｒ２〜Ｒ５は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ−は、１価のアニオンを表す。）
Figure 0006236318
（式中、Ｒ６〜Ｒ９は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｚ−は、１価のアニオンを表す。）
［１８］ さらに、ペルオキシダーゼ及びロイコ型色原体が、それぞれ第１試薬と第２試薬、又は、第２試薬と第１試薬に含まれる、［１３］〜［１７］のいずれかに記載のキット。
本発明により、ヘモグロビンの影響を受けることなく、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを正確、かつ、高感度に測定するための方法、試薬及びキットが提供される。
実施例１〜３、及び、比較例１のキットを用いる検体中のHbA1cの測定における、ヘモグロビン濃度と反応吸光度との関係を示すグラフである。◆は比較例１のキット、○は実施例１のキット、▲は実施例２のキット、□は実施例３のキットを用いた測定をそれぞれ表し、縦軸は反応吸光度(×10-4 Abs)を、横軸はヘモグロビン濃度(mg/mL)を表す。 実施例４、及び、比較例２のキットを用いる検体中のHbA1cの測定における、ヘモグロビン濃度と反応吸光度との関係を示すグラフである。◆は比較例２のキット、□は実施例４のキットを用いた測定をそれぞれ表し、縦軸は反応吸光度(×10-4 Abs)を、横軸はヘモグロビン濃度(mg/mL)を表す。 実施例５、及び、比較例３のキットを用いる検体中のHbA1cの測定における、ヘモグロビン濃度と反応吸光度との関係を示すグラフである。◆は比較例３のキット、□は実施例５のキットを用いた測定をそれぞれ表し、縦軸は反応吸光度(×10-4 Abs)を、横軸はヘモグロビン濃度(mg/mL)を表す。 実施例６、及び、比較例４のキットを用いる検体中のHbA1cの測定における、ヘモグロビン濃度と反応吸光度との関係を示すグラフである。◆は比較例４のキット、○は実施例６のキットを用いた測定をそれぞれ表し、縦軸は反応吸光度(×10-4 Abs)を、横軸はヘモグロビン濃度(mg/mL)を表す。
（１）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法
本発明の、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンに、界面活性剤存在下に、タンパク質分解酵素を作用させた後、フルクトシルペプチド酸化酵素を作用させる反応において、当該反応をハロゲン酸化物存在下に行い、生成する過酸化水素を測定する方法である。ハロゲン酸化物は、フルクトシルペプチド酸化酵素を作用させる反応に存在させても、タンパク質分解酵素を作用させる反応とフルクトシルペプチド酸化酵素を作用させる反応の両方の反応に存在させてもよい。
具体的には、以下の工程を含む測定方法が例示される。
＜測定方法１＞
（１）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンに、界面活性剤存在下に、タンパク質分解酵素を作用させる工程；
（２）工程（１）で得られる反応生成物に、ハロゲン酸化物存在下に、フルクトシルペプチド酸化酵素を作用させ、過酸化水素を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（４）既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン濃度との関係を表す検量線に基づき、工程（３）で測定した過酸化水素量から、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度を決定する工程。
＜測定方法２＞
（１）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンに、ハロゲン酸化物及び界面活性剤の存在下に、タンパク質分解酵素を作用させる工程；
（２）工程（１）で得られる反応生成物に、フルクトシルペプチド酸化酵素と反応させ、過酸化水素を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（４）既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン濃度との関係を表す検量線に基づき、工程（３）で測定した過酸化水素量から、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度を決定する工程。
また、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量の総ヘモグロビン（すなわち、ヘモグロビンと糖化ヘモグロビンを合わせた総ヘモグロビン）量に対する割合を算出する方法をも包含する。この場合、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、具体的には、以下の工程を含む測定方法である。
＜測定方法３＞
（１）ヘモグロビン含有試料中の総ヘモグロビン（すなわち、ヘモグロビンと糖化ヘモグロビンを合わせた総ヘモグロビン）量を決定する工程；
（２）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンに、界面活性剤存在下、タンパク質分解酵素を作用させる工程；
（３）工程（２）で得られる反応生成物に、ハロゲン酸化物存在下に、フルクトシルペプチド酸化酵素を作用させ、過酸化水素を生成させる工程；
（４）工程（３）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（５）既知量の糖化ヘモグロビンを用いて予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン量との関係を表す検量線に基づき、工程（４）で測定した過酸化水素量から、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量を決定する工程；及び、
（６）工程（１）で決定した総ヘモグロビン量と、工程（５）で決定した糖化ヘモグロビン量から、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量の総ヘモグロビン量に対する割合を算出する工程。
上記工程（１）の総ヘモグロビン量の決定は、工程（２）の後に行うこともできる。
＜測定方法４＞
（１）ヘモグロビン含有試料中の総ヘモグロビン（すなわち、ヘモグロビンと糖化ヘモグロビンを合わせた総ヘモグロビン）量を決定する工程；
（２）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンに、ハロゲン酸化物と界面活性剤存在下、タンパク質分解酵素を作用させる工程；
（３）工程（２）で得られる反応生成物に、フルクトシルペプチド酸化酵素を作用させ、過酸化水素を生成させる工程；
（４）工程（３）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（５）既知量の糖化ヘモグロビンを用いて予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン量との関係を表す検量線に基づき、工程（４）で測定した過酸化水素量から、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量を決定する工程；及び、
（６）工程（１）で決定した総ヘモグロビン量と、工程（５）で決定した糖化ヘモグロビン量から、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量の総ヘモグロビン量に対する割合を算出する工程。
