WO2021192465A1 - 異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法 - Google Patents

異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法 Download PDF

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WO2021192465A1
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WO
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hemoglobin
reagent
measuring
sulfonic acid
hydrogen peroxide
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PCT/JP2020/047908
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林　達也
将起 塩田
知子 荒武
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日立化成ダイアグノスティックス・システムズ株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring glycated hemoglobin in a sample containing abnormal hemoglobin, a measuring reagent, a measuring kit and a composition.
  • the present application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2020-55732 filed in Japan on March 26, 2020, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • Glycated proteins are contained in body fluids such as blood in the living body and biological samples such as hair.
  • concentration of glycated protein present in blood depends on the concentration of saccharides such as glucose dissolved in serum, and in the field of clinical diagnosis, hemoglobin A1c (hereinafter referred to as HbA1c), which is a glycated protein in blood.
  • HbA1c hemoglobin A1c
  • Measurement of the concentration of serum is used for diagnosis and monitoring of diabetes (see Non-Patent Document 1).
  • Hemoglobin is a heme protein having a molecular weight of 64,000, each having two types of subunits, an ⁇ chain and a ⁇ chain.
  • HbA1c is specifically defined as the glycated N-terminal valine residue of the ⁇ chain.
  • the enzymatic measurement method of HbA1c reported so far is mainly a method using a protease and a glycated peptide oxidase. That is, a protease is allowed to act on HbA1c in blood cells to produce a fructosyldipeptide (Fru-Val-His) which is a glycated peptide, and the fructosylpeptide oxidase is allowed to act on the produced fructosyldipeptide.
  • a method of measuring HbA1c in a sample by generating hydrogen oxide and measuring the generated hydrogen peroxide (see Patent Document 1), or by allowing a protease to act on HbA1c in blood cells to cause fructosyl, which is a glycated peptide.
  • Hexapeptide Fru-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu
  • fructosyl hexapeptide oxidase was allowed to act on the produced fructosyl hexapeptide to generate hydrogen peroxide.
  • This is a method for measuring HbA1c in a sample by measuring hydrogen peroxide (see Patent Documents 2 to 4).
  • Non-Patent Document 4 a method of measuring glycated hemoglobin in a sample by using an enzyme that catalyzes a reaction of oxidizing glycated hemoglobin to generate hydrogen peroxide without using a protease.
  • hemoglobin As for hemoglobin, the existence of abnormal hemoglobin is known in addition to normal hemoglobin such as hemoglobin A.
  • abnormal hemoglobin include hemoglobin C (HbC) in which the 6th glutamic acid from the N-terminal of the hemoglobin ⁇ chain is replaced with lysine, and hemoglobin S (HbC) in which the 6th glutamic acid from the N-terminal of the hemoglobin ⁇ chain is replaced with valine. HbS) and the like. HbS is also known as a factor in sickle cell disease.
  • Abnormal hemoglobin is genetically retained, and the sample may contain abnormal hemoglobin.
  • the method for measuring glycated hemoglobin using an enzyme that catalyzes a reaction that oxidizes glycated hemoglobin to generate hydrogen peroxide without using a protease contains abnormal hemoglobin as compared with the measurement for a sample that does not contain abnormal hemoglobin.
  • the accuracy of the measurement of the concentration of glycated hemoglobin may be inferior.
  • the abnormal hemoglobin molecule itself is probably not the short glycated peptide produced by the protease.
  • it is a substrate for enzymes it is considered that it is easily affected by abnormal hemoglobin.
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and measurement of saccharified hemoglobin using an enzyme that catalyzes a reaction of oxidizing saccharified hemoglobin to generate hydrogen peroxide without using a protease.
  • the method for measuring saccharified hemoglobin in the abnormal hemoglobin-containing sample, the saccharified hemoglobin measuring reagent in the abnormal hemoglobin-containing sample, and the abnormal hemoglobin-containing sample which are excellent in the accuracy of measuring saccharified hemoglobin in the abnormal hemoglobin-containing sample. It is an object of the present invention to provide a saccharified hemoglobin measurement kit and a composition.
  • the present inventors have specified in a method for measuring glycated hemoglobin using an enzyme that catalyzes a reaction that oxidizes glycated hemoglobin to generate hydrogen peroxide without using a protease.
  • the accuracy of measurement of glycated hemoglobin in a sample containing abnormal hemoglobin is improved by using the anionic surfactant of the above, and completed the present invention. That is, the present invention relates to the following [1] to [30].
  • the saccharified hemoglobin in the abnormal hemoglobin-containing sample and the enzyme that catalyzes the reaction of oxidizing the saccharified hemoglobin to generate hydrogen peroxide are composed of a sulfonic acid-based anionic surfactant and polyoxyethylene alkyl ether acetic acid.
  • a method for measuring saccharified hemoglobin in an abnormal hemoglobin-containing sample which comprises reacting in the presence of at least one anionic surfactant selected from the group to generate hydrogen peroxide, and measuring the produced hydrogen peroxide.
  • the sulfonic acid-based anionic surfactant includes alkenyl sulfonic acid, alkyl sulfonic acid, N-acyl taurine, alkyl sulfoacetate, alkyl benzene sulfonic acid in which the hydrogen atom of the amino group may be substituted with a substituent.
  • the abnormal hemoglobin is at least one or more amino acids deleted, substituted or added in the amino acid sequence 1 to 6 from the N-terminal of the ⁇ chain of human hemoglobin A [1].
  • the method for measuring glycated hemoglobin [4] The method for measuring glycated hemoglobin according to any one of [1] to [3], wherein the abnormal hemoglobin is human hemoglobin C or hemoglobin S. [5] The method for measuring glycated hemoglobin according to any one of [1] to [4], wherein the content ratio of the abnormal hemoglobin is 20% or more with respect to the total number of hemoglobin in the hemoglobin-containing sample. [6] The method for measuring glycated hemoglobin according to any one of [1] to [5], wherein the hydrogen peroxide is measured using a hydrogen peroxide measuring reagent.
  • a reagent for measuring glycated hemoglobin in an abnormal hemoglobin-containing sample which comprises at least one anionic surfactant selected from the group consisting of a sulfonic acid-based anionic surfactant and polyoxyethylene alkyl ether acetic acid.
  • the sulfonic acid-based anionic surfactant includes alkenyl sulfonic acid, alkyl sulfonic acid, N-acyl taurine, alkyl sulfoacetic acid, alkyl benzene sulfonic acid in which the hydrogen atom of the amino group may be substituted with a substituent.
  • the measuring reagent according to [10] which is at least one anionic surfactant selected from the group consisting of alkyl polyoxyethylene sulfosuccinate.
  • the measuring reagent according to [10] or [11] further comprising a hydrogen peroxide measuring reagent.
  • the measuring reagent according to [12], wherein the hydrogen peroxide measuring reagent is a reagent containing peroxidase and a leuco-type chromogen.
  • the measuring reagent according to [13], wherein the leuco-type chromogen is a phenothiazine-based chromogen.
  • the measuring reagent according to [14], wherein the phenothiazine-based chromogen is 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine or a salt thereof.
  • a first reagent containing at least one anionic surfactant selected from the group consisting of a sulfonic acid-based anionic surfactant and polyoxyethylene alkyl ether acetic acid, and saccharified hemoglobin are oxidized to generate hydrogen peroxide.
  • the sulfonic acid-based anionic surfactant includes alkenyl sulfonic acid, alkyl sulfonic acid, N-acyl taurine, alkyl sulfoacetic acid, alkyl benzene sulfonic acid in which the hydrogen atom of the amino group may be substituted with a substituent.
  • the measurement kit according to [16] which is at least one anionic surfactant selected from the group consisting of alkyl polyoxyethylene sulfosuccinate.
  • the leuco-type chromogen is a phenothiazine-based chromogen.
  • the phenothiazine-based phenothiazine is 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine or a salt thereof.
  • Saccharified hemoglobin containing abnormal hemoglobin and A composition comprising at least one anionic surfactant selected from the group consisting of a sulfonic acid-based anionic surfactant and polyoxyethylene alkyl ether acetic acid.
  • the sulfonic acid-based anionic surfactant includes alkenyl sulfonic acid, alkyl sulfonic acid, N-acyl taurine, alkyl sulfoacetic acid, alkyl benzene sulfonic acid, in which the hydrogen atom of the amino group may be substituted with a substituent.
  • composition according to [21] which is at least one anionic surfactant selected from the group consisting of alkyl polyoxyethylene sulfosuccinate and polyoxyethylene alkyl ether acetic acid.
  • the hydrogen peroxide measuring reagent is at least one selected from the group consisting of peroxidase and leuco-type chromogen.
  • the composition according to [25], wherein the leuco-type chromogen is a phenothiazine-based chromogen.
  • the phenothiazine-based phenothiazine is 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine or a salt thereof.
  • the abnormal hemoglobin is at least one or more amino acids deleted, substituted or added in the amino acid sequence 1 to 6 from the N-terminal of the ⁇ chain of human hemoglobin A [21]. ] To [27].
  • composition according to any one of [21] to [28], wherein the abnormal hemoglobin is human hemoglobin C or hemoglobin S.
  • the content ratio of the abnormal hemoglobin is 20% or more with respect to the total number of hemoglobin in the composition.
  • a method for measuring saccharified hemoglobin in an abnormal hemoglobin-containing sample, a saccharified hemoglobin measuring reagent in an abnormal hemoglobin-containing sample, and an abnormal hemoglobin-containing sample which are excellent in accuracy in measuring saccharified hemoglobin in an abnormal hemoglobin-containing sample.
  • a saccharified hemoglobin measurement kit in a sample and a composition are provided.
  • the vertical axis represents the absorbance difference ⁇ E (Abs ⁇ 10000), and the horizontal axis represents the HbA1c concentration ( ⁇ mol / L).
  • the method for measuring glycated hemoglobin in a sample containing abnormal hemoglobin (hereinafter referred to as a measuring method in the embodiment) of the embodiment is a method for measuring glycated hemoglobin in a sample containing abnormal hemoglobin.
  • the measurement method may include the following steps.
  • the saccharified hemoglobin in the abnormal hemoglobin-containing sample and the enzyme that catalyzes the reaction of oxidizing the saccharified hemoglobin to generate hydrogen peroxide are composed of a sulfonic acid-based anionic surfactant and polyoxyethylene alkyl ether acetic acid.
  • the saccharified hemoglobin in the abnormal hemoglobin-containing sample and the enzyme that catalyzes the reaction of oxidizing the saccharified hemoglobin to generate hydrogen peroxide are used as a sulfonic acid-based anionic surfactant and polyoxyethylene alkyl.
  • the step of reacting in the presence of at least one anionic surfactant selected from the group consisting of ether acetic acid to generate hydrogen peroxide is After mixing at least one anionic surfactant selected from the group consisting of a sulfonic acid-based anionic surfactant and polyoxyethylene alkyl ether acetic acid with an abnormal hemoglobin-containing sample, the saccharified hemoglobin is oxidized to peroxidize.
  • the measurement method may include the following steps.
  • (I-1) Reaction of hemoglobin in an abnormal hemoglobin-containing sample with at least one anionic surfactant selected from the group consisting of a sulfonic acid-based anionic surfactant and polyoxyethylene alkyl ether acetic acid in an aqueous medium.
  • (I-2) A step of adding an enzyme that catalyzes a reaction of oxidizing glycated hemoglobin to generate hydrogen peroxide to the aqueous medium of the above step (i-1) to generate hydrogen peroxide;
  • (Ii) A step of measuring hydrogen peroxide produced in the step (i-2); and
  • (Iii) A calibration curve showing the relationship between the amount of hydrogen peroxide and the saccharified hemoglobin concentration prepared in advance by measuring according to the above (i-1), (i-2) and (ii) using a known concentration of saccharified hemoglobin.
  • the method for measuring saccharified hemoglobin in the abnormal hemoglobin-containing sample of the embodiment also includes a method of calculating the ratio of the amount of saccharified hemoglobin in the hemoglobin-containing sample to the total amount of hemoglobin (that is, the total amount of hemoglobin and saccharified hemoglobin combined). Include.
  • the method for measuring glycated hemoglobin in the abnormal hemoglobin-containing sample of the embodiment may be specifically a measuring method including the following steps.
  • a step of measuring the total amount of hemoglobin in a sample containing abnormal hemoglobin (I) A step of measuring the total amount of hemoglobin in a sample containing abnormal hemoglobin; (Ii) The saccharified hemoglobin in the abnormal hemoglobin-containing sample and the enzyme that catalyzes the reaction of oxidizing the saccharified hemoglobin to generate hydrogen peroxide are composed of a sulfonic acid-based anionic surfactant and polyoxyethylene alkyl ether acetic acid.
  • the step of measuring the amount of saccharified hemoglobin in the abnormal hemoglobin-containing sample by comparing the amount of hydrogen peroxide measured in (V) A step of calculating the ratio of the amount of glycated hemoglobin in the abnormal hemoglobin-containing sample to the total amount of hemoglobin from the total amount of hemoglobin measured in the step (i) and the amount of glycated hemoglobin measured in the step (iv). ..
  • the saccharified hemoglobin in the abnormal hemoglobin-containing sample and the enzyme that catalyzes the reaction of oxidizing the saccharified hemoglobin to generate hydrogen peroxide are used as a sulfonic acid-based anionic surfactant and polyoxyethylene alkyl.
  • the step of reacting in the presence of at least one anionic surfactant selected from the group consisting of ether acetic acid to generate hydrogen peroxide is After mixing at least one anionic surfactant selected from the group consisting of a sulfonic acid-based anionic surfactant and polyoxyethylene alkyl ether acetic acid with an abnormal hemoglobin-containing sample, the saccharified hemoglobin is oxidized to peroxidize.
  • the measurement method may include the following steps.
  • a step of measuring the total amount of hemoglobin in a sample containing abnormal hemoglobin (I) A step of measuring the total amount of hemoglobin in a sample containing abnormal hemoglobin; (Ii) The saccharified hemoglobin in the abnormal hemoglobin-containing sample and the enzyme that catalyzes the reaction of oxidizing the saccharified hemoglobin to generate hydrogen peroxide are composed of a sulfonic acid-based anionic surfactant and polyoxyethylene alkyl ether acetic acid.
  • At least one anionic surfactant selected from the group consisting of a sulfonic acid-based anionic surfactant and a polyoxyethylene alkyl ether acetic acid is added to the abnormal hemoglobin-containing sample.
  • the sample containing abnormal hemoglobin in the measurement method of the embodiment is not particularly limited as long as it contains abnormal hemoglobin and the method for measuring glycated hemoglobin of the embodiment can be applied, and does not correspond to abnormal hemoglobin other than abnormal hemoglobin. It may contain normal hemoglobin.
  • the sample include whole blood, blood cells, a sample in which plasma is mixed in blood cells, and a sample obtained by hemolyzing these samples.
  • the hemolytic treatment is not particularly limited as long as it is a treatment for hemolyzing a sample in which plasma is mixed with whole blood, blood cells, and blood cells, and examples thereof include a physical method, a chemical method, and a biological method.
  • Examples of the physical method include a method using a hypotonic solution such as distilled water, a method using ultrasonic waves, and the like.
  • Examples of the chemical method include a method using an organic solvent such as methanol, ethanol, and acetone, a method using a polyoxyethylene-based surfactant, and the like.
  • Examples of the biological method include a method using an antibody or complement.
  • abnormal hemoglobin refers to an amino acid sequence of an amino acid chain constituting a hemoglobin molecule having a mutation such as substitution of a part of the amino acid, and the amino acid sequence of the amino acid chain constituting the ⁇ chain of hemoglobin. In the above, those having mutations such as substitution of some amino acids are preferable.
  • the mutation can be based on, for example, the amino acid sequence of the globin chain constituting hemoglobin A, and can be based on the amino acid sequence constituting the ⁇ chain of hemoglobin A.
  • normal hemoglobin that does not correspond to abnormal hemoglobin
  • hemoglobin A HbA 0 , HbA 1 , HbA 2
  • hemoglobin F and the like.
  • the hemoglobin is preferably human (Homo sapiens) hemoglobin. That is, it is preferable that the abnormal hemoglobin-containing sample in the measurement method of the embodiment contains human abnormal hemoglobin.
  • the sample containing abnormal amino acids contains it as compared with the sample containing no abnormal amino acids.
  • the accuracy of the measurement of glycated hemoglobin is sometimes inferior. This is probably due to mutations such as substitutions in the amino acid sequence of the globin chain that makes up the hemoglobin molecule, which changes the structure and charge of the hemoglobin molecule and catalyzes the reaction that oxidizes glycated hemoglobin to produce hydrogen peroxide. It is considered that this is because the reactivity with the enzyme is reduced.
  • the enzyme that catalyzes the reaction that oxidizes saccharified hemoglobin to generate hydrogen peroxide exerts a catalytic action by interacting with the vicinity of the N-terminal of the ⁇ chain of hemoglobin. Therefore, the decrease in the reactivity of the enzyme is more affected when there is a mutation such as substitution in the amino acid sequence of the 1st to 6th amino acids from the N-terminal of the hemoglobin ⁇ chain, which is presumed to be important for the reaction of the enzyme. It is considered to be easy to receive.
  • the abnormal hemoglobin in the abnormal hemoglobin-containing sample is at least one or more in the amino acid sequence 1 to 6 from the N-terminal of the ⁇ chain of human hemoglobin A (more specifically, hemoglobin A 0). Amino acids may be deleted, substituted or added.
  • the abnormal hemoglobin in the abnormal hemoglobin-containing sample is at least one or more amino acids deleted, substituted or added in the 3rd to 6th amino acid sequences from the N-terminal of the ⁇ chain of human hemoglobin A. good.
  • the number may be 1 to 3 or 1 to 2 as one or a plurality.
