JPH087197B2 - 液体クロマトグラフィー用充填剤とその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、クロマトグラフィー用充填剤、特に水系の
ゲル浸透クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマト
グラフィーに適した液体クロマトグラフィー用充填剤お
よびその製造法に関する。

（従来の技術） 各種物質の分離または検出に液体クロマトグラフィー
が使用され、生体試料からのタンパクの分離など、特に
親水性物質の分離には、水系のゲル浸透クロマトグラフ
ィー（以下、GPCとする）、イオン交換クロマトグラフ
ィー（以下、IECとする）などが利用されている。GPC法
は、充填剤内部の細孔に試料中の分子を拡散させると、
小さい分子は細孔内部に入り込むため溶離時間に遅れを
生じ、大きな分子から順に溶出されるという原理に基づ
いて、分離を行う方法である。他方、IEC法はイオン交
換基を有する充填剤を用い、分離対象成分イオンの充填
剤に対するイオン交換吸着性の差違によって分離する方
法である。

親水性物質を分離するための水系GPCに良く用いられ
る充填剤としては、従来からデキストランゲル、アガロ
ースゲルなどの天然高分子ゲルがある。これらのゲルは
タンパクなどの非特異的吸着が少なく優れた充填剤であ
るが、ゲルが軟質なため、耐圧性に劣り、高速処理が不
可能である。

これらの天然高分子ゲルに比べ高速処理が可能な充填
剤としては、架橋重合体ゲルからなる合成高分子系充填
剤が挙げられる。架橋重合体ゲルの素材としては、ポリ
エチレングリコールリジメタクリレート、ビニルアセテ
ート、ポリエチレングリコールジメタクリレートとヒド
ロキシエチルメタクリレートとの共重合体などがある。
上記素材でなり水系で用いられる合成高分子系充填剤
は、通常、特公昭58−45658号に開示された方法、つま
り架橋性単量体および親水性単量体に重合開始剤を加え
て懸濁重合することによって調製される。このとき、耐
圧性を向上させるには架橋度をあげる必要があるが、架
橋部分が疎水性なので、架橋度をあげるとゲルの疎水性
が増し、タンパクの非特異的吸着が生じる。このため架
橋剤量が制限され、十分な耐圧性を得ることが難しい。
さらに上記方法で得られた充填剤は、重合体粒子内の全
体に親水性単量体が分散して存在するため、水性溶媒中
では膨潤・収縮しやすく、このような理由からも耐圧性
が不充分である。

耐圧性に優れ、比較的高速処理が可能で分離能に優れ
た充填剤として、多孔性シリカゲルの表面に化学処理が
なされたシリカ系充填剤がある。しかし、このゲルは表
面の残存シラノール基の影響によりンパクなどの塩基性
基を有する物質を吸着する特性を有する。さらにシリカ
ゲルは酸およびアルカリで溶解するため、溶離液のpHが
３〜８に限定される。

IEC用充填剤として最もよく用いられているゲルに
は、スチレン−ジビニルベンゼンの架橋共重合体粒子の
表面にイオン交換基を導入したゲルおよびスチレン、ジ
ビニルベンゼンとイオン交換基を有する単量体との架橋
共重合体ゲルがある。これらのゲルにおいても、上記GP
C用ゲルと同様、架橋度が不充分であるという理由で、
あるいは、イオン交換基が粒子内部に存在するため膨潤
・収縮しやすいという理由で、耐圧性に劣る。さらに、
シリカ系の充填剤に比較して分離性能が劣る。シリカ系
IEC用充填剤は、シリカゲルの表面にイオン交換基を化
学結合させて得られる。この充填剤は、前記のように、
分離性能が良好であるが、骨格がシリカゲルであるため
上記GPC用ゲルと同様の欠点を有する。

さらに、上記水系GPCおよびIEC用充填剤に使用され
得、比較的耐圧性に優れた充填剤を得る方法として、特
開昭59−18705号、特開昭62−63856号および特開昭63−
79064号に、いわゆるシード重合法が開示されている。
これは、架橋重合体粒子に重合開始剤および単量体を含
浸させて、これをさらに懸濁重合に供し、二層構造の粒
子を得ようとする方法である。この方法において、架橋
重合体粒子に含浸させる単量体として親水性単量体を用
いれば、親水性の充填剤が得られる。しかし、得られる
粒子内部に親水性基が存在するため、上記と同様の理由
により、水系溶媒中で膨潤・収縮しやすく、従って耐圧
性はなお不充分である。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は上記従来の欠点を解決するものであり、その
目的とするところは、タンパクなどの親水性物質の分離
に適したクロマトグラフィー用充填剤であって、耐圧性
が高く、膨潤・収縮が少なく、かつタンパクなどの非特
異吸着が少ない充填剤およびその製造法を提供すること
にある。本発明の他の目的は、上記優れた性質を有し、
特にGPCおよびIECに好適な充填剤およびその製造法を提
供することにある。

