CN109563534A

CN109563534A - 糖化血红蛋白的测定方法

Info

Publication number: CN109563534A
Application number: CN201780045924.5A
Authority: CN
Inventors: 征矢阳代; 片山有基; 小川德之
Original assignee: Kyowa Medex Co Ltd
Current assignee: Hitachi Chemical Diagnostics Systems Co Ltd
Priority date: 2016-07-29
Filing date: 2017-07-28
Publication date: 2019-04-02
Anticipated expiration: 2037-07-28
Also published as: EP3492600C0; JPWO2018021530A1; US20190249222A1; WO2018021530A1; US11168349B2; JP7020413B2; EP3492600B1; EP3492600A4; CN109563534B; EP3492600A1

Abstract

一种含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白的测定方法，其特征在于，使含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白与催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶在选自由氨基的氢原子可被取代基取代的N‑酰基牛磺酸、烷基磺基乙酸、聚氧乙烯烷基醚乙酸、氨基的氢原子可被取代基取代的N‑酰基氨基酸、聚氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯多环苯基醚磷酸、烷基磷酸及它们的盐组成的组中的至少1种阴离子性表面活性剂的存在下反应而生成过氧化氢，对所生成的所述过氧化氢进行测定。

Description

糖化血红蛋白的测定方法

技术领域

本发明涉及样本中的糖化血红蛋白的测定方法、测定试剂及测定试剂盒。

本申请基于2016年7月29日在日本提出的日本特愿2016-150498号要求优先权，将其内容援引于此。

背景技术

糖化蛋白质包含于生物体内的血液等体液、毛发等生物试样中。存在于血液中的糖化蛋白质的浓度依赖于血清中所溶解的葡萄糖等糖类的浓度，在临床诊断领域中，作为血液中的糖化蛋白质的血红蛋白A1c(以下称为HbA1c)的浓度测定被用于糖尿病的诊断、监控中(参照非专利文献1)。血红蛋白是具有α链及β链这2种亚单位各2个、分子量为64000的血红素蛋白。HbA1c特别被定义为将β链的N末端缬氨酸残基被糖化的血红蛋白。作为测定该HbA1c的方法，已知使用高效液相色谱(HPLC)的仪器分析方法(参照非专利文献2)、使用抗原抗体反应的免疫测定法(非专利文献3)等。

近年来，正在进行能应用于具有通用性的自动分析装置、并且操作也简便的HbA1c的酶测定法的开发，并且已报道了各种方法。迄今为止所报道的HbA1c的酶测定法主要为使用蛋白酶和糖化肽氧化酶的方法。即，使蛋白酶作用于血细胞中的HbA1c而生成作为糖化肽的果糖基二肽(Fru-Val-His)，使果糖基肽氧化酶作用于所生成的该果糖基二肽而生成过氧化氢，测定所生成的过氧化氢，由此测定样本中的HbA1c的方法(参照专利文献1)；使蛋白酶作用于血细胞中的HbA1c而生成作为糖化肽的果糖基六肽(Fru-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu)，使果糖基六肽氧化酶作用于所生成的该果糖基六肽而生成过氧化氢，测定所生成的过氧化氢，由此测定样本中的HbA1c的方法(参照专利文献2～4)。另一方面，还已知如下方法：不使用蛋白酶而是使用催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶，测定样本中的糖化血红蛋白(参照专利文献4～6)。

另外报道了一种HbA1c浓度及HbA1c浓度比的测定方法，其特征在于，对至少用阴离子性表面活性剂进行了预处理的含有血红蛋白的试样中的血红蛋白进行测定，进而使会生成果糖基缬氨酰组氨酸的蛋白分解酶作用于血红蛋白测定用反应液，进行HbA1c浓度测定(参照专利文献7)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2001-95598号公报

专利文献2：国际公开第2008/108385号

专利文献3：国际公开第2013/162035号

专利文献4：国际公开第2015/005258号

专利文献5：国际公开第2015/005257号

专利文献6：国际公开第2015/060429号

专利文献7：国际公开第2005/049858号

非专利文献

非专利文献1：Clin Chem Lab Med，第36卷、p.299-308(1998).

非专利文献2：Diabetes，第27卷、第2期、p.102-107(1978).

非专利文献3：日本临床检查自动化学会会刊、第18卷、第4期、p.620(1993).

发明内容

发明所要解决的问题

以往的不使用蛋白酶、而是使用催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶的方法存在灵敏度不充分的问题。

因此，本发明的目的在于，提供使用催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶来简便且高灵敏度地测定样本中的糖化血红蛋白的方法、试剂及试剂盒。

用于解决问题的方法

本发明人为了解决该问题而进行了深入研究，发现了如下方法，通过使含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白与催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶在特定的阴离子性表面活性剂的存在下反应，可以简便且高灵敏度地测定含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白，从而完成了本发明。

即，本发明涉及以下的[1]～[15]。

[1]一种含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白的测定方法，其特征在于，使含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白与催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶在选自由氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸、烷基磺基乙酸、聚氧乙烯烷基醚乙酸、氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸、聚氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯多环苯基醚磷酸、烷基磷酸及它们的盐组成的组中的至少1种阴离子性表面活性剂的存在下反应而生成过氧化氢，对所生成的上述过氧化氢进行测定。

[2]根据[1]所述的测定方法，其中，上述过氧化氢的测定利用过氧化氢测定试剂进行。

[3]根据[2]所述的测定方法，其中，上述过氧化氢测定试剂为含有过氧化物酶和无色型色原体的试剂。

[4]根据[3]所述的测定方法，其中，上述无色型色原体为吩噻嗪系色原体。

[5]根据[4]所述的测定方法，其中，上述吩噻嗪系色原体为10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪或其盐。

[6]一种含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白的测定试剂，其含有：催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶；以及选自由氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸、烷基磺基乙酸、聚氧乙烯烷基醚乙酸、氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸、聚氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯多环苯基醚磷酸、烷基磷酸及它们的盐组成的组中的至少1种阴离子性表面活性剂。

[7]根据[6]所述的测定试剂，其还含有过氧化氢测定试剂。

[8]根据[7]所述的测定试剂，其中，上述过氧化氢测定试剂为含有过氧化物酶和无色型色原体的试剂。

[9]根据[8]所述的测定试剂，其中，上述无色型色原体为吩噻嗪系色原体。

[10]根据[9]所述的测定试剂，其中，上述吩噻嗪系色原体为10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪或其盐。

[11]一种含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白的测定试剂盒，其包含：含有选自由氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸、烷基磺基乙酸、聚氧乙烯烷基醚乙酸、氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸、聚氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯多环苯基醚磷酸、烷基磷酸及它们的盐组成的组中的至少1种阴离子性表面活性剂的第一试剂；以及含有催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶的第二试剂。

[12]一种含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白的测定试剂盒，其包含：含有催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶的第一试剂；以及含有选自由氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸、烷基磺基乙酸、聚氧乙烯烷基醚乙酸、氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸、聚氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯多环苯基醚磷酸、烷基磷酸及它们的盐组成的组中的至少1种阴离子性表面活性剂的第二试剂。

[13]根据[11]或[12]所述的测定试剂盒，其中，进一步将过氧化物酶及无色型色原体分别包含在第一试剂和第二试剂中、或者第二试剂和第一试剂中。

[14]根据[13]所述的测定试剂盒，其中，上述无色型色原体为吩噻嗪系色原体。

[15]根据[14]所述的测定试剂盒，其中，上述吩噻嗪系色原体为10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪或其盐。

发明效果

根据本发明，提供简便且高灵敏度地测定含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白的方法、试剂及试剂盒。

附图说明

图1是示出使用在第二试剂中含有FPOX-47Δ3的试剂盒A的含血红蛋白试样中的HbA1c的测定中的、HbA1c浓度与吸光度差ΔE的关系的图。纵轴表示吸光度差ΔE(Abs×10000)，横轴表示HbA1c浓度(μmol/L)。

具体实施方式

(1)含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白的测定方法

本发明的含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白的测定方法的特征在于，使含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白与催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶在选自由氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸、烷基磺基乙酸、聚氧乙烯烷基醚乙酸、氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸、聚氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯多环苯基醚磷酸、烷基磷酸及它们的盐组成的组中的至少1种阴离子性表面活性剂的存在下反应而生成过氧化氢，对所生成的上述过氧化氢进行测定。

具体为含有以下的步骤的测定方法。

(i)使含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白与催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶在含有选自由氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸、烷基磺基乙酸、聚氧乙烯烷基醚乙酸、氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸、聚氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯多环苯基醚磷酸、烷基磷酸及它们的盐组成的组中的至少1种阴离子性表面活性剂的水性介质中反应而生成过氧化氢的步骤；

(ii)测定上述步骤(i)中所生成的过氧化氢的步骤；以及，

(iii)将上述步骤(ii)中测定出的上述过氧化氢量与使用已知浓度的糖化血红蛋白通过上述(i)及(ii)进行测定而预先制作的、表示过氧化氢量与糖化血红蛋白浓度的关系的标准曲线进行对照，从而确定含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白浓度的步骤。

另外，本发明的含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白的测定方法还包含：计算含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白量相对于总血红蛋白量(即，血红蛋白和糖化血红蛋白相加而得的总量)的比例的方法。这种情况下，本发明的含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白的测定方法具体为含有以下的步骤的测定方法。

(i)测定含血红蛋白试样中的总血红蛋白量的步骤；

(ii)使含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白与催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶在含有选自由氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸、烷基磺基乙酸、聚氧乙烯烷基醚乙酸、氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸、聚氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯多环苯基醚磷酸、烷基磷酸及它们的盐组成的组中的至少1种阴离子性表面活性剂的水性介质中反应而生成过氧化氢的步骤；

(iii)测定上述步骤(ii)中所生成的上述过氧化氢的步骤；

(iv)将上述步骤(iii)中测定出的上述过氧化氢量与使用已知量的糖化血红蛋白通过上述(ii)及(iii)进行测定而预先制作的、表示过氧化氢量与糖化血红蛋白量的关系的标准曲线进行对照，从而测定含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白量的步骤；以及，

(v)由上述步骤(i)中测定出的上述总血红蛋白量和上述步骤(iv)中测定出的上述糖化血红蛋白量，计算含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白量相对于总血红蛋白量的比例的步骤。

需要说明的是，上述步骤(i)的总血红蛋白量的测定也可以在向含血红蛋白试样中添加选自由氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸、烷基磺基乙酸、聚氧乙烯烷基醚乙酸、氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸、聚氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯多环苯基醚磷酸、烷基磷酸及它们的盐组成的组中的至少1种阴离子性表面活性剂而使含血红蛋白试样中的血红蛋白及糖化血红蛋白变性之后进行。

本发明的测定方法中的含血红蛋白试样只要是含有血红蛋白、可应用本发明的糖化血红蛋白的测定方法的试样则没有特别限制，可列举例如全血、血细胞、在血细胞中混有血浆的试样、对这些试样进行溶血处理而得的试样等。作为溶血处理，只要是使全血、血细胞、在血细胞中混有血浆的试样溶血的处理则没有特别限制，可列举例如物理方法、化学方法、生物学方法等。作为物理方法，可列举例如使用蒸馏水等低渗液的方法、使用超声波的方法等。作为化学方法，可列举例如：使用甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂的方法；使用聚氧乙烯系表面活性剂的方法等。作为生物学方法，可列举例如使用抗体、补体的方法等。

本发明中的糖化血红蛋白是葡萄糖等糖结合于血红蛋白而生成的，可列举血红蛋白A1a、血红蛋白A1b、HbA1c等，优选HbA1c。

本发明中，使用选自由氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸、烷基磺基乙酸、聚氧乙烯烷基醚乙酸、氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸、聚氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯多环苯基醚磷酸、烷基磷酸及它们的盐组成的组中的至少1种阴离子性表面活性剂。

作为本发明中的氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸中的取代基，可列举例如烷基、卤代烷基、苯基等。作为卤代烷基，可列举例如氟代烷基、氯代烷基、溴代烷基、碘代烷基等。作为烷基及卤代烷基中的烷基，可列举例如碳原子数1～6的烷基等。作为碳原子数1～6的烷基，可列举例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基等。

