CN112834632B - 采用hplc法的血液检体测定用的检体稀释液及糖化血红蛋白的测定方法 - Google Patents

采用hplc法的血液检体测定用的检体稀释液及糖化血红蛋白的测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明的课题是在通过HPLC法对血液检体进行分析的情况下，消除在反复测定时发生的柱的分离能力的降低、装置压力的上升等问题。解决手段是下述检体稀释液、和使用该检体稀释液的采用HPLC法的糖化血红蛋白的测定方法，上述检体稀释液是采用高效液相色谱(HPLC)法的血液检体测定的检体稀释液，上述高效液相色谱(HPLC)法使用填充了由具有离子交换基的非多孔质有机高分子粒子形成的填充剂的柱，上述检体稀释液的pH值为9.0～10.0。

Description

采用HPLC法的血液检体测定用的检体稀释液及糖化血红蛋白 的测定方法
技术领域
本发明涉及通过高效液相色谱(HPLC)法对血液检体进行测定时使用的检体稀释液、以及使用了该检体稀释液的糖化血红蛋白的测定方法。
背景技术
在通过HPLC法对血液检体进行测定时，使用了用于将血液检体预先调整为适于测定的状态的检体稀释液。
例如，在日本专利第4094776号公报(专利文献1)中记载了在对糖尿病诊断所使用的糖化血红蛋白(HbA1c)进行测定时，作为血液检体的稀释液，使用含有离液离子的溶血试剂。在专利文献1中公开了所谓溶血试剂，是与红血球相比为低渗的水溶液，所谓溶血，是红血球破裂，血色素等内容物(例如，血红蛋白类)出去到红血球外，通过使用离液离子来改善HbA1c的分离。作为进行HbA1c测定的柱，在实施例中使用了由具有阳离子交换基的填充剂形成的柱。
在WO2019/004440号公报(专利文献2)中公开了磺基与具有来源于(甲基)丙烯酸酯的单体单元和来源于二乙烯基苯的单体单元的共聚物的粒子结合了的填充剂。记载了该填充剂能够使粒径小，分离能力高，具有也适于HbA1c分析的性质。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第4094776号公报
专利文献2：WO2019/004440号公报
发明内容
发明所要解决的课题
在通过HPLC法对血液检体进行分析的情况下，有时由于反复测定，发生柱的分离能力降低、测定时的装置压力上升等问题。
近年来，在用于糖尿病诊断的采用HPLC法的分析中，要求更有效率的分析。然而，为了以更高的分离能力，更有效率地测定血液检体，如果使用专利文献2所记载那样的、填充了粒径小的填充剂的柱，则由反复测定引起的上述问题比迄今为止的柱更易于发生。
这样，有效率的血液检体的测定与在反复测定中发生的问题处于此消彼长(tradeoff)关系。因此，强烈要求可以减少在反复测定中发生的问题的方法。
用于解决课题的方法
本发明人等进行了深入研究，结果发现，在采用HPLC法测定血液检体时，作为检体稀释液，使用pH值为9.0～10.0的检体稀释液，可以解决上述课题，从而完成了本发明。
本发明涉及以下[1]～[5]的检体稀释液、和[6]～[8]的糖化血红蛋白的测定方法。
[1]一种检体稀释液，其特征在于，是在采用高效液相色谱(HPLC)法测定血液检体时使用的检体稀释液，上述高效液相色谱(HPLC)法使用填充了由具有离子交换基的非多孔质有机高分子粒子形成的填充剂的柱，上述检体稀释液的pH值为9.0～10.0。
[2]根据前项1所述的检体稀释液，检体稀释液含有包含N-环己基-2-氨基乙磺酸和N-环己基-3-氨基丙磺酸中的至少1种的缓冲剂。
[3]根据前项2所述的检体稀释液，检体稀释液中的缓冲剂为N-环己基-2-氨基乙磺酸。
[4]根据前项1～3中任一项所述的检体稀释液，具有离子交换基的非多孔质有机高分子粒子的体积平均粒径为1.5μm～3.5μm。
[5]前项1～4中任一项所述的检体稀释液，填充剂为磺基与具有来源于(甲基)丙烯酸酯的单体单元和来源于二乙烯基苯的单体单元的共聚物粒子结合了的填充剂。
[6]一种采用HPLC法测定糖化血红蛋白的测定方法，其特征在于，使用前项1～5中任一项所述的检体稀释液。