（問題点を解決するための手段） 本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤は、合成有
機高分子からなる疎水性架橋重合体粒子の表面部分に合
成有機高分子からなる親水性重合体の層が形成された被
覆重合体粒子からなり、該親水性重合体の層の厚さが10
〜300Åであり、そのことにより上記目的が達成され
る。

本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤の製造法
は、重合開始剤を含浸させた合成有機高分子からなる疎
水性架橋重合体粒子を調製する工程；および該疎水性架
橋重合体粒子を分散させた水性分散液に親水性有機単量
体を添加し、該疎水性架橋重合体粒子の表面部分で該親
水性有機単量体を重合させ、該疎水性架橋重合体粒子の
表面部分に合成有機高分子からなる親水性重合体の層が
形成された被覆重合体粒子を得る工程を包含し、そのこ
とにより上記目的が達成される。

本発明に使用される合成有機高分子からなる疎水性架
橋重合体粒子の素材としては、１種の疎水性架橋性有機
単量体を単独重合して得られる疎水性架橋重合体、２種
以上の疎水性架橋性有機単量体を共重合して得られる疎
水性架橋重合体、または１種以上の疎水性架橋性有機単
量体と１種以上の疎水性非架橋性有機単量体との共重合
体が用いられる。

上記疎水性架橋性有機単量体としては、例えばエチレ
ングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレング
リコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコー
ルジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコール
ジ（メタ）アクリレートなどのジ（メタ）アクリル酸エ
ステル；テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレ
ート、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレ
ートなどの多価アルコールのポリ（メタ）アクリル酸エ
ステル；ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニ
ルキシレン、ジビニルナフタレンなどの２個以上のビニ
ル基を有する芳香族系化合物などが用いられる。上記疎
水性非架橋性有機単量体としては、疎水性の性質を有す
る非架橋性の重合性有機単量体であれば、いずれもが使
用され得る。例えばメチル（メタ）アクリレート、エチ
ル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレー
ト、イソプロピル（メタ）アクリレート、ブチル（メ
タ）アクリレート、ｔ−ブチル（メタ）アクリレートな
どの（メタ）アクリル酸エステル；酢酸ビニル；および
スチレン、メチルスチレンなどのスチレン系単量体が用
いられる。上記架橋性および非架橋性の有機単量体を混
合して用いる場合には、架橋性有機単量体が全単量体10
0重量部に対し10重量部以上、好ましくは20重量部以上
となるように使用される。

本発明において、合成有機高分子からなる疎水性架橋
重合体粒子を被覆する合成有機高分子からなる親水性重
合体に使用される親水性有機単量体は、水性分散媒中に
溶解可能な重合性単量体の中から、得られる充填剤の使
用目的に応じて選択される。例えば陽イオン交換クロマ
トグラフィーに用いる充填剤を調製する場合には、アク
リル酸、メタクリル酸、または他のカルボキシル基を有
する重合性単量体が用いられる。陰イオン交換クロマト
グラフィーに用いる充填剤を調製する場合には、ジメチ
ルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジエチルアミノ
エチル（メタ）クリレート、アリルアミン、メタクリレ
ートハイドロオキシプロピルトリメチルアンモニウムク
ロライド、メタクリレートジメチルアミノエチルトリメ
チルアンモニウムクロライドなどが用いられる。GPCに
用いる充填剤を調製する場合には、２−ヒドロキシエチ
ル（メタ）アクリレート、グリセロールモノ（メタ）ア
クリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アク
リレートなどが用いられる。

上記親水性単量体は、必要に応じて二種以上が混合し
て用いられ得る。親水性有機単量体の使用量は単量体の
種類によって異なるが合成有機高分子からなる疎水性架
橋重合体100重量部に対して５〜50重量部の割合であ
る。

本発明の方法により液体クロマトグラフィー用充填剤
を調製するには、まず、疎水性架橋重合体粒子が調製さ
れる。この疎水性架橋重合体粒子は既知の任意の水性懸
濁重合法により調製され得る。例えば、上記疎水性架橋
性単量体および必要に応じて疎水性非架橋性単量体と重
合開始剤とを希釈剤に溶解させる。単量体を希釈剤に溶
解させると、得られる重合体粒子中に希釈剤である有機
溶媒が分散して存在するため、重合終了後に有機溶媒を
除去することにより、多孔性の球状粒子が得られる。希
釈剤として上記疎水性単量体混合物と相溶性の異なる種
々の有機溶媒を使用することにより、多孔性重合体の細
孔の大きさを任意に変化させることが可能である。イオ
ン交換クロマトグラフィー用充填剤を調製する場合に
は、重合体粒子は多孔性である必要はないので、必ずし
も希釈剤を添加する必要はない。この単量体の希釈液、
または、単量体と重合開始剤とを、ポリビニルアルコー
ル、リン酸カルシウムなどの懸濁安定剤を溶解させた水
相に添加し、窒素置換後攪拌しながら40〜100℃に加熱
することにより懸濁重合を行う。