上記工程（１）の総ヘモグロビン量の決定は、工程（２）の後に行うこともできる。
本発明の測定方法におけるヘモグロビン含有試料は、ヘモグロビンを含有し、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法が適用可能な試料であれば特に制限はなく、例えば全血、血球、血球に血漿が混在した試料、これらの試料を溶血処理した試料等が挙げられる。溶血処理としては、全血、血球、血球に血漿が混在した試料を溶血させる処理であれば特に制限はなく、例えば物理的方法、化学的方法、生物学的方法等が挙げられる。物理的方法としては、例えば蒸留水等の低張液を用いる方法、超音波を用いる方法等が挙げられる。化学的方法としては、例えばメタノール、エタノール、アセトン等の有機溶媒を用いる方法、ポリオキシエチレン系界面活性剤を用いる方法等が挙げられる。生物学的方法としては、例えば抗体や補体を用いる方法等が挙げられる。
本発明における糖化ヘモグロビンは、ヘモグロビンにグルコース等の糖が結合して生成したものであり、ヘモグロビンA1a、ヘモグロビンA1b、ヘモグロビンA1c等が挙げられ、ヘモグロビンA1cが好ましい。
本発明におけるハロゲン酸化物としては、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とするハロゲン酸化物であれば特に制限はないが、例えば、ヨウ素酸若しくはその塩、臭素酸若しくはその塩、過ヨウ素酸若しくはその塩等が挙げられる。塩としては、例えばリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等が挙げられる。
ハロゲン酸化物の具体例（製品）としては、例えばヨウ素酸、ヨウ素酸ナトリウム、ヨウ素酸カリウム、臭素酸、臭素酸ナトリウム、臭素酸カリウム、過ヨウ素酸、過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム等が挙げられる。
本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法において、ハロゲン酸化物の反応液中の濃度としては、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする濃度であれば、特に制限はないが、通常0.005〜20 mmol/Lであり、0.01〜10 mmol/Lが好ましい。
本発明における界面活性剤としては、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする界面活性剤であれば特に制限はなく、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等が挙げられるが、カチオン性界面活性剤が好ましい。
カチオン性界面活性剤としては、例えばピリジニウム塩、ホスホニウム塩、イミダゾリウム塩、第四級アンモニウム塩、イソキノリニウム塩等が挙げられ、ピリジニウム塩、ホスホニウム塩、第四級アンモニウム塩、が好ましい。
ピリジニウム塩としては、以下の一般式(I)で表わされるピリジニウム塩［以下、化合物(I)という］が使用される。
Figure 0006236318
式中、Ｒ１は、置換若しくは非置換のアルキル、又は置換若しくは非置換のアルケニル、Ｒａは、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は置換若しくは非置換のアルケニル、ｎは、１〜５の整数、Ｘ−は、１価のアニオンをそれぞれ表す。
Ｒ１において、置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数1〜20の直鎖アルキル、炭素数3〜20の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数1〜20の直鎖アルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。炭素数3〜20の分岐アルキルとしては、例えばイソプロピル、イソブチル、イソペンチル、イソヘキシル、イソヘプチル、イソオクチル、イソノニル、イソデシル、イソウンデシル、イソドデシル、イソトリデシル、イソテトラデシル、イソペンタデシル、イソヘキサデシル、イソヘプタデシル、イソオクタデシル、イソノナデシル、イソイコシル、オクチルドデシル等が挙げられる。
Ｒ１において、置換若しくは非置換のアルケニルにおけるアルケニルとしては、例えば炭素数2〜20のアルケニル等が挙げられる。炭素数2〜20のアルケニルとしては、例えばビニル、プロペニル、アリル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オクタデセニル、オレイル、ノナデセニル、イコセニル等が挙げられる。
Ｒ１において、置換アルキル及び置換アルケニルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
Ｒａにおいて、置換もしくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数1〜20の直鎖アルキル、炭素数3〜20の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数1〜20の直鎖アルキルとしては、例えば前述の炭素数1〜20の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数3〜20の分岐アルキルとしては、例えば前述の炭素数3〜20の分岐アルキル等が挙げられる。
Ｒａにおいて、置換もしくは非置換のアルケニルにおけるアルケニルにとしては、例えば炭素数2〜20のアルケニル等が挙げられる。炭素数2〜20のアルケニルとしては、例えば前述の炭素数2〜20の直鎖アルケニル等が挙げられる。
Ｒａにおいて、置換アルキル及び置換アルケニルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、1-フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
ピリジン環上に２つ以上の置換基がある場合、置換基は同じであっても異なっていてもよい。化合物(I)におけるＸ−は、１価のアニオンを表す。１価のアニオンとしては、例えばハロゲンイオン、OH-、PF6 -、BF4 -、CH3CH2OSO3 -、(CF3SO2)2N-等のアニオンが挙げられる。ハロゲンイオンとしては、例えばCl-、Br-、I-等が挙げられる。
化合物(I)の具体例（製品）としては、例えば1-ドデシルピリジニウムクロライド（以下、C12pyと記す；東京化成社製）、1-セチルピリジニウムクロライド（以下、C16pyと記す；東京化成社製）、1-セチル-4-メチルピリジニウムクロライド（東京化成社製）、N-オクタデシル-4-スチルバゾールブロミド（東京化成社製）等が挙げられる。
ホスホニウム塩としては、以下の一般式(II)で表わされるホスホニウム塩［以下、化合物(II)という］が使用される。
Figure 0006236318
式中、Ｒ２〜Ｒ５は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキルを表わす、Ｙ−は、１価のアニオンをそれぞれ表す。
