JP7020413B2 - 糖化ヘモグロビンの測定方法 - Google Patents
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Description
本願は、2016年7月29日に、日本に出願された特願2016-150498号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
従って、本発明の目的は、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を用いて、検体中の糖化ヘモグロビンを簡便かつ高感度で測定する方法、試薬及びキットを提供することにある。
[1]ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも1種のアニオン性界面活性剤の存在下に反応させて過酸化水素を生成させ、生成した前記過酸化水素を測定することを特徴とする、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。
[3]前記過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である[2]記載の測定方法。
[4]前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である[3]記載の測定方法。
[5]前記フェノチアジン系色原体が、10-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-3,7-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジン又はその塩である[4]記載の測定方法。
[7]さらに、過酸化水素測定試薬を含む、[6]記載の測定試薬。
[8]前記過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である[7]記載の測定試薬。
[9]前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である[8]記載の測定試薬。
[10]前記フェノチアジン系色原体が、10-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-3,7-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジン又はその塩である[9]記載の測定試薬。
[14]前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である[13]記載の測定キット。
[15]前記フェノチアジン系色原体が、10-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-3,7-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジン又はその塩である[14]記載の測定キット。
本発明の、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも1種のアニオン性界面活性剤の存在下に反応させて過酸化水素を生成させ、生成した前記過酸化水素を測定することを特徴とする方法である。
具体的には、以下の工程を含む測定方法である。
(ii)前記工程(i)で生成した過酸化水素を測定する工程;及び、
(iii)既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて上記(i)及び(ii)により測定を行い予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン濃度との関係を表す検量線に、前記工程(ii)で測定した前記過酸化水素量を照らし合わせて、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度を決定する工程。
(ii)ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも1種のアニオン性界面活性剤を含む水性媒体中で反応させて、過酸化水素を生成させる工程;
(iii)前記工程(ii)で生成した前記過酸化水素を測定する工程;
(iv)既知量の糖化ヘモグロビンを用いて上記(ii)及び(iii)により測定を行い予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン量との関係を表す検量線に、前記工程(iii)で測定した前記過酸化水素量を照らし合わせて、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量を測定する工程;及び、
(v)前記工程(i)で測定した前記総ヘモグロビン量と、前記工程(iv)で測定した前記糖化ヘモグロビン量から、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量の総ヘモグロビン量に対する割合を算出する工程。
本発明における、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルタウリンとしては、例えばN-アシルタウリン、N-アシル-N-アルキルタウリン等が挙げられ、N-アシル-N-アルキルタウリン等が好ましい。
N-アシル-N-アルキルタウリンにおけるアルキルとしては、例えば炭素数1~6のアルキル等が挙げられる。炭素数1~6のアルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。
アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルタウリン、又はその塩の具体例(製品)としては、例えばNIKKOL LMT(N-ラウロイル-N-メチルタウリンナトリウム;日光ケミカルズ社製)、NIKKOL PMT(N-パルミトイル-N-メチルタウリンナトリウム;日光ケミカルズ社製)、NIKKOL MMT(N-ミリストイル-N-メチルタウリンナトリウム;日光ケミカルズ社製)、NIKKOL SMT(N-ステアロイル-N-メチルタウリンナトリウム;日光ケミカルズ社製)等が挙げられる。
本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法における、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルタウリン、又はその塩の反応液中の濃度は、通常0.001~10%であり、0.01~5%が好ましい。
アルキルスルホ酢酸、又はその塩の具体例(製品)としては、例えばNIKKOL LSA-F(ラウリルスルホ酢酸ナトリウム;日光ケミカルズ社製)等が挙げられる。
本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法における、アルキルスルホ酢酸、又はその塩の反応液中の濃度は、通常0.001~10%であり、0.01~5%が好ましい。
また、本発明において、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸は、塩であってもよい。ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩における塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、モノエタノールアミン塩等が挙げられる。
ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、又はその塩の具体例(製品)としては、例えばNIKKOL AKYPO RLM 45 NV(ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム;日光ケミカルズ社製)、NIKKOL AKYPO RLM 45(ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸;日光ケミカルズ社製)、NIKKOL AKYPO RLM 100(ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸;日光ケミカルズ社製)、NIKKOL ECT-3NEX(ポリオキシエチレントリデシルエーテル酢酸ナトリウム;日光ケミカルズ社製)、NIKKOL ECTD-3NEX(ポリオキシエチレントリデシルエーテル酢酸ナトリウム;日光ケミカルズ社製)、NIKKOL ECTD-6NEX(ポリオキシエチレントリデシルエーテル酢酸ナトリウム;日光ケミカルズ社製)、ネオハイテノールECL-45(ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム;第一工業製薬社製)等が挙げられる。
本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法におけるポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、又はその塩の反応液中の濃度は、通常0.001~10%であり、0.01~5%が好ましい。
本発明における、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルアミノ酸としては、例えばN-アシルアミノ酸、N-アシル-N-アルキルアミノ酸等が挙げられ、N-アシル-N-アルキルアミノ酸等が好ましい。
アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルアミノ酸におけるアミノ酸としては、例えばグリシン、サルコシン、アラニン、β-アラニン,バリン、ロイシン、イソロイシン、リシン、アルギニン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、プロリン等が挙げられる。
アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルアミノ酸におけるアシルとしては、例えば炭素数8~20のアシル等が挙げられ、炭素数10~18のアシルが好ましい。炭素数8~20のアシルとしては、例えばオクタノイル、ノナノイル、デカノイル、ウンデカノイル、ドデカノイル(ラウロイル)、トリデカノイル、テトラデカノイル、ペンタデカノイル、ヘキサデカノイル(パルミトイル)、ヘプタデカノイル、オクタデカノイル(ステアロイル)、オレオイル、バクセノイル、リノレオイル、ノナデカノイル、エイコサノイル等が挙げられる。炭素数10~18のアシルとしては、例えばデカノイル、ウンデカノイル、ドデカノイル(ラウロイル)、トリデカノイル、テトラデカノイル、ペンタデカノイル、ヘキサデカノイル(パルミトイル)、ヘプタデカノイル、オクタデカノイル(ステアロイル)、オレオイル、バクセノイル、リノレオイル等が挙げられる。
N-アシル-N-アルキルアミノ酸における、アルキルとしては、例えば炭素数1~6のアルキル等が挙げられる。炭素数1~6のアルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。
また、本発明において、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルアミノ酸は、塩であってもよい。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、モノエタノールアミン塩等が挙げられる。
本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法における、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルアミノ酸、又はその塩の反応液中の濃度は、通常0.001~10%であり、0.01~5%が好ましい。
また、本発明において、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸は塩であってもよい。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、モノエタノールアミン塩等が挙げられる。
また、本発明において、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸は、塩であってもよい。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、モノエタノールアミン塩等が挙げられる。
本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法におけるポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、又はその塩の反応液中の濃度は、通常0.001~10%であり、0.01~5%が好ましい。
また、本発明において、アルキルリン酸は塩であってもよい。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、モノエタノールアミン塩等が挙げられる。
本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法におけるアルキルリン酸、又はその塩の反応液中の濃度は、通常0.001~10%であり、0.01~5%が好ましい。
水性媒体としては、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。
水性媒体のpHは、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とするpHであれば特に制限はなく、例えばpH4~10である。水性媒体として緩衝液を用いる場合には、設定するpHに応じた緩衝剤を用いることが望ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。
緩衝液の濃度は、通常0.001~2.0mol/Lであり、0.005~1.0mol/Lが好ましい。
<酵素活性測定用試薬>
第1試薬
リン酸緩衝液(pH8.0) 0.1mmol/L
N-エチル-N-(3-メチルフェニル)-N’-サクシニルエチレンジアミン(EMSE) 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 3kU/L
4-アミノアンチピリン 0.1g/L
フルクトシルバリン水溶液 1.7mmol/L
なお、上記フルクトシルバリン水溶液は、J. Agric. Food Chem., 第24巻、第1号、p.70-73 (1976) に記載された方法により調製した。
リン酸緩衝液(pH8.0) 10mmol/L
牛血清アルブミン 0.15%
<サンプル>
FPOX-47△3(糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素)を上記の検体希釈液で希釈したもの
反応セルへ、上記サンプル(2μL)と上記酵素活性測定用試薬の第1試薬(150μL)とを添加し、37℃で3分間反応(第1反応)させた後、上記酵素活性測定用試薬の第2試薬(20μL)を添加し、当該第2試薬を添加3分後の反応液の吸光度[Abs酵素(3分後)]、及び、当該第2試薬を添加5分後の反応液の吸光度[Abs酵素(5分後)]を、共に主波長546nm、副波長700nmで測定し、Abs酵素(5分後)からAbs酵素(3分後)を差し引き、吸光度差△Abs’酵素を算出し、さらに算出した吸光度差△Abs’酵素を2(分)で除して、1分間当たりの吸光度変化量△Abs’酵素/分を算出した。
上記サンプルの代わりに上記検体希釈液を用いる以外は、同様の方法により、吸光度差△Abs’ブランク/分を算出した。
算出した△Abs’酵素/分から△Abs’ブランク/分を差し引き、当該酵素に対する吸光度差△Abs酵素/分を決定した。
上記で決定した△Abs酵素/分を基に、以下の式(I)により酵素活性を算出した。
ロイコ型色原体としては、例えばフェノチアジン系色原体、トリフェニルメタン系色原体、ジフェニルアミン系色原体、o-フェニレンジアミン、ヒドロキシプロピオン酸、ジアミノベンジジン、テトラメチルベンジジン等が挙げられ、フェノチアジン系色原体が好ましい。