ここで用いられる重合開始剤、および得られた疎水性
架橋重合体粒子（後述）に含浸させる重合開始剤は、ラ
ジカルを発生する触媒であり、疎水性であれば特に限定
されない。例えばベンゾイルパーオキサイド、アセチル
パーオキサイド、クメンパーオキサイドなどの有機過酸
化物；アゾビスイソブチロニトリル、アゾビスイソブチ
ロアミドなどのアゾ化合物など既知のラジカル発生触媒
のいずれもが使用され得る。

希釈剤としては、上記単量体を溶解させ、かつその重
合体を溶解しない有機溶媒のいずれもが使用可能であ
る。例えば、トルエン、キシレン、ジエチルベンゼン、
ドデシルベンゼンなどの芳香族炭化水素類；ヘキサン、
ヘプタン、オクタン、デカンなどの飽和炭化水素類；イ
ソアミルアルコール、ヘキシルアルコール、オクチルア
ルコールなどのアルコール類があげられる。その使用量
は何ら限定されないが上記単量体100重量部に対して15
〜200重量部の割合であることが好ましい。

次に、得られた疎水性架橋重合体粒子に重合開始剤を
含浸させる。重合開始剤を含浸させるには、該重合開始
剤を、低沸点で、かつ疎水性架橋重合体と親和性の良い
溶媒に溶解させ、これに上記疎水性架橋重合体粒子を浸
漬する。このことにより重合開始剤が粒子中に浸透す
る。これを必要に応じて重合開始剤の分解点以下の温度
で加熱して、溶媒を留去すれば重合開始剤を疎水性架橋
重合体粒子中に含有する粒子が得られる。この重合開始
剤含有粒子を上記親水性単量体が溶解する水性分散媒中
に分散させ、あるいは、該粒子が分散する水性媒体中に
親水性単量体を添加し、溶解させて、窒素置換後攪拌下
に加熱して重合を行なう。水性分散媒には疎水性架橋重
合体の分散性を安定させるため、カルボキシメチルセル
ロース、ポリビニルアルコールなどの分散安定剤を添加
してもよい。重合の温度および時間は、反応させる親水
性単量体の種類と、重合開始剤の種類によっても異なる
が、40〜100℃で0.5〜40時間程度である。

上記重合開始剤を含浸させた架橋重合体粒子を親水性
単量体の重合反応に供する方法の他、疎水性架橋重合体
粒子の調製に引き続いて親水性単量体を反応させる連続
法によっても上記二層構造の重合体粒子が調製され得
る。この方法においては、まず、上記架橋重合体粒子を
調製するための重合反応を開始させる。重合がある程度
進行し、かつ未反応の重合開始剤が残存しているときに
上記親水性単量体を反応系に加える。このような状態に
おいては、系内の油相および生成した疎水性架橋重合体
粒子内部に重合開始剤が存在するため、引き続いて親水
性単量体の重合が起こり、しかも該疎水性架橋重合体粒
子の表面部分を被覆する形で親水性重合体の層が形成さ
れる。

上記各方法で得られた重合体粒子を熱水、有機溶媒な
どで十分洗浄し、粒子に含有されている、あるいは付着
している懸濁安定剤、溶媒、残存単量体などを除去す
る。さらに必要に応じて粒子を分級して、クロマトグラ
フィー用の充填剤が得られる。

ただし、本発明の充填剤は上記の製造方法によって得
られるものに限定されるものではない。

本発明の充填剤は、合成有機高分子からなる疎水性架
橋重合体を骨格とし、合成有機高分子からなる親水性重
合体で該疎水性架橋重合体の表面部分が被覆された２層
構造の重合体粒子である。そして、親水性重合体からな
る被覆層の平均的な厚さは、10〜300Åである。被覆層
の厚さは、後述の実施例中に記載の「被覆層の平均厚さ
の測定方法」に従って測定される。平均厚さが10Åより
小さい場合は被覆が不完全であり、疎水性架橋重合体粒
子の表面が露出している部分が生じやすい。このような
露出部分があると、被分離物質（例えば、タンパク）が
充填剤に非特異的に吸着する可能性がある。平均厚さが
300Åを越える場合は、被覆層自身の膨潤・収縮が無視
できなくなり、分析中に、充填剤の分離能が低下した
り、圧力が上昇したりする。さらに、溶離液との平衡化
に時間がかかるようになるために分析時間が長くなる
か、あるいは、分離能が低下する。