作为本发明中的氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸，可列举例如N-酰基牛磺酸、N-酰基-N-烷基牛磺酸等，优选N-酰基-N-烷基牛磺酸等。

作为氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸中的酰基，可列举例如碳原子数8～20的酰基等，优选碳原子数10～18的酰基。作为碳原子数8～20的酰基，可列举例如辛酰基、壬酰基、癸酰基、十一烷酰基、十二烷酰基(月桂酰基)、十三烷酰基、十四烷酰基、十五烷酰基、十六烷酰基(棕榈酰基)、十七烷酰基、十八烷酰基(硬脂酰基)、油酰基、十八碳烯酰基(Vaccenoyl)、亚油酰基、十九烷酰基、二十烷酰基等。作为碳原子数10～18的酰基，可列举例如癸酰基、十一烷酰基、十二烷酰基(月桂酰基)、十三烷酰基、十四烷酰基、十五烷酰基、十六烷酰基(棕榈酰基)、十七烷酰基、十八烷酰基(硬脂酰基)、油酰基、十八碳烯酰基、亚油酰基等。

作为N-酰基-N-烷基牛磺酸中的烷基，可列举例如碳原子数1～6的烷基等。作为碳原子数1～6的烷基，可列举例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基等。

另外，本发明中，氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸可以为盐。作为盐，可列举例如钠盐、钾盐、铵盐、镁盐、钙盐、单乙醇胺盐等。

作为氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸或其盐的具体例子(制品)，可列举例如NIKKOL LMT(N-月桂酰基-N-甲基牛磺酸钠；日光化学公司制)、NIKKOL PMT(N-棕榈酰基-N-甲基牛磺酸钠；日光化学公司制)、NIKKOL MMT(N-肉豆蔻酰基-N-甲基牛磺酸钠；日光化学公司制)、NIKKOL SMT(N-硬脂酰基-N-甲基牛磺酸钠；日光化学公司制)等。

本发明的糖化血红蛋白的测定方法中的氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸或其盐在反应液中的浓度通常为0.001～10％，优选为0.01～5％。

作为本发明中的烷基磺基乙酸中的烷基，可列举例如碳原子数8～20的烷基等，优选碳原子数10～18的烷基。作为碳原子数8～20的烷基，可列举例如辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、油基、十九烷基、二十烷基等。作为碳原子数10～18的烷基，可列举例如癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、油基等。

另外，本发明中，烷基磺基乙酸可以为盐。作为盐，可列举例如钠盐、钾盐、铵盐、镁盐、钙盐、单乙醇胺盐等。

作为烷基磺基乙酸或其盐的具体例子(制品)，可列举例如NIKKOL LSA-F(月桂基磺基乙酸钠；日光化学公司制)等。

本发明的糖化血红蛋白的测定方法中的烷基磺基乙酸或其盐在反应液中的浓度通常为0.001～10％，优选为0.01～5％。

作为本发明中的聚氧乙烯烷基醚乙酸中的烷基，可列举例如碳原子数8～20的烷基等，优选碳原子数10～18的烷基。作为碳原子数8～20的烷基，可列举例如辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、油基、十九烷基、二十烷基等。作为碳原子数10～18的烷基，可列举例如癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、油基等。

另外，本发明中，聚氧乙烯烷基醚乙酸可以为盐。作为聚氧乙烯烷基醚乙酸盐中的盐，可列举例如钠盐、钾盐、铵盐、镁盐、钙盐、单乙醇胺盐等。

作为聚氧乙烯烷基醚乙酸或其盐的具体例子(制品)，可列举例如NIKKOL AKYPORLM 45 NV(聚氧乙烯月桂基醚乙酸钠；日光化学公司制)、NIKKOL AKYPO RLM 45(聚氧乙烯月桂基醚乙酸；日光化学公司制)、NIKKOL AKYPO RLM 100(聚氧乙烯月桂基醚乙酸；日光化学公司制)、NIKKOL ECT-3NEX(聚氧乙烯十三烷基醚乙酸钠；日光化学公司制)、NIKKOLECTD-3NEX(聚氧乙烯十三烷基醚乙酸钠；日光化学公司制)、NIKKOL ECTD-6NEX(聚氧乙烯十三烷基醚乙酸钠；日光化学公司制)、Neohitenol ECL-45(聚氧乙烯月桂基醚乙酸钠；第一工业制药公司制)等。

本发明的糖化血红蛋白的测定方法中的聚氧乙烯烷基醚乙酸或其盐在反应液中的浓度通常为0.001～10％，优选为0.01～5％。

作为本发明中的氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸中的取代基，可列举例如烷基、卤代烷基、苯基等。作为卤代烷基，可列举例如氟代烷基、氯代烷基、溴代烷基、碘代烷基等。作为烷基及卤代烷基中的烷基，可列举例如碳原子数1～6的烷基等。作为碳原子数1～6的烷基，可列举例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基等。

作为本发明中的氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸，可列举例如N-酰基氨基酸、N-酰基-N-烷基氨基酸等，优选N-酰基-N-烷基氨基酸等。

作为氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸中的氨基酸，可列举例如甘氨酸、肌氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸、脯氨酸等。

作为氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸中的酰基，可列举例如碳原子数8～20的酰基等，优选碳原子数10～18的酰基。作为碳原子数8～20的酰基，可列举例如辛酰基、壬酰基、癸酰基、十一烷酰基、十二烷酰基(月桂酰基)、十三烷酰基、十四烷酰基、十五烷酰基、十六烷酰基(棕榈酰基)、十七烷酰基、十八烷酰基(硬脂酰基)、油酰基、十八碳烯酰基、亚油酰基、十九烷酰基、二十烷酰基等。作为碳原子数10～18的酰基，可列举例如癸酰基、十一烷酰基、十二烷酰基(月桂酰基)、十三烷酰基、十四烷酰基、十五烷酰基、十六烷酰基(棕榈酰基)、十七烷酰基、十八烷酰基(硬脂酰基)、油酰基、十八碳烯酰基、亚油酰基等。

作为N-酰基-N-烷基氨基酸中的烷基，可列举例如碳原子数1～6的烷基等。作为碳原子数1～6的烷基，可列举例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基等。

另外，本发明中，氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸可以为盐。作为盐，可列举例如钠盐、钾盐、铵盐、镁盐、钙盐、单乙醇胺盐等。

作为氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸或其盐的具体例子(制品)，可列举例如NIKKOL Alaninate LN-30(N-月桂酰基-N-甲基-β-丙氨酸钠；日光化学公司制)、NIKKOL Sarcosinate PN(N-棕榈酰基肌氨酸钠；日光化学公司制)、NIKKOL SarcosinateLN(N-月桂酰基肌氨酸钠；日光化学公司制)、NIKKOL Sarcosinate MN(N-肉豆蔻酰基肌氨酸钠；日光化学公司制)、NIKKOL Sarcosinate OH(N-油酰基肌氨酸；日光化学公司制)等。

本发明的糖化血红蛋白的测定方法中的氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸或其盐在反应液中的浓度通常为0.001～10％，优选为0.01～5％。

作为本发明中的聚氧乙烯烷基醚磷酸中的烷基，可列举例如碳原子数8～20的烷基等，优选碳原子数10～18的烷基。作为碳原子数8～20的烷基，可列举例如辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、油基、十九烷基、二十烷基等。作为碳原子数10～18的烷基，可列举例如癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、油基等。

另外，本发明中，聚氧乙烯烷基醚磷酸可以为盐。作为盐，可列举例如钠盐、钾盐、铵盐、镁盐、钙盐、单乙醇胺盐等。

作为聚氧乙烯烷基醚磷酸或其盐的具体例子(制品)，可列举例如PLYSURF A212C(聚氧乙烯十三烷基醚磷酸；第一工业制药公司制)、PLYSURF A215C(聚氧乙烯十三烷基醚磷酸；第一工业制药公司制)、PLYSURF A208B(聚氧乙烯月桂基醚磷酸；第一工业制药公司制)、PLYSURF A219B(聚氧乙烯月桂基醚磷酸；第一工业制药公司制)等。

本发明的糖化血红蛋白的测定方法中的聚氧乙烯烷基醚磷酸或其盐在反应液中的浓度通常为0.001～10％，优选为0.01～5％。

本发明中的聚氧乙烯多环苯基醚磷酸中的多环苯基，可列举2个以上在基团内具有1个芳香环的基团(取代基)进行了取代的苯基、1个或多个在基团内具有2个以上芳香环的基团(取代基)进行了取代的苯基等。

另外，本发明中，聚氧乙烯多环苯基醚磷酸可以为盐。作为盐，可列举例如钠盐、钾盐、铵盐、镁盐、钙盐、单乙醇胺盐等。

作为聚氧乙烯多环苯基醚磷酸或其盐的具体例子(制品)，可列举例如PLYSURF AL(聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚磷酸；第一工业制药公司制)、PLYSURF AL12H(聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚磷酸；第一工业制药公司制)等。

本发明的糖化血红蛋白的测定方法中的聚氧乙烯多环苯基醚磷酸或其盐在反应液中的浓度通常为0.001～10％，优选为0.01～5％。

作为本发明中的烷基磷酸中的烷基，可列举例如碳原子数8～20的烷基等，优选碳原子数10～18的烷基。作为碳原子数8～20的烷基，可列举例如辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、油基、十九烷基、二十烷基等。作为碳原子数10～18的烷基，可列举例如癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、油基等。

另外，本发明中，烷基磷酸可以为盐。作为盐，可列举例如钠盐、钾盐、铵盐、镁盐、钙盐、单乙醇胺盐等。

作为烷基磷酸或其盐的具体例子(制品)，可列举例如NIKKOL SLP-N(月桂基磷酸钠；日光化学公司制)、NIKKOL Phosten HLP(月桂基磷酸；日光化学公司制)等。

本发明的糖化血红蛋白的测定方法中的烷基磷酸或其盐在反应液中的浓度通常为0.001～10％，优选为0.01～5％。

总血红蛋白量可以利用公知的方法例如氰化高铁血红蛋白、氧合血红蛋白法、SLS-血红蛋白法等来测定。不仅可以对含血红蛋白试样本身，也可以对向含血红蛋白试样中添加选自由氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸、烷基磺基乙酸、聚氧乙烯烷基醚乙酸、氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸、聚氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯多环苯基醚磷酸、烷基磷酸及它们的盐组成的组中的至少1种阴离子性表面活性剂而得到的试样应用氰化高铁血红蛋白、氧合血红蛋白法、SLS-血红蛋白法等来测定总血红蛋白量。

关于含有选自由氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸、烷基磺基乙酸、聚氧乙烯烷基醚乙酸、氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸、聚氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯多环苯基醚磷酸、烷基磷酸及它们的盐组成的组中的至少1种阴离子性表面活性剂的水性介质中的、含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白与催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶的反应，只要是催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶可作用于糖化血红蛋白的条件，则可以在任意条件下进行。

含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白与催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶的反应优选在水性介质中进行。

作为水性介质，只要是能够进行本发明的糖化血红蛋白的测定方法的水性介质则没有特别限制，可列举例如去离子水、蒸馏水、缓冲液等，优选缓冲液。

水性介质的pH只要是能够进行本发明的糖化血红蛋白的测定方法的pH则没有特别限制，例如为pH4～10。在使用缓冲液作为水性介质时，期望使用与所设定的pH对应的缓冲剂。作为缓冲液中所使用的缓冲剂，可列举例如三(羟甲基)氨基甲烷缓冲剂、磷酸缓冲剂、硼酸缓冲剂、Good’s缓冲剂等。

作为Good’s缓冲剂，可列举例如：2-吗啉代乙磺酸(MES)、二(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris)、N-(2-乙酰胺)亚氨基二乙酸(ADA)、哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)(PIPES)、N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸(ACES)、3-吗啉代-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-吗啉代丙磺酸(MOPS)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸(TES)、2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)、3-[N,N-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-羟基-3-氨基丙磺酸(TAPSO)、哌嗪-N,N’-双(2-羟基丙磺酸)(POPSO)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-2-羟基丙磺酸(HEPPSO)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸[(H)EPPS]、N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、N-环己基-3-氨基-2-羟基丙磺酸(CAPSO)、N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)等。