Ｒ２において、置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数8〜20の直鎖アルキル、炭素数8〜20の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数8〜20の直鎖アルキルとしては、例えばオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。炭素数8〜20の分岐アルキルとしては、例えばイソオクチル、イソノニル、イソデシル、イソウンデシル、イソドデシル、イソトリデシル、イソテトラデシル、イソペンタデシル、イソヘキサデシル、イソヘプタデシル、イソオクタデシル、イソノナデシル、イソイコシル、オクチルドデシル等が挙げられる。置換アルキルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、1-フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
Ｒ３〜Ｒ５において、置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数1〜20の直鎖アルキル、炭素数3〜20の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数1〜20の直鎖アルキルとしては、例えば前述の炭素数1〜20の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数3〜20の分岐アルキルとしては、例えば前述の炭素数3〜20の分岐アルキル等が挙げられる。置換アルキルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、1-フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
Ｙ−は、１価のアニオンを表す。１価のアニオンとしては、例えばハロゲンイオン、OH-、PF6 -、BF4 -、CH3CH2OSO3 -、(CF3SO2)2N-、B(C6H5)4 -、ベンゾトリアゾレート等のアニオンが挙げられる。ハロゲンイオンとしては、例えばCl-、Br-、I-等が挙げられる。
化合物(II)の具体例（製品）としては、例えばトリブチルドデシルホスホニウムブロマイド（以下、C12TBPと記す；東京化成社製）、トリブチルヘキサデシルホスホニウムブロマイド（東京化成社製）、テトラオクチルホスホニウムブロマイド（東京化成社製）、トリブチルオクチルホスホニウムブロマイド（東京化成社製）等が挙げられる。
第四級アンモニウム塩としては、以下の一般式(III)で表わされる第四級アンモニウム塩［以下、化合物(III)という］が使用される。
Figure 0006236318
式中、Ｒ６〜Ｒ９は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキルを表わす、Ｚ−は、１価のアニオンをそれぞれ表す。
Ｒ６において、置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数8〜20の直鎖アルキル、炭素数8〜20の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数8〜20の直鎖アルキルとしては、例えば前記の炭素数8〜20の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数8〜20の分岐アルキルとしては、例えば前記の炭素数8〜20の分岐アルキル等が挙げられる。置換アルキルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、1-フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
Ｒ７〜Ｒ９において、置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数1〜20の直鎖アルキル、炭素数3〜20の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数1〜20の直鎖アルキルとしては、例えば前述の炭素数1〜20の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数3〜20の分岐アルキルとしては、例えば前述の炭素数3〜20の分岐アルキル等が挙げられる。置換アルキルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、1-フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
Ｚ−は、１価のアニオンを表す。１価のアニオンとしては、例えばハロゲンイオン、OH-、PF6 -、BF4 -、CH3CH2OSO3 -、(CF3SO2)2N-、B(C6H5)4 -、ベンゾトリアゾレート等のアニオンが挙げられる。ハロゲンイオンとしては、例えばCl-、Br-、I-等が挙げられる。
化合物(III)の具体例（製品）としては、例えばデシルトリメチルアンモニウムクロライド、デシルトリメチルアンモニウムブロマイド、ドデシルトリメチルアンモニウム クロライド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロライド（以下、C14TMAと記す）、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、ジデシルジメチルアンモニウムクロライド、ジデシルジメチルアンモニウムブロマイド、ジドデシルジメチルアンモニウムクロライド、ジドデシルジメチルアンモニウムブロマイド（いずれも、東京化成社製）等が挙げられる。
アニオン性界面活性剤としては、例えば硫酸エステル塩、カルボン酸塩、スルホン酸塩、リン酸エステル塩、スルホコハク酸塩、N-メチルタウリン塩、N-アルカノイル−Ｎ−メチルタウリン塩等が挙げられる。
両性界面活性剤としては、例えば第三級アミンオキサイド、アルキルカルボキシベタイン等が挙げられる。
非イオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルケニルアミン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、エチレンジアミンテトラポリオキシエチレン、ポリグリセリン脂肪酸エステル等が挙げられる。
総ヘモグロビン量は、公知の方法、例えばシアンメトヘモグロビン法、オキシヘモグロビン法、ＳＬＳ−ヘモグロビン法等によって決定することができる。総ヘモグロビン量は、ヘモグロビン含有試料そのもののみならず、ヘモグロビン含有試料にハロゲン酸化物及び／又は界面活性剤を添加して得られる試料、ヘモグロビン含有試料にハロゲン酸化物及び／又は界面活性剤とタンパク質分解酵素とを添加して得られる試料に対して、シアンメトヘモグロビン法、オキシヘモグロビン法、SLS-ヘモグロビン法を適用することによっても決定することができる。
ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンに、上記界面活性剤存在下、タンパク質分解酵素を作用させる反応は、上記界面活性剤存在下にタンパク質分解酵素が糖化ヘモグロビンに作用し得る条件であれば、いかなる条件下でも行うことができる。ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素との反応は、水性媒体中で行われることが好ましい。水性媒体としては後述の水性媒体等が挙げられる。ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素との反応における反応温度は、通常10〜50℃であり、20〜40℃が好ましく、反応時間は、通常1分間〜3時間であり、2.5分間〜1時間が好ましい。タンパク質分解酵素の濃度としては、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素との反応が進行する濃度であれば特に制限はなく、通常50〜25,000 kU/Lであり、好ましくは250〜10,000 kU/Lである。