  • Hemoglobin C which is known as abnormal human hemoglobin, is a hemoglobin ⁇ chain in which the sixth glutamic acid from the N-terminal is replaced with lysine as compared with hemoglobin A. Further, in hemoglobin S (HbS), the sixth glutamic acid from the N-terminal of the hemoglobin ⁇ chain is replaced with valine as compared with hemoglobin A. Since these HbC or HbS have a high probability of being contained in the sample and have substitutions in the amino acid sequences of the 1st to 6th amino acids from the N-terminal of the ⁇ chain, it is considered that the influence on the accuracy of measurement is greater.
  • the abnormal hemoglobin in the abnormal hemoglobin-containing sample is human hemoglobin C or hemoglobin S.
  • SEQ ID NO: 11 shows the amino acid sequence of the ⁇ chain of human hemoglobin to be compared.
  • the abnormal hemoglobin-containing sample may contain both normal hemoglobin and abnormal hemoglobin.
  • the abnormal hemoglobin content in the abnormal hemoglobin-containing sample that is, the ratio of the abnormal hemoglobin amount to the total hemoglobin amount in the sample. It may be 15% or more, 20% or more, 25% or more, 30% or more, 35% or more, 40% or more. It may be 45% or more, 50% or more, 55% or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more. , 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more.
  • the upper limit of the ratio of the abnormal hemoglobin amount to the total hemoglobin amount in the sample is not particularly limited and may be 100% or less, 99% or less based on the number, 90% or less, and 80%. % Or less, 70% or less, 60% or less, 50% or less, 40% or less.
  • the above numerical ranges can be freely combined.
  • the ratio of the abnormal hemoglobin amount to the total hemoglobin amount in the sample may be 5 to 100%, 5 to 90%, 10 to 80%, or 10 to 70% on a number basis. It may be 20 to 60%, 20 to 50%, or 30 to 40%. Mol can be adopted as the number standard.
  • the abnormal hemoglobin-containing sample preferably contains human hemoglobin C or hemoglobin S as abnormal hemoglobin and human hemoglobin A as normal hemoglobin.
  • the saccharified hemoglobin in the present specification is produced by binding a sugar such as glucose to hemoglobin, may be produced by binding a sugar such as glucose to the ⁇ chain of hemoglobin, and is hemoglobin A1.
  • Hemoglobin A1a, hemoglobin A1b, HbA1c and the like are often mentioned, and HbA1c is preferable.
  • the glycated hemoglobin of abnormal hemoglobin HbC which is not HbA, is also glycated hemoglobin produced by binding sugar to the corresponding position of the hemoglobin ⁇ chain corresponding to hemoglobin A1, for convenience. These are collectively expressed as the amount of HbA1c.
  • glycated hemoglobin is a concept including glycated hemoglobin of abnormal hemoglobin.
  • the saccharified hemoglobin contained in the abnormal hemoglobin-containing sample can include saccharified hemoglobin of abnormal hemoglobin.
  • the total hemoglobin concentration ( ⁇ mol / L) in the reaction solution in the measuring method of the embodiment is not particularly limited, but is preferably 0.5 to 100 ⁇ mol / L, more preferably 3 to 20 ⁇ mol / L, for example. , 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35 , 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 ⁇ mol / L can be exemplified.
  • the reaction solution in the measurement method of the embodiment means a reaction system in the step of generating hydrogen peroxide.
  • a sample, a mixture of the first reagent and the second reagent can be exemplified.
  • “In the presence of anionic surfactant” means that the reaction solution in the step of generating hydrogen peroxide may contain an anionic surfactant.
  • At least one anionic surfactant selected from the group consisting of a sulfonic acid-based anionic surfactant and polyoxyethylene alkyl ether acetic acid is used.
  • the "sulfonic acid-based anionic surfactant” is an anionic surfactant and is a compound having a sulfonic acid group.
  • the sulfonic acid-based anionic surfactant include alkenyl sulfonic acid, alkyl sulfonic acid, N-acyl taurine in which the hydrogen atom of the amino group may be substituted with a substituent, alkyl sulfoacetate, alkyl benzene sulfonic acid and polyoxyethylene.
  • At least one anionic surfactant selected from the group consisting of alkyl sulfosuccinates can be exemplified.
  • Examples of the alkenyl in the alkenyl sulfonic acid in the present specification include an alkenyl group having 8 to 20 carbon atoms, and an alkenyl group having 10 to 18 carbon atoms is preferable.
  • Examples of the alkenyl having 8 to 20 carbon atoms include octenyl, nonenyl, decenyl, undecenyl, dodecenyl, tridecenyl, tetradecenyl, pentadecenyl, hexadecenyl, heptadecenyl, octadecenyl, nonadesenyl, and icosenyl.
  • the alkenyl sulfonic acid may be a salt.
  • the salt include sodium salt, potassium salt, ammonium salt, magnesium salt, calcium salt, monoethanolamine salt and the like.
  • Specific examples (products) of alkenyl sulfonic acid or a salt thereof include K lipolan PJ-400J (Na tetradecene sulfonic acid; manufactured by Lion Co., Ltd.) and the like.
  • the concentration of alkenylsulfonic acid or a salt thereof in the reaction solution in the measuring method of the embodiment is preferably 0.01 to 50 g / L, more preferably 0.1 to 5 g / L, and 0.1 to 1 g / L.
  • Is even more preferable for example, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, It is 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 g / L.
  • alkyl in the alkyl sulfonic acid in the present specification examples include an alkyl having 8 to 20 carbon atoms, and an alkyl having 10 to 18 carbon atoms is preferable.
  • alkyl having 8 to 20 carbon atoms include octyl, nonyl, decyl, undecylic, dodecyl (lauryl), tridecylic, tetradecyl (myristyl), pentadecyl, hexadecyl (cetyl), heptadecyl, octadecyl (stearyl), nonadecylic, and icosyl. Can be mentioned.
  • alkyl having 10 to 18 carbon atoms examples include decyl, undecylic, dodecyl (lauryl), tridecylic, tetradecyl (myristyl), pentadecyl, hexadecyl (cetyl), heptadecyl, octadecyl (stearyl) and the like.
  • the alkyl sulfonic acid may be a salt.
  • the salt include sodium salt, potassium salt, ammonium salt, magnesium salt, calcium salt, monoethanolamine salt and the like.
  • alkyl sulfonic acid or a salt thereof examples include sodium lauryl sulfonic acid (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) and the like.
  • the concentration of alkylsulfonic acid or a salt thereof in the reaction solution in the measuring method of the embodiment is preferably 0.01 to 50 g / L, more preferably 0.1 to 5 g / L, and 0.1 to 1 g / L.
  • Is even more preferable for example, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, It is 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 g / L.
  • examples of the substituent in N-acyl taurine in which the hydrogen atom of the amino group may be substituted with a substituent include an alkyl group, an alkyl halide group, a phenyl group and the like.
  • examples of the alkyl halide group include a fluoroalkyl group, a chloroalkyl group, a bromoalkyl group, an iodoalkyl group and the like.
  • examples of the alkyl in the alkyl group and the halogenated alkyl group include alkyl having 1 to 6 carbon atoms.
  • alkyl having 1 to 6 carbon atoms examples include methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl and the like.
  • N-acyl taurine in which the hydrogen atom of the amino group may be substituted with a substituent examples include N-acyl taurine, N-acyl-N-alkyl taurine and the like, and N-acyl-. N-alkyltaurine and the like are preferable.
  • Examples of the acyl in N-acyl taurine in which the hydrogen atom of the amino group may be substituted with a substituent include an acyl having 8 to 20 carbon atoms, and an acyl having 10 to 18 carbon atoms is preferable.
  • Examples of acyls having 8 to 20 carbon atoms include octanoyl, nonanoyl, decanoyle, undecanoyl, dodecanoyl (lauroyl), tridecanoyl, tetradecanoyl, pentadecanoyl, hexadecanoyl (palmitoyle), heptadecanoyl, octadecanoyl (stearoyl), and the like.
  • Examples thereof include ole oil, baxenoyl, linole oil, nonadecanoyle, and eikosanoyl.
  • Acyls having 10 to 18 carbon atoms include, for example, decanoyl, undecanoyl, dodecanoyl (lauroyl), tridecanoyl, tetradecanoyl, pentadecanoyl, hexadecanoyl (palmitoyle), heptadecanoyl, octadecanoyl (stearoyl), oleoil, and buxenoyl. , Linole oil and the like.
  • alkyl in the N-acyl-N-alkyl taurine examples include alkyl having 1 to 6 carbon atoms.
  • alkyl having 1 to 6 carbon atoms examples include methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl and the like.
  • the N-acyltaurine in which the hydrogen atom of the amino group may be substituted with a substituent may be a salt.
  • the salt include sodium salt, potassium salt, ammonium salt, magnesium salt, calcium salt, monoethanolamine salt and the like.
  • Specific examples (products) of N-acyltaurine or a salt thereof in which the hydrogen atom of the amino group may be substituted with a substituent include, for example, NIKKOL LMT (sodium N-lauroyl-N-methyltaurine; manufactured by Nikko Chemicals Co., Ltd.).
  • the concentration of N-acyl taurine, or a salt thereof, in which the hydrogen atom of the amino group may be substituted with a substituent is preferably 0.01 to 50 g / L, is 0.
  • 1 to 5 g / L is more preferable, 0.5 to 5 g / L is even more preferable, for example, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 g / L.
  • alkyl in alkyl sulfoacetic acid in the present specification examples include alkyl having 8 to 20 carbon atoms, and alkyl having 10 to 18 carbon atoms is preferable.
  • alkyl having 8 to 20 carbon atoms include octyl, nonyl, decyl, undecylic, dodecyl (lauryl), tridecylic, tetradecyl (myristyl), pentadecyl, hexadecyl (cetyl), heptadecyl, octadecyl (stearyl), nonadecylic, and icosyl. Can be mentioned.
  • alkyl having 10 to 18 carbon atoms examples include decyl, undecylic, dodecyl (lauryl), tridecylic, tetradecyl (myristyl), pentadecyl, hexadecyl (cetyl), heptadecyl, octadecyl (stearyl) and the like.
  • the alkyl sulfoacetic acid may be a salt.
  • the salt include sodium salt, potassium salt, ammonium salt, magnesium salt, calcium salt, monoethanolamine salt and the like.
  • Specific examples (products) of alkyl sulfoacetic acid or a salt thereof include NIKKOL LSA-F (sodium lauryl sulfoacetate; manufactured by Nikko Chemicals Co., Ltd.) and the like.
  • the concentration of alkylsulfoacetic acid or a salt thereof in the reaction solution in the measuring method of the embodiment is preferably 0.01 to 50 g / L, more preferably 0.1 to 5 g / L, and 0.1 to 1 g / L.
  • Is even more preferable for example, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, It is 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 g / L.
  • alkyl in the alkylbenzene sulfonic acid in the present specification examples include an alkyl having 8 to 20 carbon atoms, and an alkyl having 10 to 18 carbon atoms is preferable.
  • alkyl having 8 to 20 carbon atoms include octyl, nonyl, decyl, undecylic, dodecyl (lauryl), tridecylic, tetradecyl (myristyl), pentadecyl, hexadecyl (cetyl), heptadecyl, octadecyl (stearyl), nonadecylic, and icosyl. Can be mentioned.
  • alkyl having 10 to 18 carbon atoms examples include decyl, undecylic, dodecyl (lauryl), tridecylic, tetradecyl (myristyl), pentadecyl, hexadecyl (cetyl), heptadecyl, octadecyl (stearyl) and the like.
  • the alkylbenzene sulfonic acid may be a salt.
  • the salt include sodium salt, potassium salt, ammonium salt, magnesium salt, calcium salt, monoethanolamine salt and the like.
  • alkylbenzene sulfonic acid or a salt thereof examples include LAS-C8 (pn-octylbenzene sulfonic acid Na; manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) and the like.
  • the concentration of alkylbenzene sulfonic acid or a salt thereof in the reaction solution in the measuring method of the embodiment is preferably 0.01 to 50 g / L, more preferably 0.1 to 5 g / L, and 0.1 to 1 g / L.
  • Is even more preferable for example, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, It is 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 g / L.
  • alkyl in the alkyl polyoxyethylene sulfosuccinate in the present specification examples include an alkyl having 8 to 20 carbon atoms, and an alkyl having 10 to 18 carbon atoms is preferable.
  • alkyl having 8 to 20 carbon atoms include octyl, nonyl, decyl, undecylic, dodecyl (lauryl), tridecylic, tetradecyl (myristyl), pentadecyl, hexadecyl (cetyl), heptadecyl, octadecyl (stearyl), nonadecylic, and icosyl. Can be mentioned.
  • alkyl having 10 to 18 carbon atoms examples include decyl, undecylic, dodecyl (lauryl), tridecylic, tetradecyl (myristyl), pentadecyl, hexadecyl (cetyl), heptadecyl, octadecyl (stearyl) and the like.
  • the alkyl polyoxyethylene sulfosuccinate may be a salt.
  • the salt include sodium salt, potassium salt, ammonium salt, magnesium salt, calcium salt, monoethanolamine salt and the like.
  • alkyl polyoxyethylene sulfosuccinate or a salt thereof examples include neohytenol L-30 (lauryl 2Na polyoxyethylene sulfosuccinate; manufactured by Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.).
  • the concentration of alkyl polyoxyethylene sulfosuccinate or a salt thereof in the reaction solution is preferably 0.01 to 50 g / L, more preferably 0.1 to 5 g / L, and 0.5 to 0.5 to 5 g / L is more preferable, for example, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0. .2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 , 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 g / L.
  • alkyl in the polyoxyethylene alkyl ether acetic acid in the present specification examples include an alkyl having 8 to 20 carbon atoms, and an alkyl having 10 to 18 carbon atoms is preferable.
  • alkyl having 8 to 20 carbon atoms include octyl, nonyl, decyl, undecylic, dodecyl (lauryl), tridecylic, tetradecyl (myristyl), pentadecyl, hexadecyl (cetyl), heptadecyl, octadecyl (stearyl), nonadecylic, and icosyl. Can be mentioned.
  • alkyl having 10 to 18 carbon atoms examples include decyl, undecylic, dodecyl (lauryl), tridecylic, tetradecyl (myristyl), pentadecyl, hexadecyl (cetyl), heptadecyl, octadecyl (stearyl) and the like.
  • the polyoxyethylene alkyl ether acetic acid may be a salt.
  • the salt in the polyoxyethylene alkyl ether acetate examples include sodium salt, potassium salt, ammonium salt, magnesium salt, calcium salt, monoethanolamine salt and the like.
  • polyoxyethylene alkyl ether acetic acid or a salt thereof examples include, for example, NIKKOL AKYPO RLM 45 NV (polyoxyethylene lauryl ether sodium acetate; manufactured by Nikko Chemicals), NIKKOL AKYPO RLM 45 (polyoxyethylene lauryl ether).
  • NIKKOL AKYPO RLM 100 Polyoxyethylene lauryl ether acetic acid; Nikko Chemicals Co., Ltd.
  • NIKKOL ECT-3NEX Polyoxyethylene tridecyl ether acetate, Nikko Chemicals Co., Ltd.
  • NIKKOL ECTD-3NEX Sodium polyoxyethylene tridecyl ether acetate; manufactured by Nikko Chemicals
  • NIKKOL ECTD-6NEX Sodium polyoxyethylene tridecyl ether acetate; manufactured by Nikko Chemicals
  • Neohytenol ECL-45 Sodium polyoxyethylene lauryl ether acetate
  • the concentration of polyoxyethylene alkyl ether acetic acid or a salt thereof in the reaction solution in the measuring method of the embodiment is preferably 0.01 to 50 g / L, more preferably 0.1 to 5 g / L, and 0.1 to 1 g. / L is more preferable, for example, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0. 2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, It is 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 g / L.
  • the total amount of hemoglobin can be measured by a known method, for example, the cyanmethemoglobin method, the oxyhemoglobin method, the SLS-hemoglobin method, or the like.
  • the total amount of hemoglobin is not limited to the abnormal hemoglobin-containing sample itself, but at least one anionic surfactant selected from the group consisting of a sulfonic acid-based anionic surfactant and polyoxyethylene alkyl ether acetic acid is added to the abnormal hemoglobin-containing sample. It can also be measured by applying the cyanmethhemoglobin method, the oxyhemoglobin method, the SLS-hemoglobin method, or the like to the sample obtained by addition.
  • the reaction with the enzyme that catalyzes the reaction that oxidizes to produce hydrogen peroxide is any condition as long as the enzyme that catalyzes the reaction that oxidizes glycated hemoglobin to produce hydrogen peroxide can act on the glycated hemoglobin. You can also do it below.
  • the reaction between the saccharified hemoglobin in the abnormal hemoglobin-containing sample and the enzyme that catalyzes the reaction of oxidizing the saccharified hemoglobin to generate hydrogen peroxide is preferably carried out in an aqueous medium.
  • the aqueous medium is not particularly limited as long as it is an aqueous medium that enables the measurement method of the embodiment, and examples thereof include deionized water, distilled water, and a buffer solution, and a buffer solution is preferable.
  • the pH of the aqueous medium is not particularly limited as long as it enables the measurement method of the embodiment, and may be, for example, pH 4 to 10, for example, pH 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. ..
  • a buffer solution When a buffer solution is used as the aqueous medium, it is desirable to use a buffer solution according to the pH to be set.
  • the buffer used in the buffer include tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer, phosphate buffer, borate buffer, Good's buffer and the like.
  • Good buffers include, for example, 2-morpholinoetan sulfonic acid (MES), bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis-Tris), N- (2-acetamido) iminodiacetic acid (ADA).
  • MES 2-morpholinoetan sulfonic acid
  • Bis-Tris bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane
  • ADA N- (2-acetamido) iminodiacetic acid
  • Piperazin-N, N'-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES), N- (2-acetamide) -2-aminoethanesulfonic acid (ACES), 3-morpholino-2-hydroxypropanesulfonic acid (MOPSO) ), N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid (BES), 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS), N- [tris (hydroxymethyl) methyl] -2-aminoethanesulfonic acid Acid (TES), 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES), 3- [N, N-bis (2-hydroxyethyl) amino] -2-hydroxypropanesulfon Acid (DIPSO), N- [Tris (Hydroxymethyl) Methyl] -2-Hydroxy-3-aminopropanesulfon
  • the concentration of the buffer solution is not particularly limited as long as it is a concentration that enables the measurement method of the embodiment, and is preferably 0.001 to 2.0 mol / L, more preferably 0.005 to 1.0 mol / L, for example.