フェノチアジン系色原体としては、例えば10-N-カルボキシメチルカルバモイル-3,7-ビス(ジメチルアミノ)-10H-フェノチアジン(CCAP)、10-N-メチルカルバモイル-3,7-ビス(ジメチルアミノ)-10H-フェノチアジン(MCDP)、10-N-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-3,7-ビス(ジメチルアミノ)-10H-フェノチアジン ナトリウム塩(DA-67)等が挙げられる。フェノチアジン系色原体の中でも、10-N-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-3,7-ビス(ジメチルアミノ)-10H-フェノチアジン ナトリウム塩(DA-67)が特に好ましい。
トリフェニルメタン系色原体としては、例えばN,N,N’,N’,N’’,N’’-ヘキサ(3-スルホプロピル)-4,4’,4’’-トリアミノトリフェニルメタン(TPM-PS)等が挙げられる。ジフェニルアミン系色原体としては、例えばN-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-4,4’-ビス(ジメチルアミノ)ジフェニルアミンナトリウム塩(DA-64)、4,4’-ビス(ジメチルアミノ)ジフェニルアミン、ビス〔3-ビス(4-クロロフェニル)メチル-4-ジメチルアミノフェニル〕アミン(BCMA)等が挙げられる。
カプラーとしては、例えば4-アミノアンチピリン(4-AA)、3-メチル-2-ベンゾチアゾリノンヒドラジン等が挙げられる。
アニリン類としては、N-(3-スルホプロピル)アニリン、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メチルアニリン(TOOS)、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメチルアニリン(MAOS)、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン(DAOS)、N-エチル-N-(3-スルホプロピル)-3-メチルアニリン(TOPS)、N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン(HDAOS)、N,N-ジメチル-3-メチルアニリン、N,N-ビス(3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン、N-エチル-N-(3-スルホプロピル)-3-メトキシアニリン、N-エチル-N-(3-スルホプロピル)アニリン、N-エチル-N-(3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン、N-(3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン、N-エチル-N-(3-スルホプロピル)-3,5-ジメチルアニリン、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メトキシアニリン、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)アニリン、N-エチル-N-(3-メチルフェニル)-N’-サクシニルエチレンジアミン(EMSE)、N-エチル-N-(3-メチルフェニル)-N’-アセチルエチレンジアミン、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-4-フルオロ-3,5-ジメトキシアニリン(F-DAOS)等があげられる。
フェノール類としては、フェノール、4-クロロフェノール、3-メチルフェノール、3-ヒドロキシ-2,4,6-トリヨード安息香酸(HTIB)等があげられる。
検出可能な物質が蛍光の場合、過酸化水素測定用試薬は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質と蛍光物質を含む試薬等が挙げられる。蛍光物質としては、例えば4-ヒドロキシフェニル酢酸、3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸、クマリン等が挙げられる。
本発明の、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬は、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、並びに、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも1種のアニオン性界面活性剤を含む試薬であり、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定方法に用いられる。本発明の測定試薬は、さらに、過酸化水素測定試薬を含んでいてもよい。
本発明の糖化ヘモグロビン測定試薬における糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素の含量としては、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.1~30kU/Lとなる含量であり、0.2~15kU/Lとなる含量が好ましい。
本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬は、キットの形態で保存、流通及び使用されてよい。本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キットは、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法に用いられる。本発明の測定キットとしては、例えば2試薬系のキット、3試薬系のキット等が挙げられ、2試薬系キットが好ましい。
アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも1種のアニオン性界面活性剤を含む第1試薬;並びに、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第2試薬を含むキット。
アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも1種のアニオン性界面活性剤を含む第1試薬;並びに、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第2試薬を含み、過酸化水素測定試薬を、第1試薬、第2試薬のいずれか又は両方に含むキット。
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第1試薬;並びに、
アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも1種のアニオン性界面活性剤を含む第2試薬
を含むキット。
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第1試薬;並びに、
アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも1種のアニオン性界面活性剤を含む第2試薬
を含み、過酸化水素測定試薬を、第1試薬、第2試薬のいずれか又は両方に含むキット。
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、並びに、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも1種のアニオン性界面活性剤を含む第1試薬;並びに、
過酸化水素測定試薬を含む第2試薬
を含むキット。
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも1種のアニオン性界面活性剤と、過酸化水素測定試薬とを含む第1試薬;並びに、
過酸化水素測定試薬を含む第2試薬
を含むキット。