タンパク質分解酵素としては、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンに作用し、糖化ヘモグロビンから糖化ペプチドを生成させる酵素であれば特に制限はなく、例えばセリンプロテアーゼ（キモトリプシン、スブチリシン等）、システインプロテアーゼ（パパイン、カスパーゼ等）、アスパラギン酸プロテアーゼ（ペプシン、カテプシンD等）、メタロプロテアーゼ（サーモリシン等）、N-末端スレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ等が挙げられる。本発明においては、市販のタンパク質分解酵素も使用することができ、市販品としては例えばプロテアーゼＰ「アマノ」3G、プロテアーゼＫ「アマノ」（以上、天野エンザイム社製）、アクチナーゼＡＳ、アクチナーゼＥ（以上、科研ファルマ社製）、サーモリシン（大和化成社製）、スミチームMP(新日本化学工業社製)等が挙げられる。
上記タンパク質分解酵素を作用させる反応における界面活性剤の濃度としては、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素との反応が進行する濃度であれば特に制限はなく、通常0.0001〜10%であり、0.0005〜5%が好ましい。
ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素との反応により、糖化ペプチドを含む反応生成物が生成する。次いで、この反応生成物中の糖化ペプチドに、フルクトシルペプチド酸化酵素と反応し、過酸化水素が生成する。糖化ペプチドとフルクトシルペプチド酸化酵素との反応は、水性媒体中で行われることが好ましい。水性媒体としては後述の水性媒体等が挙げられる。
糖化ペプチドとフルクトシルペプチド酸化酵素との反応における反応温度は、通常10〜50℃であり、20〜40℃が好ましく、反応時間は、通常1分間〜3時間であり、2.5分間〜1時間が好ましい。フルクトシルペプチド酸化酵素の濃度としては、糖化ヘモグロビンとフルクトシルペプチド酸化酵素との反応が進行する濃度であれば特に制限はなく、通常0.1〜30 kU/Lであり、0.2〜15 kU/Lが好ましい。
フルクトシルペプチド酸化酵素としては、糖化ペプチドに作用して過酸化水素を生成させる酵素であれば特に制限はなく、例えば糸状菌由来、酵母由来、放線菌由来、バクテリア由来、古細菌由来のフルクトシルペプチド酸化酵素等が挙げられる。本発明においては、市販のフルクトシルペプチド酸化酵素も使用することができ、市販品としては例えばFPOX-CE（キッコーマン社製）、FPOX-EE（キッコーマン社製）、FPOX-CET（キッコーマン社製）等が挙げられる。
生成した過酸化水素の測定方法としては、例えば電極を用いる方法、過酸化水素測定用試薬を用いる方法等が挙げられ、過酸化水素測定用試薬を用いる方法が好ましい。過酸化水素測定用試薬は、過酸化水素を検出可能な物質に変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素、光（発光）、蛍光等が挙げられ、色素が好ましい。
検出可能な物質が色素の場合、過酸化水素測定用試薬は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質と酸化発色型色原体を含む試薬等が挙げられる。酸化発色型色原体としては、酸化カップリング型色原体、ロイコ型色原体等が挙げられ、ロイコ型色原体が好ましい。ロイコ型色原体としては、例えばフェノチアジン系色原体、トリフェニルメタン系色原体、ジフェニルアミン系色原体、o-フェニレンジアミン、ヒドロキシプロピオン酸、ジアミノベンジジン、テトラメチルベンジジン等が挙げられ、フェノチアジン系色原体が好ましい。フェノチアジン系色原体としては、例えば10-N-カルボキシメチルカルバモイル-3,7-ビス（ジメチルアミノ）-10H-フェノチアジン(CCAP)、10-N-メチルカルバモイル-3,7-ビス（ジメチルアミノ）-10H-フェノチアジン(MCDP)、10-N-（カルボキシメチルアミノカルボニル）-3,7-ビス（ジメチルアミノ）-10H-フェノチアジン ナトリウム塩(DA-67)等が挙げられる。フェノチアジン系色原体の中でも、10-N-（カルボキシメチルアミノカルボニル）-3,7-ビス（ジメチルアミノ）-10H-フェノチアジン ナトリウム塩(DA-67)が特に好ましい。トリフェニルメタン系色原体としては、例えばN,N,N’,N’,N’’,N’’-ヘキサ（３−スルホプロピル）-4,4’,4’’-トリアミノトリフェニルメタン(TPM-PS)等が挙げられる。ジフェニルアミン系色原体としては、例えばN-（カルボキシメチルアミノカルボニル）-4,4’-ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩(DA-64)、4,4’-ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔3-ビス（4-クロロフェニル）メチル-4-ジメチルアミノフェニル〕アミン(BCMA)等が挙げられる。
検出可能な物質が光（発光）の場合、過酸化水素測定用試薬は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質と化学発光物質を含む試薬等が挙げられる。化学発光物質としては、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル等が挙げられる。
検出可能な物質が蛍光の場合、過酸化水素測定用試薬は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質と蛍光物質を含む試薬等が挙げられる。蛍光物質としては、例えば4-ヒドロキシフェニル酢酸、3-（4-ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、クマリン等が挙げられる。
（２）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬
本発明の、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬は、タンパク質分解酵素、フルクトシルペプチド酸化酵素、ハロゲン酸化物、及び、界面活性剤を含む試薬であり、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法に用いられる。本発明の測定試薬は、さらに、過酸化水素測定試薬を含んでいてもよい。
本発明の測定試薬におけるタンパク質分解酵素、フルクトシルペプチド酸化酵素、ハロゲン酸化物、界面活性剤、及び、過酸化水素測定試薬としては、例えば、それぞれ、前述のタンパク質分解酵素、フルクトシルペプチド酸化酵素、ハロゲン酸化物、界面活性剤、及び、過酸化水素測定試薬等が挙げられる。
本発明の測定試薬におけるタンパク質分解酵素の濃度は、通常50〜25,000 kU/Lであり、250〜10,000 kU/Lが好ましい。本発明の測定試薬におけるフルクトシルペプチド酸化酵素の濃度は、通常0.1〜30 kU/Lであり、0.2〜15 kU/Lが好ましい。
本発明の測定試薬におけるハロゲン酸化物の濃度は、通常0.005〜20 mmol/Lであり、0.01〜10 mmol/Lが好ましい。
本発明の測定試薬における界面活性剤の濃度は、通常0.0001〜10%であり、0.0005〜5%が好ましい。
本発明の測定試薬には、必要に応じて、水性媒体、安定化剤、防腐剤、塩類、干渉物質消去剤、有機溶媒等が含有されてもよい。
水性媒体としては、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。
水性媒体のpHは、例えばpH4〜10である。水性媒体として緩衝液を用いる場合には、設定するｐＨに応じた緩衝剤を用いることが望ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。