缓冲液的浓度为通常0.001～2.0mol/L，优选为0.005～1.0mol/L。

含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白与催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶的反应中的反应温度只要是能够进行本发明的糖化血红蛋白的测定方法的反应温度则没有特别限制，通常为10～50℃，优选为20～40℃，另外，该反应中的反应时间只要是能够进行本发明的糖化血红蛋白的测定方法的反应时间则没有特别限制，通常为1分钟～3小时，优选为2.5分钟～1小时。作为催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶的浓度，只要是能够进行本发明的糖化血红蛋白的测定方法的浓度则没有特别限制，通常为0.1～30kU/L，优选为0.2～15kU/L。

本发明中，通过以下的方法计算催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶的酶活性(U)。

＜酶活性测定用试剂＞

第一试剂

磷酸缓冲液(pH8.0) 0.1mmol/L

N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰基乙二胺(EMSE)0.3g/L

过氧化物酶 3kU/L

4-氨基安替比林 0.1g/L

第二试剂

果糖基缬氨酸水溶液 1.7mmol/L

需要说明的是，上述果糖基缬氨酸水溶液是利用J.Agric.Food Chem.,第24卷,第1期,p.70-73(1976)中记载的方法制备的。

＜样本稀释液＞

磷酸缓冲液(pH8.0) 10mmol/L

牛血清白蛋白 0.15％

＜样品＞

将FPOX-47Δ3(催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶)用上述的样本稀释液稀释而得

＜测定＞

向反应池中添加上述样品(2μL)和上述酶活性测定用试剂的第一试剂(150μL)，在37℃下进行3分钟反应(第一反应)后，添加上述酶活性测定用试剂的第二试剂(20μL)，在主波长546nm、副波长700nm下测定添加该第二试剂3分钟后的反应液的吸光度[Abs_{酶(3分钟后)}]及添加该第二试剂5分钟后的反应液的吸光度[Abs_{酶(5分钟后)}]，从Abs_{酶(5分钟后)}减去Abs_{酶(3分钟后)}而计算吸光度差ΔAbs’_酶，再将计算出的吸光度差ΔAbs’_酶除以2(分钟)，由此计算出每1分钟的吸光度变化量ΔAbs’_酶/分钟。

使用上述样本稀释液代替上述样品，除此以外，通过同样的方法来计算吸光度差ΔAbs’_空白/分钟。

从计算出的ΔAbs’_酶/分钟减去ΔAbs’_空白/分钟，确定对该酶的吸光度差ΔAbs_酶/分钟。

＜酶活性＞

基于上述所确定的ΔAbs_酶/分钟，通过以下的式(I)计算出酶活性。

上述式(I)中，33.8为通过反应生成的醌亚胺色素的毫摩尔吸光系数[(mmol/L)^-1·cm^-1]。

上述式(I)中，0.5为由1mol过氧化氢生成的醌亚胺色素的摩尔数。

作为催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶，只要是作用于含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白、并且由糖化血红蛋白生成过氧化氢的酶则没有特别限制，可列举例如国际公开第2015/005258号中记载的酶、国际公开第2015/060429号中记载的阿马多里酶等。具体而言，可列举国际公开公报第2015/005258号中记载的FPOX-18A、FPOX-18B、FPOX-18C、FPOX-18D、FPOX19～46等。作为该酶的改造体的具体例子，可列举例如后述的参考例1中制造的FPOX-47Δ3等。

作为所生成的过氧化氢的测定方法，只要是可测定过氧化氢的方法则没有特别限制，可列举例如使用电极的方法、使用过氧化氢测定用试剂的方法等，优选使用过氧化氢测定用试剂的方法。过氧化氢测定用试剂是用于将过氧化氢转变为可检测物质的试剂。作为可检测物质，可列举例如色素、光(发光)、荧光等，优选色素。

在可检测物质为色素时，过氧化氢测定用试剂可列举含有过氧化物酶等过氧化活性物质和氧化发色型色原体的试剂等。作为氧化发色型色原体，可列举氧化偶合型色原体、无色型色原体等，优选无色型色原体。

本发明中，无色型色原体是指在过氧化氢及过氧化活性物质存在下单独即可转变为色素的物质。作为过氧化活性物质，可列举例如过氧化物酶等。

作为无色型色原体，可列举例如吩噻嗪系色原体、三苯基甲烷系色原体、二苯胺系色原体、邻苯二胺、羟基丙酸、二氨基联苯胺、四甲基联苯胺等，优选吩噻嗪系色原体。

作为吩噻嗪系色原体，可列举例如10-N-羧甲基氨基甲酰基-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪(CCAP)、10-N-甲基氨基甲酰基-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪(MCDP)、10-N-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪钠盐(DA-67)等。在吩噻嗪系色原体中，特别优选10-N-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪钠盐(DA-67)。

作为三苯基甲烷系色原体，可列举例如N,N,N’,N’,N”,N”-六(3-磺丙基)-4,4’,4”-三氨基三苯基甲烷(TPM-PS)等。作为二苯胺系色原体，可列举例如N-(羧甲基氨基羰基)-4,4’-双(二甲氨基)二苯胺钠盐(DA-64)、4,4’-双(二甲氨基)二苯胺、双[3-双(4-氯苯基)甲基-4-二甲氨基苯基]胺(BCMA)等。

本发明中，氧化偶合型色原体是指：在过氧化氢及过氧化活性物质存在下2个化合物发生氧化偶合而生成色素的物质。作为2个化合物的组合，可列举偶联剂与苯胺类的组合、偶联剂与酚类的组合等。

作为偶联剂，可列举例如4-氨基安替比林(4-AA)、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙等。

作为苯胺类，可列举N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N,N-二甲基-3-甲基苯胺、N,N-双(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰基乙二胺(EMSE)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-乙酰基乙二胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-4-氟-3,5-二甲氧基苯胺(F-DAOS)等。

作为酚类，可列举苯酚、4-氯苯酚、3-甲基苯酚、3-羟基-2,4,6-三碘苯甲酸(HTIB)等。

在可检测物质为光(发光)时，过氧化氢测定用试剂可列举含有过氧化物酶等过氧化活性物质和化学发光物质的试剂等。作为化学发光物质，可列举例如鲁米诺、异鲁米诺、光泽精、吖啶酯等。

在可检测物质为荧光时，过氧化氢测定用试剂可列举含有过氧化物酶等过氧化活性物质和荧光物质的试剂等。作为荧光物质，可列举例如4-羟基苯乙酸、3-(4-羟苯基)丙酸、香豆素等。

(2)含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白的测定试剂

本发明的含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白的测定试剂为含有催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶、以及选自由氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸、烷基磺基乙酸、聚氧乙烯烷基醚乙酸、氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸、聚氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯多环苯基醚磷酸、烷基磷酸及它们的盐组成的组中的至少1种阴离子性表面活性剂的试剂，用于本发明的含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白的测定方法中。本发明的测定试剂可以还含有过氧化氢测定试剂。

作为本发明的测定试剂中的催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶、选自由氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸、烷基磺基乙酸、聚氧乙烯烷基醚乙酸、氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸、聚氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯多环苯基醚磷酸、烷基磷酸及它们的盐组成的组中的至少1种阴离子性表面活性剂、以及过氧化氢测定试剂，可分别列举例如上述的催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶、选自由氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸、烷基磺基乙酸、聚氧乙烯烷基醚乙酸、氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸、聚氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯多环苯基醚磷酸、烷基磷酸及它们的盐组成的组中的至少1种阴离子性表面活性剂、以及过氧化氢测定试剂等。

本发明的糖化血红蛋白测定试剂可以为冷冻干燥的状态，也可以为溶解于水性介质中的状态。作为水性介质，可列举例如上述的水性介质等。使用冷冻干燥状态的试剂测定含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白时，该试剂可溶解于水性介质中来使用。

作为本发明的糖化血红蛋白测定试剂中的催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶的含量，通常为在用水性介质溶解的状态下的浓度达到0.1～30kU/L的含量，优选为达到0.2～15kU/L的含量。

作为本发明的糖化血红蛋白测定试剂中的选自由氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸、烷基磺基乙酸、聚氧乙烯烷基醚乙酸、氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸、聚氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯多环苯基醚磷酸、烷基磷酸及它们的盐组成的组中的至少1种阴离子性表面活性剂的含量，通常为在用水性介质溶解的状态下的浓度达到0.001～10％的含量，优选为达到0.01～5％的含量。

本发明的测定试剂中，可以根据需要含有水性介质、稳定化剂、防腐剂、盐类、干扰物质去除剂、有机溶剂等。作为水性介质，可列举例如上述的水性介质等。作为稳定化剂，可列举例如乙二胺四乙酸(EDTA)、蔗糖、氯化钙、乙酸钙、硝酸钙、亚铁氰化钾、牛血清白蛋白(BSA)、聚氧乙烯烷基苯基醚等聚氧乙烯系非离子性表面活性剂、甘油、烷撑二醇等。作为烷撑二醇，可列举例如乙二醇、丙二醇等。作为防腐剂，可列举例如叠氮化钠、抗生素等。作为盐类，可列举例如氯化钠、硝酸钠、硫酸钠、碳酸钠、甲酸钠、乙酸钠、氯化钾、硝酸钾、硫酸钾、碳酸钾、甲酸钾、乙酸钾等。作为干扰物质去除剂，可列举例如用于去除抗坏血酸的影响的抗坏血酸氧化酶等。作为有机溶剂，可列举例如作为无色型色原体在水性介质中的溶解辅助剂的二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、二氧杂环己烷、丙酮、甲醇、乙醇等。

(3)含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白的测定试剂盒

本发明的含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白的测定试剂可以以试剂盒的方式保存、流通及使用。本发明的含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白的测定试剂盒用于本发明的含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白的测定方法中。作为本发明的测定试剂盒，可列举例如双试剂体系的试剂盒、三试剂体系的试剂盒等，优选双试剂体系试剂盒。

本发明中，在使用双试剂体系试剂盒测定含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白时，例如可以向反应池中添加含血红蛋白试样和第一试剂并在一定温度下进行一定时间的反应后添加第二试剂，测定所生成的过氧化氢，由此测定糖化血红蛋白。

·试剂盒1

一种试剂盒，其包含：含有选自由氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸、烷基磺基乙酸、聚氧乙烯烷基醚乙酸、氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸、聚氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯多环苯基醚磷酸、烷基磷酸及它们的盐组成的组中的至少1种阴离子性表面活性剂的第一试剂；以及

含有催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶的第二试剂。

·试剂盒2

含有催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶的第二试剂，

在第一试剂、第二试剂中的任一者或两者中含有过氧化氢测定试剂。

使用含有过氧化物酶和无色型色原体的试剂作为过氧化氢测定试剂时，优选过氧化物酶和无色型色原体被包含在不同的试剂中。即，优选过氧化物酶和无色型色原体分别被包含在第一试剂和第二试剂中、或第二试剂和第一试剂中。

·试剂盒3

一种试剂盒，其包含：含有催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶的第一试剂；以及

含有选自由氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸、烷基磺基乙酸、聚氧乙烯烷基醚乙酸、氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸、聚氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯多环苯基醚磷酸、烷基磷酸及它们的盐组成的组中的至少1种阴离子性表面活性剂的第二试剂。

·试剂盒4

含有选自由氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸、烷基磺基乙酸、聚氧乙烯烷基醚乙酸、氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸、聚氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯多环苯基醚磷酸、烷基磷酸及它们的盐组成的组中的至少1种阴离子性表面活性剂的第二试剂，

·试剂盒5

一种试剂盒，其包含：含有催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶以及选自由氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸、烷基磺基乙酸、聚氧乙烯烷基醚乙酸、氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸、聚氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯多环苯基醚磷酸、烷基磷酸及它们的盐组成的组中的至少1种阴离子性表面活性剂的第一试剂；以及