本発明の充填剤は、骨格部分に架橋度の高い合成有機
高分子からなる重合体を用いているので、機械的強度が
極めて大きく耐圧性に優れた液体クロマトグラフィー用
充填剤を得ることができる。さらに、この充填剤の骨格
部分には親水性の基が存在しないため、膨潤および収縮
の度合が極めて低い。表面は親水性の重合体で被覆され
るためタンパクなどの非特異的吸着がない。適当な親水
性単量体を選択することにより、粒子表面の親水性の度
合、イオン交換能などが調製できるので、分析あるいは
分離を目的とする親水性物質の種類に応じた所望のIEC
あるいはGPC用の充填剤が得られうる。この充填剤は広
いpH範囲において使用することが可能である。さらに、
上記のように耐圧性が大きく、膨潤・収縮の度合が極め
て低いため、粒径の微小化が図れ、その結果、高精度で
の分離が可能となる。高圧条件下での使用が可能なた
め、迅速分析がなされ得る。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

以下の実施例および比較例において得られた充填剤の
物性測定および性能評価の方法は次の通りである。

「被覆層の平均厚さの測定方法」 充填剤に用いる被覆重合体粒子をエポキシ樹脂に包埋
した後、Reichert−Jung社製ミクロトームULTRACUTEを
用いて厚さ約900Åの切片を得る。この切片を、カチオ
ン交換型充填剤は硝酸銀溶液（容量分析用、和光純薬工
業（株）製）を用いて、アニオン交換型充填剤またはGP
C用充填剤ではオスミウム酸溶液（電子顕微鏡用、和光
純薬工業（株）製）を用いて、ラベルまたは染色し、日
本電子（株）製透過型電子顕微鏡JEM100Sにて観察およ
び写真撮影を行い、親水性基の分布状態および親水性重
合体からなる被覆層の平均厚さを測定した。

「充填剤の評価方法」 IEC用充填剤については、これを内径6mmおよび長さ75
mmのステンレス製カラムに充填し、耐圧性および水に対
する膨潤性を調べた。耐圧性はカラムに精製水を流し、
流速を変えて流速と圧力損失との関係より測定した。膨
潤性は、イオン強度の異なる液を流した時のカラム圧の
変化より求めた。京都電子工業（株）製電位差自動滴定
装置AT−310により充填剤表面のイオン交換基を定量し
た。さらに、積水化学工業（株）製液体クロマトグラフ
システムSSLC−20を用いてタンパクの分離を行った。

陽イオン交換クロマトグラフィー用充填剤では、さら
に、（株）京都第一科学製Hi−AUTOA_1Cでヒト血液の分
析を行い分離能などを従来品と比較した。測定方法は次
の通りである。ヒト血液検体として、同一人（健常人）
の血液を採取後直ちにヘパリンを添加したものを用い
た。血液検体は、本装置付属の専用溶血液21L（ノニオ
ン系界面活性剤を含むリン酸緩衝液）によって、自動的
に290倍に希釈・溶血される。溶離液は本装置付属の専
用試薬であるＡ液（pH5.9のリン酸緩衝液）、Ｂ液（pH
7.2のリン酸緩衝液）およびＣ液（pH5.9のリン酸緩衝
液）を使用した。

GPC用充填剤については、これを内径7.5mmおよび長さ
500mmのステンレス製カラムに充填し、IEC用充填剤と同
様にして、耐圧性を評価した。膨潤性については、乾燥
状態と精製水に浸漬した状態の粒径の違いを、遠心沈降
式粒度分布測定装置SA−CP3（（株）島津製作所製）で
測定することにより評価した。

さらに、分子量既知の標準サンプルを用いて較正曲線
を作成し排除限界分子量（以下M Limと略す）を求め
た。GPCにおける較正曲線とは被分離物質の分子量とク
ロマトグラムにおける溶出容量との関係を表わす曲線で
あり、第１図に示すように縦軸に被分離物質（ポリマー
またはオリゴマー）の分子量（Ｍ）の対数を、横軸に溶
出容量（Ve）を目盛ったグラフ上にプロットして得られ
る曲線である。第１図で傾斜した直線の延長と縦軸に平
行な線の延長が交わる点の縦軸の値が、排除限界分子量
M Limである。較正曲線作成時の分析条件を以下に示
す。