[7]根据前项6所述的糖化血红蛋白的测定方法，检体稀释液中的缓冲剂为N-环己基-2-氨基乙磺酸，作为在HPLC法中使用的洗脱液的缓冲剂，使用具有氨基和磺基的两性离子化合物。
[8]根据前项7所述的糖化血红蛋白的测定方法，具有氨基和磺基的两性离子化合物为选自2-吗啉代乙磺酸和3-吗啉代丙磺酸中的至少1种。
发明的效果
通过使用本发明的检体稀释液，在反复测定中发生的问题可以减少，可以有效率地测定血液检体。
附图说明
图1显示使用了pH9.6的检体稀释液的实施例1的糖化血红蛋白(HbA1c)的反复测定中的柱压力的变化的状况。
图2为在使用了pH9.6的检体稀释液的实施例1的HbA1c的测定中获得的色谱图。图中，1为不稳定型HbA1c的峰，2为稳定型HbA1c的峰。
图3显示使用了pH9.6的检体稀释液的实施例1的HbA1c的测定结果。
图4显示使用了pH7.0的检体稀释液的比较例1的HbA1c的反复测定中的柱压力的变化的状况。
图5为在使用了pH10.5的检体稀释液的比较例2的HbA1c的反复测定中获得的色谱图。图中，1为不稳定型HbA1c的峰，2为稳定型HbA1c的峰。
图6为显示将HPLC用测定试样利用动态光散射法进行了测定时的、pH与HPLC用测定试样中的粒径尺寸的关系的图。
图7为显示使用了不添加CHES而制作的检体稀释液的、将HPLC用测定试样利用动态光散射法进行了测定时的、pH与HPLC用测定试样中的粒径尺寸的关系的图。
具体实施方式
以下显示实施方式详细地说明本发明。
本实施方式中的血液检体是指从哺乳动物、特别是人的体内取得的液体，是指在健康诊断等中采取到小药瓶(vial)等容器中的物质。
在本说明书中，将加入了检体稀释液的血液检体称为HPLC用测定试样。检体稀释液相对于血液检体以体积比计为50～200倍的比例加入。优选为80～150倍的比例，更优选为90～110倍的比例。血液检体可以在采取同时用检体稀释液进行稀释，也可以在某个操作后加入检体稀释液。
检体稀释液为了稳定地保持其pH值，可以包含缓冲剂。作为缓冲剂，可举出例如磷酸、乙酸、甲酸、碳酸、胺化合物、和它们的盐、以及它们的组合。磷酸系缓冲液的显示缓冲作用的pH值的范围宽，最常使用。添加了胺化合物的缓冲液也经常适合使用。作为胺化合物的例子，可举出乙醇胺、二甲基氨基乙醇、三乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、吡啶、咪唑、三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)等。此外，被称为古德的缓冲液(Good buffers)的、2-吗啉代乙磺酸(MES)、3-吗啉代丙磺酸(MOPS)、哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)(PIPES)、2-〔4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基〕乙磺酸(HEPES)、2-羟基-3-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(HEPSO)、3-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(EPPS)、N,N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸(ACES)、N-(2-乙酰胺)亚氨基二乙酸(ADA)、N-〔三(羟基甲基)甲基〕-2-氨基乙磺酸(TES)、N-三(羟基甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)等两性离子化合物也适合使用。它们之中，从在本发明的检体稀释液所要求的pH值区域具有缓冲能力考虑，CHES、CAPS更适合使用。在采用使用应用了粒径小的填充剂的柱的HPLC法的测定中，在抑制由反复使用引起的柱压上升方面，CHES是最优选的。