過酸化水素測定試薬を含む第1試薬;並びに、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、並びに、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも1種のアニオン性界面活性剤を含む第2試薬
を含むキット。
過酸化水素測定試薬を含む第1試薬;並びに、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいN-アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも1種のアニオン性界面活性剤と、過酸化水素測定試薬を含む第2試薬を含むキット。
本発明の測定キットを構成する試薬における、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素の含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.2~60kU/Lとなる含量であり、0.4~30kU/Lとなる含量が好ましい。
NIKKOL PMT[N-アシルタウリン塩(N-パルミトイル-N-メチルタウリンナトリウム);日光ケミカルズ社製]
NIKKOL LSA-F[アルキルスルホ酢酸塩(ラウリルスルホ酢酸ナトリウム);日光ケミカルズ社製]
NIKKOL AKYPO RLM 45 NV[ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩(ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム);日光ケミカルズ社製]
NIKKOL アラニネートLN-30[N-アシルアミノ酸塩(N-ラウロイル-N-メチル-β-アラニンナトリウム);日光ケミカルズ社製]
NIKKOL サルコシネートPN[N-アシルアミノ酸塩(N-パルミトイルサルコシンナトリウム);日光ケミカルズ社製]
プライサーフA212C[ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸(ポリオキシエチレントリデシルエーテルリン酸);第一工業製薬社製]
プライサーフAL[ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸(ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルリン酸);第一工業製薬社製]
NIKKOL SLP-N[アルキルリン酸塩(ラウリルリン酸ナトリウム);日光ケミカルズ社製)]
NIKKOL SLS(ラウリル硫酸ナトリウム;日光ケミカルズ社製)
NIKKOL OS-14(α-オレフィンスルホン酸ナトリウム;日光ケミカルズ社製)
NIKKOL SBL-2N-27(ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩;日光ケミカルズ社製)
ノンサールLK-2(天然脂肪酸のアルキル金属塩;日油社製)
エチレングリコール(純正化学社製)
プロピレングリコール(純正化学社製)
ポリオキシエチレンセチルエーテル(Brij58;シグマ-アルドリッチ社製)
テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド(C14TMA)(カチオン性界面活性剤;東京化成社製)
ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド(C16TMA)(カチオン性界面活性剤;東京化成社製)
(1)FPOX-47発現ベクターpTrc-FPOX-47の造成
配列番号1で表される塩基配列からなるDNAを含む発現プラスミドpTrc-FPOX-42をテンプレートDNAとして用い、配列番号2で表される塩基配列からなるFPOX-42 F342V-F及び配列番号3で表される塩基配列からなるFPOX-42 F342V-Rをフォワードプライマー及びリバースプライマーとしてそれぞれ用いて、以下の試薬組成及びPCR条件により、PCRを行い、PCR産物を得た。pTrc-FPOX-42は、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素であるFPOX-42をコードするDNAを含む発現プラスミドであり、国際公開第2015/005258号に開示されている方法に従って造成することができる。PCRは、東洋紡社製のPCRキット、DNA polymerase「KOD-Plus-」のプロトコールに基づいて実施した。
・KOD-Plus-バッファー
・テンプレートDNA(pTrc-FPOX-42) 1~2 ng/μL
・フォワードプライマー(FPOX-42 F342V-F) 0.3 μmol/L
・リバースプライマー(FPOX-42 F342V-R) 0.3 μmol/L
・dNTP 混合液 各0.2 mmol/L
・MgSO4 1 mmol/L
・DNA ポリメラーゼ(KOD-Plus-) 0.02 U/μL
・滅菌水添加により、50 μLとした。
1. 94℃ 2分
2. 98℃ 15秒
3. 60℃ 30秒
4. 68℃ 6分
5. 2~4の繰り返し(全30サイクル)
6. 68℃ 10分
次いで、得られたPCR産物の精製試料を用いて東洋紡社製の大腸菌コンピテントセル「Competent high DH5α」に形質転換した。50 mg/L アンピシリンを含有したLB寒天培地上に生育したコロニーを選択し、Promega社製「Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification」を使用して、当該キットのプロトコールに従い、プラスミドを抽出した。
抽出したプラスミドをDNAシークエンサーで配列解析することにより、FPOX-47をコードする、配列番号4で表される塩基配列を有するDNAを含むプラスミド、pTrc-FPOX-47が造成されていることを確認した。配列解析には、pTrc99aベクター(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)のマルチクローニングサイト直前、直後の塩基配列を反映した配列番号5で表される塩基配列からなるpTrc-F及び配列番号6で表される塩基配列からなるpTrc-Rをフォワードプライマー及びリバースプライマーとしてそれぞれ使用した。
プラスミドpTrc-FPOX-47に含まれるFPOX-47をコードする塩基配列の3’末端側の終止コドンの直前に位置する9塩基を除き、終止コドンおよびBam HI制限酵素認識サイトを付加した、配列番号7で表される塩基配列からなるFPOX-47△3-R、及び、pTrc99aベクターのマルチクローニングサイト直前の塩基配列を反映した配列番号5で表される塩基配列からなるpTrc-Fを設計し、化学合成した。
pTrc-F及びFPOX-47△3-Rをプライマー対として用い、pTrc-FPOX-47をテンプレートとして、以下の試薬組成及びPCR条件によりPCRを行い、FPOX-47のC末端の3つのアミノ酸を欠失した欠失体FPOX-47△3をコードする塩基配列を含むDNA断片を含んだPCR産物を得た。PCRは、東洋紡社製のPCRキット、DNA polymerase「KOD-Plus-」のプロトコールに基づいて実施した。
・KOD-Plus-バッファー
・テンプレートDNA(pTrc-FPOX-47) 0.2~0.5 ng/μL
・フォワードプライマー(pTrc-F) 0.3 μmol/L
・リバースプライマー(FPOX-47△3-R) 0.3 μmol/L
・dNTP 混合液 各0.2 mmol/L
・MgSO4 1 mmol/L
・DNA ポリメラーゼ(KOD-Plus-) 0.02 U/μL
・滅菌水添加により、50 μLとした。
1. 94℃ 2分
2. 98℃ 15秒
3. 60℃ 30秒
4. 68℃ 2分
5. 2~4の繰り返し(全30サイクル)
6. 68℃ 5分