グッドの緩衝剤としては、例えば2-モルホリノエタンスルホン酸(MES)、ビス（2-ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン(Bis-Tris)、N-（2-アセトアミド）イミノ二酢酸(ADA)、ピペラジン-N,N’-ビス（2-エタンスルホン酸）(PIPES)、N-（2-アセトアミド）-2-アミノエタンスルホン酸(ACES)、3-モルホリノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(MOPSO)、N,N-ビス（2-ヒドロキシエチル）-2-アミノエタンスルホン酸(BES)、3-モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)、N-〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕-2-アミノエタンスルホン酸(TES)、2-〔4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジニル〕エタンスルホン酸(HEPES)、3-〔N,N-ビス（2-ヒドロキシエチル）アミノ〕-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(DIPSO)、N-〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕-2-ヒドロキシ-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPSO)、ピペラジン-N,N’-ビス（2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）(POPSO)、3-〔4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジニル〕-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(HEPPSO)、3-〔4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジニル〕プロパンスルホン酸[(H)EPPS]、N-〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン(Tricine)、N,N-ビス（2-ヒドロキシエチル）グリシン(Bicine)、N-トリス（ヒドロキシメチル）メチル-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPS)、N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸(CHES)、N-シクロヘキシル-3-アミノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(CAPSO)、N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸(CAPS)等が挙げられる。
緩衝液の濃度は、通常0.001〜2.0 mol/Lであり、0.005〜1.0 mol/Lが好ましい。
安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、シュークロース、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、フェロシアン化カリウム、牛血清アルブミン(BSA)、ポリオキシエチレン系界面活性剤等が挙げられる。ポリオキシエチレン系界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル［市販品：ノニオンHS-240（日油社製）、トリトン X-405（シグマアルドリッチ社製）］等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等があげられる。塩類としては、例えば塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、塩化カリウム、硝酸カリウム、硫酸カリウム、炭酸カリウム等が挙げられる。干渉物質消去剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を消去するためのアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。有機溶媒としては、例えばロイコ型色原体の水性媒体への溶解補助のためのジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキサイド(DMSO)、ジオキサン、アセトン、メタノール、エタノール等が挙げられる。
（３）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キット
本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬は、キットの形態で保存、流通及び使用されてよい。本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キットは、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法に用いられる。本発明の測定キットとしては、例えば２試薬系のキット、３試薬系のキット等が挙げられ、２試薬系キットが好ましい。
本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キットは、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定方法を可能とするキットであれば、特に制限はなく、２試薬系キットの場合は、例えばタンパク質分解酵素を含む第１試薬と、フルクトシルペプチド酸化酵素、ハロゲン酸化物、及び、界面活性剤を含む第２試薬とを含むキットや、タンパク質分解酵素、ハロゲン酸化物、及び、界面活性剤を含む第１試薬と、フルクトシルペプチド酸化酵素を含む第２試薬とを含むキット等が挙げられる。
さらに、本発明の糖化ヘモグロビン測定キットとして、これらのキットの第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に過酸化水素測定試薬が含まれるキットが挙げられる。特に、過酸化水素測定試薬として、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬を用いる場合は、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とは別々の試薬に含まれることが好ましい。すなわち、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とが、それぞれ第１試薬と第２試薬に、又は、第２試薬と第１試薬に含まれることが好ましい。
本発明の測定キットを構成する試薬中のタンパク質分解酵素の濃度は、通常100〜30,000 kU/Lであり、500〜10,000 kU/Lが好ましい。本発明の測定キットを構成する試薬中のフルクトシルペプチド酸化酵素の濃度は、通常0.5〜100 kU/Lであり、1〜50 kU/Lが好ましい。
本発明の測定キットを構成する試薬中のハロゲン酸化物の濃度は、通常0.005〜20 mmol/Lであり、0.01〜10 mmol/Lが好ましい。
本発明の測定キットを構成する試薬中の界面活性剤の濃度は、通常0.0001〜40%であり、0.0005〜20%が好ましい。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