  • the reaction temperature in the reaction between the saccharified hemoglobin in the abnormal hemoglobin-containing sample and the enzyme that catalyzes the reaction of oxidizing the saccharified hemoglobin to generate hydrogen peroxide is particularly high as long as it is a reaction temperature that enables the measurement method of the embodiment.
  • the reaction time in the reaction is not particularly limited as long as it enables the measurement method of the embodiment, and is preferably 1 minute to 3 hours, more preferably 2.5 minutes to 1 hour, for example, 1 Minutes, 1.5 minutes, 2 minutes, 2.5 minutes, 3 minutes, 3.5 minutes, 4 minutes, 4.5 minutes, 5 minutes, 6 minutes, 7 minutes, 8 minutes, 9 minutes, 10 minutes, 11 Minutes, 12 minutes, 13 minutes, 14 minutes, 15 minutes, 20 minutes, 30 minutes, 40 minutes, 50 minutes, 1 hour, 1.5 hours, 2 hours, 2.5 hours, 3 hours.
  • the concentration of the enzyme that catalyzes the reaction of oxidizing saccharified hemoglobin to generate hydrogen peroxide is not particularly limited as long as it enables the measurement method of the embodiment, and is preferably 0.1 to 30 kU / L. 0.2 to 15 kU / L is more preferable, for example, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 , 27, 28, 29, 30 kU / L.
  • the enzyme activity (U) of the enzyme that catalyzes the reaction of oxidizing glycated hemoglobin to generate hydrogen peroxide was calculated by the following method.
  • ⁇ Reagent for measuring enzyme activity First reagent Phosphate buffer (pH 8.0) 0.1 mmol / L N-Ethyl-N- (3-Methylphenyl) -N'-Succinyl Ethylenediamine (EMSE) 0.3g / L Peroxidase 3kU / L 4-Aminoantipyrine 0.1 g / L
  • Second reagent Fructosylvaline aqueous solution 1.7 mmol / L The aqueous fructosylvaline solution was prepared by the method described in J. Agric. Food Chem., Vol. 24, No. 1, p.70-73 (1976).
  • sample diluent Phosphate buffer (pH 8.0) 10 mmol / L Bovine serum albumin 0.15%
  • FPOX-47 ⁇ 3 an enzyme that catalyzes the reaction that oxidizes glycated hemoglobin to generate hydrogen peroxide
  • ⁇ Measurement> The sample (2 ⁇ L) and the first reagent (150 ⁇ L) of the enzyme activity measurement reagent are added to the reaction cell and reacted at 37 ° C. for 3 minutes (first reaction), and then the enzyme activity measurement reagent is used.
  • Abs enzyme [Abs enzyme (after 5 minutes) ] was measured at both a main wavelength of 546 nm and a sub wavelength of 700 nm, and the Abs enzyme (after 5 minutes ) was subtracted from the Abs enzyme (after 3 minutes) to obtain the absorbance difference ⁇ Abs' enzyme . calculated, 'by dividing the enzyme with 2 minutes, absorbance change ⁇ Abs per minute' further calculated absorbance difference ⁇ Abs were calculated enzyme / min.
  • the absorbance difference ⁇ Abs' blank / min was calculated by the same method except that the sample diluent was used instead of the sample. Calculated ⁇ Abs 'enzyme / min ⁇ Abs' subtracted blank / min, it was determined absorbance difference ⁇ Abs enzyme / min for the enzyme.
  • the enzyme that catalyzes the reaction of oxidizing glycated hemoglobin to generate hydrogen peroxide is not particularly limited as long as it is an enzyme that acts on glycated hemoglobin in a sample containing abnormal hemoglobin and produces hydrogen peroxide from glycated hemoglobin.
  • the enzyme described in International Publication No. 2015/005258, the amadriaase described in International Publication No. 2015/060429, and the like can be mentioned, and their contents are incorporated herein by reference.
  • Specific examples thereof include FPOX-18A, FPOX-18B, FPOX-18C, FPOX-18D, and FPOX19-46 described in International Publication No. 2015/005258.
  • Specific examples of the modified product of the enzyme include FPOX-47 ⁇ 3 produced in Experiment 1 described later.
  • the method for measuring the generated hydrogen peroxide is not particularly limited as long as it can measure hydrogen peroxide, and examples thereof include a method using an electrode and a method using a reagent for measuring hydrogen peroxide.
  • a method using a measurement reagent is preferable.
  • the hydrogen peroxide measurement reagent is a reagent for converting hydrogen peroxide into a detectable substance. Examples of the detectable substance include dyes, light (emission), fluorescence and the like, and dyes are preferable.
  • the reagent for measuring hydrogen peroxide includes a reagent containing a peroxide active substance such as peroxidase and an oxidative color-developing chromogen.
  • a peroxide active substance such as peroxidase
  • an oxidative color-developing chromogen examples include an oxidative coupling type chromogen, a leuco-type chromogen and the like, and a leuco-type chromogen is preferable.
  • the leuco-type chromogen refers to a substance that is independently converted into a dye in the presence of hydrogen peroxide and an active peroxide substance.
  • the peroxide active substance include peroxidase and the like.
  • leuco-type chromogens include phenothiazine-based chromogens, triphenylmethane-based chromogens, diphenylamine-based chromogens, o-phenylenediamine, hydroxypropionic acid, diaminobenzidine, tetramethylbenzidine, and the like. Phenothiazines are preferred.
  • phenothiazine-based chromogen examples include 10-N-carboxymethylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine (CCAP) and 10-N-methylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino).
  • CCAP 10-N-carboxymethylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine
  • CCAP 10-N-methylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino).
  • -10H-phenothiazine (MCDP) 10-N- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine sodium salt (DA-67) and the like can be mentioned.
  • phenothiazine-based chromogens 10-N- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine sodium salt (DA-67) is particularly preferable.
  • triphenylmethane-based chromogen examples include N, N, N', N', N'', N''-hexa (3-sulfopropyl) -4,4', 4''-triaminotriphenyl. Examples thereof include methane (TPM-PS).
  • diphenylamine-based chromogens examples include N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4'-bis (dimethylamino) diphenylamine sodium salt (DA-64), 4,4'-bis (dimethylamino) diphenylamine, and bis.
  • DA-64 N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4'-bis (dimethylamino) diphenylamine sodium salt
  • DA-64 4,4'-bis (dimethylamino) diphenylamine
  • BCMA [3-Bis (4-chlorophenyl) methyl-4-dimethylaminophenyl] amine
  • the oxidative coupling type chromogen refers to two compounds in which a dye is produced by oxidative coupling in the presence of hydrogen peroxide and an active peroxide substance.
  • the combination of the two compounds include a combination of a coupler and an aniline, a combination of a coupler and a phenol, and the like.
  • the coupler include 4-aminoantipyrine (4-AA), 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazine and the like.
  • anilins examples include N- (3-sulfopropyl) aniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methylaniline (TOOS), and N-ethyl-N- (2-hydroxy).
  • the reagent for measuring hydrogen peroxide includes a reagent containing a peroxidase active substance such as peroxidase and a chemiluminescent substance.
  • a peroxidase active substance such as peroxidase and a chemiluminescent substance.
  • the chemiluminescent substance include luminol, isolminol, lucigenin, acridinium ester and the like.
  • the reagent for measuring hydrogen peroxide includes a reagent containing a peroxide active substance such as peroxidase and a fluorescent substance.
  • the fluorescent substance include 4-hydroxyphenyl acetic acid, 3- (4-hydroxyphenyl) propionic acid, coumarin and the like.
  • the saccharified hemoglobin measuring reagent in the abnormal hemoglobin-containing sample of the embodiment (hereinafter referred to as the measuring reagent of the embodiment) oxidizes saccharified hemoglobin to generate hydrogen peroxide. It is a reagent containing an enzyme that catalyzes the reaction to be produced, and at least one anionic surfactant selected from the group consisting of a sulfonic acid-based anionic surfactant and polyoxyethylene alkyl ether acetic acid.
  • the measuring reagent of the embodiment is used in the method for measuring glycated hemoglobin in the abnormal hemoglobin-containing sample of the embodiment.
  • the measuring reagent of the embodiment may further contain a hydrogen peroxide measuring reagent.
  • a sex surfactant As a sex surfactant; and as a reagent for measuring hydrogen peroxide, for example, an enzyme that catalyzes a reaction of oxidizing saccharified hemoglobin to generate hydrogen peroxide, which is exemplified in the measurement method of the above-described embodiment; a sulfonic acid-based anion.
  • At least one anionic surfactant selected from the group consisting of a sex surfactant and a polyoxyethylene alkyl ether acetic acid; and a reagent for measuring hydrogen peroxide and the like can be mentioned respectively.
  • the measurement reagent of the embodiment contains a sulfonic acid-based anionic surfactant, the alkenyl sulfonic acid, alkyl sulfonic acid, and hydrogen atom of the amino group are substituted with substituents in the sulfonic acid-based anionic surfactant.
  • the measurement reagent of the embodiment may be in a lyophilized state or in a state of being dissolved in an aqueous medium.
  • the aqueous medium include the above-mentioned aqueous medium and the like.
  • the reagent can be used by dissolving it in an aqueous medium.
  • the content of the enzyme that catalyzes the reaction of oxidizing saccharified hemoglobin to generate hydrogen peroxide in the saccharified hemoglobin measuring reagent of the embodiment is a concentration of 0.1 to 30 kU / L in a state of being dissolved in an aqueous medium.
  • the content is preferably 0.2 to 15 kU / L, more preferably 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0. 8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,
  • the content is 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 kU / L.
  • the content of at least one anionic surfactant selected from the group consisting of the sulfonic acid-based anionic surfactant and the polyoxyethylene alkyl ether acetic acid in the saccharified hemoglobin measuring reagent of the embodiment is in a state of being dissolved in an aqueous medium.
  • the concentration in (1) is preferably 0.001 to 10 g / L, more preferably 0.01 to 5 g / L, and for example, 0.001, 0.002, 0.003, 0.
  • the measuring reagent of the embodiment may contain an aqueous medium, a stabilizer, a preservative, salts, an interfering substance scavenger, an organic solvent and the like, if necessary.
  • the aqueous medium include the above-mentioned aqueous medium and the like.
  • the stabilizer include polyoxyethylene such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), shoe cloth, calcium chloride, calcium acetate, calcium nitrate, potassium ferrocyanide, pyruvate, bovine serum albumin (BSA), and polyoxyethylene alkylphenyl ether.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • BSA bovine serum albumin
  • Nonionic surfactants, glycerin, alkylene glycol and the like can be mentioned.
  • alkylene glycol examples include ethylene glycol and propylene glycol.
  • preservatives include sodium azide, antibiotics and the like.
  • salts include sodium chloride, sodium nitrate, sodium sulfate, sodium carbonate, sodium formate, sodium acetate, potassium chloride, potassium nitrate, potassium sulfate, potassium carbonate, potassium formate, potassium acetate and the like.
  • interfering substance eliminator examples include ascorbic acid oxidase for eliminating the influence of ascorbic acid.
  • organic solvent examples include dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO), dioxane, acetone, methanol, ethanol and the like as an auxiliary agent for dissolving the leuco-type chromogen in an aqueous medium.
  • the saccharified hemoglobin measuring reagent in the abnormal hemoglobin-containing sample of the embodiment may be stored, distributed and used in the form of a kit.
  • the saccharified hemoglobin measurement kit in the abnormal hemoglobin-containing sample of the embodiment (hereinafter, referred to as the kit of the embodiment) is used as a method for measuring saccharified hemoglobin in the abnormal hemoglobin-containing sample of the embodiment.
  • the measurement kit of the embodiment include a two-reagent kit, a three-reagent kit, and the like, and a two-reagent kit is preferable.
  • An enzyme that catalyzes the reaction of oxidizing saccharified hemoglobin to produce hydrogen peroxide in the kit of the embodiment at least one anionic selected from the group consisting of a sulfonic acid-based anionic surfactant and a polyoxyethylene alkyl ether acetic acid.
  • Surfactants; and, as the hydrogen peroxide measuring reagent for example, an enzyme that catalyzes the reaction of oxidizing saccharified hemoglobin to produce hydrogen peroxide, which is exemplified in the measuring method of the above-described embodiment; sulfonic acid-based anionic property.
  • At least one anionic surfactant selected from the group consisting of a surfactant and a polyoxyethylene alkyl ether acetic acid; and a hydrogen peroxide measuring reagent and the like can be mentioned respectively.
  • the kit of the embodiment contains a sulfonic acid-based anionic surfactant
  • the sulfonic acid-based anionic surfactant may be prepared even if the hydrogen atom of the alkenyl sulfonic acid, alkyl sulfonic acid, or amino group is substituted with a substituent.
  • the abnormal hemoglobin-containing sample and the first reagent are added to a reaction cell, and the temperature is constant for a certain period of time.
  • the saccharified hemoglobin can be measured by adding a second reagent and measuring the generated hydrogen peroxide after carrying out the reaction in.
  • Kit 1 A first reagent containing at least one anionic surfactant selected from the group consisting of sulfonic acid-based anionic surfactants and polyoxyethylene alkyl ether acetic acid; A kit containing a second reagent containing an enzyme that catalyzes a reaction that oxidizes glycated hemoglobin to produce hydrogen peroxide.
  • Kit 2 A first reagent containing at least one anionic surfactant selected from the group consisting of sulfonic acid-based anionic surfactants and polyoxyethylene alkyl ether acetic acid; A kit containing a second reagent containing an enzyme that catalyzes a reaction that oxidizes saccharified hemoglobin to produce hydrogen peroxide, and the hydrogen peroxide measuring reagent in one or both of the first reagent and the second reagent.
  • anionic surfactant selected from the group consisting of sulfonic acid-based anionic surfactants and polyoxyethylene alkyl ether acetic acid
  • the peroxidase and leuco-type chromogen are contained in separate reagents. That is, it is preferable that the peroxidase and the leuco-type chromogen are contained in the first reagent and the second reagent, or in the second reagent and the first reagent, respectively.
  • Kit 3 A first reagent containing an enzyme that catalyzes a reaction that oxidizes glycated hemoglobin to produce hydrogen peroxide; A kit containing a second reagent containing at least one anionic surfactant selected from the group consisting of sulfonic acid-based anionic surfactants and polyoxyethylene alkyl ether acetic acid.
  • Kit 4 A first reagent containing an enzyme that catalyzes a reaction that oxidizes glycated hemoglobin to produce hydrogen peroxide; A second reagent containing at least one anionic surfactant selected from the group consisting of a sulfonic acid-based anionic surfactant and polyoxyethylene alkyl ether acetic acid is contained, and the hydrogen peroxide measuring reagent is used as the first reagent and the second reagent.
  • a kit that is included in either or both of the reagents.
  • the peroxidase and leuco-type chromogen are contained in separate reagents. That is, it is preferable that the peroxidase and the leuco-type chromogen are contained in the first reagent and the second reagent, or in the second reagent and the first reagent, respectively.
  • Kit 5 An enzyme that catalyzes a reaction that oxidizes saccharified hemoglobin to produce hydrogen peroxide, and at least one anionic surfactant selected from the group consisting of a sulfonic acid-based anionic surfactant and a polyoxyethylene alkyl ether acetic acid.
  • Kit 6 An enzyme that catalyzes a reaction that oxidizes saccharified hemoglobin to produce hydrogen peroxide, and at least one anionic surfactant selected from the group consisting of a sulfonic acid-based anionic surfactant and polyoxyethylene alkyl ether acetic acid.
  • the peroxidase and leuco-type chromogen are contained in separate reagents. That is, it is preferable that the peroxidase and the leuco-type chromogen are contained in the first reagent and the second reagent, or in the second reagent and the first reagent, respectively.
  • Kit 7 First reagent containing hydrogen peroxide measurement reagent; An enzyme that catalyzes a reaction that oxidizes saccharified hemoglobin to produce hydrogen peroxide, and at least one anionic surfactant selected from the group consisting of a sulfonic acid-based anionic surfactant and a polyoxyethylene alkyl ether acetic acid. A kit containing a second reagent containing.
  • Kit 8 First reagent containing hydrogen peroxide measurement reagent; An enzyme that catalyzes a reaction that oxidizes saccharified hemoglobin to produce hydrogen peroxide, and at least one anionic surfactant selected from the group consisting of a sulfonic acid-based anionic surfactant and polyoxyethylene alkyl ether acetic acid. A kit containing a second reagent containing a hydrogen peroxide measurement reagent.
  • the peroxidase and leuco-type chromogen are contained in separate reagents. That is, it is preferable that the peroxidase and the leuco-type chromogen are contained in the first reagent and the second reagent, or in the second reagent and the first reagent, respectively.
  • the kit of the embodiment may be lyophilized or dissolved in an aqueous medium.
  • the aqueous medium include the above-mentioned aqueous medium and the like.
  • the reagents constituting the kit can be dissolved in an aqueous medium and used.
  • the content of the enzyme that catalyzes the reaction of oxidizing saccharified hemoglobin to produce hydrogen peroxide in the reagents constituting the kit of the embodiment is such that the concentration in the state of being dissolved in an aqueous medium is 0.2 to 60 kU / L.
  • a certain content is preferable, and a content of 0.4 to 30 kU / L is more preferable, for example, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0. .8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 kU / L.
  • the content of at least one anionic surfactant selected from the group consisting of sulfonic acid-based anionic surfactants and polyoxyethylene alkyl ether acetic acid in the reagents constituting the kit of the embodiment is in a state of being dissolved in an aqueous medium.