含有过氧化氢测定试剂的第二试剂。

·试剂盒6

一种试剂盒，其包含：含有催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶、选自由氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸、烷基磺基乙酸、聚氧乙烯烷基醚乙酸、氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸、聚氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯多环苯基醚磷酸、烷基磷酸及它们的盐组成的组中的至少1种阴离子性表面活性剂、和过氧化氢测定试剂的第一试剂；以及

含有过氧化氢测定试剂的第二试剂。

·试剂盒7

一种试剂盒，其包含：含有过氧化氢测定试剂的第一试剂；以及

含有催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶以及选自由氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸、烷基磺基乙酸、聚氧乙烯烷基醚乙酸、氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸、聚氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯多环苯基醚磷酸、烷基磷酸及它们的盐组成的组中的至少1种阴离子性表面活性剂的第二试剂。

·试剂盒8

含有催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶、选自由氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸、烷基磺基乙酸、聚氧乙烯烷基醚乙酸、氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸、聚氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯多环苯基醚磷酸、烷基磷酸及它们的盐组成的组中的至少1种阴离子性表面活性剂、以及过氧化氢测定试剂的第二试剂。

本发明的糖化血红蛋白测定试剂盒可以为冷冻干燥的状态，也可以为溶解于水性介质中的状态。作为水性介质，可列举例如上述的水性介质等。使用冷冻干燥状态的试剂盒测定含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白时，构成该试剂盒的试剂可溶解于水性介质中来使用。

构成本发明的测定试剂盒的试剂中的催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶的含量通常为在用水性介质溶解的状态下的浓度达到0.2～60kU/L的含量，优选为达到0.4～30kU/L的含量。

构成本发明的测定试剂盒的试剂中的选自由氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸、烷基磺基乙酸、聚氧乙烯烷基醚乙酸、氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸、聚氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯多环苯基醚磷酸、烷基磷酸及它们的盐组成的组中的至少1种阴离子性表面活性剂的含量通常为在用水性介质溶解的状态下的浓度达到0.002～20％的含量，优选为达到0.02～10％的含量。

实施例

以下，通过实施例更详细地说明本发明，但这些例子对本发明的范围没有任何限定。需要说明的是，本实施例、比较例及试验例中使用下述制造商的试剂及酶。

Bis-Tris(同仁化学研究所公司制)、DA-67(和光纯药工业公司制)、4-氨基安替比林(Acritech公司制)、EMSE(同仁化学研究所公司制)、过氧化物酶(东洋纺公司制)、果糖基缬氨酸(按照J.Agric.Food Chem.,第24卷,第1期,p.70-73(1976)中记载的方法制备)

NIKKOL LMT[N-酰基牛磺酸盐(N-月桂酰基-N-甲基牛磺酸钠)；日光化学公司制]

NIKKOL PMT[N-酰基牛磺酸盐(N-棕榈酰基-N-甲基牛磺酸钠)；日光化学公司制]

NIKKOL LSA-F[烷基磺基乙酸盐(月桂基磺基乙酸钠)；日光化学公司制]

NIKKOL AKYPO RLM 45 NV[聚氧乙烯烷基醚乙酸盐(聚氧乙烯月桂基醚乙酸钠)；日光化学公司制]

NIKKOL Alaninate LN-30[N-酰基氨基酸盐(N-月桂酰基-N-甲基-β-丙氨酸钠)；日光化学公司制]

NIKKOL Sarcosinate PN[N-酰基氨基酸盐(N-棕榈酰基肌氨酸钠)；日光化学公司制]

PLYSURF A212C[聚氧乙烯烷基醚磷酸(聚氧乙烯十三烷基醚磷酸)；第一工业制药公司制]

PLYSURF AL[聚氧乙烯多环苯基醚磷酸(聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚磷酸)；第一工业制药公司制]

NIKKOL SLP-N[烷基磷酸盐(月桂基磷酸钠)；日光化学公司制)]

NEOGEN粉末W(直链状烷基苯磺酸；第一工业制药公司制)

NIKKOL SLS(月桂基硫酸钠；日光化学公司制)

NIKKOL OS-14(α-烯烃磺酸钠；日光化学公司制)

NIKKOL SBL-2N-27(聚氧乙烯烷基醚硫酸盐；日光化学公司制)

NONSOUL LK-2(天然脂肪酸的烷基金属盐；日油公司制)

甘油(和光纯药工业公司制)

乙二醇(纯正化学公司制)

丙二醇(纯正化学公司制)

正十二烷基-β-麦芽糖苷(非离子性表面活性剂；和光纯药工业公司制)

聚氧乙烯鲸蜡基醚(Brij58；Sigma-Aldrich公司制)

十四烷基三甲基溴化铵(C14TMA)(阳离子性表面活性剂；东京化成公司制)

十六烷基三甲基溴化铵(C16TMA)(阳离子性表面活性剂；东京化成公司制)

[参考例1]FPOX-47Δ3的制作

(1)FPOX-47表达载体pTrc-FPOX-47的制作

使用含有由序列号1所示的碱基序列构成的DNA的表达质粒pTrc-FPOX-42作为模板DNA，分别使用由序列号2所示的碱基序列构成的FPOX-42 F342V-F及由序列号3所示的碱基序列构成的FPOX-42 F342V-R作为正向引物及反向引物，按照以下的试剂组成及PCR条件进行PCR，得到PCR产物。pTrc-FPOX-42为含有编码FPOX-42的DNA的表达质粒，所述FPOX-42为催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶，可以按照国际公开第2015/005258号中公开的方法来制作。PCR基于东洋纺公司制的PCR试剂盒、DNA聚合酶“KOD-Plus-”的操作规程来实施。

(试剂组成)

·KOD-Plus-缓冲液

·模板DNA(pTrc-FPOX-42)1～2ng/μL

·正向引物(FPOX-42 F342V-F)0.3μmol/L

·反向引物(FPOX-42 F342V-R)0.3μmol/L

·dNTP混合液各0.2mmol/L

·MgSO₄ 1mmol/L

·DNA聚合酶(KOD-Plus-)0.02U/μL

·通过添加灭菌水而制成50μL。

(PCR条件)

1. 94℃2分钟

2. 98℃15秒

3. 60℃30秒

4. 68℃6分钟

5. 重复2～4(共30个循环)

6. 68℃10分钟

向得到的PCR产物50μL中添加New England Biolabs公司制造的“限制酶Dpn I”1μL，在37℃下温育1小时而分解模板DNA。使用Promega公司制造的“Wizard SV Gel and PCRClean-Up System”，按照该试剂盒的操作规程对进行了限制酶处理的PCR产物进行纯化，得到PCR产物的纯化试样。

然后，使用得到的PCR产物的纯化试样转化至东洋纺公司制的大肠杆菌感受态细胞“Competent high DH5α”中。选择在含有50mg/L氨苄青霉素的LB琼脂培养基上生长出的菌落，使用Promega公司制造的“Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification”，按照该试剂盒的操作规程提取质粒。

用DNA测序仪对提取的质粒进行序列分析，由此确认制作了含有具有编码FPOX-47的、序列号4所示的碱基序列的DNA的质粒pTrc-FPOX-47。序列分析中，分别使用反映了pTrc99a载体(GE Healthcare Bio-Sciences公司制)的紧挨多克隆位点的前方、紧挨多克隆位点的后方的碱基序列的由序列号5所示的碱基序列构成的pTrc-F及由序列号6所示的碱基序列构成的pTrc-R作为正向引物及反向引物。

(2)FPOX-47Δ3表达载体pTrc-FPOX-47Δ3的制作

设计并化学合成了将位于编码质粒pTrc-FPOX-47中所含的FPOX-47的碱基序列的3’末端侧的紧挨终止密码子的前方的9个碱基除去并附加了终止密码子及Bam HI限制酶识别位点的、由序列号7所示的碱基序列构成的FPOX-47Δ3-R、和反映了pTrc99a载体的紧挨多克隆位点的前方的碱基序列的由序列号5所示的碱基序列构成的pTrc-F。

使用pTrc-F及FPOX-47Δ3-R作为引物对，以pTrc-FPOX-47为模板，按照以下的试剂组成及PCR条件进行PCR，得到含有如下DNA片段的PCR产物，所述DNA片段含有编码FPOX-47的C末端的3个氨基酸缺失后的缺失体FPOX-47Δ3的碱基序列。PCR基于东洋纺公司制的PCR试剂盒、DNA聚合酶“KOD-Plus-”的操作规程来实施。

(试剂组成)

·KOD-Plus-缓冲液

·模板DNA(pTrc-FPOX-47)0.2～0.5ng/μL

·正向引物(pTrc-F)0.3μmol/L

·反向引物(FPOX-47Δ3-R)0.3μmol/L

·dNTP混合液各0.2mmol/L

·MgSO₄ 1mmol/L

·DNA聚合酶(KOD-Plus-)0.02U/μL

·通过添加灭菌水而制成50μL。

(PCR条件)

1. 94℃2分钟

2. 98℃15秒

3. 60℃30秒

4. 68℃2分钟

5.重复2～4(共30个循环)

6. 68℃5分钟

使用所得到的PCR产物的一部分，用1％琼脂糖TAE凝胶进行电泳，确认得到了所预期的尺寸的DNA片段。

将得到的PCR产物用Promega公司制造的“Wizard SV Gel and PCR Clean-Upsystem”按照该试剂盒的操作规程进行纯化，得到含有编码FPOX-47Δ3的DNA的DNA片段。将得到的该DNA片段用Nco I及Bam HI(均为宝生物公司制)这2种限制酶在37℃下处理1小时，将得到的反应混合物用Promega公司制造的“Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system”按照该试剂盒的操作规程进行纯化，得到限制酶处理片段。

另外，将国际公开第2010/041715号小册子中记载的表达不具有果糖基六肽氧化活性的糖化肽氧化酶FPOX-15的pTrc-FPOX-15用同样的限制酶同样地进行处理，用1％琼脂糖TAE凝胶进行电泳，切出与载体相当的DNA片段，用Wizard SV Gel and PCR Clean-Upsystem纯化DNA片段，得到除去了编码FPOX-15的DNA的质粒片段。

将得到的限制酶处理片段与除去了编码FPOX-15的DNA的质粒片段混合，使用DNA连接试剂盒(宝生物公司制)进行连接后，将连接产物导入到东洋纺公司制的大肠杆菌感受态细胞“Competent high DH5α”中。

将导入了连接产物的大肠杆菌接种到含有50mg/L氨苄青霉素的LB琼脂培养基中，在37℃下培养14小时，选择所出现的菌落。将所选择的菌落用含有50mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基在37℃下培养14小时，使用Promega公司制造的“Wizard Plus SV MiniprepsDNA Purification”按照该试剂盒的操作规程制备质粒。使用由序列号5所示的碱基序列构成的pTrc-F及由序列号6所示的碱基序列构成的pTrc-R分别作为正向引物及反向引物进行PCR，确认所制备的质粒的碱基序列，确认到该质粒上含有FPOX-47的碱基序列的除终止密码子以外的3’侧9个碱基发生了缺失的、序列号8所示的碱基序列。将该质粒称为pTrc-FPOX-47Δ3。

(3)FPOX-47Δ3的获得

将含有上述(2)中得到的pTrc-FPOX-47Δ3的大肠杆菌用含有氨苄青霉素50mg/L的LB培养基在37℃振荡培养14小时。使用所得到的培养液，按照国际公开第2010/041715号小册子中记载的糖化肽氧化酶FPOX-9及FPOX-15的纯化方法进行纯化，得到纯化FPOX-47Δ3的溶液。将FPOX-47的氨基酸序列示于序列号9，将FPOX-47Δ3的氨基酸序列示于序列号10。

(4)FPOX-47Δ3的催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶活性(以下称为糖化血红蛋白氧化酶活性)的确认

