WO2007063701A1 - 親水性高分子微粒子、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤及びイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法 - Google Patents

親水性高分子微粒子、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤及びイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2007063701A1
WO2007063701A1 PCT/JP2006/322670 JP2006322670W WO2007063701A1 WO 2007063701 A1 WO2007063701 A1 WO 2007063701A1 JP 2006322670 W JP2006322670 W JP 2006322670W WO 2007063701 A1 WO2007063701 A1 WO 2007063701A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
liquid chromatography
ion exchange
exchange liquid
water
packing material
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/322670
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Takuya Yotani
Makoto Takahara
Original Assignee
Sekisui Chemical Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP2006110221A external-priority patent/JP3990713B2/ja
Priority claimed from JP2006123569A external-priority patent/JP3984633B2/ja
Priority claimed from JP2006158422A external-priority patent/JP2007326935A/ja
Priority claimed from JP2006158421A external-priority patent/JP2007327821A/ja
Application filed by Sekisui Chemical Co., Ltd. filed Critical Sekisui Chemical Co., Ltd.
Priority to US12/085,936 priority Critical patent/US7811453B2/en
Priority to EP06832626A priority patent/EP1955764A4/en
Priority to CN2006800326033A priority patent/CN101257969B/zh
Publication of WO2007063701A1 publication Critical patent/WO2007063701A1/ja
Priority to US12/875,283 priority patent/US8968562B2/en

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B01D15/362—Cation-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B01J20/26—Synthetic macromolecular compounds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B01J20/26—Synthetic macromolecular compounds
    • B01J20/264—Synthetic macromolecular compounds derived from different types of monomers, e.g. linear or branched copolymers, block copolymers, graft copolymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J39/00—Cation exchange; Use of material as cation exchangers; Treatment of material for improving the cation exchange properties
    • B01J39/04—Processes using organic exchangers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J39/00—Cation exchange; Use of material as cation exchangers; Treatment of material for improving the cation exchange properties
    • B01J39/26—Cation exchangers for chromatographic processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F20/00—Homopolymers and copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride, ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F20/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms, Derivatives thereof
    • C08F20/10—Esters
    • C08F20/20—Esters of polyhydric alcohols or polyhydric phenols, e.g. 2-hydroxyethyl (meth)acrylate or glycerol mono-(meth)acrylate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F222/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and at least one being terminated by a carboxyl radical and containing at least one other carboxyl radical in the molecule; Salts, anhydrides, esters, amides, imides, or nitriles thereof
    • C08F222/10—Esters
    • C08F222/1006—Esters of polyhydric alcohols or polyhydric phenols
    • C08F222/102—Esters of polyhydric alcohols or polyhydric phenols of dialcohols, e.g. ethylene glycol di(meth)acrylate or 1,4-butanediol dimethacrylate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/54—Sorbents specially adapted for analytical or investigative chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/58—Use in a single column
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/10—Esters
    • C08F220/26—Esters containing oxygen in addition to the carboxy oxygen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/52—Amides or imides
    • C08F220/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F220/58—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing oxygen in addition to the carbonamido oxygen, e.g. N-methylolacrylamide, N-(meth)acryloylmorpholine
    • C08F220/585—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing oxygen in addition to the carbonamido oxygen, e.g. N-methylolacrylamide, N-(meth)acryloylmorpholine and containing other heteroatoms, e.g. 2-acrylamido-2-methylpropane sulfonic acid [AMPS]

Definitions

  • Hydrophilic polymer fine particles packing material for ion exchange liquid chromatography, and method for producing packing material for ion exchange liquid chromatography
  • the present invention relates to an ion exchange liquid that can suppress swelling in an aqueous medium and can effectively suppress nonspecific adsorption of hydrophilic polymer fine particles, proteins and the like that are excellent in dispersibility in an aqueous medium.
  • a packing material for ion exchange liquid chromatography manufactured using the method for manufacturing a packing material for ion exchange liquid chromatography, and a packing material for ion exchange liquid chromatography for analysis of sugar hemoglobin.
  • Submicron Force Micron-sized polymer fine particles are used in a wide variety of fields such as organic pigments, toner particles, spacers for liquid crystals, latex fine particles, and fillers for ion-exchange liquid chromatography.
  • fields such as organic pigments, toner particles, spacers for liquid crystals, latex fine particles, and fillers for ion-exchange liquid chromatography.
  • application to packing materials for ion exchange liquid chromatography has attracted attention in recent years.
  • the ion exchange liquid chromatography method is known as an extremely effective method for separation and analysis of various biological substances.
  • it has been attracting attention as a method for analyzing glycated hemoglobins (hereinafter also referred to as hemoglobin Ale).