在检体稀释液中，除了这些成分以外，根据需要可以包含表面活性剂、水溶性的有机溶剂、防腐剂、抗凝固剂、和其它盐。作为表面活性剂的例子，可举出Triton(注册商标)X-100、Tween(注册商标)20、Tween(注册商标)80、十二烷基苯磺酸钠等。作为添加的表面活性剂，更优选为Triton(注册商标)X-100。作为水溶性的有机溶剂的例子，可举出丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇、二甘醇、二甘醇单甲基醚、二甘醇二甲基醚、二甘醇单丁基醚、乙二醇单丙基醚、乙二醇单甲基醚、丙二醇单甲基醚、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、二甲亚砜(DMSO)等。作为防腐剂，可举出叠氮化钠(NaN3)、对羟基苯甲酸酯、プロクリン300(Proclin300)等。作为抗凝固剂，可举出乙二胺四乙酸·二钠(EDTA·2Na)、乙二胺四乙酸·二钾(EDTA·2K)、乙二胺四乙酸·三钾(EDTA·3K)、氟化钠、氟化钾等。作为其它盐，作为添加的盐的种类，可举出氯化钠、氯化钾、氯化铵、溴化钠、溴化钾、溴化铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵等。
缓冲剂、盐的组合、浓度等根据目的而适当调节。在HPLC法中，注入的HPLC用测定试样的盐浓度过高是不优选的，因此通常调整为0.1mmol/L～500mmol/L的浓度。缓冲液的pH值通过公知的方法调节。例如，通过一边测定包含必要成分(缓冲剂、其它化合物)的水溶液的pH值，一边加入碱或酸来调节。
本实施方式中的检体稀释液的pH值为9.0～10.0。本发明的检体稀释液的效果在反复测定中该效果显现。例如，对血液检体使用本发明的检体稀释液而制作HPLC用测定试样，即使对该试样进行2000次～3000次反复测定，糖化血红蛋白的测定值也显示稳定的值，柱压也稳定。
与此相对，在检体稀释液的pH值小于9.0时，在反复测定中，发生柱压的上升。其结果，装置压力上升，难以送液，不能测定。这里的所谓装置压力，为在通过装置具备的压力计测定的流量1.5ml/分钟时在泵出口受到的压力。装置压力为洗脱液在配管、过滤器、柱、检测器等中流动时产生的压力。在多数情况下，柱压的上升是装置压力上升的原因。柱压的上升推测是柱中的微粒的堵塞、填充剂的污染、填充剂的变质等。
在pH值大于10.0时，出现测定结果不令人满意的影响。即，作为糖化血红蛋白的测定值，得不到正确的值。推测是因为以血液检体内的蛋白质作为中心的成分变性。
检体稀释液优选为pH9.2～9.8，pH9.4～9.7是更优选的。另外，pH值为在25℃下测定的情况下的数值。
本实施方式涉及的检体稀释液在使用HPLC法的血液检体测定中显示效果的理由的详细情况不清楚。对在血液检体中加入检体稀释液而获得的柱注入用检体进行了采用动态光散射法的分析，结果表明了根据检体稀释液的pH值，假定为柱注入用检体所含有的某种微细粒子的物质的平均直径变化。在pH9以上时，假定为被测定的粒子的物质的平均直径变小。这样的倾向在作为检体稀释液的缓冲剂使用了CHES时、使用了磷酸时都能观测到。可以认为这样的HPLC用测定试样中的微细粒子的平均直径的降低可能成为防止在进行反复测定时的装置压力的上升等问题的主要原因。
本实施方式的检体稀释液可以在采用HPLC法的血液检体的测定中适合使用。特别是，在糖化血红蛋白的测定中发挥其效果。在糖化血红蛋白测定中，测定血液检体所包含的红血球中的血红蛋白类。糖化血红蛋白的测定作为糖尿病等的诊断指标而一般被广泛使用。因此，需要迅速测定大量血液检体。为了迅速测定大量检体，期望能够进行更多反复测定。
通过这样的情况，本发明的检体稀释液在糖化血红蛋白的测定中是特别有用的。
采用检体稀释液的血液检体的稀释，通过在血液检体中注入检体稀释液后暂时放置，或将小药瓶强制地摇动而进行。所得的柱注入用检体的适当量被注入到柱中。