使用上述(3)中得到的纯化FPOX-47Δ3的溶液，利用以下的测定试剂盒及测定步骤确认FPOX-47Δ3对HbA1c的糖化血红蛋白氧化酶活性。

＜测定试剂盒A＞

第一试剂

Bis-Tris(pH6.5) 50mmol/L

DA-67 40μmol/L

NIKKOL LMT 1g/L

第二试剂

磷酸缓冲液(pH6.5) 10mmol/L

FPOX-47Δ3 1.5kU/L

过氧化物酶 200kU/L

＜测定试剂盒a＞

第一试剂

Bis-Tris(pH6.5) 50mmol/L

DA-67 40μmol/L

第二试剂

磷酸缓冲液(pH6.5) 10mmol/L

FPOX-47Δ3 1.5kU/L

过氧化物酶 200kU/L

测定试剂盒a除了在第一试剂中不含NIKKOL LMT以外与测定试剂盒A相同。

＜样品＞

将对人的血液进行离心分离而得的血细胞用去离子水稀释从而使其溶血而制备的、由作为HbA1c测定的基准方法的KO500法和总血红蛋白测定法之一的SLS-血红蛋白法标定HbA1c浓度为2.6μmol/L、4.5μmol/L、6.4μmol/L、8.4μmol/L的溶血试样，作为样品使用。

＜测定步骤＞

向反应池中添加上述的各样品(10μL)和上述测定试剂盒A的第一试剂(100μL)，在37℃下进行5分钟反应(第一反应)，在主波长660nm、副波长800nm下测定反应液的吸光度(E1)，然后，向该反应液中添加上述测定试剂盒A的第二试剂(40μL)，进一步在37℃下进行5分钟反应(第二反应)，在主波长660nm、副波长800nm下测定反应液的吸光度(E2)。从E2中减去E1而算出吸光度差ΔE’_A。

向反应池中添加上述的各样品(10μL)和上述测定试剂盒a的第一试剂(100μL)，在37℃下进行5分钟反应(第一反应)，在主波长660nm、副波长800nm下测定反应液的吸光度(E3)，然后，向该反应液中添加上述测定试剂盒a的第二试剂(40μL)，进一步在37℃下进行5分钟反应(第二反应)，在主波长660nm、副波长800nm下测定反应液的吸光度(E4)。从E4中减去E3而算出吸光度差ΔE’_a。

从ΔE’_A中减去ΔE’_a，作为对各样品的吸光度差ΔE。将各样品的HbA1c浓度与ΔE的关系示于图1。

由第1图可知，在使用含有作为阴离子性表面活性剂的N-酰基牛磺酸的本发明的试剂盒(试剂盒A)的测定中，在HbA1c浓度与吸光度之间可确认到定量关系。因此确认，FPOX-47Δ3为具有催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的活性的酶。

[实施例1]

制备包含以下的第一试剂及第二试剂的HbA1c测定用试剂盒(试剂盒1A～1I)。

第一试剂

Bis-Tris(pH6.5) 50mmol/L

DA-67 40μmol/L

表面活性剂A～I(参照第1表)

第二试剂

磷酸缓冲液(pH6.5) 10mmol/L

FPOX-47Δ3 0.9kU/L

过氧化物酶 200kU/L

[比较例1]

制备包含以下的第一试剂及第二试剂的HbA1c测定用试剂盒(试剂盒1a～1e)。

第一试剂

Bis-Tris(pH6.5) 50mmol/L

DA-67 40μmol/L

表面活性剂a～e(参照第1表)

第二试剂

磷酸缓冲液(pH6.5) 10mmol/L

FPOX-47Δ3 0.9kU/L

过氧化物酶 200kU/L

表面活性剂a～e为国际公开第2015/060429号中记载的阴离子性表面活性剂。

[实施例2]

作为HbA1c测定用试剂盒，使用实施例1的试剂盒1A，作为试样，使用利用作为HPLC法的KO500法标定HbA1c浓度分别为4.9％、5.6％、6.7％、7.5％、8.4％及9.9％的6个浓度的全血，通过以下的步骤确定各试样的HbA1c浓度(量)相对于总血红蛋白浓度(量)的比例[HbA1c(％)]。

(1)用于确定总血红蛋白浓度的标准曲线的制作

使用作为总血红蛋白测定用试剂盒的血红蛋白B-Test Wako(SLS-血红蛋白法)(和光纯药工业公司制)及血红蛋白B-Test Wako所附带的标准品(总血红蛋白浓度：15.3mg/mL)，按照以下的步骤进行测定，测定对该标准品的吸光度。

向反应池中添加该标准品(10μL)和血红蛋白B-Test Wako(250μL)，在37℃下反应10分钟，在主波长546nm、副波长660nm下测定反应液的吸光度(E)，作为对该标准品的吸光度。除了使用生理盐水来代替该标准品以外，通过同样的方法来测定，作为对生理盐水的吸光度。将从对该标准品的吸光度中减去对生理盐水的吸光度而算出的值，作为对该标准品的空白校正吸光度。由对该标准品的空白校正吸光度和对生理盐水的空白校正吸光度(0Abs)制作表示总血红蛋白浓度(μmol/L)与吸光度之间的关系的标准曲线。

(2)用于确定HbA1c浓度的标准曲线的制作

对于利用KO500法标定HbA1c浓度为2.98μmol/L、6.13μmol/L的2个血细胞级分，使用实施例1的HbA1c测定用试剂盒1A，按照以下的步骤进行测定，测定对各血细胞级分的吸光度。

向反应池中添加上述的各血细胞级分(10μL)和实施例1的试剂盒1A的第一试剂(100μL)，在37℃下进行5分钟反应(第一反应)，在主波长660nm、副波长800nm下测定反应液的吸光度(E1)，然后，向该反应液中添加实施例1的试剂盒1A的第二试剂(40μL)，进一步在37℃下进行5分钟反应(第二反应)，在主波长660nm、副波长800nm下测定反应液的吸光度(E2)。从E2中减去E1而算出吸光度差ΔE’_1A，作为对各血细胞级分的吸光度。除了使用生理盐水来代替上述的各血细胞级分以外，通过同样的方法算出吸光度差ΔE’_生理盐水，作为对生理盐水的吸光度。将从对该血细胞级分的各吸光度中减去对生理盐水的吸光度而算出的值作为对该血细胞级分的空白校正吸光度。由对该血细胞级分的空白校正吸光度和对于生理盐水的空白校正吸光度(0Abs)制作表示HbA1c浓度(μmol/L)与吸光度之间的关系的标准曲线。

(3)各血细胞级分的总血红蛋白浓度的确定

对于各试样，在25℃、3000rpm(1500×G)下进行5分钟离心分离而得到血细胞级分。对于各血细胞级分，使用血红蛋白B-Test Wako，通过与(1)同样的方法进行测定，由得到的测定值和(1)的标准曲线确定各血细胞级分中的总血红蛋白浓度(μmol/L)。

(4)各血细胞级分中的HbA1c浓度的确定

对于(3)中得到的各血细胞级分，使用本发明的测定试剂盒1A，通过与(2)同样的方法进行测定，由得到的测定值和(2)的标准曲线确定各血细胞级分中的HbA1c浓度(μmol/L)。

(5)HbA1c(％)(HbA1c浓度相对于总血红蛋白浓度的比例)的确定

由上述(3)中确定的各血细胞级分中的总血红蛋白浓度(μmol/L)和上述(4)中确定的各血细胞级分中的HbA1c浓度(μmol/L)，通过以下的式(II)，以NGSP值(国际标准值)计算出HbA1c(％)。

HbA1c(％)＝

[HbA1c浓度(μmol/L)]/[总血红蛋白浓度(μmol/L)]×98.2+1.97 (II)

(6)同一血细胞级分中的HbA1c(％)的利用KO500法的确定

使用与上述(5)中的HbA1c(％)的确定中所用的血细胞级分相同的血细胞级分，利用使用HPLC的KO500法来确定各血细胞级分中的HbA1c(％)。

(7)本发明的测定方法与KO500法的相关性

由使用本发明的测定方法在上述(5)中确定的HbA1c(％)、与使用KO500法在上述(6)中确定的HbA1c(％)来验证本发明的测定方法与KO500法之间的相关关系，确定相关系数。

其结果是，两测定法之间的相关系数为0.943，在两测定法之间确认到良好的相关关系。因此可知，利用使用实施例1的试剂盒1A的本发明的测定方法可以准确地测定试样中的HbA1c。

使用实施例1的试剂盒1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H及1I的各试剂盒代替实施例1的试剂盒1A，除此以外，通过与上述同样的步骤确定各试样中的HbA1c(％)，验证使用试剂盒1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H及1I的各试剂盒的测定方法与KO500法之间的相关关系，确定相关系数。将其结果示于第1表。

[比较例2]

使用比较例1的试剂盒1a、1b、1c、1d及1e的各试剂盒代替实施例1的试剂盒1A，除此以外，通过与实施例2同样的步骤确定各血细胞级分中的HbA1c(％)，验证使用试剂盒1a、1b、1c、1d及1e的各试剂盒的测定方法与KO500法之间的相关关系，确定相关系数。将其结果示于第1表。

[表1]

第1表

*相关系数：关于与KO500法的相关性的相关系数

由第1表可知，在使用本发明的试剂盒1A～1I的测定中，在与KO500法之间确认到良好的相关关系，但在使用比较例1的试剂盒1a～1e的测定中，在与KO500法之间未确认到良好的相关关系。因此可知，通过使用本发明的试剂盒1A～1I，可以准确地测定试样中的糖化血红蛋白。

[实施例3]

制备包含以下的第一试剂及第二试剂的HbA1c测定用试剂盒(试剂盒2A～2I)。

第一试剂

Bis-Tris(pH6.5) 50mmol/L

DA-67 40μmol/L

表面活性剂A～I(参照第2表)

第二试剂

磷酸缓冲液(pH6.5) 10mmol/L

FPOX-47Δ3 1.5kU/L

过氧化物酶 200kU/L

实施例3的各试剂盒(试剂盒2A～2I)除了第二试剂中的FPOX-47Δ3为1.5kU/L以外与实施例1的各试剂盒(试剂盒1A～1I)相同。

[比较例3]

制备包含以下的第一试剂及第二试剂的HbA1c测定用试剂盒(试剂盒2a～2e)。

第一试剂

Bis-Tris(pH6.5) 50mmol/L

DA-67 40μmol/L

表面活性剂a～e(参照第2表)

第二试剂

磷酸缓冲液(pH6.5) 10mmol/L

FPOX-47Δ3 1.5kU/L

过氧化物酶 200kU/L

表面活性剂a～e为国际公开第2015/060429号中记载的阴离子性表面活性剂。比较例3的各试剂盒(试剂盒2a～2e)除了第二试剂中的FPOX-47Δ3为1.5kU/L以外与比较例1的各试剂盒(试剂盒1a～1e)相同。

[实施例4]

作为HbA1c测定用试剂盒，使用实施例3的试剂盒2A，作为试样，使用利用作为HPLC法的KO500法标定HbA1c浓度分别为4.9％、5.6％、6.7％、7.5％、8.4％及9.9％的6个浓度的全血，通过以下的步骤确定各试样的HbA1c浓度(量)相对于总血红蛋白浓度(量)的比例[HbA1c(％)]。

(1)用于确定总血红蛋白浓度的标准曲线的制作

使用作为总血红蛋白测定用试剂盒的血红蛋白B-Test Wako(SLS-血红蛋白法)(和光纯药工业公司制)进行与实施例2的(1)同样的测定，制作表示总血红蛋白浓度与吸光度的关系的标准曲线。

(2)用于确定HbA1c浓度的标准曲线的制作

对于利用KO500法标定HbA1c浓度为2.54μmol/L、6.40μmol/L的2个血细胞级分，使用实施例3的HbA1c测定用试剂盒2A进行与实施例2的(2)同样的测定，测定对各血细胞级分的吸光度。使用生理盐水代替该血细胞级分进行同样的测定，测定对生理盐水的吸光度。将从对该血细胞级分的各吸光度中减去对生理盐水的吸光度而算出的值作为对该血细胞级分的空白校正吸光度。由对该血细胞级分的空白校正吸光度与对生理盐水的空白校正吸光度(0Abs)制作表示HbA1c浓度(μmol/L)与吸光度之间的关系的标准曲线。