尚、本実施例、比較例及び試験例においては、下記メーカーの試薬及び酵素を使用した。
ＡＣＥＳ（同仁化学研究所社製）、ＡＤＡ（同仁化学研究所社製）、酢酸カルシウム１水和物（和光純薬工業社製）、塩化ナトリウム（和光純薬工業社製）、ＤＡ−６７（和光純薬工業社製）、１−ドデシルピリジニウムクロライド（Ｃ１２ｐｙ）［化合物(I)；東京化成社製］、１−セチルピリジニウムクロライド（Ｃ１６ｐｙ）［化合物(I)；東京化成社製］、トリブチルドデシルホスホニウムブロマイド（Ｃ１２ＴＢＰ）［化合物(II)；東京化成社製］、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロライド（Ｃ１４ＴＭＡ）［化合物(III)；東京化成社製］、ヨウ素酸カリウム（ハロゲン酸化物；東京化成社製）、臭素酸カリウム（ハロゲン酸化物；東京化成社製）、過ヨウ素酸カリウム（ハロゲン酸化物；東京化成社製）、ノニオンＨＳ−２４０（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；日油社製）、サーモリシン（タンパク質分解酵素；大和化成社製）、ＦＰＯＸ−ＣＥ（フルクトシルペプチド酸化酵素；キッコーマン社製）、ＦＰＯＸ−ＣＥＴ（フルクトシルペプチド酸化酵素；キッコーマン社製）、ペルオキシダーゼ（東洋紡績社製）。
以下の第１試薬及び第２試薬からなるHbA1c測定キットを調製した。
第１試薬
ＡＣＥＳ（ｐＨ７．０） 20 mmol/L
酢酸カルシウム１水和物 10 mmol/L
塩化ナトリウム 100 mmol/L
Ｃ１２ｐｙ 1.6 g/L
ヨウ素酸カリウム 0.1 g/L
サーモリシン 1,800 kU/L
ＤＡ−６７ 25μmol/L
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０） 50 mmol/L
ノニオンＨＳ−２４０ 5 g/L
ＦＰＯＸ−ＣＥ 12 kU/L
ペルオキシダーゼ 120 kU/L
以下の第１試薬及び第２試薬からなるHbA1c測定キットを調製した。
第１試薬
ＡＣＥＳ（ｐＨ７．０） 20 mmol/L
酢酸カルシウム１水和物 10 mmol/L
塩化ナトリウム 100 mmol/L
Ｃ１２ｐｙ 1.6 g/L
臭素酸カリウム 0.1 g/L
サーモリシン 1,800 kU/L
ＤＡ−６７ 25μmol/L
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０） 50 mmol/L
ノニオンＨＳ−２４０ 5 g/L
ＦＰＯＸ−ＣＥ 12 kU/L
ペルオキシダーゼ 120 kU/L
以下の第１試薬及び第２試薬からなるHbA1c測定キットを調製した。
第１試薬
ＡＣＥＳ（ｐＨ７．０） 20 mmol/L
酢酸カルシウム１水和物 10 mmol/L
塩化ナトリウム 100 mmol/L
Ｃ１２ｐｙ 1.6 g/L
過ヨウ素酸カリウム 0.1 g/L
サーモリシン 1,800 kU/L
ＤＡ−６７ 25μmol/L
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０） 50 mmol/L
ノニオンＨＳ−２４０ 5 g/L
ＦＰＯＸ−ＣＥ 12 kU/L
ペルオキシダーゼ 120 kU/L
以下の第１試薬及び第２試薬からなるHbA1c測定キットを調製した。
第１試薬
ＡＣＥＳ（ｐＨ７．０） 20 mmol/L
酢酸カルシウム１水和物 10 mmol/L
塩化ナトリウム 100 mmol/L
Ｃ１６ｐｙ 0.35 g/L
臭素酸カリウム 0.025 g/L
サーモリシン 1,800 kU/L
ＤＡ−６７ 25μmol/L
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０） 50 mmol/L
ノニオンＨＳ−２４０ 5 g/L
ＦＰＯＸ−ＣＥＴ 6 kU/L
ペルオキシダーゼ 120 kU/L
以下の第１試薬及び第２試薬からなるHbA1c測定キットを調製した。
第１試薬
ＡＣＥＳ（ｐＨ７．０） 20 mmol/L
酢酸カルシウム１水和物 10 mmol/L
塩化ナトリウム 100 mmol/L
Ｃ１２ＴＢＰ 0.8 g/L
臭素酸カリウム 0.1 g/L
サーモリシン 1,800 kU/L
ＤＡ−６７ 25μmol/L
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０） 50 mmol/L
ノニオンＨＳ−２４０ 5 g/L
ＦＰＯＸ−ＣＥＴ 6 kU/L
ペルオキシダーゼ 120 kU/L
以下の第１試薬及び第２試薬からなるHbA1c測定キットを調製した。
第１試薬
ＡＣＥＳ（ｐＨ７．０） 20 mmol/L
酢酸カルシウム１水和物 10 mmol/L
塩化ナトリウム 100 mmol/L
Ｃ１４ＴＭＡ 0.6 g/L
ヨウ素酸カリウム 0.1 g/L
サーモリシン 1,800 kU/L
ＤＡ−６７ 25μmol/L
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０） 50 mmol/L
ノニオンＨＳ−２４０ 5 g/L
ＦＰＯＸ−ＣＥ 12 kU/L
ペルオキシダーゼ 120 kU/L
以下の第１試薬及び第２試薬からなるHbA1c測定キットを調製した。
第１試薬
ＡＣＥＳ（ｐＨ７．０） 20 mmol/L
酢酸カルシウム１水和物 10 mmol/L
塩化ナトリウム 100 mmol/L
Ｃ１４ＴＭＡ 0.6 g/L
過ヨウ素酸カリウム 0.1 g/L
サーモリシン 1,800 kU/L
ＤＡ−６７ 25μmol/L
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０） 50 mmol/L
ノニオンＨＳ−２４０ 5 g/L
ＦＰＯＸ−ＣＥ 12 kU/L
ペルオキシダーゼ 120 kU/L
HbA1c測定キットとして、実施例１のキットを、試料として、糖尿病が疑われる10名の被験者由来の全血を用いて、以下の手順により、各試料におけるHbA1c濃度（量）の総ヘモグロビン濃度（量）に対する割合［HbA1c(%)］を決定した。
（１）総ヘモグロビン濃度決定のための検量線の作成
測定キットとして、総ヘモグロビン測定用キットであるヘモグロビンＢ−テストワコー（SLS-ヘモグロビン法）（和光純薬工業社製）を用いて、検体として、ヘモグロビンＢ−テストワコーに付属の標準品（ヘモグロビン濃度：15.3 mg/mL）を用いて、ヘモグロビン濃度と吸光度との関係を示す検量線を作成した。
（２）HbA1c濃度決定のための検量線の作成
ラテックス免疫凝集法と、血球画分の総ヘモグロビン値とから、HbA1c濃度が2.77μmol/L、6.33μmol/Lと値付けされた２つの血球画分について、実施例１のHbA1c測定キットを用いて、各血球画分に対する吸光度を測定した。当該血球画分の代わりに生理食塩水を用いて吸光度を測定し、当該血球画分に対するそれぞれの吸光度から、生理食塩水に対する吸光度を差し引いて算出した値を、当該血球画分に対するブランク補正吸光度とした。当該血球画分に対するブランク補正吸光度と、生理食塩水に対するブランク補正吸光度(0 Abs)とから、HbA1c濃度(μmol/L)と吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。
（３）各血球画分におけるヘモグロビン濃度の決定
各試料に対して、25℃、3,000 rpmで5分間遠心分離を行い、血球画分を得た。各血球画分について、ヘモグロビンＢ−テストワコーを用いて吸光度を測定し、得られた測定値と（１）の検量線とから、各血球画分中のヘモグロビン濃度(μmol/L)を決定した。
（４）各血球画分におけるHbA1c濃度の決定