作为注入HPLC用测定试样的柱的填充剂，使用了具有离子交换基的非多孔质有机高分子粒子。在分析对象作为阳离子而存在的情况下，使用具有阳离子交换基的填充剂，在分析对象作为阴离子而存在的情况下，使用了具有阴离子交换基的填充剂。在糖化血红蛋白的测定中，一般使用了具有阳离子交换基的填充剂。非多孔质有机高分子粒子在其表面基本不具有微细的细孔。具体而言，通过气体吸附法而测定的全部细孔容积相对于粒子的质量优选为0.05cm3/g以下，进一步优选为0.02cm3/g以下。基本没有微细的细孔的粒子的强度提高。此外，在使用以该粒子作为基材的填充剂进行HPLC分析的情况下，试样所包含的蛋白质等化合物不会在细孔内扩散，因此能够进行迅速的分析。
全部细孔容积可以使用カンタクローム社制Autosorb(注册商标)iQ作为装置进行测定。
为了充分获得本实施方式的检体稀释液的效果，作为填充剂的具有离子交换基的非多孔质有机高分子粒子的体积平均粒径优选为1.5μm～3.5μm。填充了上述粒径范围的填充剂的柱可以将测定对象的成分迅速并且高效率地分离。这样的优点的另一方面，使用了粒径小的填充剂的柱有时发生装置压力的上升等问题。然而，通过使用本发明的检体稀释液，可以避免这样的问题。从分离的效率与装置压力的上升的平衡的观点考虑，粒子的平均粒径更优选为2.5μm～3.2μm。
体积平均粒径是指以下粒径。即，是将填充剂粒子用粒度分布测定装置以成为2000个以上的方式摄像，从所得的二维的粒子图像(优选为静止图像)，获得各粒子的等效圆直径(具有与粒子图像的投影面积相同面积的圆的直径)。从该等效圆直径算出各粒子的体积，以算出的体积作为基准，进行平均化而获得的粒径。此时，各粒子视为具有与上述等效圆直径相同直径的球体。作为粒度分布测定装置，可以使用FPIA-3000(シスメックス株式会社制)等。
在糖化血红蛋白等血液检体中的成分的测定中，作为填充剂，更优选为专利文献2所记载的聚合物填充剂。具体而言，优选为填充了如下填充剂的柱，所述填充剂是作为离子交换基的磺基与具有来源于(甲基)丙烯酸酯的单体单元和来源于二乙烯基苯的单体单元的共聚物的粒子结合了的填充剂。这样的填充剂即使在粒径小的情况下，发生粒子本身因为使用时的柱压而变形等问题的情况也少，提供更适合的糖化血红蛋白的分析结果。另外，(甲基)丙烯酸酯是指丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯。
对上述柱更详细地说明。
上述共聚物粒子所使用的二乙烯基苯为间位和对位的异构体混合物。作为(甲基)丙烯酸酯，优选为甲基丙烯酸缩水甘油酯。在使用甲基丙烯酸缩水甘油酯的情况下，甲基丙烯酸缩水甘油酯的使用量以相对于单体合计的比例计，优选为70质量％～90质量％。共聚物粒子可以通过悬浮聚合等来制造。对于悬浮聚合，在制造多孔质有机高分子粒子时，加入稀释剂进行聚合。在制造非多孔性有机高分子的情况下，可以通过不进行稀释剂的添加而聚合来获得目标物质。
通过使磺化剂与通过聚合而获得的二乙烯基苯与甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚物粒子反应从而使磺基结合。作为磺化剂，可举出2-羟基乙磺酸钠、3-羟基丙磺酸钠、2-巯基乙磺酸钠、3-巯基丙磺酸钠、2-溴丙磺酸钠、3-溴丙磺酸钠、1,3-丙磺内酯、2,4-丁磺内酯、1,3-丁磺内酯、1,4-丁磺内酯等。磺化剂利用与在通过聚合而获得的共聚物粒子的表面存在的环氧基的反应而与基材表面结合。在这些磺化剂中，从反应的容易性考虑，优选为3-巯基丙磺酸钠、1,3-丙磺内酯，更优选为1,3-丙磺内酯。与上述共聚物粒子结合的磺基的量优选为20μmol/g～300μmol/g。
填充剂的磺基的量可以通过以下方法测定。即，在进行了真空干燥的粒子1g中加入0.5mol/L盐酸10mL使其分散，过滤后用水洗涤。由此，磺基变为酸型，获得被洗涤了的状态的粒子。接下来，在上述粒子中加入0.5mol/L氢氧化钠10mL，在设置了用于收集滤液的容器的状态下将其过滤，接着将粒子用水10mL进行洗涤。将滤液与洗涤液的混合液用0.1mol/L盐酸滴定。求出此时所需要的盐酸的摩尔数，将用氢氧化钠的摩尔数(在上述情况下，5mmol)减去所需要的盐酸的摩尔数而得的值设为磺基的量。