  • the content at a concentration of 0.002 to 20 g / L is preferable, the content at 0.02 to 10 g / L is more preferable, and the content at 0.1 to 10 g / L is further preferable, for example, 0.001.
  • composition of the embodiment comprises a saccharified hemoglobin containing abnormal hemoglobin, and at least one anionic surfactant selected from the group consisting of a sulfonic acid-based anionic surfactant and polyoxyethylene alkyl ether acetic acid. , Including.
  • composition of the embodiment may further contain an enzyme that catalyzes a reaction that oxidizes glycated hemoglobin to produce hydrogen peroxide.
  • the composition of the embodiment may further contain a hydrogen peroxide measuring reagent.
  • a hydrogen peroxide measuring reagent As the hydrogen peroxide measurement reagent, at least one selected from the group consisting of peroxidase and leuco-type chromogen can be used.
  • the composition of the embodiment may contain, for example, either peroxidase or leuco-type chromogen, or may contain both peroxidase and leuco-type chromogen.
  • composition of the embodiment can be used as a reaction solution of the method for measuring glycated hemoglobin in the abnormal hemoglobin-containing sample of the embodiment, or as a solution for preparing the reaction solution.
  • composition of the embodiment can be exemplified as an example of the composition of the embodiment.
  • composition 1 Saccharified hemoglobin containing abnormal hemoglobin and At least one anionic surfactant selected from the group consisting of sulfonic acid-based anionic surfactants and polyoxyethylene alkyl ether acetic acid, and A composition containing a leuco-type chromogen and.
  • composition 2 Saccharified hemoglobin containing abnormal hemoglobin and At least one anionic surfactant selected from the group consisting of sulfonic acid-based anionic surfactants and polyoxyethylene alkyl ether acetic acid, and A composition comprising, with peroxidase.
  • composition 3 Saccharified hemoglobin containing abnormal hemoglobin and At least one anionic surfactant selected from the group consisting of sulfonic acid-based anionic surfactants and polyoxyethylene alkyl ether acetic acid, and A composition comprising an enzyme that catalyzes a reaction that oxidizes glycated hemoglobin to produce hydrogen peroxide.
  • composition 4 Saccharified hemoglobin containing abnormal hemoglobin and At least one anionic surfactant selected from the group consisting of sulfonic acid-based anionic surfactants and polyoxyethylene alkyl ether acetic acid, and An enzyme that catalyzes the reaction that oxidizes glycated hemoglobin to produce hydrogen peroxide, A composition containing a leuco-type chromogen and.
  • composition 5 Saccharified hemoglobin containing abnormal hemoglobin and At least one anionic surfactant selected from the group consisting of sulfonic acid-based anionic surfactants and polyoxyethylene alkyl ether acetic acid, and An enzyme that catalyzes the reaction that oxidizes glycated hemoglobin to produce hydrogen peroxide, A composition comprising, with peroxidase.
  • -Composition 6 Saccharified hemoglobin containing abnormal hemoglobin and At least one anionic surfactant selected from the group consisting of sulfonic acid-based anionic surfactants and polyoxyethylene alkyl ether acetic acid, and An enzyme that catalyzes the reaction that oxidizes glycated hemoglobin to produce hydrogen peroxide, Leuco-type color substance and A composition comprising, with peroxidase.
  • the saccharified hemoglobin containing abnormal hemoglobin means that the saccharified hemoglobin of the abnormal hemoglobin is contained as the saccharified hemoglobin.
  • Saccharification of abnormal hemoglobin As hemoglobin, for example, saccharification of abnormal hemoglobin in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in at least the 1st to 6th amino acid sequences from the N-terminal of the ⁇ chain of human hemoglobin A. Hemoglobin; saccharified hemoglobin of hemoglobin C; saccharified hemoglobin of hemoglobin S and the like can be exemplified.
  • anionic surfactant As a kind of anionic surfactant; and the hydrogen peroxide measuring reagent, for example, the abnormal hemoglobin exemplified in the measuring method of the above-described embodiment; catalyzing the reaction of oxidizing glycated hemoglobin to generate hydrogen peroxide.
  • Enzymes at least one anionic surfactant selected from the group consisting of sulfonic acid-based anionic surfactants and polyoxyethylene alkyl ether acetic acid; and hydrogen peroxide measuring reagents, respectively.
  • the composition of the embodiment contains a sulfonic acid-based anionic surfactant
  • the sulfonic acid-based anionic surfactant is prepared by substituting hydrogen atoms of alkenylsulfonic acid, alkylsulfonic acid, and amino groups with substituents.
  • the numerical value exemplified as the amount in the sample containing abnormal hemoglobin in the measurement method of the above-mentioned embodiment can be mentioned.
  • Examples of the total hemoglobin content in the composition of the embodiment include numerical values exemplified as the amount in the reaction solution in the measurement method of the above-mentioned embodiment.
  • NIKKOL Alanine LN-30 [Lauroylmethylalanine Na; manufactured by Nikko Chemicals Co., Ltd.]
  • NIKKOL Sarcosine LN-30 [N-lauroyl sarcosine Na; manufactured by Nikko Chemicals Co., Ltd.]
  • pTrc-FPOX-42 is an expression plasmid containing DNA encoding FPOX-42, an enzyme that catalyzes the reaction of oxidizing glycated hemoglobin to produce hydrogen peroxide, and is disclosed in International Publication No. 2015/005258. It can be created according to the method used. PCR was performed based on the protocol of DNA polymerase "KOD-Plus-", a PCR kit manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • plasmids were extracted using "Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification" manufactured by Promega according to the protocol of the kit.
  • sequence analysis of the extracted plasmid with a DNA sequencer it was confirmed that pTrc-FPOX-47, a plasmid containing DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, encoding FPOX-47, was constructed. ..
  • pTrc-F consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 reflecting the nucleotide sequence immediately before and after the multicloning site of the pTrc99a vector (manufactured by GE Healthcare Bioscience) and SEQ ID NO: 6 are represented.
  • PTrc-R consisting of the above nucleotide sequences was used as a forward primer and a reverse primer, respectively.
  • PCR was performed according to the following reagent composition and PCR conditions, and the three amino acids at the C-terminal of FPOX-47 were missing.
  • a PCR product containing a DNA fragment containing a nucleotide sequence encoding the lost deletion form FPOX-47 ⁇ 3 was obtained.
  • PCR was performed based on the protocol of DNA polymerase "KOD-Plus-", a PCR kit manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • the obtained PCR product was purified using the "Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system" manufactured by Promega according to the protocol of the kit to obtain a DNA fragment containing DNA encoding FPOX-47 ⁇ 3.
  • the obtained DNA fragment was treated with two types of restriction enzymes Nco I and Bam HI (both manufactured by Takara Bio Inc.) at 37 ° C. for 1 hour, and the obtained reaction mixture was treated with Promega's "Wizard SV Gel and PCR Clean".
  • -Up system was used to purify according to the protocol of the kit to obtain restriction enzyme-treated fragments.
  • pTrc-FPOX-15 which expresses the inactive saccharified peptide oxidase FPOX-15 that oxidizes the plasmid hexapeptide described in International Publication No. 2010/0417115, was similarly treated with the same restriction enzyme, and 1 % Electrophoresis with agarose TAE gel, excision of DNA fragment corresponding to the vector, purification of DNA fragment using Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system, plasmid fragment from which DNA encoding FPOX-15 has been removed. Obtained.
  • the obtained restriction enzyme-treated fragment and the plasmid fragment from which the DNA encoding FPOX-15 has been removed are mixed and ligated using a DNA Ligation Kit (manufactured by Takara Bio), and then the ligation product is manufactured by Toyobo Co., Ltd. It was introduced into Escherichia coli competent cell "Competent high DH5 ⁇ ". Escherichia coli into which the ligation product was introduced was inoculated on an LB agar medium containing 50 mg / L ampicillin, cultured at 37 ° C. for 14 hours, and the colonies that appeared were selected. The selected colonies were cultured in LB liquid medium containing 50 mg / L ampicillin at 37 ° C.
  • plasmids were prepared according to the protocol of the kit using "Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification" manufactured by Promega. bottom.
  • PCR was performed using pTrc-F consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 and pTrc-R consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 as a forward primer and a reverse primer, respectively, and the base sequence of the prepared plasmid was obtained. It was confirmed that the plasmid contained the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 in which the 9 bases on the 3'side excluding the termination codon of the nucleotide sequence of FPOX-47 were deleted. The plasmid is called pTrc-FPOX-47 ⁇ 3.
  • glycated hemoglobin oxidase activity enzyme activity (hereinafter referred to as glycated hemoglobin oxidase activity) that catalyzes the reaction of oxidizing glycated hemoglobin of FPOX-47 ⁇ 3 to generate hydrogen peroxide.
  • Purified FPOX- obtained in (3) above.
  • the solution of 47 ⁇ 3 the glycated hemoglobin oxidase activity of FPOX-47 ⁇ 3 against HbA1c was confirmed by the following measurement kit and measurement procedure.
  • the measurement kit a is the same as the measurement kit A except that the first reagent does not contain NIKKOL LMT.
  • KO500 method which is a reference method for HbA1c measurement
  • SLS-hemoglobin method which is one of the total hemoglobin measurement methods. Therefore, hemoglobin samples with HbA1c concentrations of 2.6 ⁇ mol / L, 4.5 ⁇ mol / L, 6.4 ⁇ mol / L, and 8.4 ⁇ mol / L were used as samples.
  • E2 was measured at a main wavelength of 660 nm and a secondary wavelength of 800 nm.
  • E2 from subtracting the E1 was calculated absorbance difference ⁇ E 'A.
  • Each of the above samples (10 ⁇ L) and the first reagent (100 ⁇ L) of the measurement kit a are added to the reaction cell and reacted at 37 ° C. for 5 minutes (first reaction), and the absorbance (E3) of the reaction solution is mainly adjusted. Measurement was performed at a wavelength of 660 nm and a sub-wavelength of 800 nm, then the second reagent (40 ⁇ L) of the above-mentioned measurement kit a was added to the reaction solution, and the reaction was further reacted at 37 ° C.
  • FPOX-47 ⁇ 3 is an enzyme having an activity of catalyzing a reaction of oxidizing glycated hemoglobin to generate hydrogen peroxide.
  • kits 1A to 1F An HbA1c measurement kit (kits 1A to 1F) composed of the following first and second reagents was prepared.
  • kits 1a to 1b composed of the following first and second reagents was prepared.
  • the kit 1A composed of the above first reagent and the second reagent was used, and as a sample, the HbA1c concentrations were 5.11%, 5.73%, and 6.40 by the KO500 method, which is an HPLC method, respectively.
  • the HbA1c concentration (amount) in each sample was performed by the following procedure. ) To the total hemoglobin concentration (amount) [HbA1c (%)] was determined.
  • Hemoglobin B-test Wako SLS-hemoglobin method
  • hemoglobin B-test Wako which are kits for measuring total hemoglobin
  • the measurement was performed according to the following procedure, and the absorbance with respect to the standard product was measured.
  • the standard product (10 ⁇ L) and hemoglobin B-testwaco 250 ⁇ L were added and reacted at 37 ° C.
  • the absorbance (E) of the reaction solution was measured at a main wavelength of 546 nm and a sub-wavelength of 660 nm.
  • the absorbance with respect to the standard product was used.
  • the measurement was carried out by the same method except that physiological saline was used instead of the standard product, and the absorbance with respect to physiological saline was used.
  • the value calculated by subtracting the absorbance for physiological saline from the absorbance for the standard product was defined as the blank-corrected absorbance for the standard product. From the blank-corrected absorbance for the standard product and the blank-corrected absorbance (0 Abs) for physiological saline, a calibration curve showing the relationship between the total hemoglobin concentration ( ⁇ mol / L) and the absorbance was prepared.
  • the absorbance (E1) of the solution was measured at a main wavelength of 660 nm and a sub-wavelength of 800 nm, then the second reagent (40 ⁇ L) of the above-mentioned HbA1c measurement kit 1A was added to the reaction solution, and the reaction was further carried out at 37 ° C. for 5 minutes ( The second reaction) was carried out, and the absorbance (E2) of the reaction solution was measured at a main wavelength of 660 nm and a sub-wavelength of 800 nm. E2 from subtracting the E1, calculates the absorbance difference ⁇ E '1A, and absorbance for each blood cell fraction.
  • Absorbance difference ⁇ E'physiological saline was calculated by the same method except that physiological saline was used instead of each blood cell fraction described above, and was used as the absorbance for physiological saline.
  • the value calculated by subtracting the absorbance for physiological saline from each absorbance for the blood cell fraction was used as the blank-corrected absorbance for the blood cell fraction. From the blank-corrected absorbance for the blood cell fraction and the blank-corrected absorbance (0 Abs) for physiological saline, a calibration curve showing the relationship between the HbA1c concentration ( ⁇ mol / L) and the absorbance was prepared.
  • HbA1c (%) (ratio of HbA1c concentration to total hemoglobin concentration)
  • HbA1c (%) was determined, the correlation between the measurement method using each kit and the KO500 method was verified, and the correlation coefficient was determined.
  • HbA1c measurement kits 1A, 1B, 1C, 1D, 1E, 1F, 1a and 1b can be used to obtain HbA1c in the sample if it is a sample containing no abnormal hemoglobin and does not contain abnormal hemoglobin. It became clear that the measurement was accurate.
  • HbA1c measurement kit the same as above is used except that the above HbA1c measurement kits 1B, 1C, 1D, 1E, 1F, 1a and 1b are used instead of the above HbA1c measurement kit 1A. Measurements were performed, and the HbA1c concentration (%) in each hemolytic sample was measured for each kit. For each sample, the HbA1c concentration (%) that was priced at the time of purchase from Discovery Life Science was set as the reference 0, and the difference between the reference value and the measured HbA1c (%) [ ⁇ HbA1c concentration (%)] was set. Calculated.