  • Hemoglobin Ale is a chemical combination of sugar in the blood and the ⁇ chain ⁇ end of hemoglobin, and the proportion of hemoglobin Ale in hemoglobin, that is, the total of hemoglobin Ale and non-sugar hemoglobin.
  • the ratio of hemoglobin Ale to is said to reflect the average blood glucose level over a period of 1 to 2 months. Therefore, the hemoglobin Ale value (%), which represents the proportion of hemoglobin Ale, has come to be widely used as an index for diagnosis of diabetes instead of blood glucose level, which can vary greatly temporarily! .
  • the fine particles using a hydrophobic crosslinkable monomer have a problem that the surface is highly hydrophobic, and thus the dispersibility in an aqueous medium is poor. Further, when such fine particles are used as a packing material for liquid chromatography, there is a problem that nonspecific adsorption occurs when a biological sample such as protein is brought into contact with the fine particles.
  • Examples of the method for increasing the hydrophilicity of the filler for ion exchange liquid chromatography include a method of containing a large amount of hydrophilic monomer in the fine particle portion of the base material of the filler for ion exchange liquid chromatography.
  • a compound in which an ion exchange group is introduced into a base that also has a silica-based compound power, or an ion exchange group-containing compound in a crosslinkable particle made of an organic synthetic polymer Those obtained by reacting (Patent Document 1, etc.) are known. Also known are those obtained by reacting a crosslinkable monomer and an ion exchange group-containing compound (Patent Document 2, etc.).
  • Patent Document 3 discloses a hydrophilic polymer layer on the surface of hydrophobic crosslinked polymer fine particles. Formed coated polymer microparticles are disclosed. Hydrophobic crosslinked polymer fine particles have high mechanical strength because they are strongly crosslinked by the constituent hydrophobic crosslinking monomers.
  • Swelling can be suppressed.
  • the thickness of the formed hydrophilic polymer layer to 1 to 30 nm, the non-specific adsorption of the analyte and the like is prevented, and the hydrophilic polymer layer is maintained while maintaining the hydrophilic property. It is possible to suppress swelling due to.
  • Patent Document 4 the surface of the filler particles having an ion exchange group is subjected to a hydrophilic treatment. Specifically, the surface of the filler particles having an ion exchange group has a hydrophilic group such as a protein.
  • a packing material for ion exchange liquid chromatography that has been made hydrophilic by adsorbing a compound is disclosed. In such a packing material for ion exchange liquid chromatography, the substrate does not swell or shrink, while non-specific adsorption of proteins and the like can be effectively prevented by the hydrophilic surface.
  • Patent Document 1 JP-A-1-262468
  • Patent Document 2 Japanese Patent Publication No. 63-59463
  • Patent Document 3 Japanese Patent Publication No. 8-7197
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-91505
  • the present invention suppresses swelling in an aqueous medium and is effective against an aqueous medium.
  • Hydrophilic polymer fine particles with excellent dispersibility packing material for ion exchange liquid chromatography capable of effectively suppressing non-specific adsorption of proteins, etc., and sugar gel using the packing material for ion exchange liquid chromatography
  • a method for producing a packing material for ion exchange liquid chromatography capable of maintaining the suppression effects such as swelling and nonspecific adsorption over a long period of time and a method for producing the packing material for ion exchange liquid chromatography It is an object of the present invention to provide a packing material for ion exchange liquid chromatography and a packing material for ion exchange liquid chromatography for analyzing hemoglobin.
  • the present invention is to disperse each in water and acetone, irradiate with ultrasonic waves for 15 minutes, let stand for 24 hours at 25 ° C to equilibrate, and then measure the particle size with a particle size distribution analyzer.
  • a particle size distribution analyzer Of the particle diameter D when dispersed in water and the particle diameter D when dispersed in acetone.
  • Ratio D ZD is 2.0 or less, and the hydrophilic polymer fine particles are arranged in a single layer without gaps.
  • hydrophilic fine polymer particle in which pure water droplets are formed and the contact angle of water measured by a contact angle meter at 25 ° C is 70 ° or less.
  • the present invention also relates to a packing material for ion exchange liquid chromatography, which is made up of substrate fine particles and ion exchange groups present on the surface of the substrate fine particles, each dispersed in water and acetone, and ultrasonic After being allowed to equilibrate for 24 hours at 25 ° C, the particle size was measured with a particle size distribution analyzer. When dispersed in water, the particle size was dispersed in D and acetone. The ratio of particle diameter D to D DD is 2.0 or less, and
  • the ion exchange liquid chromatography packing material is arranged in a single layer without any gaps, and droplets of pure water are formed.
  • the contact angle of water measured by a contact angle meter at 25 ° C is 60 ° or less. It is a packing material for ion exchange liquid chromatography.