在本实施方式涉及的使用了HPLC用测定试样的糖化血红蛋白的HPLC测定中，为了迅速的测定而适合使用不连续梯度法(Stepgradients)。作为典型的梯度条件，可举出将洗脱液的第1液调整为pH4.0～6.0的弱酸性，将洗脱液的第2液调整为pH8.0～11.0。通过该条件可以实现短时间的糖化血红蛋白测定。
在各个梯度测定后，兼作柱的洗涤和对接下来的测定的准备，也广泛进行流动洗脱液的第3液的操作。
作为不连续梯度法所使用的洗脱液的第1液、第2液、和第3液，适当使用能达到目的物质。例如，第1液、第2液、和第3液为了稳定地保持其pH值，可以包含缓冲剂。作为缓冲剂，可举出例如磷酸、乙酸、甲酸、碳酸、胺化合物、和它们的盐、以及它们的组合。磷酸系缓冲液的显示缓冲作用的pH的范围宽，最常使用，添加了胺化合物的缓冲液也经常适合使用。作为胺化合物的例子，可举出乙醇胺、二甲基氨基乙醇、三乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、吡啶、咪唑、三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)等。此外，被称为古德的缓冲液(Good buffers)的、2-吗啉代乙磺酸(MES)、3-吗啉代丙磺酸(MOPS)、哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)(PIPES)、2-〔4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基〕乙磺酸(HEPES)、2-羟基-3-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(HEPSO)、3-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(EPPS)、N,N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸(ACES)、N-(2-乙酰胺)亚氨基二乙酸(ADA)、N-〔三(羟基甲基)甲基〕-2-氨基乙磺酸(TES)、N-三(羟基甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)等两性离子化合物也适合使用。
在洗脱液中，除了这些成分以外，根据需要可以包含表面活性剂、水溶性的有机溶剂、防腐剂、抗凝固剂、和其它盐。作为表面活性剂的例子，可举出Triton(注册商标)X-100、Tween(注册商标)20、Tween(注册商标)80、十二烷基苯磺酸钠等。作为水溶性的有机溶剂的例子，可举出丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇、二甘醇、二甘醇单甲基醚、二甘醇二甲基醚、二甘醇单丁基醚、乙二醇单丙基醚、乙二醇单甲基醚、丙二醇单甲基醚、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、二甲亚砜(DMSO)等。作为防腐剂，可举出叠氮化钠、对羟基苯甲酸酯、プロクリン300等。作为抗凝固剂，可举出乙二胺四乙酸·二钠(EDTA·2Na)、乙二胺四乙酸·二钾(EDTA·2K)、氟化钠、氟化钾等。作为其它盐，作为添加的盐的种类，可举出氯化钠、氯化钾、氯化铵、溴化钠、溴化钾、溴化铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵等。
缓冲剂、盐的组合、浓度等根据目的而适当调节。在HPLC法中，注入的HPLC用测定试样的盐浓度过高是不优选的，因此通常调整为0.1mmol/L～500mmol/L的浓度。缓冲液的pH通过公知的方法调节。例如，通过一边测定包含必要成分(缓冲剂、其它化合物)的水溶液的pH值，一边加入碱或酸来调节。