得られたPCR産物を、Promega社製「Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system」を用いて、当該キットのプロトコールに従って精製し、FPOX-47△3をコードするDNAを含むDNA断片を得た。得られた当該DNA断片を2種類の制限酵素Nco I及びBam HI(共に、タカラバイオ社製)により37℃で1時間処理し、得られた反応混合物をPromega社製「Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system」を用いて、当該キットのプロトコールに従い精製し、制限酵素処理断片を得た。
得られた制限酵素処理断片と、FPOX-15をコードするDNAが除去されたプラスミド断片とを混合し、DNA Ligation Kit(タカラバイオ社製)を用いてライゲーションした後、ライゲーション産物を東洋紡社製の大腸菌コンピテントセル「Competent high DH5α」に導入した。
ライゲーション産物が導入された大腸菌を50 mg/L アンピシリンを含むLB寒天培地に植菌し、37℃で14時間培養し、出現したコロニーを選択した。選択したコロニーを、50 mg/L アンピシリンを含むLB液体培地で、37℃で14時間培養し、Promega社製「Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification」を使用して、当該キットのプロトコールに従い、プラスミドを調製した。配列番号5で表される塩基配列からなるpTrc-F及び配列番号6で表される塩基配列からなるpTrc-Rをフォワードプライマー及びリバースプライマーとしてそれぞれ用いてPCRを行い、調製したプラスミドの塩基配列を確認し、当該プラスミド上に、FPOX-47の塩基配列の、終止コドンを除いた3’側9塩基が欠失した配列番号8で表される塩基配列が含まれることを確認した。同プラスミドをpTrc-FPOX-47△3と称する。
上記(2)で得られたpTrc-FPOX-47△3を含む大腸菌を、アンピシリン50 mg/Lを含有するLB培地で、37℃、14時間振盪培養した。得られた培養液を用いて、国際公開第2010/041715号パンフレットに記載されている糖化ペプチドオキシダーゼFPOX-9及びFPOX-15の精製方法に従って精製し、精製FPOX-47△3の溶液を得た。FPOX-47のアミノ酸配列を配列番号9に、FPOX-47△3のアミノ酸配列を配列番号10にそれぞれ示す。
上記(3)で得られた精製FPOX-47△3の溶液を用いて、以下の測定キット及び測定手順により、FPOX-47△3のHbA1cに対する糖化ヘモグロビンオキシダーゼ活性を確認した。
第1試薬
Bis-Tris(pH6.5) 50mmol/L
DA-67 40μmol/L
NIKKOL LMT 1g/L
第2試薬
リン酸緩衝液(pH6.5) 10mmol/L
FPOX-47△3 1.5kU/L
ペルオキシダーゼ 200kU/L
第1試薬
Bis-Tris(pH6.5) 50mmol/L
DA-67 40μmol/L
第2試薬
リン酸緩衝液(pH6.5) 10mmol/L
FPOX-47△3 1.5kU/L
ペルオキシダーゼ 200kU/L
ヒトの血液を遠心分離して得られる血球を脱イオン水で希釈して溶血させて調製され、HbA1c測定の基準法であるKO500法と、総ヘモグロビン測定法の1つであるSLS-ヘモグロビン法とから、HbA1c濃度が2.6μmol/L、4.5μmol/L、6.4μmol/L、8.4μmol/Lと値付けされている溶血試料をサンプルとして用いた。
反応セルへ、上記の各サンプル(10μL)と上記測定キットAの第1試薬(100μL)とを添加し、37℃で5分間反応(第1反応)させ、反応液の吸光度(E1)を主波長660nm、副波長800nmで測定し、次いで、この反応液に上記測定キットAの第2試薬(40μL)を添加し、さらに37℃で5分間反応(第2反応)させ、反応液の吸光度(E2)を主波長660nm、副波長800nmで測定した。E2からE1を差し引き、吸光度差△E’Aを算出した。
反応セルへ、上記の各サンプル(10μL)と上記測定キットaの第1試薬(100μL)とを添加し、37℃で5分間反応(第1反応)させ、反応液の吸光度(E3)を主波長660nm、副波長800nmで測定し、次いで、この反応液に上記測定キットaの第2試薬(40μL)を添加し、さらに37℃で5分間反応(第2反応)させ、反応液の吸光度(E4)を主波長660nm、副波長800nmで測定した。E4からE3を差し引き、吸光度差△E’aを算出した。
△E’Aから△E’aを差し引き、各サンプルに対する吸光度差△Eとした。各サンプルにおけるHbA1c濃度と△Eとの関係を図1に示す。
以下の第1試薬及び第2試薬からなるHbA1c測定用キット(キット1A~1I)を調製した。
Bis-Tris(pH6.5) 50mmol/L
DA-67 40μmol/L
界面活性剤A~I(第1表参照)
第2試薬
リン酸緩衝液(pH6.5) 10mmol/L
FPOX-47△3 0.9kU/L
ペルオキシダーゼ 200kU/L
以下の第1試薬及び第2試薬からなるHbA1c測定用キット(キット1a~1e)を調製した。
Bis-Tris(pH6.5) 50mmol/L
DA-67 40μmol/L
界面活性剤a~e(第1表参照)
第2試薬
リン酸緩衝液(pH6.5) 10mmol/L
FPOX-47△3 0.9kU/L
ペルオキシダーゼ 200kU/L
界面活性剤a~eは、国際公開第2015/060429号に記載されているアニオン性界面活性剤である。
HbA1c測定用キットとして、実施例1のキット1Aを用い、試料として、HPLC法であるKO500法によって、HbA1c濃度がそれぞれ4.9%、5.6%、6.7%、7.5%、8.4%及び9.9%と値付けされている、6濃度の全血を用いて、以下の手順により、各試料におけるHbA1c濃度(量)の総ヘモグロビン濃度(量)に対する割合[HbA1c(%)]を決定した。
総ヘモグロビン測定用キットであるヘモグロビンB-テストワコー(SLS-ヘモグロビン法)(和光純薬工業社製)及びヘモグロビンB-テストワコーに付属の標準品(総ヘモグロビン濃度:15.3mg/mL)を用いて、以下の手順に従って測定を行い、当該標準品に対する吸光度を測定した。
反応セルへ、当該標準品(10μL)とヘモグロビンB-テストワコー(250μL)とを添加し、37℃で10分間反応させ、反応液の吸光度(E)を主波長546nm、副波長660nmで測定し、当該標準品に対する吸光度とした。当該標準品の代わりに生理食塩水を用いる以外は同様の方法により測定し、生理食塩水に対する吸光度とした。当該標準品に対する吸光度から、生理食塩水に対する吸光度を差し引いて算出した値を、当該標準品に対するブランク補正吸光度とした。当該標準品に対するブランク補正吸光度と、生理食塩水に対するブランク補正吸光度(0 Abs)とから、総ヘモグロビン濃度(μmol/L)と吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。
KO500法によりHbA1c濃度が2.98μmol/L、6.13μmol/Lと値付けされている2つの血球画分について、実施例1のHbA1c測定用キット1Aを用いて、以下の手順に従って測定し、各血球画分に対する吸光度を測定した。
反応セルへ、上記の各血球画分(10μL)と実施例1のキット1Aの第1試薬(100μL)とを添加し、37℃で5分間反応(第1反応)させ、反応液の吸光度(E1)を主波長660nm、副波長800nmで測定し、次いで、この反応液に実施例1のキット1Aの第2試薬(40μL)を添加し、さらに37℃で5分間反応(第2反応)させ、反応液の吸光度(E2)を主波長660nm、副波長800nmで測定した。E2からE1を差し引き、吸光度差△E’1Aを算出し、各血球画分に対する吸光度とした。上記の各血球画分の代わりに生理食塩水を用いる以外は同様の方法により、吸光度差△E’生理食塩水を算出し、生理食塩水に対する吸光度とした。当該血球画分に対するそれぞれの吸光度から、生理食塩水に対する吸光度を差し引いて算出した値を、当該血球画分に対するブランク補正吸光度とした。当該血球画分に対するブランク補正吸光度と、生理食塩水に対するブランク補正吸光度(0 Abs)とから、HbA1c濃度(μmol/L)と吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。