カラム ステンレス製 内径7.5mm、 長さ 500mm 液体クロマトグラフ 積水化学工業（株）製 液体クロマトグラフシステム
SSLC−20 サンプル Sigma 社製 デキストラン 0.5％水溶液 和光純薬工業（株）製 ポリエチレングリコール 0.5％水溶液 溶離液 精製水 流速 1.0ml/分 検出器 昭和電工（株）製 示差屈折計 SE−51 各実施例のGPC用充填剤についてM Limを求めた。さら
に、50mMリン酸緩衝液を溶離液として各種タンパクのGP
C分析を行い、較正曲線を描いた。

実施例１ 疎水性架橋重合体粒子として積水化学工業（株）製ポ
リエチレン系ゲルHSG−50 200gを用い、これをベンゾ
イルパーオキサイド（重合開始剤）0.5gが溶解している
アセトン１に浸漬して該重合開始剤を含浸させた。次
に、アセトンを20℃において減圧下で留去した。１％ポ
リビニルアルコール水溶液2.5lに上記の含浸処理した疎
水性架橋重合体を懸濁させ、攪拌しながらオクタエチレ
ングリコールモノメタクリレート（親水性単量体）50g
を添加し、窒素置換後80℃で２時間重合反応を行った。
生成物を熱水およびアセトンで順次洗浄し、乾燥した。
得られた微小のポリマー粒子を日清エンジニアリング
（株）製空気分級機ターボクラシファイアTC−15Nによ
り分級して粒径が８〜10μｍの粒子を集め、GPC用充填
剤を得た。これを内径7.5mmおよび長さ500mmのステンレ
ス製カラムに充填した。充填は精製水120mlに充填剤20g
を取り10分間攪拌した後、2.0ml/分で定流量充填するこ
とにより行った。

上記の方法により耐圧性および膨潤性の評価を行っ
た。耐圧性評価においては、120kg/cm²まで圧力損失が
流速と比例した。膨潤性試験を行ったところ、乾燥状態
と精製水に浸漬した状態での粒径の違いはなく、水系溶
媒中で膨潤しないことがわかった。

充填剤を上記の方法によりオスミウム酸で染色して、
被覆層の平均厚さを測定したところ、約50Åであった。
さらに上記の評価方法に従って、較正曲線を作成した。
得られた較正曲線を第２図に示す。M Limは5.0×10⁵で
あった。ここで、第２図および後述の第４図、第５図、
第７図の較正曲線におけるプロット１〜６はデキストラ
ンサンプルを用いて得られた結果であり、デキストラン
の分子量は、それぞれ１が2000000、２が500000、３が1
00000、４が70000、５が40000、そして６が10000であ
る。プロット７〜10はポリエチレングリコールサンプル
を用いて得られた結果であり、分子量はそれぞれ、７が
10000、８が6000、９が2000、そして10が600である。

種々のタンパク（Sigma社製）の分析を行った結果、
得られた較正曲線を第３図に示す。ここで、第３図およ
び後述の第６図、第８図におけるプロット11〜20はそれ
ぞれ、11はチログロブリン（分子量660000、以下括弧内
は分子量を示す）、12はγ−グロブリン（156000）、13
は牛血清アルブミン（67000）、14はオブアルブミン（4
3000）、15はペルオキシダーゼ（40200）、16はβ−ラ
クトグロブリン（35000）、17はミオグロビン（1690
0）、18はリボヌクレアーゼＡ（13700）、19はチトクロ
ームＣ（12400）、20はグリシン４量体（246）を用いて
得られた結果である。

比較例１ 疎水性非架橋性単量体であるスチレン100g、疎水性架
橋性単量体であるジビニルベンゼン200g、親水性単量体
であるオクタエチレングリコールモノメタクリレート10
0gおよび重合開始剤であるベンゾイルパーオキサイド1g
をトルエン270gに溶解し、４％ポリビニルアルコール水
溶液2.5lに添加して、攪拌しながら調粒した後、窒素雰
囲気下で80℃に加熱し懸濁重合した。80℃で８時間重合
した後、生成物を実施例１と同様な操作により分級、充
填し評価した。

耐圧性については60kg/cm²まで圧力損失が流速と比例
した。膨潤性試験を行ったところ、平均粒径が9.2μｍ
から12.5μｍに変化し、充填剤の膨潤の度合が高いこと
がわかった。オスミウム酸染色後上記の方法により充填
剤粒子の被覆層の厚さを測定しようとしたところ、充填
剤粒子の内部にも水酸基が一様に分布していた。

較正曲線を描いてM Limを求めようとしたところ、ポ
リエチレングリコールは分子量が大きいほど溶離液への
溶解性が低くなり、充填剤の疎水性相互作用により、分
子量の大きいものが後に溶出される結果となった。得ら
れた較正曲線を第４図に示す。