(3)各血细胞级分中的总血红蛋白浓度的确定

对于各试样，在25℃、3000rpm(1500×G)下进行5分钟离心分离而得到血细胞级分。对于各血细胞级分，使用血红蛋白B-Test Wako通过与(1)同样的方法进行测定，由得到的测定值与(1)的标准曲线确定各血细胞级分中的总血红蛋白浓度(μmol/L)。

(4)各血细胞级分的HbA1c浓度的确定

对于(3)中得到的各血细胞级分，使用本发明的测定试剂盒2A，通过与(2)同样的方法进行测定，由得到的测定值与(2)的标准曲线确定各血细胞级分中的HbA1c浓度(μmol/L)。

(5)HbA1c(％)(＝HbA1c浓度相对于总血红蛋白浓度的比例)的确定

由上述(3)中确定的各血细胞级分中的总血红蛋白浓度(μmol/L)和上述(4)中确定的各血细胞级分中的HbA1c浓度(μmol/L)通过以下的式(II)，以NGSP值(国际标准值)计算出HbA1c(％)。

HbA1c(％)＝

[HbA1c浓度(μmol/L)]/[总血红蛋白浓度(μmol/L)]×98.2+1.97 (II)

(6)同一血细胞级分中的HbA1c(％)的利用KO500法的确定

使用与上述(5)中的HbA1c(％)的确定所用的血细胞级分相同的血细胞级分，利用使用HPLC的KO500法确定各血细胞级分中的HbA1c(％)。

(7)本发明的测定方法与KO500法的相关性

由使用本发明的测定方法在上述(5)中确定的HbA1c(％)与使用KO500法在上述(6)中确定的HbA1c(％)来验证本发明的测定方法与KO500法之间的相关关系，确定相关系数。其结果是，两测定法之间的相关系数为0.998，在两测定法之间确认到良好的相关关系。因此可知，利用使用实施例3的试剂盒2A的本发明的测定方法可以准确地测定试样中的HbA1c。

(8)HbA1c浓度与吸光度之间的相关式～灵敏度的比较

确定表示上述(4)中所确定的各血细胞级分中的HbA1c浓度(x轴)与对各血细胞级分的吸光度(y轴)之间的关系的一次函数的斜率，作为HbA1c测定的灵敏度的指标。该斜率为对HbA1c(1μmol/L)的吸光度。其结果是，斜率为0.0108。

使用实施例3的试剂盒2B、2C、2D、2E、2F、2G、2H及2I的各试剂盒代替实施例3的试剂盒2A，除此以外，通过与上述同样的步骤确定各试样中的HbA1c(％)，验证使用试剂盒2B、2C、2D、2E、2F、2G、2H及2I的各试剂盒的测定方法与KO500法之间的相关关系，确定相关系数。将其结果示于第2表。

另外，使用实施例3的试剂盒2B、2C、2D、2E、2F、2G、2H及2I的各试剂盒代替实施例3的试剂盒2A，除此以外，通过与上述(8)同样的步骤确定使用各试剂盒的测定中的对HbA1c(1μmol/L)的吸光度。将其结果示于第2表。

[比较例4]

使用比较例3的试剂盒2a、2b、2c、2d及2e的各试剂盒代替实施例3的试剂盒2A，除此以外，通过与实施例4同样的步骤确定各血细胞级分中的HbA1c(％)，验证使用试剂盒2a、2b、2c、2d及2e的各试剂盒的测定方法与KO500法之间的相关关系，确定相关系数。将其结果示于第2表。

另外，确定使用比较例3的试剂盒2b、2c及2d的各试剂盒的测定中的、表示与对各血细胞级分的吸光度(y轴)之间的关系的一次函数的斜率，作为HbA1c测定中的灵敏度的指标。该相关式的斜率为每单位HbA1c(1μmol/L)的吸光度。将其结果示于第2表。

[表2]

第2表

*相关系数：关于与KO5O0法的相关性的相关系数

**灵敏度：为表示各血细胞级分中的HbA1c浓度(X轴)与对各血细胞级分的吸光度(y轴)之间的关系的一次函数的斜率，表示每单位HbA1c(1μmol/L)的吸光度。

由第2表可知，在使用本发明的实施例3的试剂盒2A～2I的测定与KO500法之间、以及在使用含有国际公开第2015/060429号中记载的阴离子性表面活性剂的比较例3的试剂盒2a～2d的测定与KO500法之间，均确认到良好的相关关系。需要说明的是，使用试剂盒2e时，未能测定糖化血红蛋白。

进而，由第2表可知，使用本发明的实施例3的试剂盒2A～2I的测定与使用比较例3的试剂盒2a～2d的测定相比，每单位HbA1c浓度(μmol/L)的吸光度大。因此可知，本发明的测定方法与使用比较例3的试剂盒2a～2e的测定方法相比灵敏度高，利用本发明的测定方法可以高灵敏度地测定糖化血红蛋白。

[实施例5]

制备包含以下的第一试剂及第二试剂的HbA1c测定用试剂盒(试剂盒2J～2L)。

第一试剂

Bis-Tris(pH6.5) 50mmol/L

DA-67 40μmol/L

NIKKOL LMT 1.0g/L

第二试剂

磷酸缓冲液(pH6.5) 10mmol/L

FPOX-47Δ3 1.5kU/L

过氧化物酶 200kU/L

稳定化剂J～L(参照第3表)

[实施例6]

使用实施例5的试剂盒2J、2K及2L的各试剂盒代替实施例3的试剂盒2A，除此以外，通过与实施例4同样的步骤确定各血细胞级分中的HbA1c(％)，验证使用试剂盒2A、2J、2K及2L的各试剂盒的测定方法与KO500法之间的相关关系，确定相关系数。将其结果示于第3表。

另外，确定使用实施例3的试剂盒2A以及实施例5的试剂盒2J、2K及2L的各试剂盒的测定中的、表示与对各血细胞级分的吸光度(y轴)之间的关系的一次函数的斜率，作为HbA1c测定的灵敏度的指标。该相关式的斜率为每单位HbA1c(1μmol/L)的吸光度。将其结果示于第3表。

[表3]

第3表

*相关系数：关于与KO500法的相关性的相关系数

由第3表可知，使用本发明的实施例5的试剂盒2J～2L的测定与使用本发明的实施例3的试剂盒2A的测定同样地，在与KO500法之间确认到良好的相关关系。

另外，由第3表可知，使用本发明的实施例5的试剂盒2J～2L的测定与使用实施例3的试剂盒2A的测定同样地，每单位HbA1c浓度(μmol/L)的吸光度为0.008以上。

因此可知，使用作为阴离子性表面活性剂的N-酰基牛磺酸盐的本发明的糖化血红蛋白的测定方法是即使在作为稳定化剂的甘油或烷撑二醇存在下也准确且高灵敏度的测定方法。

[实施例7]

(1)溶血样本的制备

对于将人血液离心分离而得到的血细胞级分，使用作为总血红蛋白测定试剂的血红蛋白B-Test Wako进行与实施例2的(1)同样的测定，由得到的吸光度与实施例2的(1)中制作的表示总血红蛋白浓度(μmol/L)与吸光度之间的关系的标准曲线确定该血细胞级分的总血红蛋白浓度。然后，将该标定后的该血细胞级分用纯化水稀释而使其溶血，制备总血红蛋白浓度为4mg/mL、6mg/mL及8mg/mL的各溶血样本。

(2)用于确定HbA1c浓度的标准曲线的制作

对于利用KO500法标定HbA1c浓度为2.98μmol/L、6.13μmol/L的2个血细胞级分，使用实施例3的试剂盒2A按照以下的步骤进行测定，测定对各血细胞级分的吸光度。

向反应池中添加上述的各血细胞级分(9.6μL)和实施例3的试剂盒2A的第一试剂(120μL)，在37℃下进行5分钟反应(第一反应)，在主波长660nm、副波长800nm下测定反应液的吸光度(E1)，然后，向该反应液中添加实施例3的试剂盒2A的第二试剂(40μL)，进一步在37℃下进行5分钟反应(第二反应)，在主波长660nm、副波长800nm下测定反应液的吸光度(E2)。从E2中减去E1而计算吸光度差ΔE’_2A，作为对各血细胞级分的吸光度。除了使用生理盐水来代替上述的各血细胞级分以外，通过同样的方法计算吸光度差ΔE’_生理盐水，作为对生理盐水的吸光度。将从对该血细胞级分的各吸光度中减去对生理盐水的吸光度而算出的值作为对该血细胞级分的空白校正吸光度。由对该血细胞级分的空白校正吸光度和对生理盐水的空白校正吸光度(0Abs)制作表示HbA1c浓度(μmol/L)与吸光度之间的关系的标准曲线。

(3)各溶血样本的HbA1c浓度的确定

对于(1)中制备的各溶血样本，使用实施例3的试剂盒2A，通过与(2)同样的方法进行测定，由得到的测定值与(2)的标准曲线测定各溶血样本中的HbA1c浓度(μmol/L)。

(4)HbA1c(％)(＝HbA1c浓度相对于总血红蛋白浓度的比例)的确定

由上述(1)中制备的各溶血样本的总血红蛋白浓度(μmol/L)和上述(3)中测定出的各溶血样本的HbA1c浓度(μmol/L)，通过以下的式(II)，以NGSP值(国际标准值)计算出HbA1c(％)。

HbA1c(％)＝

[HbA1c浓度(μmol/L)]/[总血红蛋白浓度(μmol/L)]×98.2+1.97 (II)

(5)总血红蛋白浓度的影响的评价

将总血红蛋白浓度为6mg/mL的溶血样本中的HbA1c浓度(％)设为基准0，计算各溶血样本与该基准的HbA1c浓度(％)之差[ΔHbA1c浓度(％)]。将其结果示于第4表。

作为HbA1c测定用试剂盒，使用实施例3的试剂盒2B～2I的各试剂盒来代替实施例3的试剂盒2A并进行同样的测定，针对各试剂盒测定各溶血样本中的HbA1c浓度(％)。将总血红蛋白浓度为6mg/mL的溶血样本中的HbA1c浓度(％)设为基准0，计算各溶血样本与该基准的HbA1c浓度(％)之差[ΔHbA1c浓度(％)]。将其结果示于第4表。

[比较例5]

使用比较例3的试剂盒2b～2d的各试剂盒代替实施例3的试剂盒2A，除此以外，通过与实施例7同样的方法针对各试剂盒测定各溶血样本中的HbA1c浓度(％)。将总血红蛋白浓度为6mg/mL的溶血样本中的HbA1c浓度(％)设为基准0，计算各溶血样本与该基准的HbA1c浓度(％)之差[ΔHbA1c浓度(％)]。将其结果示于第4表。

[表4]

第4表

如上所述，测定中使用的溶血样本为由同一人血液制备的，因此，HbA1c相对于总血红蛋白的比例(％)不取决于总血红蛋白浓度而是保持恒定。因此，ΔHbA1c浓度(％)越接近0，则越不受总血红蛋白浓度的影响。由第4表可知，使用本发明的试剂盒2A～2G的各试剂盒的本发明的糖化血红蛋白的测定方法与使用比较例3的试剂盒2b～2d的各试剂盒的糖化血红蛋白的测定方法相比，不受总血红蛋白浓度的影响。

[比较例6]

制备包含以下的第一试剂及第二试剂的HbA1c测定用试剂盒(试剂盒2f～2m)。

第一试剂

Bis-Tris(pH6.5) 50mmol/L

DA-67 40μmol/L

表面活性剂f～m(参照第5表)

第二试剂

磷酸缓冲液(pH6.5) 10mmol/L

FPOX-47Δ3 1.5kU/L

过氧化物酶 200kU/L

表面活性剂f～m为国际公开第2015/060429号中记载的非离子性表面活性剂或阳离子性表面活性剂。比较例6的各试剂盒(试剂盒2f～2m)除了第一试剂中的表面活性剂以外与比较例3的各试剂盒(试剂盒2a～2e)相同。