各試料に対して、25℃、3000rpm(1500×G)で5分間遠心分離を行い、血球画分を得た。各血球画分について、ヘモグロビンB-テストワコーを用いて(1)と同様の方法により測定を行い、得られた測定値と(1)の検量線とから、各血球画分中の総ヘモグロビン濃度(μmol/L)を決定した。
(3)で得られた各血球画分について、本発明の測定キット1Aを用いて(2)と同様の方法により測定を行い、得られた測定値と(2)の検量線とから、各血球画分中のHbA1c濃度(μmol/L)を決定した。
上記(3)で決定した各血球画分における総ヘモグロビン濃度(μmol/L)と、上記(4)で決定した各血球画分におけるHbA1c濃度(μmol/L)とから、以下の式(II)により、HbA1c(%)をNGSP値(国際標準値)として算出した。
上記(5)でのHbA1c(%)の決定に使用した血球画分と同一の血球画分を用いて、各血球画分中のHbA1c(%)を、HPLCを用いるKO500法により決定した。
本発明の測定方法を用いて、上記(5)で決定したHbA1c(%)と、KO500法を用いて、上記(6)で決定したHbA1c(%)とから、本発明の測定方法とKO500法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。
その結果、両測定法間の相関係数が0.943となり、両測定法間に良好な相関関係が認められた。従って、実施例1のキット1Aを用いる本発明の測定方法により、試料中のHbA1cを正確に測定できることが明らかとなった。
実施例1のキット1Aの代わりに、実施例1のキット1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H及び1Iの各キットを用いる以外は上記と同様の手順により、各試料中のHbA1c(%)を決定し、キット1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H及び1Iの各キットを用いる測定方法とKO500法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。その結果を第1表に示す。
実施例1のキット1Aの代わりに、比較例1のキット1a、1b、1c、1d及び1eの各キットを用いる以外は実施例2と同様の手順により、各血球画分中のHbA1c(%)を決定し、キット1a、1b、1c、1d及び1eの各キットを用いる測定方法とKO500法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。その結果を第1表に示す。
以下の第1試薬及び第2試薬からなるHbA1c測定用キット(キット2A~2I)を調製した。
Bis-Tris(pH6.5) 50mmol/L
DA-67 40μmol/L
界面活性剤A~I(第2表参照)
第2試薬
リン酸緩衝液(pH6.5) 10mmol/L
FPOX-47△3 1.5kU/L
ペルオキシダーゼ 200kU/L
以下の第1試薬及び第2試薬からなるHbA1c測定用キット(キット2a~2e)を調製した。
Bis-Tris(pH6.5) 50mmol/L
DA-67 40μmol/L
界面活性剤a~e(第2表参照)
第2試薬
リン酸緩衝液(pH6.5) 10mmol/L
FPOX-47△3 1.5kU/L
ペルオキシダーゼ 200kU/L
界面活性剤a~eは、国際公開第2015/060429号に記載されているアニオン性界面活性剤である。比較例3の各キット(キット2a~2e)は、第2試薬中のFPOX-47△3が1.5kU/Lであること以外は、比較例1の各キット(キット1a~1e)と同じである。
HbA1c測定用キットとして、実施例3のキット2Aを用い、試料として、HPLC法であるKO500法によって、HbA1c濃度がそれぞれ4.9%、5.6%、6.7%、7.5%、8.4%及び9.9%と値付けされている6濃度の全血を用いて、以下の手順により、各試料におけるHbA1c濃度(量)の総ヘモグロビン濃度(量)に対する割合[HbA1c(%)]を決定した。
総ヘモグロビン測定用キットであるヘモグロビンB-テストワコー(SLS-ヘモグロビン法)(和光純薬工業社製)を用いて、実施例2の(1)と同様の測定を行い、総ヘモグロビン濃度と吸光度との関係を示す検量線を作成した。
KO500法によりHbA1c濃度が2.54μmol/L、6.40μmol/Lと値付けされている2つの血球画分について、実施例3のHbA1c測定用キット2Aを用いて、実施例2の(2)と同様の測定を行い、各血球画分に対する吸光度を測定した。当該血球画分の代わりに生理食塩水を用いて同様の測定を行い、生理食塩水に対する吸光度を測定した。当該血球画分に対するそれぞれの吸光度から、生理食塩水に対する吸光度を差し引いて算出した値を、当該血球画分に対するブランク補正吸光度とした。当該血球画分に対するブランク補正吸光度と、生理食塩水に対するブランク補正吸光度(0 Abs)とから、HbA1c濃度(μmol/L)と吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。
各試料に対して、25℃、3000rpm(1500×G)で5分間遠心分離を行い、血球画分を得た。各血球画分について、ヘモグロビンB-テストワコーを用いて(1)と同様の方法により測定を行い、得られた測定値と(1)の検量線とから、各血球画分中の総ヘモグロビン濃度(μmol/L)を決定した。
(3)で得られた各血球画分について、本発明の測定キット2Aを用いて(2)と同様の方法により測定を行い、得られた測定値と(2)の検量線とから、各血球画分中のHbA1c濃度(μmol/L)を決定した。
上記(3)で決定した各血球画分における総ヘモグロビン濃度(μmol/L)と、上記(4)で決定した各血球画分におけるHbA1c濃度(μmol/L)とから、以下の式(II)により、HbA1c(%)をNGSP値(国際標準値)として算出した。
上記(5)でのHbA1c(%)の決定に使用した血球画分と同一の血球画分を用いて、各血球画分中のHbA1c(%)を、HPLCを用いるKO500法により決定した。
本発明の測定方法を用いて、上記(5)で決定したHbA1c(%)と、KO500法を用いて、上記(6)で決定したHbA1c(%)とから、本発明の測定方法とKO500法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。その結果、両測定法間の相関係数が0.998となり、両測定法間に良好な相関関係が認められた。従って、実施例3のキット2Aを用いる本発明の測定方法により、試料中のHbA1cを正確に測定できることが明らかとなった。
上記(4)で決定した各血球画分中のHbA1c濃度(x軸)と、各血球画分に対する吸光度(y軸)との間の関係を表す1次関数の傾きを決定し、HbA1c測定における感度の指標とした。当該傾きは、HbA1c(1μmol/L)に対する吸光度である。その結果、傾きは0.0108であった。
実施例3のキット2Aの代わりに、実施例3のキット2B、2C、2D、2E、2F、2G、2H及び2Iの各キットを用いる以外は上記と同様の手順により、各試料中のHbA1c(%)を決定し、キット2B、2C、2D、2E、2F、2G、2H及び2Iの各キットを用いる測定方法とKO500法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。その結果を第2表に示す。
また、実施例3のキット2Aの代わりに、実施例3のキット2B、2C、2D、2E、2F、2G、2H及び2Iの各キットを用いる以外は上記(8)と同様の手順により、各キットを用いる測定における、HbA1c(1μmol/L)に対する吸光度を決定した。その結果を第2表に示す。
実施例3のキット2Aの代わりに、比較例3のキット2a、2b、2c、2d及び2eの各キットを用いる以外は実施例4と同様の手順により、各血球画分中のHbA1c(%)を決定し、キット2a、2b、2c、2d及び2eの各キットを用いる測定方法とKO500法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。その結果を第2表に示す。