各血球画分について、実施例１の測定キットを用いて吸光度を測定し、得られた測定値と（２）の検量線とから、各血球画分中のHbA1c濃度(μmol/L)を決定した。
（５）HbA1c(%)（＝HbA1c濃度のヘモグロビン濃度に対する割合）の決定
上記（３）で決定した各血球画分におけるヘモグロビン濃度(μmol/L)と、上記（４）で決定した各血球画分におけるHbA1c濃度(μmol/L)とから、以下の式により、日本糖尿病学会(Japan Diabetes Society；JDS)値のHbA1c(%)を算出した。
Figure 0006236318
（６）同一血球画分中のHbA1c(%)の免疫測定法での決定
上記（５）でのHbA1c(%)の決定に使用した血球画分と同一の血球画分を用いて、各血球画分中のHbA1c(%)を、デタミナーＬ HbA1c（協和メデックス社製）を用いる免疫測定法により、デタミナーＬ HbA1cの添付文書に記載の方法に従って決定した。
（７）本発明の測定方法と免疫測定法との相関
本発明の測定方法を用いて、上記（５）で決定したHbA1c(%)と、免疫測定法を用いて、上記（６）で決定したHbA1c(%)とから、本発明の測定方法と免疫測定法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。
同様に、実施例１の測定キットの代わりに、実施例２〜７の測定キットを用いて、デタミナーＬ HbA1c（協和メデックス社製）を用いた測定との間の相関係数を決定した。その結果を第１表に示す。
Figure 0006236318
第１表に示す通り、実施例１〜７の測定キットを用いる本発明の測定方法と、免疫測定法との間に良好な相関関係が認められた。従って、実施例１〜７の測定キットを用いる本発明の測定方法により、試料中のHbA1cを正確、かつ、高感度に測定できることが明らかとなった。
［比較例１］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるHbA1c測定キットを調製した。
第１試薬
ＡＣＥＳ（ｐＨ７．０） 20 mmol/L
酢酸カルシウム１水和物 10 mmol/L
塩化ナトリウム 100 mmol/L
Ｃ１２ｐｙ 1.6 g/L
サーモリシン 1,800 kU/L
ＤＡ−６７ 25μmol/L
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０） 50 mmol/L
ノニオンＨＳ−２４０ 5 g/L
ＦＰＯＸ−ＣＥ 12 kU/L
ペルオキシダーゼ 120 kU/L
［比較例２］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるHbA1c測定キットを調製した。
第１試薬
ＡＣＥＳ（ｐＨ７．０） 20 mmol/L
酢酸カルシウム１水和物 10 mmol/L
塩化ナトリウム 100 mmol/L
Ｃ１６ｐｙ 0.35 g/L
サーモリシン 1,800 kU/L
ＤＡ−６７ 25μmol/L
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０） 50 mmol/L
ノニオンＨＳ−２４０ 5 g/L
ＦＰＯＸ−ＣＥＴ 6 kU/L
ペルオキシダーゼ 120 kU/L
［比較例３］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるHbA1c測定キットを調製した。
第１試薬
ＡＣＥＳ（ｐＨ７．０） 20 mmol/L
酢酸カルシウム１水和物 10 mmol/L
塩化ナトリウム 100 mmol/L
Ｃ１２ＴＢＰ 0.8 g/L
サーモリシン 1,800 kU/L
ＤＡ−６７ 25μmol/L
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０） 50 mmol/L
ノニオンＨＳ−２４０ 5 g/L
ＦＰＯＸ−ＣＥＴ 6 kU/L
ペルオキシダーゼ 120 kU/L
［比較例４］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるHbA1c測定キットを調製した。
第１試薬
ＡＣＥＳ（ｐＨ７．０） 20 mmol/L
酢酸カルシウム１水和物 10 mmol/L
塩化ナトリウム 100 mmol/L
Ｃ１４ＴＭＡ 0.6 g/L
サーモリシン 1,800 kU/L
ＤＡ−６７ 25μmol/L
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０） 50 mmol/L
ノニオンＨＳ−２４０ 5 g/L
ＦＰＯＸ−ＣＥ 12 kU/L
ペルオキシダーゼ 120 kU/L
［試験例１］ ハロゲン酸化物の効果〜ヘモグロビン濃度の影響抑制
（１）溶血検体の調製
ヒト血液を遠心分離して得られた血球画分について、ヘモグロビン測定試薬であるネスコート ヘモキット-N（アルフレッサファーマ社製）を用いて吸光度を測定し、該血球画分のヘモグロビン濃度を決定した。次いで、この値付けされた該血球画分を精製水で希釈して溶血させ、ヘモグロビン濃度が2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL及び10 mg/mLの各溶血検体を調製した。
（２）溶血検体中のHbA1c(%)の決定
キットとして、実施例１のキットを用いて、検体として、上記（１）で調製した溶血検体を用いて測定を行い、得られた測定値を基に、実施例８の（２）で作製したHbA1c濃度(μmol/L)と吸光度との間の関係を示す検量線から、各検体中のHbA1c濃度(μmol/L)を決定した。
一方、同じ溶血検体について、ヘモグロビンＢ−テストワコーを用いて吸光度を測定し、得られた測定値と実施例８の（１）で作成した検量線とから、各検体中のヘモグロビン濃度(μmol/L)を決定した。
決定した各検体中のHbA1c濃度(μmol/L)とヘモグロビン濃度(μmol/L)とから、以下の式により、日本糖尿病学会(Japan Diabetes Society；JDS)値のHbA1c(%)を算出した。
Figure 0006236318
キットとして、実施例１のキットの代わりに、実施例２〜７及び比較例１〜４の各キットを用いて同様の測定を行い、それぞれのキットに対して、各検体中のHbA1c(%)を測定した。ヘモグロビン濃度が6mg/mLである検体でのHbA1c(%)を基準0とし、その基準からの各検体のHbA1c(%)の差［△HbA1c(%)］を算出した。その結果を第２表に示す。
Figure 0006236318
測定に用いた溶血検体は、同一のヒト血液より調製されたものであるため、総ヘモグロビンに対するHbA1cの割合(%)は、ヘモグロビン濃度に拠らず一定である。従って、△HbA1c(%)が0に近い程、HbA1c測定方法がヘモグロビン濃度の影響を受けない、ということになる。第２表から明らかな通り、ハロゲン酸化物を含む本発明のキットでは、ハロゲン酸化物を含まない比較例のキットに比較して、ヘモグロビン濃度の影響を受けないことが判明した。
［試験例２］ ハロゲン酸化物の効果（２）〜高感度測定
キットとして、実施例１〜３及び比較例１の各キットを、検体として、試験例１の（１）で調製した溶血検体を用いて、試験例１と同様の方法により、それぞれのキットにおいて、各検体に対する反応吸光度を測定した。その結果を第１図に示す。
同様に、キットとして、実施例４及び比較例２の各キットを、検体として、試験例１の（１）で調製した溶血検体を用いて、試験例１と同様の方法により、それぞれのキットにおいて、各検体に対する反応吸光度を測定した。その結果を第２図に示す。
同様に、キットとして、実施例５及び比較例３の各キットを、検体として、試験例１の（１）で調製した溶血検体を用いて、試験例１と同様の方法により、それぞれのキットにおいて、各検体に対する反応吸光度を測定した。その結果を第３図に示す。