[实施例8]

作为HbA1c测定用试剂盒，使用实施例3的试剂盒2A，作为试样，使用利用作为HPLC法的KO500法标定HbA1c浓度分别为4.9％、5.6％、6.7％、7.5％、8.4％及9.9％的6个浓度的全血，通过与实施例4同样的步骤确定关于与KO500法的相关性的相关系数及作为灵敏度的指标的每单位HbA1c(1μmol/L)的吸光度。将其结果示于第5表。

[比较例7]

作为HbA1c测定用试剂盒，使用比较例6的试剂盒2f～2m的各试剂盒，作为试样，使用利用作为HPLC法的KO500法标定HbA1c浓度分别为4.9％、5.6％、6.7％、7.5％、8.4％及9.9％的6个浓度的全血，通过与实施例4同样的步骤确定关于与KO500法的相关性的相关系数及作为灵敏度的指标的每单位HbA1c(1μmol/L)的吸光度。将其结果示于第5表。

[表5]

第5表

*相关系数：关于与KO500法的相关性的相关系数

**灵敏度：为表示各血细胞级分中的HbA1c浓度(X轴)与对各血细胞级分的吸光度(y轴)之间的关系的一次函数的斜率，表示每单位HbA1c(1μmol/L)的吸光度

由第5表可知，使用本发明的实施例3的试剂盒2A的测定与使用比较例6的试剂盒2f～2m的测定相比，在与KO500法之间确认到更良好的相关性。特别是分别含有作为阳离子性表面活性剂的C14TMA及C16TMA的试剂盒2f及2g，未能测定试样中的糖化血红蛋白。

另外，由第5表可知，使用本发明的实施例3的试剂盒2A的测定与使用比较例6的试剂盒2f～2m的测定相比，每单位HbA1c浓度(μmol/L)的吸光度大。因此可知，本发明的测定方法与使用比较例6的试剂盒2f～2m的测定相比灵敏度高，利用本发明的测定方法可以高灵敏度地测定糖化血红蛋白。

[实施例9]

制备包含以下的含有催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶的第一试剂及含有作为阴离子性表面活性剂的N-酰基牛磺酸盐的第二试剂的HbA1c测定用试剂盒(试剂盒3A)。

第一试剂

Bis-Tris(pH7.0) 50mmol/L

DA-67 40μmol/L

FPOX-47Δ3 0.6kU/L

第二试剂

[实施例10]

作为HbA1c测定用试剂盒，使用实施例9的试剂盒3A，作为试样，使用利用作为HPLC法的KO500法标定HbA1c浓度分别为3.7％、4.4％、5.4％、6.7％及9.2％的5个浓度的全血，通过以下的步骤确定各试样的HbA1c浓度(量)相对于总血红蛋白浓度(量)的比例[HbA1c(％)]。

(1)用于确定总血红蛋白浓度的标准曲线的制作

使用作为总血红蛋白测定用试剂盒的血红蛋白B-Test Wako(SLS-血红蛋白法)(和光纯药工业公司制)，进行与实施例2的(1)同样的测定，制作表示总血红蛋白浓度与吸光度的关系的标准曲线。

(2)用于确定HbA1c浓度的标准曲线的制作

对于利用KO500法标定HbA1c浓度为3.64μmol/L、9.18μmol/L的2个血细胞级分，使用实施例9的HbA1c测定用试剂盒3A进行与实施例7的(2)同样的测定，测定对各血细胞级分的吸光度。使用生理盐水代替该血细胞级分并进行同样的测定，测定对生理盐水的吸光度。将从对该血细胞级分的各吸光度中减去对生理盐水的吸光度而算出的值作为对该血细胞级分的空白校正吸光度。由对该血细胞级分的空白校正吸光度和对生理盐水的空白校正吸光度(0Abs)制作表示HbA1c浓度(μmol/L)与吸光度之间的关系的标准曲线。

(3)各血细胞级分中的总血红蛋白浓度的确定

对于各试样，在25℃、3000rpm(1500×G)下进行5分钟离心分离而得到血细胞级分。对于各血细胞级分，使用血红蛋白B-Test Wako通过与(1)同样的方法进行测定，由得到的测定值和(1)的标准曲线确定各血细胞级分中的总血红蛋白浓度(μmol/L)。

(4)各血细胞级分中的HbA1c浓度的确定

对于(3)中得到的各血细胞级分，使用本发明的测定试剂盒3A，通过与(2)同样的方法进行测定，由得到的测定值和(2)的标准曲线确定各血细胞级分中的HbA1c浓度(μmol/L)。

(5)HbA1c(％)(＝HbA1c浓度相对于总血红蛋白浓度的比例)的确定

HbA1c(％)＝

[HbA1c浓度(μmol/L)]/[总血红蛋白浓度(μmol/L)]×98.2+1.97 (II)

(6)同一血细胞级分中的HbA1c(％)的利用KO500法的确定

使用与上述(5)中的HbA1c(％)的确定中所用的血细胞级分相同的血细胞级分，利用使用HPLC的KO500法确定各血细胞级分中的HbA1c(％)。

(7)本发明的测定方法与KO500法的相关性

由使用本发明的测定方法在上述(5)中确定的HbA1c(％)与使用KO500法在上述(6)中确定的HbA1c(％)来验证本发明的测定方法与KO500法之间的相关关系，确定相关系数。其结果是，两测定法之间的相关系数为0.974，在两测定法之间确认到良好的相关关系。

(8)灵敏度的比较

确定表示上述(4)中所确定的各血细胞级分中的HbA1c浓度(x轴)与对各血细胞级分的吸光度(y轴)之间的关系的一次函数的斜率，作为HbA1c测定中的灵敏度的指标。该斜率为对HbA1c(1μmol/L)的吸光度。其结果是，斜率为0.0058。

因此可知，使用包含含有催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶的第一试剂和含有作为阴离子性表面活性剂的N-酰基牛磺酸盐的第二试剂的本发明的糖化血红蛋白测定试剂盒的本发明的糖化血红蛋白的测定方法是准确且高灵敏度的测定方法。

产业上的可利用性

根据本发明，提供在糖尿病等的诊断中有用的用于测定含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白的方法、试剂及试剂盒。

序列表

<110> 协和梅迪克斯株式会社（KYOWA MEDEX CO.,LTD）

<120> 糖化血红蛋白的测定方法（Method for measurement of the glycosylatedhemoglobin）

<130> 1000P12426WO0

<150> JP2016-150498

<151> 2016-07-29

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1317

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> FPOX-42

<400> 1

atggcgcccc gagccaacac caaaatcatc gtcgtcggcg gcggcggcac aatgggctcg 60

tcgacagccc tacacctcct gcgcgccggc tacacgccgt ccaacatcac agtgctcgac 120

acgtacccta tcccttccgc acagtctgca ggctacgacc tgaacaagat cttcggcatc 180

tcaggcgcga acaagcatga cttacaactc tcgcttgagg cgttcgacat gtggaaaaat 240

gatcctctat tcaagccgtt tttccacaat gttggacaga tggacgtctc ttcaacagaa 300

gaaggcatca aacgccttcg ccgcagatac cagtctcttc tccgcgcagg cattgggctc 360

gagaagacga atttcctgct ggaaagtgaa gacgagatcc tggctaaagc gccgcatttc 420

acgcgggagc agattaaagg ctggaaaggg ctgttctgtg gcgacggcgg ttggctcgct 480

gcagccaaag ccatcaatgc catcgggcag ttcctcaagg aacagggcgt caagtttgga 540

tttggcgagg ccggcacgtt caaaaagcca ctcttcgccg atgccgacga gaagacgtgc 600

atcggcgtcg aaactgtaga cggcacaaaa tactacgccg acaaggtcgt tctagcagct 660

ggtgcctgga gttcgacgtt ggtcgatctg gaggagcagt gcgtttcaaa ggcctgggtc 720

tttgcccaca tccaactgac gcccgctgaa gcagccgcgt acaagaacac tcctgttata 780

tacgacggtg actatgggtt tttcattgag ccggacgaga acggcatcat aaaagtctgc 840

gacgaattcc ctggcttcac gcacttcaag atgcaccagc cgtacggctc accggtgccc 900

aaattgatct ctgtgcctcg ctcccatgcg aagcacccca cagatacata cccgcacgcg 960

tcggaggtca ccatcaaaaa ggctatcaac cggttcctgc cgaggttcaa tgacaaggaa 1020

ctgtttaaca gggccatgtg ctggtgcacc gataccgcgg atagcaatct gcttgtttgt 1080

gagcatccac gctggaaggg gttttatctt gcaacagggg acagcgggca ttcgttcaag 1140

ttgctgccga atattggaaa gcacgttgtc gagttattgg aggggaggct ggaaagtgtg 1200

tttaaggatg cttggaggtg gaggcctggc agtggggatg cattaaagag tagacgggct 1260

gcgcctgcga aggacctggc ggatatgccg gggtggagga atgaggcaaa gatgtag 1317

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FPOX-42 F342V-F

<400> 2

gaggttcaat gacaaggaac tggtgaacag g 31

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FPOX-42 F342V-R

<400> 3

gcaccagcac atggccctgt tcaccagttc 30

<210> 4

<211> 1317

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FPOX-47

<400> 4

atggcgcccc gagccaacac caaaatcatc gtcgtcggcg gcggcggcac aatgggctcg 60

tcgacagccc tacacctcct gcgcgccggc tacacgccgt ccaacatcac agtgctcgac 120

acgtacccta tcccttccgc acagtctgca ggctacgacc tgaacaagat cttcggcatc 180

tcaggcgcga acaagcatga cttacaactc tcgcttgagg cgttcgacat gtggaaaaat 240

gatcctctat tcaagccgtt tttccacaat gttggacaga tggacgtctc ttcaacagaa 300

gaaggcatca aacgccttcg ccgcagatac cagtctcttc tccgcgcagg cattgggctc 360

gagaagacga atttcctgct ggaaagtgaa gacgagatcc tggctaaagc gccgcatttc 420

acgcgggagc agattaaagg ctggaaaggg ctgttctgtg gcgacggcgg ttggctcgct 480

gcagccaaag ccatcaatgc catcgggcag ttcctcaagg aacagggcgt caagtttgga 540

tttggcgagg ccggcacgtt caaaaagcca ctcttcgccg atgccgacga gaagacgtgc 600

atcggcgtcg aaactgtaga cggcacaaaa tactacgccg acaaggtcgt tctagcagct 660

ggtgcctgga gttcgacgtt ggtcgatctg gaggagcagt gcgtttcaaa ggcctgggtc 720

tttgcccaca tccaactgac gcccgctgaa gcagccgcgt acaagaacac tcctgttata 780

tacgacggtg actatgggtt tttcattgag ccggacgaga acggcatcat aaaagtctgc 840

gacgaattcc ctggcttcac gcacttcaag atgcaccagc cgtacggctc accggtgccc 900

aaattgatct ctgtgcctcg ctcccatgcg aagcacccca cagatacata cccgcacgcg 960

tcggaggtca ccatcaaaaa ggctatcaac cggttcctgc cgaggttcaa tgacaaggaa 1020

ctggtgaaca gggccatgtg ctggtgcacc gataccgcgg atagcaatct gcttgtttgt 1080

gagcatccac gctggaaggg gttttatctt gcaacagggg acagcgggca ttcgttcaag 1140

ttgctgccga atattggaaa gcacgttgtc gagttattgg aggggaggct ggaaagtgtg 1200

tttaaggatg cttggaggtg gaggcctggc agtggggatg cattaaagag tagacgggct 1260

gcgcctgcga aggacctggc ggatatgccg gggtggagga atgaggcaaa gatgtag 1317

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pTrc-F

<400> 5

caattaatca tccggctcgt a 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pTrc-R