また、比較例3のキット2b、2c及び2dの各キットを用いる測定における、各血球画分に対する吸光度(y軸)との間の関係を表す1次関数の傾きを決定し、HbA1c測定における感度の指標とした。当該相関式の傾きは、HbA1c(1μmol/L)当たりの吸光度である。その結果を第2表に示す。
さらに、第2表から明らかな様に、本発明の実施例3のキット2A~2Iを用いる測定は、比較例3のキット2a~2dを用いる測定に比較して、HbA1c濃度(μmol/L)当たりの吸光度が大きかった。従って、本発明の測定方法は、比較例3のキット2a~2eを用いる測定方法に比較して感度が高く、本発明の測定方法により、糖化ヘモグロビンを高感度に測定できることが明らかとなった。
以下の第1試薬及び第2試薬からなるHbA1c測定用キット(キット2J~2L)を調製した。
Bis-Tris(pH6.5) 50mmol/L
DA-67 40μmol/L
NIKKOL LMT 1.0g/L
第2試薬
リン酸緩衝液(pH6.5) 10mmol/L
FPOX-47△3 1.5kU/L
ペルオキシダーゼ 200kU/L
安定化剤J~L(第3表参照)
実施例3のキット2Aに加えて実施例5のキット2J、2K及び2Lの各キットを用いる以外は実施例4と同様の手順により、各血球画分中のHbA1c(%)を決定し、キット2A、2J、2K及び2Lの各キットを用いる測定方法とKO500法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。その結果を第3表に示す。
また、実施例3のキット2A並びに実施例5のキット2J、2K及び2Lの各キットを用いる測定における、各血球画分に対する吸光度(y軸)との間の関係を表す1次関数の傾きを決定し、HbA1c測定における感度の指標とした。当該相関式の傾きは、HbA1c(1μmol/L)当たりの吸光度である。その結果を第3表に示す。
また、第3表から明らかな様に、本発明の実施例5のキット2J~2Lを用いる測定は、実施例3のキット2Aを用いる測定と同様に、HbA1c濃度(μmol/L)当たりの吸光度が0.008以上であった。
したがって、アニオン性界面活性剤であるN-アシルタウリン塩を用いる本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法は、安定化剤であるグリセリン又はアルキレングリコールの存在下においても正確、かつ、高感度な測定方法であることが明らかとなった。
(1)溶血検体の調製
ヒト血液を遠心分離して得られた血球画分を、総ヘモグロビン測定試薬であるヘモグロビンB-テストワコーを用いて実施例2の(1)と同様の測定を行い、得られた吸光度と実施例2の(1)で作成した総ヘモグロビン濃度(μmol/L)と吸光度との間の関係を示す検量線とから、該血球画分の総ヘモグロビン濃度を決定した。次いで、この値付けされた該血球画分を精製水で希釈して溶血させ、総ヘモグロビン濃度が4mg/mL、6mg/mL及び8mg/mLの各溶血検体を調製した。
KO500法によりHbA1c濃度が2.98μmol/L、6.13μmol/Lと値付けされている2つの血球画分について、実施例3のキット2Aを用いて、以下の手順に従って測定し、各血球画分に対する吸光度を測定した。
反応セルへ、上記の各血球画分(9.6μL)と実施例3のキット2Aの第1試薬(120μL)とを添加し、37℃で5分間反応(第1反応)させ、反応液の吸光度(E1)を主波長660nm、副波長800nmで測定し、次いで、この反応液に実施例3のキット2Aの第2試薬(40μL)を添加し、さらに37℃で5分間反応(第2反応)させ、反応液の吸光度(E2)を主波長660nm、副波長800nmで測定した。E2からE1を差し引き、吸光度差△E’2Aを算出し、各血球分画に対する吸光度とした。上記の各血球画分の代わりに生理食塩水を用いる以外は同様の方法により、吸光度差△E’生理食塩水を算出し、生理食塩水に対する吸光度とした。当該血球分画に対するそれぞれの吸光度から、生理食塩水に対する吸光度を差し引いて算出した値を、当該血球分画に対するブランク補正吸光度とした。当該血球分画に対するブランク補正吸光度と、生理食塩水に対するブランク補正吸光度(0 Abs)とから、HbA1c濃度(μmol/L)と吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。
(1)で調製した各溶血検体について、実施例3のキット2Aを用いて(2)と同様の方法により測定を行い、得られた測定値と(2)の検量線とから、各溶血検体中のHbA1c濃度(μmol/L)を測定した。
上記(1)で調製した各溶血検体における総ヘモグロビン濃度(μmol/L)と、上記(3)で測定した各溶血検体におけるHbA1c濃度(μmol/L) とから、以下の式(II)により、HbA1c(%)をNGSP値(国際標準値)として算出した。
総ヘモグロビン濃度が6mg/mLである溶血検体でのHbA1c濃度(%)を基準0とし、その基準からの各溶血検体のHbA1c濃度(%)の差[△HbA1c濃度(%)]を算出した。その結果を第4表に示す。
実施例3のキット2Aの代わりに、比較例3のキット2b~2dの各キットを用いる以外は、実施例7と同様の方法により、各キットに対して、各溶血検体中のHbA1c濃度(%)を測定した。総ヘモグロビン濃度が6mg/mLである溶血検体でのHbA1c濃度(%)を基準0とし、その基準からの各溶血検体のHbA1c濃度(%)の差[△HbA1c濃度(%)]を算出した。その結果を第4表に示す。
以下の第1試薬及び第2試薬からなるHbA1c測定用キット(キット2f~2m)を調製した。
Bis-Tris(pH6.5) 50mmol/L
DA-67 40μmol/L
界面活性剤f~m(第5表参照)
第2試薬
リン酸緩衝液(pH6.5) 10mmol/L
FPOX-47△3 1.5kU/L
ペルオキシダーゼ 200kU/L
HbA1c測定用キットとして、実施例3のキット2Aを用い、試料として、HPLC法であるKO500法によって、HbA1c濃度がそれぞれ4.9%、5.6%、6.7%、7.5%、8.4%及び9.9%と値付けされている6濃度の全血を用いて、実施例4と同様の手順により、KO500法との相関に係る相関係数、及び、感度の指標としてのHbA1c(1μmol/L)当たりの吸光度を決定した。その結果を第5表に示す。
HbA1c測定用キットとして、比較例6のキット2f~2mの各キットを用い、試料として、HPLC法であるKO500法によって、HbA1c濃度がそれぞれ4.9%、5.6%、6.7%、7.5%、8.4%及び9.9%と値付けされている6濃度の全血を用いて、実施例4と同様の手順により、KO500法との相関に係る相関係数、及び、感度の指標としてのHbA1c(1μmol/L)当たりの吸光度を決定した。その結果を第5表に示す。
また、第5表から明らかな様に、本発明の実施例3のキット2Aを用いる測定は、比較例6のキット2f~2mを用いる測定に比較して、HbA1c濃度(μmol/L)当たりの吸光度が大きかった。従って、本発明の測定方法は、比較例6のキット2f~2mを用いる測定に比較して感度が高く、本発明の測定方法により、糖化ヘモグロビンを高感度に測定できることが明らかとなった。
以下の、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第1試薬、及び、アニオン性界面活性剤であるN-アシルタウリン塩を含む第2試薬からなるHbA1c測定用キット(キット3A)を調製した。
Bis-Tris(pH7.0) 50mmol/L
DA-67 40μmol/L
FPOX-47△3 0.6kU/L
第2試薬
Bis-Tris(pH7.0) 50mmol/L
アジ化ナトリウム 0.1g/L
NIKKOL LMT 4.5g/L
ペルオキシダーゼ 200kU/L
HbA1c測定用キットとして、実施例9のキット3Aを用い、試料として、HPLC法であるKO500法によって、HbA1c濃度がそれぞれ3.7%、4.4%、5.4%、6.7%、及び9.2%と値付けされている5濃度の全血を用いて、以下の手順により、各試料におけるHbA1c濃度(量)の総ヘモグロビン濃度(量)に対する割合[HbA1c(%)]を決定した。