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Abstract

異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤存在下に反応させて過酸化水素を生成させ、生成した前記過酸化水素を測定することを含む、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。

Description

異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法
　本発明は、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法、測定試薬、測定キット及び組成物に関する。
　本願は、２０２０年３月２６日に、日本に出願された特願２０２０－５５７３２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　糖化タンパク質は、生体内の血液等の体液や毛髪等の生体試料中に含まれている。血液中に存在する糖化タンパク質の濃度は、血清中に溶解しているグルコース等の糖類の濃度に依存しており、臨床診断分野において、血液中の糖化タンパク質であるヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）の濃度の測定が、糖尿病の診断やモニタリングに用いられている（非特許文献１参照）。ヘモグロビンは、α鎖及びβ鎖の２種類のサブユニットを各々２つ持つ、分子量６４，０００のヘムタンパク質である。ＨｂＡ１ｃは特にβ鎖のＮ末端バリン残基が糖化されたものと定義されている。このＨｂＡ１ｃを測定する方法としては、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を用いる機器分析的方法（非特許文献２参照）、抗原抗体反応を用いる免疫測定法（非特許文献３参照）等が知られていた。
　近年、汎用性のある自動分析装置への適用が可能であり、また、操作も簡便なＨｂＡ１ｃの酵素的測定法の開発が進んでおり、種々の方法が報告されている。これまで報告されているＨｂＡ１ｃの酵素的測定法は、主として、プロテアーゼと糖化ペプチドオキシダーゼとを用いる方法である。すなわち、血球中のＨｂＡ１ｃにプロテアーゼを作用させて、糖化ペプチドであるフルクトシルジペプチド(Ｆｒｕ－Ｖａｌ－Ｈｉｓ)を生成させ、生成した当該フルクトシルジペプチドに対して、フルクトシルペプチドオキシダーゼを作用させて過酸化水素を生成させ、生成した過酸化水素を測定することにより、検体中のＨｂＡ１ｃを測定する方法（特許文献１参照）や、血球中のＨｂＡ１ｃにプロテアーゼを作用させて、糖化ペプチドであるフルクトシルヘキサペプチド(Ｆｒｕ－Ｖａｌ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ)を生成させ、生成した当該フルクトシルヘキサペプチドに対して、フルクトシルヘキサペプチドオキシダーゼを作用させて過酸化水素を生成させ、生成した過酸化水素を測定することにより、検体中のＨｂＡ１ｃを測定する方法（特許文献２～４参照）である。一方で、プロテアーゼを用いることなく、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を用いて、検体中の糖化ヘモグロビンを測定する方法も知られている（特許文献４～７、非特許文献４参照）。
特開２００１－９５５９８号公報 国際公開第２００８／１０８３８５号 国際公開第２０１３／１６２０３５号 国際公開第２０１５／００５２５８号 国際公開第２０１５／００５２５７号 国際公開第２０１５／０６０４２９号 国際公開第２０１８／０２１５３０号
Clin Chem Lab Med，第36巻、p.299-308(1998). Diabetes，第27巻、第2号、p.102-107(1978). 日本臨床検査自動化学会会誌、第18巻、第4号、p.620 (1993). Scientific Reports(2019) 9:942
　ヘモグロビンには、ヘモグロビンＡ等の正常ヘモグロビンの他に、異常ヘモグロビンの存在が知られている。
　異常ヘモグロビンとしては、例えば、ヘモグロビンβ鎖のＮ末端から６番目のグルタミン酸がリジンに置換されたヘモグロビンＣ（ＨｂＣ）、ヘモグロビンβ鎖のＮ末端から６番目のグルタミン酸がバリンに置換されたヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）等が挙げられる。ＨｂＳは鎌状赤血球症の要因としても知られている。異常ヘモグロビンは遺伝的に保有され、検体中に異常ヘモグロビンが含有される場合がある。
　しかしながら、プロテアーゼを用いることなく、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を用いる糖化ヘモグロビンの測定方法では、異常ヘモグロビンを含有しない検体に対する測定と比べ、異常ヘモグロビンを含有する検体に対する測定で、糖化ヘモグロビンの濃度の測定の正確性が劣る場合があった。
　これは、プロテアーゼを用いることなく、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を用いる糖化ヘモグロビンの測定方法では、おそらくプロテアーゼにより生成された短い糖化ペプチドではなく異常ヘモグロビン分子そのものが、酵素の基質となるため、異常ヘモグロビンの影響を受けやすいためであると考えられる。
　本発明は、上記のような問題点を解消するためになされたものであり、プロテアーゼを用いることなく、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を用いる糖化ヘモグロビンの測定方法において、異常ヘモグロビン含有試料中の、糖化ヘモグロビンの測定の正確性に優れた、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キット、及び組成物を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、プロテアーゼを用いることなく、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を用いる糖化ヘモグロビンの測定方法において、特定のアニオン性界面活性剤を用いることにより、異常ヘモグロビンを含有する試料中の、糖化ヘモグロビンの測定の正確性が向上されることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の［１］～［３０］に関する。
［１］　異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤存在下に反応させて過酸化水素を生成させ、生成した前記過酸化水素を測定することを含む、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。
［２］　前記スルホン酸系アニオン性界面活性剤が、アルケニルスルホン酸、アルキルスルホン酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ－アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、アルキルベンゼンスルホン酸及びポリオキシエチレンスルホコハク酸アルキルからなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤である、［１］に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
［３］　前記異常ヘモグロビンが、少なくともヒトのヘモグロビンＡのβ鎖のＮ末端から１～６番目のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたものである、［１］又は［２］に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
［４］　前記異常ヘモグロビンが、ヒトのヘモグロビンＣ又はヘモグロビンＳである、［１］～［３］のいずれか一項に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
［５］　前記ヘモグロビン含有試料中の総ヘモグロビン数に対し、前記異常ヘモグロビンの含有割合が２０％以上である、［１］～［４］のいずれか一項に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
［６］　前記過酸化水素の測定が、過酸化水素測定試薬により行われる、［１］～［５］のいずれか一項に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
［７］　前記過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である［６］に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
［８］　前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である、［７］に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
［９］　前記フェノチアジン系色原体が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩である、［８］に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
［１０］　糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、
　スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤と、を含む、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬。
［１１］　前記スルホン酸系アニオン性界面活性剤が、アルケニルスルホン酸、アルキルスルホン酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ－アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、アルキルベンゼンスルホン酸及びポリオキシエチレンスルホコハク酸アルキルからなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤である、［１０］に記載の測定試薬。
［１２］　さらに、過酸化水素測定試薬を含む、［１０］又は［１１］に記載の測定試薬。
［１３］　前記過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である、［１２］に記載の測定試薬。
［１４］　前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である、［１３］に記載の測定試薬。
［１５］　前記フェノチアジン系色原体が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩である、［１４］に記載の測定試薬。
［１６］　スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤を含む第１試薬と、　糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第２試薬と、を含む、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キット。
［１７］　前記スルホン酸系アニオン性界面活性剤が、アルケニルスルホン酸、アルキルスルホン酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ－アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、アルキルベンゼンスルホン酸及びポリオキシエチレンスルホコハク酸アルキルからなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤である、［１６］に記載の測定キット。
［１８］　さらに、ペルオキシダーゼ及びロイコ型色原体を、それぞれ第１試薬と第２試薬、又は、第２試薬と第１試薬に含む、［１６］又は［１７］に記載の測定キット。
［１９］　前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である、［１８］に記載の測定キット。
［２０］　前記フェノチアジン系色原体が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩である、［１９］に記載の測定キット。
［２１］　異常ヘモグロビンを含む糖化ヘモグロビンと、
　スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤と、を含む組成物。
［２２］　前記スルホン酸系アニオン性界面活性剤が、アルケニルスルホン酸、アルキルスルホン酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ－アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、アルキルベンゼンスルホン酸、ポリオキシエチレンスルホコハク酸アルキル及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤である、［２１］に記載の組成物。
［２３］　さらに、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む、［２１］又は［２２］に記載の組成物。
［２４］　さらに、過酸化水素測定試薬を含む、［２１］～［２３］のいずれか一項に記載の組成物。
［２５］　前記過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼ及びロイコ型色原体からなる群より選ばれる少なくとも一種である、［２４］に記載の組成物。
［２６］　前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である、［２５］に記載の組成物。
［２７］　前記フェノチアジン系色原体が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩である、［２６］に記載の組成物。
［２８］　前記異常ヘモグロビンが、少なくともヒトのヘモグロビンＡのβ鎖のＮ末端から１～６番目のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたものである、［２１］～［２７］のいずれか一項に記載の組成物。
［２９］　前記異常ヘモグロビンが、ヒトのヘモグロビンＣ又はヘモグロビンＳである、［２１］～［２８］のいずれか一項に記載の組成物。
［３０］　前記組成物中の総ヘモグロビン数に対し、前記異常ヘモグロビンの含有割合が２０％以上である、［２１］～［２９］のいずれか一項に記載の組成物。
　本発明によれば、異常ヘモグロビン含有試料中の、糖化ヘモグロビンの測定の正確性に優れた、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キット、及び組成物が提供される。
ＦＰＯＸ－４７△３を第２試薬に含むキットＡを用いた、ヘモグロビン含有試料中のＨｂＡ１ｃの測定における、ＨｂＡ１ｃ濃度と吸光度差△Ｅとの関係を示すグラフである。縦軸は吸光度差△Ｅ（Ａｂｓ×１００００）を、横軸はＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を表す。
　以下、本発明の異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キット及び組成物の実施形態を説明する。
（１）異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法
　実施形態の、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法（以下、実施形態の測定方法という。）は、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤存在下に反応させて過酸化水素を生成させ、生成した前記過酸化水素を測定することを含む方法である。
　具体的には、以下の工程を含む測定方法であってよい。
（ｉ）異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤存在下に反応させて過酸化水素を生成させる工程；
（ｉｉ）前記工程（ｉ）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（ｉｉｉ）既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて上記（ｉ）及び（ｉｉ）により測定を行い、予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン濃度との関係を表す検量線に、前記工程（ｉｉ）で測定した前記過酸化水素量を照らし合わせて、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度を決定する工程。
　上記工程（ｉ）において、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤存在下に反応させて過酸化水素を生成させる工程は、
　スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤と、異常ヘモグロビン含有試料と、を混合した後に、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を添加して、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、反応させる工程であってもよい。
　具体的には、以下の工程を含む測定方法であってもよい。
（ｉ－１）異常ヘモグロビン含有試料中のヘモグロビンと、スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤とを水性媒体中で反応させる工程；
（ｉ－２）糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を、前記工程（ｉ－１）の水性媒体に添加して、過酸化水素を生成させる工程；
（ｉｉ）前記工程（ｉ－２）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（ｉｉｉ）既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて上記（ｉ－１）、（ｉ－２）及び（ｉｉ）により測定を行い、予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン濃度との関係を表す検量線に、前記工程（ｉｉ）で測定した前記過酸化水素量を照らし合わせて、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度を決定する工程。
　また、実施形態の異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量の総ヘモグロビン量（すなわち、ヘモグロビンと糖化ヘモグロビンを合わせた総量）に対する割合を算出する方法をも包含する。この場合、実施形態の異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、具体的には、以下の工程を含む測定方法であってよい。
（ｉ）異常ヘモグロビン含有試料中の総ヘモグロビン量を測定する工程；
（ｉｉ）異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤存在下に反応させて過酸化水素を生成させる工程；
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）で生成した前記過酸化水素を測定する工程； 
（ｉｖ）既知量の糖化ヘモグロビンを用いて上記（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）により測定を行い、予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン量との関係を表す検量線に、前記工程（ｉｉｉ）で測定した前記過酸化水素量を照らし合わせて、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量を測定する工程；及び、
（ｖ）前記工程（ｉ）で測定した前記総ヘモグロビン量と、前記工程（ｉｖ）で測定した前記糖化ヘモグロビン量から、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量の総ヘモグロビン量に対する割合を算出する工程。
　上記工程（ｉｉ）において、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤存在下に反応させて過酸化水素を生成させる工程は、
　スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤と、異常ヘモグロビン含有試料と、を混合した後に、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を添加して、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、反応させる工程であってもよい。
　具体的には、以下の工程を含む測定方法であってもよい。
（ｉ）異常ヘモグロビン含有試料中の総ヘモグロビン量を測定する工程；
（ｉｉ）異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤存在下に反応させて過酸化水素を生成させる工程；
（ｉｉ－１）異常ヘモグロビン含有試料中のヘモグロビンと、スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤とを水性媒体中で反応させる工程；
（ｉｉ－２）糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を、前記工程（ｉｉ－１）の水性媒体に添加して、過酸化水素を生成させる工程；
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ－２）で生成した前記過酸化水素を測定する工程； 
（ｉｖ）既知量の糖化ヘモグロビンを用いて上記（ｉｉ－１）、（ｉｉ－２）及び（ｉｉｉ）により測定を行い、予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン量との関係を表す検量線に、前記工程（ｉｉｉ）で測定した前記過酸化水素量を照らし合わせて、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量を測定する工程；及び、
（ｖ）前記工程（ｉ）で測定した前記総ヘモグロビン量と、前記工程（ｉｖ）で測定した前記糖化ヘモグロビン量から、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量の総ヘモグロビン量に対する割合を算出する工程。
　尚、前記工程（ｉ）の総ヘモグロビン量の測定は、異常ヘモグロビン含有試料に、スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤を添加して、異常ヘモグロビン含有試料中のヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンを変性させた後に行うこともできる。
　実施形態の測定方法における異常ヘモグロビン含有試料は、異常ヘモグロビンを含有し、実施形態の糖化ヘモグロビンの測定方法が適用可能な試料であれば特に制限はなく、異常ヘモグロビンの他に、異常ヘモグロビンに該当しない正常ヘモグロビンを含有していてもよい。上記試料としては、例えば全血、血球、血球に血漿が混在した試料、これらの試料を溶血処理した試料等が挙げられる。溶血処理としては、全血、血球、血球に血漿が混在した試料を溶血させる処理であれば特に制限はなく、例えば物理的方法、化学的方法、生物学的方法等が挙げられる。物理的方法としては、例えば蒸留水等の低張液を用いる方法、超音波を用いる方法等が挙げられる。化学的方法としては、例えばメタノール、エタノール、アセトン等の有機溶媒を用いる方法、ポリオキシエチレン系界面活性剤を用いる方法等が挙げられる。生物学的方法としては、例えば抗体や補体を用いる方法等が挙げられる。
　本明細書において「異常ヘモグロビン」とは、ヘモグロビン分子を構成するアミノ酸鎖のアミノ酸配列において、一部のアミノ酸の置換等の変異を有するものをいい、ヘモグロビンのβ鎖を構成するアミノ酸鎖のアミノ酸配列において、一部のアミノ酸の置換等の変異を有するものが好ましい。当該変異とは、例えばヘモグロビンＡを構成するグロビン鎖のアミノ酸配列を基準とすることができ、ヘモグロビンＡのβ鎖を構成するアミノ酸配列を基準とすることができる。
　異常ヘモグロビンに該当しない正常ヘモグロビンとしては、ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ０、ＨｂＡ１、ＨｂＡ２）や、ヘモグロビンＦ等が挙げられる。
　ヘモグロビンは、ヒト（Homo sapiens）のヘモグロビンであることが好ましい。即ち、実施形態の測定方法における異常ヘモグロビン含有試料は、ヒトの異常ヘモグロビンを含有していることが好ましい。
　プロテアーゼを用いることなく、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を用いる糖化ヘモグロビンの測定方法において、異常アミノ酸を含有しない試料と比べ、異常アミノ酸を含有する試料では、含有される糖化ヘモグロビンの測定の正確性が劣る場合がある。
　これは、おそらくヘモグロビン分子を構成するグロビン鎖のアミノ酸配列に置換等の変異を有することで、ヘモグロビン分子の構造や電荷に変化が生じ、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応性が低下するからであると考えられる。
　一方、従来のＨｂＡ１ｃにプロテアーゼ及びフルクトシルペプチドオキシダーゼを作用させて、糖化ペプチドであるフルクトシルジペプチド(Ｆｒｕ－Ｖａｌ－Ｈｉｓ) 由来の過酸化水素を測定してＨｂＡ１ｃを測定する方法においては、このような反応性の低下の問題は生じ難い。例えば、フルクトシルペプチドオキシダーゼが作用するのは、プロテアーゼにより切断されて生成したフルクトシルジペプチド(Ｆｒｕ－Ｖａｌ－Ｈｉｓ)であるため、異常ヘモグロビンＨｂＣやＨｂＳのように、ヘモグロビンβ鎖のうちのジペプチドに相当する部分（N末端から１番目のバリン及び２番目ヒスチジン）以外のアミノ酸に変異が生じていたとしても、通常のヘモグロビンと同様に測定が可能である。
　糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素は、ヘモグロビンのβ鎖のＮ末端付近と相互作用することにより、触媒作用を発揮するものと推定されている。したがって、当該酵素の反応性の低下は、酵素の反応に重要と推定されているヘモグロビンβ鎖のＮ末端から１～６番目のアミノ酸のアミノ酸配列に置換等の変異を有する場合に、より影響を受けやすいものと考えられる。
　上記の観点から、異常ヘモグロビン含有試料における前記異常ヘモグロビンは、少なくともヒトのヘモグロビンＡ（より具体的にはヘモグロビンＡ０）のβ鎖のＮ末端から１～６番目のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたものであってよく、
　異常ヘモグロビン含有試料における前記異常ヘモグロビンは、少なくともヒトのヘモグロビンＡのβ鎖のＮ末端から３～６番目のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたものであってよい。
　１又は複数個としては、１～３個であってもよく、１～２個であってもよい。
　ヒトの異常ヘモグロビンとして知られるヘモグロビンＣ（ＨｂＣ）は、ヘモグロビンＡと比較し、ヘモグロビンβ鎖のＮ末端から６番目のグルタミン酸がリジンに置換されたものである。また、ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）では、ヘモグロビンＡと比較し、ヘモグロビンβ鎖のＮ末端から６番目のグルタミン酸がバリンに置換されたものである。これらＨｂＣ又はＨｂＳは検体に含有される確率が高く、β鎖のＮ末端から１～６番目のアミノ酸のアミノ酸配列に置換を有するので、測定の正確性に与える影響もより大きいものと考えられる。
　上記の観点から、異常ヘモグロビン含有試料における前記異常ヘモグロビンは、ヒトのヘモグロビンＣ又はヘモグロビンＳであることがさらに好ましい。
　配列番号１１に、上記の比較対象であるヒトのヘモグロビンのβ鎖のアミノ酸配列を記載する。