<400> 6

cttctgagtt cggcatgggg 20

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FPOX-47儮3-R

<400> 7

atgggatccc tactcattcc tccaccccgg catatccgc 39

<210> 8

<211> 1308

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FPOX-47儮3

<400> 8

atggcgcccc gagccaacac caaaatcatc gtcgtcggcg gcggcggcac aatgggctcg 60

tcgacagccc tacacctcct gcgcgccggc tacacgccgt ccaacatcac agtgctcgac 120

acgtacccta tcccttccgc acagtctgca ggctacgacc tgaacaagat cttcggcatc 180

tcaggcgcga acaagcatga cttacaactc tcgcttgagg cgttcgacat gtggaaaaat 240

gatcctctat tcaagccgtt tttccacaat gttggacaga tggacgtctc ttcaacagaa 300

gaaggcatca aacgccttcg ccgcagatac cagtctcttc tccgcgcagg cattgggctc 360

gagaagacga atttcctgct ggaaagtgaa gacgagatcc tggctaaagc gccgcatttc 420

acgcgggagc agattaaagg ctggaaaggg ctgttctgtg gcgacggcgg ttggctcgct 480

gcagccaaag ccatcaatgc catcgggcag ttcctcaagg aacagggcgt caagtttgga 540

tttggcgagg ccggcacgtt caaaaagcca ctcttcgccg atgccgacga gaagacgtgc 600

atcggcgtcg aaactgtaga cggcacaaaa tactacgccg acaaggtcgt tctagcagct 660

ggtgcctgga gttcgacgtt ggtcgatctg gaggagcagt gcgtttcaaa ggcctgggtc 720

tttgcccaca tccaactgac gcccgctgaa gcagccgcgt acaagaacac tcctgttata 780

tacgacggtg actatgggtt tttcattgag ccggacgaga acggcatcat aaaagtctgc 840

gacgaattcc ctggcttcac gcacttcaag atgcaccagc cgtacggctc accggtgccc 900

aaattgatct ctgtgcctcg ctcccatgcg aagcacccca cagatacata cccgcacgcg 960

tcggaggtca ccatcaaaaa ggctatcaac cggttcctgc cgaggttcaa tgacaaggaa 1020

ctggtgaaca gggccatgtg ctggtgcacc gataccgcgg atagcaatct gcttgtttgt 1080

gagcatccac gctggaaggg gttttatctt gcaacagggg acagcgggca ttcgttcaag 1140

ttgctgccga atattggaaa gcacgttgtc gagttattgg aggggaggct ggaaagtgtg 1200

tttaaggatg cttggaggtg gaggcctggc agtggggatg cattaaagag tagacgggct 1260

gcgcctgcga aggacctggc ggatatgccg gggtggagga atgagtag 1308

<210> 9

<211> 438

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FPOX-47

<400> 9

Met Ala Pro Arg Ala Asn Thr Lys Ile Ile Val Val Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Thr Met Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Leu Arg Ala Gly Tyr Thr

20 25 30

Pro Ser Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Tyr Pro Ile Pro Ser Ala Gln

35 40 45

Ser Ala Gly Tyr Asp Leu Asn Lys Ile Phe Gly Ile Ser Gly Ala Asn

50 55 60

Lys His Asp Leu Gln Leu Ser Leu Glu Ala Phe Asp Met Trp Lys Asn

65 70 75 80

Asp Pro Leu Phe Lys Pro Phe Phe His Asn Val Gly Gln Met Asp Val

85 90 95

Ser Ser Thr Glu Glu Gly Ile Lys Arg Leu Arg Arg Arg Tyr Gln Ser

100 105 110

Leu Leu Arg Ala Gly Ile Gly Leu Glu Lys Thr Asn Phe Leu Leu Glu

115 120 125

Ser Glu Asp Glu Ile Leu Ala Lys Ala Pro His Phe Thr Arg Glu Gln

130 135 140

Ile Lys Gly Trp Lys Gly Leu Phe Cys Gly Asp Gly Gly Trp Leu Ala

145 150 155 160

Ala Ala Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Gln Phe Leu Lys Glu Gln Gly

165 170 175

Val Lys Phe Gly Phe Gly Glu Ala Gly Thr Phe Lys Lys Pro Leu Phe

180 185 190

Ala Asp Ala Asp Glu Lys Thr Cys Ile Gly Val Glu Thr Val Asp Gly

195 200 205

Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Lys Val Val Leu Ala Ala Gly Ala Trp Ser

210 215 220

Ser Thr Leu Val Asp Leu Glu Glu Gln Cys Val Ser Lys Ala Trp Val

225 230 235 240

Phe Ala His Ile Gln Leu Thr Pro Ala Glu Ala Ala Ala Tyr Lys Asn

245 250 255

Thr Pro Val Ile Tyr Asp Gly Asp Tyr Gly Phe Phe Ile Glu Pro Asp

260 265 270

Glu Asn Gly Ile Ile Lys Val Cys Asp Glu Phe Pro Gly Phe Thr His

275 280 285

Phe Lys Met His Gln Pro Tyr Gly Ser Pro Val Pro Lys Leu Ile Ser

290 295 300

Val Pro Arg Ser His Ala Lys His Pro Thr Asp Thr Tyr Pro His Ala

305 310 315 320

Ser Glu Val Thr Ile Lys Lys Ala Ile Asn Arg Phe Leu Pro Arg Phe

325 330 335

Asn Asp Lys Glu Leu Val Asn Arg Ala Met Cys Trp Cys Thr Asp Thr

340 345 350

Ala Asp Ser Asn Leu Leu Val Cys Glu His Pro Arg Trp Lys Gly Phe

355 360 365

Tyr Leu Ala Thr Gly Asp Ser Gly His Ser Phe Lys Leu Leu Pro Asn

370 375 380

Ile Gly Lys His Val Val Glu Leu Leu Glu Gly Arg Leu Glu Ser Val

385 390 395 400

Phe Lys Asp Ala Trp Arg Trp Arg Pro Gly Ser Gly Asp Ala Leu Lys

405 410 415

Ser Arg Arg Ala Ala Pro Ala Lys Asp Leu Ala Asp Met Pro Gly Trp

420 425 430

Arg Asn Glu Ala Lys Met

435

<210> 10

<211> 435

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FPOX-47儮3

<400> 10

Met Ala Pro Arg Ala Asn Thr Lys Ile Ile Val Val Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Thr Met Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Leu Arg Ala Gly Tyr Thr

20 25 30

Pro Ser Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Tyr Pro Ile Pro Ser Ala Gln

35 40 45

Ser Ala Gly Tyr Asp Leu Asn Lys Ile Phe Gly Ile Ser Gly Ala Asn

50 55 60

Lys His Asp Leu Gln Leu Ser Leu Glu Ala Phe Asp Met Trp Lys Asn

65 70 75 80

Asp Pro Leu Phe Lys Pro Phe Phe His Asn Val Gly Gln Met Asp Val

85 90 95

Ser Ser Thr Glu Glu Gly Ile Lys Arg Leu Arg Arg Arg Tyr Gln Ser

100 105 110

Leu Leu Arg Ala Gly Ile Gly Leu Glu Lys Thr Asn Phe Leu Leu Glu

115 120 125

Ser Glu Asp Glu Ile Leu Ala Lys Ala Pro His Phe Thr Arg Glu Gln

130 135 140

Ile Lys Gly Trp Lys Gly Leu Phe Cys Gly Asp Gly Gly Trp Leu Ala

145 150 155 160

Ala Ala Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Gln Phe Leu Lys Glu Gln Gly

165 170 175

Val Lys Phe Gly Phe Gly Glu Ala Gly Thr Phe Lys Lys Pro Leu Phe

180 185 190

Ala Asp Ala Asp Glu Lys Thr Cys Ile Gly Val Glu Thr Val Asp Gly

195 200 205

Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Lys Val Val Leu Ala Ala Gly Ala Trp Ser

210 215 220

Ser Thr Leu Val Asp Leu Glu Glu Gln Cys Val Ser Lys Ala Trp Val

225 230 235 240

Phe Ala His Ile Gln Leu Thr Pro Ala Glu Ala Ala Ala Tyr Lys Asn

245 250 255

Thr Pro Val Ile Tyr Asp Gly Asp Tyr Gly Phe Phe Ile Glu Pro Asp

260 265 270

Glu Asn Gly Ile Ile Lys Val Cys Asp Glu Phe Pro Gly Phe Thr His

275 280 285

Phe Lys Met His Gln Pro Tyr Gly Ser Pro Val Pro Lys Leu Ile Ser

290 295 300

Val Pro Arg Ser His Ala Lys His Pro Thr Asp Thr Tyr Pro His Ala

305 310 315 320

Ser Glu Val Thr Ile Lys Lys Ala Ile Asn Arg Phe Leu Pro Arg Phe

325 330 335

Asn Asp Lys Glu Leu Val Asn Arg Ala Met Cys Trp Cys Thr Asp Thr

340 345 350

Ala Asp Ser Asn Leu Leu Val Cys Glu His Pro Arg Trp Lys Gly Phe

355 360 365

Tyr Leu Ala Thr Gly Asp Ser Gly His Ser Phe Lys Leu Leu Pro Asn

370 375 380

Ile Gly Lys His Val Val Glu Leu Leu Glu Gly Arg Leu Glu Ser Val

385 390 395 400

Phe Lys Asp Ala Trp Arg Trp Arg Pro Gly Ser Gly Asp Ala Leu Lys

405 410 415

Ser Arg Arg Ala Ala Pro Ala Lys Asp Leu Ala Asp Met Pro Gly Trp

420 425 430

Arg Asn Glu

435

Claims

1.一种含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白的测定方法，其特征在于，使含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白与催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶在选自由氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸、烷基磺基乙酸、聚氧乙烯烷基醚乙酸、氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸、聚氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯多环苯基醚磷酸、烷基磷酸及它们的盐组成的组中的至少1种阴离子性表面活性剂的存在下反应而生成过氧化氢，对所生成的所述过氧化氢进行测定。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其中，所述过氧化氢的测定利用过氧化氢测定试剂进行。

3.根据权利要求2所述的测定方法，其中，所述过氧化氢测定试剂为含有过氧化物酶和无色型色原体的试剂。

4.根据权利要求3所述的测定方法，其中，所述无色型色原体为吩噻嗪系色原体。

5.根据权利要求4所述的测定方法，其中，所述吩噻嗪系色原体为10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪或其盐。

6.一种含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白的测定试剂，其含有：催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶；以及选自由氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸、烷基磺基乙酸、聚氧乙烯烷基醚乙酸、氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸、聚氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯多环苯基醚磷酸、烷基磷酸及它们的盐组成的组中的至少1种阴离子性表面活性剂。

7.根据权利要求6所述的测定试剂，其还含有过氧化氢测定试剂。

8.根据权利要求7所述的测定试剂，其中，所述过氧化氢测定试剂为含有过氧化物酶和无色型色原体的试剂。

9.根据权利要求8所述的测定试剂，其中，所述无色型色原体为吩噻嗪系色原体。

10.根据权利要求9所述的测定试剂，其中，所述吩噻嗪系色原体为10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪或其盐。

11.一种含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白的测定试剂盒，其包含：含有选自由氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸、烷基磺基乙酸、聚氧乙烯烷基醚乙酸、氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸、聚氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯多环苯基醚磷酸、烷基磷酸及它们的盐组成的组中的至少1种阴离子性表面活性剂的第一试剂；以及含有催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶的第二试剂。

12.一种含血红蛋白试样中的糖化血红蛋白的测定试剂盒，其包含：含有催化将糖化血红蛋白氧化而生成过氧化氢的反应的酶的第一试剂；以及含有选自由氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基牛磺酸、烷基磺基乙酸、聚氧乙烯烷基醚乙酸、氨基的氢原子可被取代基取代的N-酰基氨基酸、聚氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯多环苯基醚磷酸、烷基磷酸及它们的盐组成的组中的至少1种阴离子性表面活性剂的第二试剂。

13.根据权利要求11或12所述的测定试剂盒，其中，进一步将过氧化物酶及无色型色原体分别包含在第一试剂和第二试剂中或者第二试剂和第一试剂中。

14.根据权利要求13记载的测定试剂盒，其中，所述无色型色原体为吩噻嗪系色原体。

15.根据权利要求14所述的测定试剂盒，其中，所述吩噻嗪系色原体为10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪或其盐。