実施例２ 親水性単量体として２−ヒドロキシエチルメタクリレ
ートを用いたこと以外は実施例１と同様にしてGPC用充
填剤の調製を行い、これを評価した。

耐圧性については120kg/cm²まで圧力損失と流速とが
比例した。膨潤性試験を行ったところ乾燥状態と精製水
に浸漬した状態での粒径の違いはなかった。被覆層の厚
さは、約100Åであった。M Limは、1.0×10⁵であった。
得られた較正曲線を第５図に、そしてタンパクの分析結
果を第６図に示す。

実施例３ 疎水性架橋性単量体であるジエチレングリコールジメ
タクリレート150gおよびテトラメチロールメタンテトラ
アクリレート150gと重合開始剤であるベンゾイルパーオ
キサイド1gとを希釈剤であるトルエン200gに溶解させ
た。これを４％ポリビニルアルコール水溶液2.5lに添加
して、攪拌しながら調粒した後、窒素置換下で80℃に加
熱し懸濁重合を行った。80℃で８時間重合した後、生成
物を熱水およびアセトンで順次洗浄し、乾燥して微小の
疎水性架橋重合体粒子を得た。この疎水性架橋重合体粒
子200gを用い、親水性単量体としてオクタエチレングリ
コールモノメタクリレートを用いて、実施例１に準じて
充填剤を調製し、その評価を行った。

耐圧性については100kg/cm²まで圧力損失と流速とが
比例した。膨潤性試験を行ったところ、乾燥状態と精製
水に浸漬した状態での粒径の違いはなかった。被覆層の
厚さは約100Åであった。M Limは7.0×10⁵であった。得
られた較正曲線を第７図に、そしてタンパクの分析結果
を第８図に示す。

比較例２ 疎水性架橋性単量体であるジエチレングリコールジメ
タクリレート150gおよびテトラメチロールメタンテトラ
アクリレート150g、そして親水性単量体であるオクタエ
チレングリコールモノメタクリレート75gを用いたこと
以外は比較例１と同様にして微小のポリマー粒子を得
た。得られたポリマー粒子を実施例１と同様に分級し、
充填しようとしたところ、ゲルが軟質のため充填液が流
れず、充填ができなかった。充填剤粒子の被覆層の厚さ
を測定しようとしたところ、充填剤粒子の内部に一様に
水酸基が観察された。

実施例４ 疎水性架橋性単量体としてジエチレングリコールジメ
タクリレート300gを用い、実施例３に準じて疎水性架橋
重合体を調製した。親水性単量体として陰イオン交換能
を有するジエチルアミノエチルメタクリレート50gを用
い、実施例１と同様の操作でIEC用充填剤を調製した。
前記IEC用充填剤の評価方法に従い、充填剤の評価を行
った。

その結果、耐圧性については150kg/cm²まで圧力損失
と流速とが比例した。膨潤性試験を行ったところ、溶離
液を精製水から0.5MのNaCl溶液に変えた場合、カラム圧
力の上昇は認められなかった。滴定により充填剤表面の
イオン交換能を測定したところ、0.05meq/gであった。
充填剤粒子の被覆層の厚さは、約50Åであった。さらに
積水化学工業（株）製液体クロマトグラフシステムSSLC
−20を用い、数種のタンパク（Sigma社製）の混合物の
分析を行った。溶離は、20mMピペラジンー塩酸緩衝液
（pH6.0、以下Ａ液と表す）；およびＡ液と0.5M NaCl
（pH6.0）との等量混合物（以下Ｂ液と表す）を用い、
Ａ液100％からＢ液100％へのリニアグラジエント法によ
り行った。その結果得られたクロマトグラムを第９図に
示す。第９図において、ピーク21はコナルブミン、22は
トランスフェリン、そして23はオブアルブミンに起因す
るピークである。

実施例５ 疎水性重合性単量体として疎水性非架橋性単量体であ
るスチレン100gと疎水性架橋性単量体であるジビニルベ
ンゼン200gを用い、実施例３に準じて疎水性架橋重合体
を調製した。さらに親水性単量体として陽イオン交換能
を有するアクリル酸50gを用い、実施例１と同様に操作
してIEC用充填剤を得、その評価を行った。