　異常ヘモグロビン含有試料は、正常ヘモグロビンと異常ヘモグロビンとの両方を含むものであってもよい。異常ヘモグロビン含有試料における、異常ヘモグロビン含有率、すなわち、該試料中の総ヘモグロビン量に対する異常ヘモグロビン量の比率については特に制限はなく、例えば、個数基準で、５％以上であってよく、１０％以上であってよく、１５％以上であってよく、２０％以上であってよく、２５％以上であってよく、３０％以上であってよく、３５％以上であってよく、４０％以上であってよく、４５％以上であってよく、５０％以上であってよく、５５％以上であってよく、６０％以上であってよく、６５％以上であってよく、７０％以上であってよく、７５％以上であってよく、８０％以上であってよく、８５％以上であってよく、９０％以上であってよく、９５％以上であってもよい。
　試料中の総ヘモグロビン量に対する異常ヘモグロビン量の比率について、上限値は特に制限されず、１００％以下であってよく、個数基準で９９％以下であってよく、９０％以下であってよく、８０％以下であってよく、７０％以下であってよく、６０％以下であってよく、５０％以下であってよく、４０％以下であってよい。
　上記の数値範囲は自由に組み合わせることができる。例えば、試料中の総ヘモグロビン量に対する異常ヘモグロビン量の比率は、個数基準で５～１００％であってよく、５～９０％であってよく、１０～８０％であってよく、１０～７０％であってよく、２０～６０％であってよく、２０～５０％であってよく、３０～４０％であってもよい。
　上記個数基準としてはmolを採用することができる。
　異常ヘモグロビン含有試料は、異常ヘモグロビンとして、ヒトのヘモグロビンＣ又はヘモグロビンＳと、正常ヘモグロビンとしてヒトのヘモグロビンＡを含有することが好ましい。
　本明細書における糖化ヘモグロビンは、ヘモグロビンにグルコース等の糖が結合して生成したものであり、ヘモグロビンのβ鎖にグルコース等の糖が結合して生成したものであってよく、ヘモグロビンＡ１であってよく、ヘモグロビンＡ１ａ、ヘモグロビンＡ１ｂ、ＨｂＡ１ｃ等が挙げられ、ＨｂＡ１ｃが好ましい。
　なお、後述の実施例におけるＨｂＡ１ｃの測定では、ＨｂＡではない異常ヘモグロビンＨｂＣの糖化ヘモグロビンも、ヘモグロビンＡ１に相当するヘモグロビンβ鎖の対応する位置に糖が結合して生成した糖化ヘモグロビンであるので、便宜上これらをまとめてＨｂＡ１ｃ量として表記している。
　本明細書において、糖化ヘモグロビンとは、異常ヘモグロビンの糖化ヘモグロビンを含む概念である。異常ヘモグロビン含有試料に含有される糖化ヘモグロビンは、異常ヘモグロビンの糖化ヘモグロビンを含むことができる。
　実施形態の測定方法における、反応液中の総ヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）は、特に制限されるものではないが、０．５～１００μｍｏｌ／Ｌが好ましく、３～２０μｍｏｌ／Ｌがより好ましく、例えば、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００μｍｏｌ／Ｌを例示できる。
　ここで、実施形態の測定方法における反応液とは、過酸化水素を生成させる工程における反応系を構成するものを意味する。後述の実施例においては、試料、第１試薬及び第２試薬の混合物を例示できる。
　「アニオン性界面活性剤存在下」としては、過酸化水素を生成させる工程における反応液が、アニオン性界面活性剤を含むことができる。
　実施形態の測定方法においては、スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤が使用される。
　本明細書において、「スルホン酸系アニオン性界面活性剤」とは、アニオン性界面活性剤であって、スルホン酸基を有する化合物である。
　スルホン酸系アニオン性界面活性剤としては、アルケニルスルホン酸、アルキルスルホン酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ－アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、アルキルベンゼンスルホン酸及びポリオキシエチレンスルホコハク酸アルキルからなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤を例示できる。
　本明細書における、アルケニルスルホン酸におけるアルケニルとしては、例えば、炭素数８～２０のアルケニル基が挙げられ、炭素数１０～１８のアルケニル基が好ましい。炭素数８～２０のアルケニルとしては、オクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、トリデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オクタデセニル、ノナデセニル、イコセニル等が挙げられる。
　また、本明細書において、アルケニルスルホン酸は、塩であってもよい。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、モノエタノールアミン塩等が挙げられる。
　アルケニルスルホン酸、又はその塩の具体例（製品）としては、例えばＫリポランＰＪ－４００Ｊ（テトラデセンスルホン酸Ｎａ；ライオン社製）等が挙げられる。
　実施形態の測定方法における、アルケニルスルホン酸、又はその塩の反応液中の濃度は、０．０１～５０ｇ／Ｌが好ましく、０．１～５ｇ／Ｌがより好ましく、０．１～１ｇ／Ｌがさらに好ましく、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ｇ／Ｌである。
　本明細書における、アルキルスルホン酸におけるアルキルとしては、例えば炭素数８～２０のアルキル等が挙げられ、炭素数１０～１８のアルキルが好ましい。炭素数８～２０のアルキルとしては、例えばオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。炭素数１０～１８のアルキルとしては、例えばデシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）等が挙げられる。
　また、本明細書において、アルキルスルホン酸は、塩であってもよい。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、モノエタノールアミン塩等が挙げられる。
　アルキルスルホン酸、又はその塩の具体例（製品）としては、例えばラウリルスルホン酸ナトリウム（東京化成工業社製）等が挙げられる。
　実施形態の測定方法における、アルキルスルホン酸、又はその塩の反応液中の濃度は、０．０１～５０ｇ／Ｌが好ましく、０．１～５ｇ／Ｌがより好ましく、０．１～１ｇ／Ｌがさらに好ましく、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ｇ／Ｌである。
　本明細書における、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ－アシルタウリンにおける置換基としては、例えばアルキル基、ハロゲン化アルキル基、フェニル基等が挙げられる。ハロゲン化アルキル基としては、例えばフルオロアルキル基、クロロアルキル基、ブロモアルキル基、ヨードアルキル基等が挙げられる。アルキル基及びハロゲン化アルキル基におけるアルキルとしては、例えば炭素数１～６のアルキル等が挙げられる。炭素数１～６のアルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。
　本明細書における、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ－アシルタウリンとしては、例えばＮ－アシルタウリン、Ｎ－アシル－Ｎ－アルキルタウリン等が挙げられ、Ｎ－アシル－Ｎ－アルキルタウリン等が好ましい。
　アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ－アシルタウリンにおけるアシルとしては、例えば炭素数８～２０のアシル等が挙げられ、炭素数１０～１８のアシルが好ましい。炭素数８～２０のアシルとしては、例えばオクタノイル、ノナノイル、デカノイル、ウンデカノイル、ドデカノイル（ラウロイル）、トリデカノイル、テトラデカノイル、ペンタデカノイル、ヘキサデカノイル（パルミトイル）、ヘプタデカノイル、オクタデカノイル（ステアロイル）、オレオイル、バクセノイル、リノレオイル、ノナデカノイル、エイコサノイル等が挙げられる。炭素数１０～１８のアシルとしては、例えばデカノイル、ウンデカノイル、ドデカノイル（ラウロイル）、トリデカノイル、テトラデカノイル、ペンタデカノイル、ヘキサデカノイル（パルミトイル）、ヘプタデカノイル、オクタデカノイル（ステアロイル）、オレオイル、バクセノイル、リノレオイル等が挙げられる。
　Ｎ－アシル－Ｎ－アルキルタウリンにおけるアルキルとしては、例えば炭素数１～６のアルキル等が挙げられる。炭素数１～６のアルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。
　また、本明細書において、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ－アシルタウリンは、塩であってもよい。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、モノエタノールアミン塩等が挙げられる。
　アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ－アシルタウリン、又はその塩の具体例（製品）としては、例えばＮＩＫＫＯＬ　ＬＭＴ（Ｎ－ラウロイル－Ｎ－メチルタウリンナトリウム；日光ケミカルズ社製）、ＮＩＫＫＯＬ　ＰＭＴ（Ｎ－パルミトイル－Ｎ－メチルタウリンナトリウム；日光ケミカルズ社製）、ＮＩＫＫＯＬ　ＭＭＴ（Ｎ－ミリストイル－Ｎ－メチルタウリンナトリウム；日光ケミカルズ社製）、ＮＩＫＫＯＬ　ＳＭＴ（Ｎ－ステアロイル－Ｎ－メチルタウリンナトリウム；日光ケミカルズ社製）等が挙げられる。
　実施形態の測定方法における、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ－アシルタウリン、又はその塩の反応液中の濃度は、０．０１～５０ｇ／Ｌが好ましく、０．１～５ｇ／Ｌがより好ましく、０．５～５ｇ／Ｌがさらに好ましく、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ｇ／Ｌである。
　本明細書における、アルキルスルホ酢酸におけるアルキルとしては、例えば炭素数８～２０のアルキル等が挙げられ、炭素数１０～１８のアルキルが好ましい。炭素数８～２０のアルキルとしては、例えばオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。炭素数１０～１８のアルキルとしては、例えばデシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）等が挙げられる。
　また、本明細書において、アルキルスルホ酢酸は、塩であってもよい。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、モノエタノールアミン塩等が挙げられる。
　アルキルスルホ酢酸、又はその塩の具体例（製品）としては、例えばＮＩＫＫＯＬ　ＬＳＡ－Ｆ（ラウリルスルホ酢酸ナトリウム；日光ケミカルズ社製）等が挙げられる。
　実施形態の測定方法における、アルキルスルホ酢酸、又はその塩の反応液中の濃度は、０．０１～５０ｇ／Ｌが好ましく、０．１～５ｇ／Ｌがより好ましく、０．１～１ｇ／Ｌがさらに好ましく、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ｇ／Ｌである。
　本明細書における、アルキルベンゼンスルホン酸におけるアルキルとしては、例えば炭素数８～２０のアルキル等が挙げられ、炭素数１０～１８のアルキルが好ましい。炭素数８～２０のアルキルとしては、例えばオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。炭素数１０～１８のアルキルとしては、例えばデシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）等が挙げられる。
　また、本明細書において、アルキルベンゼンスルホン酸は、塩であってもよい。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、モノエタノールアミン塩等が挙げられる。
　アルキルベンゼンスルホン酸、又はその塩の具体例（製品）としては、例えばＬＡＳ－Ｃ８（ｐ－ｎ－オクチルベンゼンスルホン酸Ｎａ；ナカライテスク社製）等が挙げられる。
　実施形態の測定方法における、アルキルベンゼンスルホン酸、又はその塩の反応液中の濃度は、０．０１～５０ｇ／Ｌが好ましく、０．１～５ｇ／Ｌがより好ましく、０．１～１ｇ／Ｌがさらに好ましく、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ｇ／Ｌである。
　本明細書における、ポリオキシエチレンスルホコハク酸アルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数８～２０のアルキル等が挙げられ、炭素数１０～１８のアルキルが好ましい。炭素数８～２０のアルキルとしては、例えばオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。炭素数１０～１８のアルキルとしては、例えばデシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）等が挙げられる。
　また、本明細書において、ポリオキシエチレンスルホコハク酸アルキルは、塩であってもよい。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、モノエタノールアミン塩等が挙げられる。
　ポリオキシエチレンスルホコハク酸アルキル、又はその塩の具体例（製品）としては、例えばネオハイテノ－ルＬ－３０（ポリオキシエチレンスルホコハク酸ラウリル２Ｎａ；第一工業製薬社製）等が挙げられる。
　実施形態の測定方法における、ポリオキシエチレンスルホコハク酸アルキル、又はその塩の反応液中の濃度は、０．０１～５０ｇ／Ｌが好ましく、０．１～５ｇ／Ｌがより好ましく、０．５～５ｇ／Ｌがさらに好ましく、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ｇ／Ｌである。
　本明細書における、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸におけるアルキルとしては、例えば炭素数８～２０のアルキル等が挙げられ、炭素数１０～１８のアルキルが好ましい。炭素数８～２０のアルキルとしては、例えばオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。炭素数１０～１８のアルキルとしては、例えばデシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）等が挙げられる。　また、本明細書において、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸は、塩であってもよい。ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩における塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、モノエタノールアミン塩等が挙げられる。
　ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、又はその塩の具体例（製品）としては、例えばＮＩＫＫＯＬ　ＡＫＹＰＯ　ＲＬＭ　４５　ＮＶ（ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム；日光ケミカルズ社製）、ＮＩＫＫＯＬ　ＡＫＹＰＯ　ＲＬＭ　４５（ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸；日光ケミカルズ社製）、ＮＩＫＫＯＬ　ＡＫＹＰＯ　ＲＬＭ　１００（ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸；日光ケミカルズ社製）、ＮＩＫＫＯＬ　ＥＣＴ－３ＮＥＸ（ポリオキシエチレントリデシルエーテル酢酸ナトリウム；日光ケミカルズ社製）、ＮＩＫＫＯＬ　ＥＣＴＤ－３ＮＥＸ（ポリオキシエチレントリデシルエーテル酢酸ナトリウム；日光ケミカルズ社製）、ＮＩＫＫＯＬ　ＥＣＴＤ－６ＮＥＸ（ポリオキシエチレントリデシルエーテル酢酸ナトリウム；日光ケミカルズ社製）、ネオハイテノールＥＣＬ－４５（ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム；第一工業製薬社製）等が挙げられる。
　実施形態の測定方法におけるポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、又はその塩の反応液中の濃度は、０．０１～５０ｇ／Ｌが好ましく、０．１～５ｇ／Ｌがより好ましく、０．１～１ｇ／Ｌがさらに好ましく、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ｇ／Ｌである。
　総ヘモグロビン量は、公知の方法、例えばシアンメトヘモグロビン法、オキシヘモグロビン法、ＳＬＳ－ヘモグロビン法等によって測定することができる。総ヘモグロビン量は、異常ヘモグロビン含有試料そのもののみならず、異常ヘモグロビン含有試料に、スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤を添加して得られる試料に対して、シアンメトヘモグロビン法、オキシヘモグロビン法、ＳＬＳ－ヘモグロビン法等を適用することによっても測定することができる。
　スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤を含む水性媒体中での、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応は、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素が糖化ヘモグロビンに作用し得る条件であれば、いかなる条件下でも行うことができる。
　異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応は、水性媒体中で行うことが好ましい。　水性媒体としては、実施形態の測定方法を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。
　水性媒体のｐＨは、実施形態の測定方法を可能とするｐＨであれば特に制限はなく、例えばｐＨ４～１０であってよく、例えば、ｐＨ４、５、６、７、８、９、１０である。水性媒体として緩衝液を用いる場合には、設定するｐＨに応じた緩衝剤を用いることが望ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。
　グッドの緩衝剤としては、例えば２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３－モルホリノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ－〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕－２－アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３－〔Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ〕－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ－〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕－２－ヒドロキシ－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔（Ｈ）ＥＰＰＳ〕、Ｎ－〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ－シクロヘキシル－２－アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ－シクロヘキシル－３－アミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ－シクロヘキシル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等が挙げられる。　緩衝液の濃度は、実施形態の測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、０．００１～２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５～１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましく、例えば、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０ｍｏｌ／Ｌである。
　異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応における反応温度は、実施形態の測定方法を可能とする反応温度であれば特に制限はなく、１０～５０℃が好ましく、２０～４０℃がより好ましく、例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、３７、４０、４５、５０℃である。また、当該反応における反応時間は、実施形態の測定方法を可能とする反応時間であれば特に制限はなく、１分間～３時間が好ましく、２．５分間～１時間がより好ましく、例えば、１分、１．５分、２分、２．５分、３分、３．５分、４分、４．５分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、２０分、３０分、４０分、５０分、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間である。糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素の濃度としては、実施形態の測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、０．１～３０ｋＵ／Ｌが好ましく、０．２～１５ｋＵ／Ｌがより好ましく、例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ｋＵ／Ｌである。
　本明細書において、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素の酵素活性（Ｕ）は、以下の方法により算出した。
＜酵素活性測定用試薬＞
第１試薬
　リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）　　　　　　　０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ’－サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）　　　　　　　　　　　　　　　　　０．３ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　３ｋＵ／Ｌ
　４－アミノアンチピリン　　　　　　　　　０．１ｇ／Ｌ
第２試薬
　フルクトシルバリン水溶液　　　　　　　　１．７ｍｍｏｌ／Ｌ
　なお、上記フルクトシルバリン水溶液は、J. Agric. Food Chem., 第24巻、第1号、p.70-73 (1976) に記載された方法により調製した。
＜検体希釈液＞
　リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　牛血清アルブミン　　　　　　　　　　　　０．１５％
＜サンプル＞
　ＦＰＯＸ－４７△３（糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素）を上記の検体希釈液で希釈したもの
＜測定＞
　反応セルへ、上記サンプル（２μＬ）と上記酵素活性測定用試薬の第１試薬（１５０μＬ）とを添加し、３７℃で３分間反応（第１反応）させた後、上記酵素活性測定用試薬の第２試薬（２０μＬ）を添加し、当該第２試薬を添加した３分後の反応液の吸光度［Ａｂｓ酵素（３分後）］、及び、当該第２試薬を添加した５分後の反応液の吸光度［Ａｂｓ酵素（５分後）］を、共に主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定し、Ａｂｓ酵素（５分後）からＡｂｓ酵素（３分後）を差し引き、吸光度差△Ａｂｓ’酵素を算出し、さらに算出した吸光度差△Ａｂｓ’酵素を２（分）で除して、１分間当たりの吸光度変化量△Ａｂｓ’酵素／分を算出した。
　上記サンプルの代わりに上記検体希釈液を用いる以外は、同様の方法により、吸光度差△Ａｂｓ’ブランク／分を算出した。
　算出した△Ａｂｓ’酵素／分から△Ａｂｓ’ブランク／分を差し引き、当該酵素に対する吸光度差△Ａｂｓ酵素／分を決定した。
＜酵素活性＞
　上記で決定した△Ａｂｓ酵素／分を基に、以下の式（Ｉ）により酵素活性を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素としては、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンに作用し、糖化ヘモグロビンから過酸化水素を生成させる酵素であれば特に制限はなく、例えば国際公開第２０１５／００５２５８号に記載の酵素、国際公開第２０１５／０６０４２９号に記載のアマドリア一ゼ等が挙げられ、それらの内容をここに援用する。具体的には、国際公開公報第２０１５／００５２５８号に記載されたFPOX-18A、FPOX-18B、FPOX-18C、FPOX-18D、FPOX19～46等が挙げられる。該酵素の改変体の具体例としては、例えば後述する実験１で製造されるＦＰＯＸ－４７△３等が挙げられる。
　生成した過酸化水素の測定方法としては、過酸化水素を測定し得る方法であれば特に制限はなく、例えば電極を用いる方法、過酸化水素測定用試薬を用いる方法等が挙げられ、過酸化水素測定用試薬を用いる方法が好ましい。過酸化水素測定用試薬は、過酸化水素を検出可能な物質に変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素、光（発光）、蛍光等が挙げられ、色素が好ましい。
　検出可能な物質が色素の場合、過酸化水素測定用試薬は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質と酸化発色型色原体を含む試薬等が挙げられる。酸化発色型色原体としては、酸化カップリング型色原体、ロイコ型色原体等が挙げられ、ロイコ型色原体が好ましい。
　本明細書において、ロイコ型色原体とは、過酸化水素および過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質をいう。過酸化活性物質としては、例えばペルオキシダーゼ等が挙げられる。
　ロイコ型色原体としては、例えばフェノチアジン系色原体、トリフェニルメタン系色原体、ジフェニルアミン系色原体、ｏ－フェニレンジアミン、ヒドロキシプロピオン酸、ジアミノベンジジン、テトラメチルベンジジン等が挙げられ、フェノチアジン系色原体が好ましい。
　フェノチアジン系色原体としては、例えば１０－Ｎ－カルボキシメチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０－Ｎ－メチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、１０－Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ－６７）等が挙げられる。フェノチアジン系色原体の中でも、１０－Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ－６７）が特に好ましい。
　トリフェニルメタン系色原体としては、例えばＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’－ヘキサ（３－スルホプロピル）－４，４’，４’’－トリアミノトリフェニルメタン（ＴＰＭ－ＰＳ）等が挙げられる。ジフェニルアミン系色原体としては、例えばＮ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム塩（ＤＡ－６４）、４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３－ビス（４－クロロフェニル）メチル－４－ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等が挙げられる。