総ヘモグロビン測定用キットであるヘモグロビンB-テストワコー(SLS-ヘモグロビン法)(和光純薬工業社製)を用いて、実施例2の(1)と同様の測定を行い、総ヘモグロビン濃度と吸光度との関係を示す検量線を作成した。
KO500法によりHbA1c濃度が3.64μmol/L、9.18μmol/Lと値付けされている2つの血球画分について、実施例9のHbA1c測定用キット3Aを用いて、実施例7の(2)と同様の測定を行い、各血球画分に対する吸光度を測定した。当該血球画分の代わりに生理食塩水を用いて同様の測定を行い、生理食塩水に対する吸光度を測定した。当該血球画分に対するそれぞれの吸光度から、生理食塩水に対する吸光度を差し引いて算出した値を、当該血球画分に対するブランク補正吸光度とした。当該血球画分に対するブランク補正吸光度と、生理食塩水に対するブランク補正吸光度(0 Abs)とから、HbA1c濃度(μmol/L)と吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。
各試料に対して、25℃、3000rpm(1500×G)で5分間遠心分離を行い、血球画分を得た。各血球画分について、ヘモグロビンB-テストワコーを用いて(1)と同様の方法により測定を行い、得られた測定値と(1)の検量線とから、各血球画分中の総ヘモグロビン濃度(μmol/L)を決定した。
(3)で得られた各血球画分について、本発明の測定キット3Aを用いて(2)と同様の方法により測定を行い、得られた測定値と(2)の検量線とから、各血球画分中のHbA1c濃度(μmol/L)を決定した。
上記(3)で決定した各血球画分における総ヘモグロビン濃度(μmol/L)と、上記(4)で決定した各血球画分におけるHbA1c濃度(μmol/L)とから、以下の式(II)により、HbA1c(%)をNGSP値(国際標準値)として算出した。
上記(5)でのHbA1c(%)の決定に使用した血球画分と同一の血球画分を用いて、各血球画分中のHbA1c(%)を、HPLCを用いるKO500法により決定した。
本発明の測定方法を用いて、上記(5)で決定したHbA1c(%)と、KO500法を用いて、上記(6)で決定したHbA1c(%)とから、本発明の測定方法とKO500法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。その結果、両測定法間の相関係数が0.974となり、両測定法間に良好な相関関係が認められた。
上記(4)で決定した各血球画分中のHbA1c濃度(x軸)と、各血球画分に対する吸光度(y軸)との間の関係を表す1次関数の傾きを決定し、HbA1c測定における感度の指標とした。当該傾きは、HbA1c(1μmol/L)に対する吸光度である。その結果、傾きは0.0058であった。
Claims (15)
- ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、アミノ基の水素原子が炭素数1~6のアルキル基で置換されていてもよいN-アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が炭素数1~6のアルキル基で置換されていてもよいN-アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも1種のアニオン性界面活性剤の存在下に反応させて過酸化水素を生成させ、生成した前記過酸化水素を測定することを特徴とする、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。
- 前記過酸化水素の測定が、過酸化水素測定試薬により行われる、請求項1記載の測定方法。
- 前記過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である請求項2記載の測定方法。
- 前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である請求項3記載の測定方法。
- 前記フェノチアジン系色原体が、10-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-3,7-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジン又はその塩である請求項4記載の測定方法。
- 糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、並びに、アミノ基の水素原子が炭素数1~6のアルキル基で置換されていてもよいN-アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が炭素数1~6のアルキル基で置換されていてもよいN-アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも1種のアニオン性界面活性剤を含むヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬。
- さらに、過酸化水素測定試薬を含む、請求項6記載の測定試薬。
- 前記過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である請求項7記載の測定試薬。
- 前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である請求項8記載の測定試薬。
- 前記フェノチアジン系色原体が、10-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-3,7-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジン又はその塩である請求項9記載の測定試薬。
- アミノ基の水素原子が炭素数1~6のアルキル基で置換されていてもよいN-アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が炭素数1~6のアルキル基で置換されていてもよいN-アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも1種のアニオン性界面活性剤を含む第1試薬と、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第2試薬とを含むヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キット。
- 糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第1試薬と、アミノ基の水素原子が炭素数1~6のアルキル基で置換されていてもよいN-アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、アミノ基の水素原子が炭素数1~6のアルキル基で置換されていてもよいN-アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも1種のアニオン性界面活性剤を含む第2試薬とを含むヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キット。
- さらに、ペルオキシダーゼ及びロイコ型色原体を、それぞれ第1試薬と第2試薬、又は、第2試薬と第1試薬に含む、請求項11又は12記載の測定キット。
- 前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である請求項13記載の測定キット。
- 前記フェノチアジン系色原体が、10-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-3,7-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジン又はその塩である請求項14記載の測定キット。
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