その結果、耐圧性については150kg/cm²まで圧力損失
と流速とが比例した。膨潤性試験を行ったところ、溶離
液を40mMのリン酸緩衝液から200mMのリン酸緩衝液に変
えた場合、カラム圧力の上昇は認められなかった。滴定
により充填剤表面のイオン交換能を定量したところ0.08
meq/gであった。充填剤を硝酸銀溶液で処理して上記の
方法にしたがって被覆層の厚さを測定したところ、約80
Åであった。さらに積水化学工業（株）製液体クロマト
グラフシステムSSLC−20を用い、数種のタンパク（Sigm
a社製）の混合物の分析を行った。溶離は、50mMリン酸
緩衝液（pH7.0、以下Ａ液と表す）；およびＡ液と500mM
NaCl（pH7.0）との等量混合物（以下Ｂ液と表す）を用
い、Ａ液100％からＢ液100％へのリニアグラジエント法
により行った。その結果得られたクロマトグラムを第10
図に示す。第10図および後述の第12図、第14図、第16図
において、ピーク24はミオグロビン（ウマ骨格由来）、
25はα−キモトリプシノーゲン（ウシ膵臓由来）、26は
リボヌクリレアーゼＡ（ウシ膵臓由来）、そして27はリ
ゾチーム（ニワトリ卵白由来）に起因するピークであ
る。さらに（株）京都第一科学製Hi−AUTO A_1Cでヒト血
液の分析を行った。その結果得られたクロマトグラフを
第11図に示す。第11図および後述の第13図、第15図にお
いて、28はHbA_1aおよびA_1b、29は胎児性Hb（Ｆ）、30は
不安定型HbA_1C、31は安定型HbA_1C、そして32はHbA₀に起
因するピークである。

実施例６ 疎水性架橋性単量体としてジエチレングリコールジメ
タクリレート300g・そして希釈剤としてトルエンに代え
てイソアミルアルコール200gを用い、実施例３に準じて
疎水性架橋重合体粒子を調製した。さらに、親水性単量
体として陽イオン交換能を有するメタクリル酸50gを用
い、実施例１と同様の操作法によりIEC用充填剤を調製
した。

実施例５と同様の評価を行った結果、耐圧性について
は150kg/cm²まで圧力損失と流速とが比例した。膨潤性
試験を行ったところ、溶離液を40mMのリン酸緩衝液から
200mMのリン酸緩衝液に変えた場合、カラム圧力の上昇
は認められなかった。滴定により測定した充填剤表面の
イオン交換能は、0.05meq/gであった。充填剤粒子を硝
酸銀溶液で処理して測定された被覆層の厚さは、約100
Åであった。さらに積水化学工業（株）製液体クロマト
グラフSSLC−20を用いてタンパクの分離を行った。その
結果得られたクロマトグラムを第12図に示す。さらに
（株）京都第一科学製Hi−AUTO A_1Cでヒト血液の分析を
行った。その結果得られたクロマトグラムを第13図に示
す。

実施例７ この実施例では、疎水性架橋重合体粒子の調製に続い
て親水性単量体を反応させる連続した重合法を採用し
た。

疎水性非架橋性単量体としてスチレン100g、疎水性架
橋性単量体としてジビニルベンゼン200gおよびベンゾイ
ルパーオキサイド1gをトルエン200gに溶解し、４％ポリ
ビニルアルコール水溶液2.5lに添加して、攪拌しながら
調粒した後、窒素置換下で80℃に加熱し懸濁重合を行っ
た。80℃で２時間重合した後、アクリル酸50gを添加
し、さらに80℃で２時間重合し生成物を熱水およびアセ
トンで順次洗浄し、乾燥し、分級した。得られた微小の
ポリマー粒子を実施例５と同様の方法で評価した。

耐圧性については150kg/cm²まで圧力損失と流速とが
比例した。膨潤性試験を行ったところ、溶離液を40mMの
リン酸緩衝液から200mMのリン酸緩衝液に変えた場合、
カラム圧力の上昇は認められなかった。滴定により充填
剤表面のイオン交換能を測定したところ、0.07meq/gで
あった。被覆層の厚さは、約80Åであった。積水化学工
業（株）製液体クロマトグラフSSLC−20を用いてタンパ
クの分離を行った。その結果得られたクロマトグラムは
第10図と同様であった。さらに、（株）京都第一科学製
Hi−AUTO A_1Cでヒト血液の分析を行った。その結果得ら
れたクロマトグラムは第11図と同様であった。

比較例３ 親水性単量体としてアクリル酸150gを用いたこと以外
は比較例１と同様の操作でIEC用充填剤を調製した。

実施例５と同様の評価を行った結果、耐圧性について
は80kg/cm²まで圧力損失と流速とが比例した。膨潤性試
験を行ったところ、溶離液を40mMのリン酸緩衝液から20
0mMのリン酸緩衝液に変えた場合、カラム圧力が20kg/cm
²上昇した。このように実施例５の充填剤に比較して耐
圧性および耐膨潤性が劣ることが明らかである。硝酸銀
溶液で処理して充填剤粒子の被覆層の厚さを測定しよう
としたとろこ、充填剤粒子の内部にもカルボキシル基が
存在していることがわかった。積水化学工業（株）製液
体クロマトグラフSSLC−20を用いてタンパクの分離を行
った。その結果得られたクロマトグラムを第14図に示
す。さらに、（株）京都第一科学製 Hi−AUTO A_1Cでヒ
ト血液の分析を行った。その結果得られたクロマトグラ
フを第15図に示す。第14図および第15図の結果を、第10
図および第11図と比較すると、明らかに充填剤のタンパ
クおよび糖化ヘモグロビンに対する保持力が弱く、分離
能が劣っていることが明らかである。