　本明細書において、酸化カップリング型色原体とは、過酸化水素及び過酸化活性物質の存在下、酸化的カップリングにより色素が生成される、２つの化合物をいう。２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等が挙げられる。
　カプラーとしては、例えば４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ）、３－メチル－２－ベンゾチアゾリノンヒドラジン等が挙げられる。
　アニリン類としては、Ｎ－（３－スルホプロピル）アニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－メチルアニリン、Ｎ，Ｎ－ビス（３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）アニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－（３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）アニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ’－サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ’－アセチルエチレンジアミン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－４－フルオロ－３，５－ジメトキシアニリン（Ｆ－ＤＡＯＳ）等があげられる。
　フェノール類としては、フェノール、４－クロロフェノール、３－メチルフェノール、３－ヒドロキシ－２，４，６－トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等があげられる。
　検出可能な物質が光（発光）の場合、過酸化水素測定用試薬は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質と化学発光物質を含む試薬等が挙げられる。化学発光物質としては、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル等が挙げられる。　検出可能な物質が蛍光の場合、過酸化水素測定用試薬は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質と蛍光物質を含む試薬等が挙げられる。蛍光物質としては、例えば４－ヒドロキシフェニル酢酸、３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、クマリン等が挙げられる。
（２）異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬
　実施形態の、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬（以下、実施形態の測定試薬という。）は、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤と、を含む試薬である。実施形態の測定試薬は、実施形態の異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定方法に使用される。実施形態の測定試薬は、さらに、過酸化水素測定試薬を含んでいてもよい。
　実施形態の測定試薬における、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素；スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤；並びに、過酸化水素測定試薬としては、例えば、前述の実施形態の測定方法で例示した、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素；スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤；並びに、過酸化水素測定試薬等がそれぞれ挙げられる。
　実施形態の測定試薬がスルホン酸系アニオン性界面活性剤を含む場合、前記スルホン酸系アニオン性界面活性剤は、アルケニルスルホン酸、アルキルスルホン酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ－アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、アルキルベンゼンスルホン酸及びポリオキシエチレンスルホコハク酸アルキルからなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤であることが好ましい。
　実施形態の測定試薬は、凍結乾燥された状態でも、水性媒体に溶解された状態でもよい。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。凍結乾燥された状態の試薬を用いて異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定する場合には、当該試薬は水性媒体に溶解して使用することができる。
　実施形態の糖化ヘモグロビン測定試薬における糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．１～３０ｋＵ／Ｌである含量が好ましく、０．２～１５ｋＵ／Ｌである含量がより好ましく、例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ｋＵ／Ｌである含量である。
　実施形態の糖化ヘモグロビン測定試薬における、スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００１～１０ｇ／Ｌである含量であることが好ましく、０．０１～５ｇ／Ｌである含量がより好ましく、例えば、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１．０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｇ／Ｌである。
　実施形態の測定試薬には、必要に応じて、水性媒体、安定化剤、防腐剤、塩類、干渉物質消去剤、有機溶媒等が含有されてもよい。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シュークロース、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、硝酸カルシウム、フェロシアン化カリウム、ピルビン酸、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等のポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤、グリセリン、アルキレングリコール等が挙げられる。アルキレングリコールとしては、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等があげられる。塩類としては、例えば塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、硝酸カリウム、硫酸カリウム、炭酸カリウム、ギ酸カリウム、酢酸カリウム等が挙げられる。干渉物質消去剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を消去するためのアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。有機溶媒としては、例えばロイコ型色原体の水性媒体への溶解補助剤としてのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）、ジオキサン、アセトン、メタノール、エタノール等が挙げられる。
（３）異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キット
　実施形態の異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬は、キットの形態で保存、流通及び使用されてよい。実施形態の異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キット（以下、実施形態のキットという。）は、実施形態の異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法に使用される。実施形態の測定キットとしては、例えば２試薬系のキット、３試薬系のキット等が挙げられ、２試薬系キットが好ましい。
　実施形態のキットにおける、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素；スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤；並びに、過酸化水素測定試薬としては、例えば、前述の実施形態の測定方法で例示した、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素；スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤；並びに、過酸化水素測定試薬等がそれぞれ挙げられる。
　実施形態のキットがスルホン酸系アニオン性界面活性剤を含む場合、前記スルホン酸系アニオン性界面活性剤は、アルケニルスルホン酸、アルキルスルホン酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ－アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、アルキルベンゼンスルホン酸及びポリオキシエチレンスルホコハク酸アルキルからなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤であることが好ましい。
　本明細書において、２試薬系キットを用いて異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定する場合には、例えば反応セルに、異常ヘモグロビン含有試料と第１試薬とを添加し、一定時間、一定温度で反応を行った後、第２試薬を添加し、生成した過酸化水素を測定することにより、糖化ヘモグロビンを測定することができる。
・キット１
スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤を含む第１試薬；並びに、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第２試薬を含むキット。
・キット２
スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤を含む第１試薬；並びに、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第２試薬を含み、過酸化水素測定試薬を、第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含むキット。
　過酸化水素測定試薬として、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬を用いる場合は、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とは別々の試薬に含まれることが好ましい。すなわち、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とが、それぞれ第１試薬と第２試薬に、又は、第２試薬と第１試薬に含まれることが好ましい。
・キット３
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第１試薬；並びに、
スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤を含む第２試薬
を含むキット。
・キット４
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第１試薬；並びに、
スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤を含む第２試薬
を含み、過酸化水素測定試薬を、第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含むキット。
　過酸化水素測定試薬として、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬を用いる場合は、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とは別々の試薬に含まれることが好ましい。すなわち、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とが、それぞれ第１試薬と第２試薬に、又は、第２試薬と第１試薬に含まれることが好ましい。
・キット５
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、並びに、スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤を含む第１試薬；並びに、
過酸化水素測定試薬を含む第２試薬
を含むキット。
・キット６
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤と、過酸化水素測定試薬とを含む第１試薬；並びに、
過酸化水素測定試薬を含む第２試薬
を含むキット。
　過酸化水素測定試薬として、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬を用いる場合は、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とは別々の試薬に含まれることが好ましい。すなわち、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とが、それぞれ第１試薬と第２試薬に、又は、第２試薬と第１試薬に含まれることが好ましい。
・キット７
過酸化水素測定試薬を含む第１試薬；並びに、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、並びに、スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤を含む第２試薬
を含むキット。
・キット８
過酸化水素測定試薬を含む第１試薬；並びに、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤と、過酸化水素測定試薬を含む第２試薬を含むキット。
　過酸化水素測定試薬として、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬を用いる場合は、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とは別々の試薬に含まれることが好ましい。すなわち、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とが、それぞれ第１試薬と第２試薬に、又は、第２試薬と第１試薬に含まれることが好ましい。
　実施形態のキットは、凍結乾燥された状態でも、水性媒体に溶解された状態でもよい。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。凍結乾燥された状態のキットを用いて異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定する場合には、当該キットを構成する試薬は水性媒体に溶解して使用することができる。
　実施形態のキットを構成する試薬における、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素の含量は、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．２～６０ｋＵ／Ｌである含量が好ましく、０．４～３０ｋＵ／Ｌである含量がより好ましく、例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０ｋＵ／Ｌである含量である。
　実施形態のキットを構成する試薬における、スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤の含量は、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００２～２０ｇ／Ｌである含量が好ましく、０．０２～１０ｇ／Ｌである含量がより好ましく、０．１～１０ｇ／Ｌである含量がさらに好ましく、例えば、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１．０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｇ／Ｌである含量である。
（４）組成物
　実施形態の組成物は、異常ヘモグロビンを含む糖化ヘモグロビンと、スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤と、を含むものである。
　実施形態の組成物は、さらに、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含んでいてもよい。
　実施形態の組成物は、さらに、過酸化水素測定試薬を含んでいてもよい。
　過酸化水素測定試薬として、ペルオキシダーゼ及びロイコ型色原体からなる群より選ばれる少なくとも一種を用いることができる。実施形態の組成物には、例えば、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体のどちらか一方が含まれていてもよく、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体の両方が含まれていてもよい。
　実施形態の組成物は、実施形態の異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定方法の反応液、又は該反応液の調整のための液としてに用いることができる。
　実施形態の組成物の一例として、以下の組成物を例示できる。
・組成物１
異常ヘモグロビンを含む糖化ヘモグロビンと、
スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤と、
ロイコ型色原体と、を含む組成物。
・組成物２
異常ヘモグロビンを含む糖化ヘモグロビンと、
スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤と、
ペルオキシダーゼと、を含む組成物。
・組成物３
異常ヘモグロビンを含む糖化ヘモグロビンと、
スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤と、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、を含む組成物。
・組成物４
異常ヘモグロビンを含む糖化ヘモグロビンと、
スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤と、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、
ロイコ型色原体と、を含む組成物。
・組成物５
異常ヘモグロビンを含む糖化ヘモグロビンと、
スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤と、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、
ペルオキシダーゼと、を含む組成物。
・組成物６
異常ヘモグロビンを含む糖化ヘモグロビンと、
スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤と、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、
ロイコ型色原体と、
ペルオキシダーゼと、を含む組成物。
　ここで、異常ヘモグロビンを含む糖化ヘモグロビンとは、糖化ヘモグロビンとして異常ヘモグロビンの糖化ヘモグロビンを含むことを意味する。異常ヘモグロビンの糖化ヘモグロビンとしては、例えば、少なくともヒトのヘモグロビンＡのβ鎖のＮ末端から１～６番目のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された異常ヘモグロビンの糖化ヘモグロビン；ヘモグロビンＣの糖化ヘモグロビン；ヘモグロビンＳの糖化ヘモグロビン等を例示できる。
　実施形態の組成物における、異常ヘモグロビン；糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素；スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤；並びに、過酸化水素測定試薬としては、例えば、前述の実施形態の測定方法で例示した、異常ヘモグロビン；糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素；スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤；並びに、過酸化水素測定試薬等がそれぞれ挙げられる。
　実施形態の組成物がスルホン酸系アニオン性界面活性剤を含む場合、前記スルホン酸系アニオン性界面活性剤は、アルケニルスルホン酸、アルキルスルホン酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ－アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、アルキルベンゼンスルホン酸及びポリオキシエチレンスルホコハク酸アルキルからなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤であることが好ましい。
　実施形態の組成物における、異常ヘモグロビンの含有量は、前述の実施形態の測定方法において、異常ヘモグロビン含有試料における量として例示した数値が挙げられる。
　実施形態の組成物における、総ヘモグロビンの含有量は、前述の実施形態の測定方法において、反応液中における量として例示した数値が挙げられる。
　次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　以下、使用した試薬類の情報を下記に示す。
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（同仁化学研究所社製）
　ＤＡ－６７（和光純薬工業社製）
　ペルオキシダーゼ（東洋紡社製）
　ＫリポランＰＪ－４００Ｊ［テトラデセンスルホン酸Ｎａ；ライオン社製］
　ＮＩＫＫＯＬ　ＬＭＴ［Ｎ－ラウロイル－Ｎ－メチルタウリンＮａ；日光ケミカルズ社製］
　ＮＩＫＫＯＬ　ＬＳＡ－Ｆ［ラウリルスルホ酢酸Ｎａ；日光ケミカルズ社製］
　ＬＡＳ－Ｃ８［ｐ－ｎ－オクチルベンゼンスルホン酸Ｎａ；ナカライテスク社製］
　ネオハイテノ－ルＬ－３０［ポリオキシエチレンスルホコハク酸ラウリル２Ｎａ；第一工業製薬社製］
　ＮＩＫＫＯＬ　ＥＣＴＤ－３ＮＥＸ［ポリオキシエチレントリデシルエーテル酢酸Ｎａ；日光ケミカルズ社製］
　ＮＩＫＫＯＬ　アラニネートＬＮ－３０［ラウロイルメチルアラニンＮａ；日光ケミカルズ社製］
　ＮＩＫＫＯＬ　サルコシネートＬＮ－３０［Ｎ－ラウロイルサルコシンＮａ；日光ケミカルズ社製］
［実験１］FPOX-47△3の造成
（１）FPOX-47発現ベクターpTrc-FPOX-47の造成
　配列番号１で表される塩基配列からなるDNAを含む発現プラスミドpTrc-FPOX-42をテンプレートDNAとして用い、配列番号２で表される塩基配列からなるFPOX-42 F342V-F及び配列番号３で表される塩基配列からなるFPOX-42 F342V-Rをフォワードプライマー及びリバースプライマーとしてそれぞれ用いて、以下の試薬組成及びPCR条件により、PCRを行い、PCR産物を得た。pTrc-FPOX-42は、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素であるFPOX-42をコードするDNAを含む発現プラスミドであり、国際公開第２０１５／００５２５８号に開示されている方法に従って造成することができる。PCRは、東洋紡社製のPCRキット、DNA polymerase「KOD-Plus-」のプロトコールに基づいて実施した。
（試薬組成）
・KOD-Plus-バッファー
・テンプレートDNA（pTrc-FPOX-42）　1～2 ng/μL
・フォワードプライマー（FPOX-42 F342V-F）　0.3 μmol/L
・リバースプライマー（FPOX-42 F342V-R）　0.3 μmol/L
・dNTP 混合液　各0.2 mmol/L
・MgSO4　1 mmol/L
・DNA ポリメラーゼ（KOD-Plus-）　0.02 U/μL
・滅菌水添加により、50 μLとした。
（PCR条件）
1. 94℃　2分
2. 98℃　15秒
3. 60℃　30秒
4. 68℃　6分
5. 2～4の繰り返し（全30サイクル）
6. 68℃　10分
　得られたPCR産物50 μLにニューイングランドバイオラボ社製「制限酵素Dpn I」1μLを添加し、37℃、1時間インキュベーションすることでテンプレートDNAを分解した。制限酵素処理したPCR産物をPromega社製「Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System」を用いて、当該キットのプロトコールに従って精製し、PCR産物の精製試料を得た。
　次いで、得られたPCR産物の精製試料を用いて東洋紡社製の大腸菌コンピテントセル「Competent high DH5α」に形質転換した。50 mg/L アンピシリンを含有したLB寒天培地上に生育したコロニーを選択し、Promega社製「Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification」を使用して、当該キットのプロトコールに従い、プラスミドを抽出した。
　抽出したプラスミドをDNAシークエンサーで配列解析することにより、FPOX-47をコードする、配列番号４で表される塩基配列を有するDNAを含むプラスミド、pTrc-FPOX-47が造成されていることを確認した。配列解析には、pTrc99aベクター（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）のマルチクローニングサイト直前、直後の塩基配列を反映した配列番号５で表される塩基配列からなるpTrc-F及び配列番号６で表される塩基配列からなるpTrc-Rをフォワードプライマー及びリバースプライマーとしてそれぞれ使用した。
（２）FPOX-47△3発現ベクターpTrc-FPOX-47△3の造成
　プラスミドpTrc-FPOX-47に含まれるFPOX-47をコードする塩基配列の3’末端側の終止コドンの直前に位置する9塩基を除き、終止コドンおよびBam HI制限酵素認識サイトを付加した、配列番号７で表される塩基配列からなるFPOX-47△3-R、及び、pTrc99aベクターのマルチクローニングサイト直前の塩基配列を反映した配列番号５で表される塩基配列からなるpTrc-Fを設計し、化学合成した。
　pTrc-F及びFPOX-47△3-Rをプライマー対として用い、pTrc-FPOX-47をテンプレートとして、以下の試薬組成及びPCR条件によりPCRを行い、FPOX-47のＣ末端の３つのアミノ酸を欠失した欠失体FPOX-47△3をコードする塩基配列を含むDNA断片を含んだPCR産物を得た。PCRは、東洋紡社製のPCRキット、DNA polymerase「KOD-Plus-」のプロトコールに基づいて実施した。
（試薬組成）
・KOD-Plus-バッファー
・テンプレートDNA（pTrc-FPOX-47）　0.2～0.5 ng/μL
・フォワードプライマー（pTrc-F）　0.3 μmol/L
・リバースプライマー（FPOX-47△3-R）　0.3 μmol/L
・dNTP 混合液　各0.2 mmol/L
・MgSO4　1 mmol/L
・DNA　ポリメラーゼ（KOD-Plus-）　0.02 U/μL
・滅菌水添加により、50 μLとした。
（PCR条件）
1. 94℃　2分
2. 98℃　15秒
3. 60℃　30秒
4. 68℃　2分
5. 2～4の繰り返し（全30サイクル）
6. 68℃　5分
　得られたPCR産物の一部を用いて1%アガロースTAEゲルで電気泳動し、想定したサイズのDNA断片が得られていることを確認した。
　得られたPCR産物を、Promega社製「Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system」を用いて、当該キットのプロトコールに従って精製し、FPOX-47△3をコードするDNAを含むDNA断片を得た。得られた当該DNA断片を２種類の制限酵素Nco I及びBam HI（共に、タカラバイオ社製）により37℃で1時間処理し、得られた反応混合物をPromega社製「Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system」を用いて、当該キットのプロトコールに従い精製し、制限酵素処理断片を得た。