在使用了填充粒径小的填充剂的柱的HPLC法的反复测定中，可以认为优选使所使用的洗脱液的组合的化学性质没有很大差异，因为这样可以使得对柱的影响小。根据这样的推测，对于作为本发明涉及的一方案的、糖化血红蛋白的测定方法，在将CHES、或CAPS用于检体稀释液的缓冲剂的情况下，优选将与CHES、CAPS化学结构类似的、具有氨基和磺基的两性离子化合物用于不连续梯度中的洗脱液的缓冲剂。作为在各个pH时具有缓冲能力的组合，更优选第1液使用MES，第2液使用MOPS，进一步优选检体稀释液使用CHES，第1液使用MES，第2液使用MOPS。
本实施方式的HPLC用柱通过将通过上述方法而获得的阳离子交换类型的填充剂通过浆料法等公知的填充法而填充于柱来获得。
本实施方式的HPLC用柱优选壳体的材质为PEEK(聚醚醚酮)制。一般而言HPLC用柱也使用SUS制的柱，但在本发明中为了抑制血红蛋白类等血中包含的蛋白质对壳体的吸附，优选使用PEEK制的柱。在柱内设置用于不使填充剂粒子流出的滤头(frit)，但该滤头也为了抑制吸附而期望使用PEEK制、或将PEEK与PTFE(聚四氟乙烯)进行混合并烧结了的材质。
柱的长度(柱尺寸)没有特别限制，期望在短时间结束测定，因此其长度优选短，具体而言更优选为7mm以上且50mm以下，进一步优选为8mm以上且20mm以下。如果柱过短则不能实现充分的分离。另一方面，如果柱过长则分析所需要的时间变长。此外柱的粗细优选为以必要的流量向柱导入了洗脱液的情况下柱压不会过大的粗细的范围。另一方面，如果柱过粗则消耗的洗脱液的量变多，不经济。具体而言，柱的内径优选为1mm以上且10mm以下，更优选为2mm以上且6mm以下。
必要的洗脱液的流量与柱的粗细、填充剂的磺基量、填充剂的平均粒径等有关系。例如，在柱的粗细为内径4.6mm的情况下，洗脱液的流量优选为0.2mL/分钟～5.0mL/分钟，更优选为1.0mL/分钟～2.0mL/分钟。
在通过应用了本实施方式制造的填充剂的柱，测定血中的糖化血红蛋白浓度时，优选使用搭载了可以输送多种洗脱液的梯度功能的HPLC装置。作为这样的装置的例子，可举出Agilent Technology社的Infinity(注册商标)1260、株式会社岛津制作所制Prominense等。
此外，在设计成糖化血红蛋白测定专用的装置中特别适合使用。设计成糖化血红蛋白测定专用的装置被设置在医院等，广泛使用于糖尿病诊断。对于糖化血红蛋白测定专用装置，为了在尽量短时间结束1次测定，进行了柱与洗脱液的组合和梯度条件的最佳化。
实施例
＜实施例1＞
[聚合工序]
在由甲基丙烯酸缩水甘油酯(日油株式会社制)和二乙烯基苯(新日铁住金化学株式会社制，纯度99％)(甲基丙烯酸缩水甘油酯：二乙烯基苯＝82：17(质量比))构成的单体混合物50g中，添加作为聚合引发剂的过氧化月桂酰(ナカライテスク株式会社制)0.5g(相当于上述单体混合物的1质量％的量)，获得了混合物。将所得的混合物，以1％烷基二苯基醚磺酸钠水溶液500g作为水相，通过微通道悬浮装置(株式会社イーピーテック制)而制成油滴，进一步在80℃下进行15小时聚合反应，获得了共聚物粒子。
所得的粒子的平均粒径为2.7μm。
[修饰工序]
在上述共聚物粒子3g中加入2-丙醇24g和1,3-丙磺内酯(东京化成工业株式会社制)3g，加热到50℃。在其中加入8mol/L氢氧化钾水溶液1.2g，搅拌了6小时后过滤，用0.5mol/L盐酸、水、0.5mol/L氢氧化钠水溶液、水依次洗涤从而获得了具有阳离子交换基的非多孔质有机高分子粒子(填充剂粒子1)。所得的粒子的平均粒径为2.8μm。
加入0.5mol/L盐酸10mL使进行了真空干燥的1.0g填充剂粒子1分散，进行了过滤后用水洗涤，获得了磺基变为酸型的粒子。在上述粒子中加入0.5mol/L氢氧化钠10mL，在设置了用于收集滤液的容器的状态下将其过滤，接着将粒子用水10mL进行洗涤。将采取到设置的容器的滤液和洗涤液的混合液用0.1mol/L盐酸滴定。由最初使用的氢氧化钠的摩尔数(5mmol)、与滴定所需要的盐酸的摩尔数之差求出磺基的量。其结果，磺基量相对于粒子质量为200μmol/g。采用气体吸附的细孔测定(使用了カンタクローム社制Autosorb(注册商标)iQ作为装置。)的结果，细孔容积为0.01cm3/g，是非常小的值。
将填充剂粒子1填充于PEEK制的内径4.6mm、长度10mm的柱而获得了分析用柱。