同様に、キットとして、実施例６及び比較例４の各キットを、検体として、試験例１の（１）で調製した溶血検体を用いて、試験例１と同様の方法により、それぞれのキットにおいて、各検体に対する反応吸光度を測定した。その結果を第４図に示す。
第１〜４図から明らかな通り、本発明のキット及び比較例のキットのいずれのキットにおいても、ヘモグロビン濃度に比例して反応吸光度が上昇したが、ハロゲン酸化物を含む本発明のキットを用いる場合は、ハロゲン酸化物を含まない比較例のキットを用いる場合に比較して、同一濃度のヘモグロビンの検体（すなわち、同一濃度のHbA1cの検体）において、反応吸光度が高いことが判明した。
前述の通り、測定に用いた溶血検体は、同一のヒト血液より調製されたものであるため、HbA1c濃度はヘモグロビン濃度に依存して高くなるが、同一濃度のHbA1cの検体においては、反応吸光度が高い程、高感度測定が可能となる。
実施例１〜３のキットを用いる場合は、比較例１のキットを用いる場合に比較して、同一濃度のHbA1cの検体において、高い反応吸光度が得られた。同様に、実施例４，５，６のキットを用いる場合は、それぞれ、比較例２，３，４のキットを用いる場合に比較して、同一濃度のHbA1cの検体において、高い反応吸光度が得られた。従って、ハロゲン酸化物を含む本発明のキットを用いる測定方法は、ハロゲン酸化物を含まない比較例のキットを用いる測定方法と比較して、高感度なHbA1cの測定が可能となることが判明した。
本発明により、糖尿病の診断に有用な糖化ヘモグロビンの測定等に有用な、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法、測定試薬、及び、測定キットが提供される。

Claims (8)

  1. 以下の工程（１）〜（４）を含み、工程（１）及び（２）の少なくとも１つの工程が、ハロゲン酸化物存在下に行われることを特徴とする、全血、血球、血球に血漿が混在した試料、及び、これらの試料を溶血処理した試料からなる群より選ばれるヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。
    （１）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンに、以下の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、及び、以下の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩からなる群より選ばれるカチオン性界面活性剤存在下に、タンパク質分解酵素を作用させる工程；
    （２）工程（１）で得られる反応生成物に、フルクトシルペプチド酸化酵素を作用させ、過酸化水素を生成させる工程；
    （３）工程（２）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
    （４）既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン濃度との関係を表す検量線に基づき、工程（３）で測定した過酸化水素量から、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度を決定する工程。
    Figure 0006236318

    （式中、Ｒ１は、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒａは、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｎは、１〜５の整数を表し、Ｘ−は、１価のアニオンを表す。）
    Figure 0006236318

    （式中、Ｒ２〜Ｒ５は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ−は、１価のアニオンを表す。）
  2. ハロゲン酸化物が、ヨウ素酸若しくはその塩、臭素酸若しくはその塩、及び、過ヨウ素酸若しくはその塩からなる群より選ばれるハロゲン酸化物である、請求項１記載の方法。
  3. 過酸化水素の測定が、過酸化水素測定試薬により行われる、請求項１又は２記載の方法。
  4. 過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である請求項３記載の方法。
  5. 全血、血球、血球に血漿が混在した試料、及び、これらの試料を溶血処理した試料からなる群より選ばれるヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定するためのキットであって、タンパク質分解酵素、ハロゲン酸化物、及び、以下の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、及び、以下の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩からなる群より選ばれるカチオン性界面活性剤を含む第１試薬と、フルクトシルペプチド酸化酵素を含む第２試薬とを含むことを特徴とする糖化ヘモグロビン測定キット。
    Figure 0006236318
    （式中、Ｒ１は、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒａは、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｎは、１〜５の整数を表し、Ｘ−は、１価のアニオンを表す。）
    Figure 0006236318

    （式中、Ｒ２〜Ｒ５は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ−は、１価のアニオンを表す。）
  6. 全血、血球、血球に血漿が混在した試料、及び、これらの試料を溶血処理した試料からなる群より選ばれるヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定するためのキットであって、タンパク質分解酵素、及び、以下の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、及び、以下の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩からなる群より選ばれるカチオン性界面活性剤を含む第１試薬と、フルクトシルペプチド酸化酵素、及び、ハロゲン酸化物を含む第２試薬とを含むことを特徴とする糖化ヘモグロビン測定キット。
    Figure 0006236318
    （式中、Ｒ１は、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒａは、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｎは、１〜５の整数を表し、Ｘ−は、１価のアニオンを表す。）
    Figure 0006236318
    （式中、Ｒ２〜Ｒ５は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ−は、１価のアニオンを表す。）
  7. ハロゲン酸化物が、ヨウ素酸若しくはその塩、臭素酸若しくはその塩、及び、過ヨウ素酸若しくはその塩からなる群より選ばれるハロゲン酸化物である、請求項５又は６記載のキット。
  8. さらに、ペルオキシダーゼ及びロイコ型色原体が、それぞれ第１試薬と第２試薬、又は、第２試薬と第１試薬に含まれる、請求項５〜７のいずれかに記載のキット。
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