　また、国際公開第２０１０／０４１７１５号パンフレットに記載されているフルクトシルヘキサペプチドを酸化する活性のない糖化ペプチドオキシダーゼFPOX-15を発現させるpTrc-FPOX-15を同じ制限酵素で同様に処理し、1% アガロースTAEゲルで電気泳動し、ベクターに相当するDNA断片を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up systemを用いてDNA断片を精製し、FPOX-15をコードするDNAが除去されたプラスミド断片を得た。
　得られた制限酵素処理断片と、FPOX-15をコードするDNAが除去されたプラスミド断片とを混合し、DNA Ligation Kit（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションした後、ライゲーション産物を東洋紡社製の大腸菌コンピテントセル「Competent high DH5α」に導入した。
　ライゲーション産物が導入された大腸菌を50 mg/L アンピシリンを含むLB寒天培地に植菌し、37℃で14時間培養し、出現したコロニーを選択した。選択したコロニーを、50 mg/L アンピシリンを含むLB液体培地で、37℃で14時間培養し、Promega社製「Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification」を使用して、当該キットのプロトコールに従い、プラスミドを調製した。配列番号５で表される塩基配列からなるpTrc-F及び配列番号６で表される塩基配列からなるpTrc-Rをフォワードプライマー及びリバースプライマーとしてそれぞれ用いてPCRを行い、調製したプラスミドの塩基配列を確認し、当該プラスミド上に、FPOX-47の塩基配列の、終止コドンを除いた3’側9塩基が欠失した配列番号８で表される塩基配列が含まれることを確認した。同プラスミドをpTrc-FPOX-47△3と称する。
（３）FPOX-47△3の取得
　上記（２）で得られたpTrc-FPOX-47△3を含む大腸菌を、アンピシリン50 mg/Lを含有するLB培地で、37℃、14時間振盪培養した。得られた培養液を用いて、国際公開第２０１０／０４１７１５号パンフレットに記載されている糖化ペプチドオキシダーゼFPOX-9及びFPOX-15の精製方法に従って精製し、精製FPOX-47△3の溶液を得た。FPOX-47のアミノ酸配列を配列番号９に、FPOX-47△3のアミノ酸配列を配列番号１０にそれぞれ示す。
（４）FPOX-47△3の糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素活性（以下、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ活性と称する）の確認
　上記（３）で得られた精製FPOX-47△3の溶液を用いて、以下の測定キット及び測定手順により、FPOX-47△3のＨｂＡ１ｃに対する糖化ヘモグロビンオキシダーゼ活性を確認した。
＜測定キットＡ＞
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．５）　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　４０μｍｏｌ／Ｌ
　ＮＩＫＫＯＬ　ＬＭＴ　　　　　　　　　　１ｇ／Ｌ
第２試薬
　リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－４７△３　　　　　　　　　　　１．５ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　２００ｋＵ／Ｌ
＜測定キットａ＞
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．５）　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　４０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
　リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－４７△３　　　　　　　　　　　１．５ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　２００ｋＵ／Ｌ
　測定キットａは、第１試薬中にＮＩＫＫＯＬ　ＬＭＴが含まれていないこと以外は、測定キットＡと同じである。
＜サンプル＞
　ヒトの血液を遠心分離して得られる血球を脱イオン水で希釈して溶血させて調製され、ＨｂＡ１ｃ測定の基準法であるＫＯ５００法と、総ヘモグロビン測定法の１つであるＳＬＳ－ヘモグロビン法とから、ＨｂＡ１ｃ濃度が２．６μｍｏｌ／Ｌ、４．５μｍｏｌ／Ｌ、６．４μｍｏｌ／Ｌ、８．４μｍｏｌ／Ｌと値付けされている溶血試料をサンプルとして用いた。
＜測定手順＞
　反応セルへ、上記の各サンプル（１０μＬ）と上記測定キットＡの第１試薬（１００μＬ）とを添加し、３７℃で５分間反応（第１反応）させ、反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定し、次いで、この反応液に上記測定キットＡの第２試薬（４０μＬ）を添加し、さらに３７℃で５分間反応（第２反応）させ、反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定した。Ｅ２からＥ１を差し引き、吸光度差△Ｅ’Ａを算出した。
　反応セルへ、上記の各サンプル（１０μＬ）と上記測定キットａの第１試薬（１００μＬ）とを添加し、３７℃で５分間反応（第１反応）させ、反応液の吸光度（Ｅ３）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定し、次いで、この反応液に上記測定キットａの第２試薬（４０μＬ）を添加し、さらに３７℃で５分間反応（第２反応）させ、反応液の吸光度（Ｅ４）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定した。Ｅ４からＥ３を差し引き、吸光度差△Ｅ’ａを算出した。
　△Ｅ’Ａから△Ｅ’ａを差し引き、各サンプルに対する吸光度差△Ｅとした。各サンプルにおけるＨｂＡ１ｃ濃度と△Ｅとの関係を図１に示す。
　第１図から明らかな様に、アニオン性界面活性剤であるＮ－アシルタウリンを含むキット（キットＡ）を用いた測定において、ＨｂＡ１ｃ濃度と吸光度との間に定量関係が認められた。従って、ＦＰＯＸ－４７△３が、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する活性を有する酵素であることを確認した。
［実験２］
　次いで、下記の各種アニオン性界面活性剤を有するＨｂＡ１ｃ測定用キットにより、異常ヘモグロビンを含有しない異常ヘモグロビン非含有試料に対し、ＨｂＡ１ｃを測定できているかを、基準法であるＫＯ５００法との相関により確認した。
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キット（キット１Ａ～１Ｆ）を調整した。
（キット１Ａ～１Ｆ）
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ピルビン酸Ｎａ　　　　　　　　　　　　　２ｇ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　４０μｍｏｌ／Ｌ
　アニオン性界面活性剤Ａ～Ｆ（第２表参照）
第２試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　フェロシアン化カリウム　　　　　　　　　１．５ｍｇ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－４７△３　　　　　　　　　　　１．５ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　２００ｋＵ／Ｌ
　また、以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キット（キット１ａ～１ｂ）を調整した。
（キット１ａ～１ｂ）
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ピルビン酸Ｎａ　　　　　　　　　　　　　２ｇ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　４０μｍｏｌ／Ｌ
　アニオン性界面活性剤ａ～ｂ（第２表参照）
第２試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　フェロシアン化カリウム　　　　　　　　　１．５ｍｇ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－４７△３　　　　　　　　　　　１．５ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　２００ｋＵ／Ｌ
　ＨｂＡ１ｃ測定用キットとして、上記の第１試薬及び第２試薬からなるキット１Ａを用い、試料として、ＨＰＬＣ法であるＫＯ５００法によって、ＨｂＡ１ｃ濃度がそれぞれ５．１１％、５．７３％、６．４０％、７．４５％、８．５５％及び１０．５６％と値付けされている、６濃度の全血（異常ヘモグロビン非含有）を用いて、以下の手順により、各試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度（量）の総ヘモグロビン濃度（量）に対する割合［ＨｂＡ１ｃ（％）］を決定した。
（１）総ヘモグロビン濃度決定のための検量線の作成
　総ヘモグロビン測定用キットであるヘモグロビンＢ－テストワコー（ＳＬＳ－ヘモグロビン法）（和光純薬工業社製）及びヘモグロビンＢ－テストワコーに付属の標準品（総ヘモグロビン濃度：１５．０ｍｇ／ｍｌ、異常ヘモグロビン非含有）を用いて、以下の手順に従って測定を行い、当該標準品に対する吸光度を測定した。
　反応セルヘ、当該標準品（１０μＬ）とヘモグロビンＢ－テストワコー（２５０μＬ）とを添加し、３７℃で１０分間反応させ、反応液の吸光度（Ｅ）を主波長５４６ｎｍ、副波長６６０ｎｍで測定し、当該標準品に対する吸光度とした。当該標準品の代わりに生理食塩水を用いる以外は同様の方法により測定し、生理食塩水に対する吸光度とした。当該標準品に対する吸光度から、生理食塩水に対する吸光度を差し引いて算出した値を、当該標準品に対するブランク補正吸光度とした。当該標準品に対するブランク補正吸光度と、生理食塩水に対するブランク補正吸光度（０Ａｂｓ）とから、総ヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。
（２）ＨｂＡ１ｃ濃度決定のための検量線の作成
　Ｋ０５００法によりＨｂＡ１ｃ濃度が３．７２μｍｏ１／Ｌ、１０．３８μｍｏｌ／Ｌと値付けされている２つの溶血した血球画分について、上記のＨｂＡ１ｃ測定用キット１Ａを用いて、以下の手順に従って測定し、各血球画分に対する吸光度を測定した。
　反応セルヘ、上記の溶血した各血球画分（９．６μＬ）と上記のＨｂＡ１ｃ測定用キット１Ａの第一試薬（１２０μＬ）とを添加し、３７℃で５分間反応（第一反応）させ、反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定し、次いで、この反応液に上記のＨｂＡ１ｃ測定用キット１Ａの第二試薬（４０μＬ）を添加し、さらに３７℃で５分間反応（第二２反応）させ、反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定した。Ｅ２からＥ１を差し引き、吸光度差△Ｅ’１Ａを算出し、各血球画分に対する吸光度とした。上記の各血球画分の代わりに生理食塩水を用いる以外は同様の方法により、吸光度差△Ｅ’生理食塩水を算出し、生理食塩水に対する吸光度とした。当該血球画分に対するそれぞれの吸光度から、生理食塩水に対する吸光度を差し引いて算出した値を、当該血球画分に対するブランク補正吸光度とした。当該血球画分に対するブランク補正吸光度と、生理食塩水に対するブランク補正吸光度（０Ａｂｓ）とから、ＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。
（３）各血球画分における総ヘモグロビン濃度の決定
　６濃度の全血試料の各々について、２５℃、３０００ｒｐｍ（１５００×Ｇ）で５分間遠心分離を行い、血球画分を得た。各血球分画１００μＬに、精製水４ｍLを添加し、溶血した血球分画を得た。溶血した各血球画分について、ヘモグロビンＢ－テストワコーを用いて（１）と同様の方法により測定を行い、得られた測定値と（１）の検量線とから、各血球画分中の総ヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を決定した。
（４）各血球画分におけるＨｂＡ１ｃ濃度の決定
　上記（３）で得られた溶血した各血球画分について、上記のＨｂＡ１ｃ測定用キット１Ａを用いて（２）と同様の方法により測定を行い、得られた測定値と（２）の検量線とから、各血球画分中のＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を決定した。
（５）ＨｂＡ１ｃ（％）（ＨｂＡ１ｃ濃度の総ヘモグロビン濃度に対する割合）の決定　上記（３）で決定した各血球画分における総ヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と、上記（４）で決定した各血球画分におけるＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）とから、以下の式（ＩＩ）により、ＨｂＡ１ｃ（％）をＮＧＳＰ値（国際標準値）として算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
（６）ＨｂＡ１ｃ測定用キットを用いた測定方法とＫＯ５００法との相関
　ＨｂＡ１ｃ測定用キット１Ａを使用した測定方法を用いて、上記（５）で決定したＨｂＡ１ｃ（％）と、予めＫＯ５００法を用いて値付けされたＨｂＡ１ｃ（％）とから、ＨｂＡ１ｃ測定用キット１Ａを使用した測定方法とＫ０５００法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。
　また、上記のＨｂＡ１ｃ測定用キット１Ａの代わりに、上記の測定用キット１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ、１ａ及び１ｂの各キットを用いた以外は上記と同様の手順により、各試料中のＨｂＡ１ｃ（％）を決定し、各キットを用いた測定方法とＫＯ５００法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。
　結果を第２表に示す。両測定法間の相関係数は、いずれも０．９８以上となり、両測定法間に良好な相関関係が認められた。したがって、上記のＨｂＡ１ｃ測定用キット１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ、１ａ及び１ｂの各キットのいずれによっても、異常ヘモグロビンを含まない異常ヘモグロビン非含有試料であれば、試料中のＨｂＡ１ｃを正確に測定できていることが明らかとなった。
［実験３］
　次いで、上記の各種アニオン性界面活性剤を有するＨｂＡ１ｃ測定用キットにより、異常ヘモグロビンＨｂＣを含有する異常ヘモグロビン含有試料に対し、ＨｂＡ１ｃを測定できているかを確認した。
　なお、本実験では、ＨｂＡではない異常ヘモグロビンＨｂＣを含む糖化ヘモグロビンの測定結果も、ＨｂＡ１ｃ量として表記している。
　（１）溶血検体の調製
　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社から購入した、ＨＰＬＣ法により既にＨｂＣ含有量及びＨｂＡ１ｃ（％）が値付けされている血球検体３つ（検体１～３：第１表参照）の各々１００μＬに、精製水４ｍＬを添加し、溶血検体を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（２）各溶血検体における総ヘモグロビン濃度の決定
　上記（１）で調製した各溶血検体について、総ヘモグロビン測定試薬であるヘモグロビンＢ－テストワコーを用いて上記実験２と同様の測定を行い、得られた吸光度と上記実験２で作成した総ヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との間の関係を示す検量線とから、各溶血検体中の総ヘモグロビン濃度を決定した。
（３）各溶血検体におけるＨｂＡ１ｃ濃度の決定
　上記（１）で調製した各溶血検体について、上記のＨｂＡ１ｃ測定用キット１Ａを用いて、上記実験２と同様の方法により測定を行い、得られた測定値と上記実験２で作成したＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との間の関係を示す検量線とから、各溶血検体中のＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を測定した。
（４）ＨｂＡ１ｃ（％）（＝ＨｂＡ１ｃ濃度の総ヘモグロビン濃度に対する割合）の決定　上記（２）で測定した各溶血検体における総ヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と、上記（３）で測定した各溶血検体におけるＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）とから、以下の式（ＩＩ）により、ＨｂＡ１ｃ（％）をＮＧＳＰ値（国際標準値）として算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
（５）購入時表示値と、上記（４）で決定したＨｂＡ１ｃ（％）との比較
　各検体について、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社からの購入時に値付けされていたＨｂＡ１ｃ濃度（％）を基準０とし、その基準値と、上記（４）で決定したＨｂＡ１ｃ（％）との差［△ＨｂＡ１ｃ濃度（％）］を算出した。
　また、ＨｂＡ１ｃ測定用キットとして、上記のＨｂＡ１ｃ測定用キット１Ａの代わりに、上記のＨｂＡ１ｃ測定用キット１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ、１ａ及び１ｂの各キットを用いた以外は上記と同様の測定を行い、各キットに対して、各溶血検体中のＨｂＡ１ｃ濃度（％）を測定した。各検体について、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社からの購入時に値付けされていたＨｂＡ１ｃ濃度（％）を基準０とし、その基準値と、測定したＨｂＡ１ｃ（％）との差［△ＨｂＡ１ｃ濃度（％）］を算出した。
　なお、本実験３のＨｂＡ１ｃ測定用キット１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ及び１Ｆの各キットを用いた測定が、本発明を適用した実施例に該当する。
　結果を第２表に示す。異常ヘモグロビンを含有する異常ヘモグロビン含有試料に対し、ＨｂＡ１ｃ測定用キット１ａ及び１ｂの各キットを用いた測定では、△ＨｂＡ１ｃ濃度（％）の値が０より小さく、且つ実施例の△ＨｂＡ１ｃ濃度（％）の値より小さく、本発明を適用した実施例に比べ、異常ヘモグロビン含有試料に対する試料中のＨｂＡ１ｃの測定の正確性に劣る傾向であった。
　一方で、異常ヘモグロビンを含有する異常ヘモグロビン含有試料に対し、ＨｂＡ１ｃ測定用キット１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ及び１Ｆの各キットを用いた測定では、△ＨｂＡ１ｃ濃度（％）の値が０に近く、異常ヘモグロビン含有試料であっても、試料中のＨｂＡ１ｃを、より正確に測定できることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。

Claims (30)

  1. 　異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素とを、スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤存在下に反応させて過酸化水素を生成させ、生成した前記過酸化水素を測定することを含む、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。
  2. 　前記スルホン酸系アニオン性界面活性剤が、アルケニルスルホン酸、アルキルスルホン酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ－アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、アルキルベンゼンスルホン酸及びポリオキシエチレンスルホコハク酸アルキルからなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤である、請求項１に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
  3. 　前記異常ヘモグロビンが、少なくともヒトのヘモグロビンＡのβ鎖のＮ末端から１～６番目のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたものである、請求項１又は２に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
  4. 　前記異常ヘモグロビンが、ヒトのヘモグロビンＣ又はヘモグロビンＳである、請求項１～３のいずれか一項に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
  5. 　前記ヘモグロビン含有試料中の総ヘモグロビン数に対し、前記異常ヘモグロビンの含有割合が２０％以上である、請求項１～４のいずれか一項に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
  6. 　前記過酸化水素の測定が、過酸化水素測定試薬により行われる、請求項１～５のいずれか一項に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
  7. 　前記過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である、請求項６に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
  8. 　前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である、請求項７に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
  9. 　前記フェノチアジン系色原体が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩である、請求項８に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
  10. 　糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、
    　スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤と、を含む、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬。
  11. 　前記スルホン酸系アニオン性界面活性剤が、アルケニルスルホン酸、アルキルスルホン酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ－アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、アルキルベンゼンスルホン酸及びポリオキシエチレンスルホコハク酸アルキルからなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤である、請求項１０に記載の測定試薬。
  12. 　さらに、過酸化水素測定試薬を含む、請求項１０又は１１に記載の測定試薬。
  13. 　前記過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である、請求項１２に記載の測定試薬。
  14. 　前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である、請求項１３に記載の測定試薬。
  15. 　前記フェノチアジン系色原体が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩である、請求項１４に記載の測定試薬。
  16. 　スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤を含む第１試薬と、
    　糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第２試薬と、を含む、異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キット。
  17. 　前記スルホン酸系アニオン性界面活性剤が、アルケニルスルホン酸、アルキルスルホン酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ－アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、アルキルベンゼンスルホン酸及びポリオキシエチレンスルホコハク酸アルキルからなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤である、請求項１６に記載の測定キット。
  18. 　さらに、ペルオキシダーゼ及びロイコ型色原体を、それぞれ第１試薬と第２試薬、又は、第２試薬と第１試薬に含む、請求項１６又は１７に記載の測定キット。
  19. 　前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である、請求項１８に記載の測定キット。
  20. 　前記フェノチアジン系色原体が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩である、請求項１９に記載の測定キット。
  21. 　異常ヘモグロビンを含む糖化ヘモグロビンと、
    　スルホン酸系アニオン性界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤と、を含む組成物。
  22. 　前記スルホン酸系アニオン性界面活性剤が、アルケニルスルホン酸、アルキルスルホン酸、アミノ基の水素原子が置換基で置換されていてもよいＮ－アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、アルキルベンゼンスルホン酸、ポリオキシエチレンスルホコハク酸アルキル及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のアニオン性界面活性剤である、請求項２１に記載の組成物。
  23. 　さらに、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む、請求項２１又は２２に記載の組成物。
  24. 　さらに、過酸化水素測定試薬を含む、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の組成物。
  25. 　前記過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼ及びロイコ型色原体からなる群より選ばれる少なくとも一種である、請求項２４に記載の組成物。
  26. 　前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である請求項２５に記載の組成物。
  27. 　前記フェノチアジン系色原体が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩である、請求項２６に記載の組成物。
  28. 　前記異常ヘモグロビンが、少なくともヒトのヘモグロビンＡのβ鎖のＮ末端から１～６番目のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたものである、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の組成物。
  29. 　前記異常ヘモグロビンが、ヒトのヘモグロビンＣ又はヘモグロビンＳである、請求項２１～２８のいずれか一項に記載の組成物。
  30. 　前記組成物中の総ヘモグロビン数に対し、前記異常ヘモグロビンの含有割合が２０％以上である、請求項２１～２９のいずれか一項に記載の組成物。
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