[糖化血红蛋白的定量]
将上述柱与HPLC装置，Infinity1260(Agilent Technology社制)连接。检体稀释液和洗脱液以表1的浓度将各试剂溶解于水而制作。另外，使用0.1mol/L氢氧化钾水溶液将25℃下的pH值调整为表1所记载的数值。此外，将分析中的梯度条件示于表2中。洗脱液的流量为1.5mL/分钟，温度在37℃下进行。相对于全血检体的体积1，将检体稀释液以体积比计为100倍的比例加入而制作出HPLC用测定试样。注入该HPLC用测定试样5μL，进行反复测定。即使在3000次反复测定中，也观测不到压力的上升。此外，糖化血红蛋白的测定值没有大的变化。将柱压的变化的状况示于图1中。将第2000次的糖化血红蛋白的测定结果的色谱图示于图2中，将糖化血红蛋白的测定结果的变化的状况示于图3中。能够稳定地测定。
[表1]
表1
CHES：N-环己基-2-氨基乙磺酸(缓冲剂)MES：2-吗啉代乙磺酸(缓冲剂)MOPS：3-吗啉代丙磺酸(缓冲剂)EDTA·3K：乙二胺四乙酸·三钾(抗凝固剂)NaN3：叠氮化钠(防腐剂)Triton(注册商标)X-100(表面活性剂)Proclin300プロクリン300(防腐剂)Tween(注册商标)20(表面活性剂)
[表2]
表2
＜比较例1＞
使检体稀释液的pH值为7.0，除此以外，与实施例1同样地操作而进行了糖化血红蛋白的反复测定。将此时的压力的变化示于图4中。如果测定次数超过1000次则压力上升了。因此，不能再继续测定。
＜比较例2＞
使稀释液的pH值为10.5，除此以外，与实施例1同样地操作而进行了糖化血红蛋白的反复测定，结果观测到色谱图变化的现象。将第500次色谱图示于图5中。糖化血红蛋白的测定值变化，得不到正确的测定值。推测如果pH值变为10.5则发生蛋白质的变性等正是一个原因。
＜HPLC用测定试样中的粒径的测定＞
基于实施例1所使用的检体稀释液的组成，制作出pH值不同的检体稀释液。将该检体稀释液对血液检体进行处理(如上述那样，将该检体稀释液相对于血液检体的体积1以体积比计为100倍的比例加入)，获得了HPLC用测定试样。将所得的试样所含有的粒子的Z平均粒径利用动态光散射法测定。测定使用了Malvern社制Zetasizer(注册商标)nano ZSP。将测定结果示于图6中。可知如果pH变为9.0以上则HPLC用测定试样中含有的粒子的Z平均粒径平均为约20nm，显示基本恒定的小值，但如果小于9.0则Z平均粒径增大。
不知道HPLC用测定试样中的粒子来源于什么。此外，反复测定中的柱压的上升与该粒子处于何种关系是不清楚的。然而，推测pH值在特定范围正是本发明的效果出现的因素之一。
根据实施例1所使用的检体稀释液的组成，对仅除去了CHES的检体稀释液进行了同样的实验。将HPLC用测定试样中含有的粒子的Z平均粒径示于图7中。可知在不使用CHES的情况下，HPLC用测定试样中包含的粒子的Z平均粒径变大。

Claims (5)

1.一种检体稀释液，其特征在于，是在采用高效液相色谱法即HPLC法测定血液检体时使用的检体稀释液，所述高效液相色谱法使用填充了由具有离子交换基的非多孔质有机高分子粒子形成的填充剂的柱，所述检体稀释液的pH值为9.0～10.0，所述检体稀释液中的缓冲剂为N-环己基-2-氨基乙磺酸，具有离子交换基的非多孔质有机高分子粒子的体积平均粒径为1.5μm～3.5μm。
2.根据权利要求1所述的检体稀释液，填充剂为磺基与具有来源于(甲基)丙烯酸酯的单体单元和来源于二乙烯基苯的单体单元的共聚物粒子结合了的填充剂。
3.一种采用HPLC法测定糖化血红蛋白的测定方法，其特征在于，使用权利要求1或2所述的检体稀释液。
4.根据权利要求3所述的糖化血红蛋白的测定方法，作为在HPLC法中使用的洗脱液的缓冲剂，使用具有氨基和磺基的两性离子化合物。
5.根据权利要求4所述的糖化血红蛋白的测定方法，具有氨基和磺基的两性离子化合物为选自2-吗啉代乙磺酸和3-吗啉代丙磺酸中的至少1种。
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