比較例４ 疎水性重合性単量体として疎水性非架橋性単量体であ
るスチレン100gと疎水性架橋性単量体であるジビニルベ
ンゼン200gを用い、実施例３に準じて疎水性架橋重合体
を調製した。さらに親水性単量体として陽イオン交換能
を有するアクリル酸300gを用い、実施例１と同様に重合
したところ、反応中に凝集が起こり、軟質の微小ポリマ
ー粒子が得られた。このポリマー粒子を実施例１と同様
に分級し、充填しようとしたところ、粒子が軟質なため
充填液が流れず充填することができなかった。硝酸銀溶
液て処理後充填剤粒子の被覆層の厚さは、約400Åあっ
た。

比較例５ 疎水性重合性単量体として疎水性非架橋性単量体であ
るスチレン100gと疎水性架橋性単量体であるジビニルベ
ンゼン200gを用い、実施例３に準じて疎水性架橋重合体
を調製した。さらに親水性単量体として陽イオン交換能
を有するアクリル酸10gを用い、実施例１と同様に操作
してIEC用充填剤を得、その評価を行った。

その結果、耐圧性については150kg/cm²まで圧力損失
と流速が比例した。膨潤性試験を行ったところ、溶離液
を40mMのリン酸緩衝液から200mMのリン酸緩衝液に変え
た場合、カラム圧力の上昇は認められなかった。滴定に
より充填剤表面のイオン交換能を定量したところ0.005m
eq/gであった。充填剤を硝酸銀溶液で処理して上記の方
法にしたがって被覆層の厚さを測定したところ、約８Å
であり、表面の１部に被覆されていない箇所が観察され
た。

さらに積水化学工業（株）製液体クロマトグラフSSLC
−20を用い、数種のタンパク（Sigma社製）の混合物の
分析を行った。その結果得られたクロマトグラムを第16
図に示す。溶出の順序が第10図と異なるのは、非被覆層
部分とタンパクとの間に疎水性相互作用が生じるためと
考えられる。

（発明の効果） 本発明によれば、このように、耐圧性に優れ、かつ膨潤
・収縮が少なく、タンパクの非特異的吸着がない水系の
液体クロマトグラフィー用充填剤が得られる。このよう
な充填剤は、GPC用あるいはIEC用の充填剤として各種親
水性物質の単離もしくは分析に広範囲で利用され得る。

【図面の簡単な説明】

第１図はゲル浸透クロマトグラフィーにおいて被分離物
質の分子量と溶離液の溶出容量との関係を表す較正曲線
である。 第２図、第４図、第５図および第７図はそれぞれ実施例
１、比較例１、実施例２および実施例３で得られた充填
剤をカラムに充填し、GPC分析を行ったときの較正曲線
を示す。 第３図、第６図および第８図はそれぞれ実施例１、２お
よび３で得られた充填剤をカラムに充填し、タンパクの
分離を行ったときの較正曲線を示す。 第９図は実施例４で得られた充填剤を充填したカラムを
用いてタンパクの分離を行ったときに得られたクロマト
グラムを示す。 第10図、第12図、第14図および第16図は、それぞれ実施
例５、実施例６、比較例３および比較例５で得られた充
填剤を充填したカラムを用いてタンパクの分析を行った
時に得られたクロマトグラムを示す。 第11図、第13図および第15図は、それぞれ実施例５、実
施例６および比較例３で得られた充填剤を充填したカラ
ムを用いて血液の分析を行った時に得られたクロマトグ
ラムを示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】合成有機高分子からなる疎水性架橋重合体
   粒子の表面部分に合成有機高分子からなる親水性重合体
   の層が形成された被覆重合体粒子からなり、 該親水性重合体の層の厚さが10〜300Åである、液体ク
   ロマトグラフィー用充填剤。
2. 【請求項２】液体クロマトグラフィー用充填剤の製造法
   であって、 重合開始剤を含浸させた合成有機高分子からなる疎水性
   架橋重合体粒子を調製する工程；および 該疎水性架橋重合体粒子を分散させた水性分散液に親水
   性有機単量体を添加し、該疎水性架橋重合体粒子の表面
   部分で該親水性有機単量体を重合させ、該疎水性架橋重
   合体粒子の表面部分に合成有機高分子からなる親水性重
   合体の層が形成された被覆重合体粒子を得る工程； を包含する液体クロマトグラフィー用充填剤の製造法。