  • the present invention is a packing material for ion exchange liquid chromatography having an ion exchange group, a water contact angle of 60 ° or less, and a surface coated with a hydrophilic compound. is there.
  • the present invention provides an ion comprising a hydrophobic crosslinked polymer particle made of a synthetic organic polymer and a hydrophilic polymer force layer having an ion exchange group copolymerized on the surface of the hydrophobic crosslinked polymer particle.
  • a packing material for exchange liquid chromatography the outermost surface of which is hydrophilized with ozone water.
  • the present invention provides a packing material for ion exchange liquid chromatography, which has a hydrophilization step of hydrophilizing the surface of the packing material particles having ion exchange groups by washing with ozone water having a dissolved ozone gas concentration of 20 ppm or more.
  • a method for producing a packing material for ion exchange liquid chromatography wherein the treatment by the accelerated oxidation method is performed during the hydrophilization step.
  • the present inventors have determined that the polymer fine particle D ZD (hereinafter also referred to as the degree of swelling)
  • the hydrophilic polymer fine particles of the present invention are each dispersed in water and acetone, irradiated with ultrasonic waves for 15 minutes, allowed to equilibrate for 240 hours at 25 ° C, and then measured by a particle size distribution analyzer. When each particle size was measured, it was dispersed in water with the particle size D when dispersed in water and acetone.
  • the ratio D / ⁇ to the particle diameter D is 2.0.
  • D ZD D ZD
  • the preferred lower limit is 1.0 and the preferred upper limit is 1.8.
  • the particle size distribution measuring instrument is not particularly limited, and for example, Accusizer780 (Particle
  • the hydrophilic polymer fine particles of the present invention comprise pure water droplets formed on the hydrophilic polymer fine particles arranged in a single layer without gaps, and a contact angle meter at 25 ° C.
  • the contact angle of water measured by (1) is 70 ° or less.
  • Contact angle measurement is a method for evaluating the hydrophilicity and hydrophobicity of surfaces, including polymer materials. Used. The smaller the water contact angle, the higher the hydrophilicity, and in the present invention
  • the hydrophilicity is greatly improved, the dispersibility in water is improved, and when the hydrophilic polymer fine particles of the present invention are used as a packing material for liquid chromatography. Even when a biological sample such as protein is brought into contact, non-specific adsorption hardly occurs. In addition, when used in water-based paints, the dispersibility is good, so that the workability of painting is improved.
  • a preferred upper limit is 60 °.
  • contact angle meter for example, Kyowa Interface Science Co., can be used an automatic contact angle meter, such as Dropma S ter500.
  • the contact angle of water is measured by using a contact angle meter as described above, such as the method of determining the angle force contact angle ( ⁇ Z2 method) on the solid surface of the straight line connecting the left and right end points and the vertex of the droplet. Specifically, the following methods can be mentioned.
  • the hydrophilic polymer fine particles are fixed on the top.
  • the hydrophilic polymer fine particles of the present invention are hardly swollen even in an aqueous medium when the degree of swelling satisfies the above range, and the dispersibility in the aqueous medium is excellent when the contact angle of water satisfies the above range. It will be a thing.
  • hydrophilic polymer fine particles satisfying the range of the swelling degree and the range of the contact angle of water include, for example, a hydrophobic crosslinkable monomer having a water solubility of 5% by weight or less and examples of such fine particles include a hydrophobic cross-linked polymer force which is a hydrophobic or non-crosslinkable monomer force, and a hydrophilic treatment is applied to the outermost surface.
  • the hydrophobic crosslinked polymer is a hydrophobic crosslinked polymer obtained by homopolymerizing one kind of hydrophobic crosslinkable monomer having a water solubility of 5% by weight or less (for example, ethylene glycol dimethacrylate).
  • Rate independent polymer polymer consisting of dibutylbenzene alone, etc .
  • 2 or more Hydrophobic cross-linked polymer obtained by copolymerizing a hydrophobic cross-linkable monomer having a water solubility of 5% by weight or less for example, composed of ethylene glycol dimethaacrylate and trimethylolpropantrimethacrylate) Copolymer, dibutylbenzene and dibutyltoluene copolymer, etc.
  • hydrophobic crosslinkable monomer having at least one water solubility of 5% by weight or less and at least one water solubility of 5
  • Hydrophobic crosslinked polymer obtained by copolymerization with a hydrophobic non-crosslinkable monomer having a weight percentage of less than or equal to for example, composed of ethylene glycol dimethacrylate, trimethylolpropane trimetaacrylate and butyl methacrylate
  • the hydrophobic crosslinkable monomer having a water solubility of 5% by weight or less is not particularly limited as long as it has two or more vinyl groups in one monomer molecule.
  • Di (meth) acrylic acid esters such as di (meth) acrylate, polyethylene glycol di (meth) acrylate, propylene glycol di (meth) acrylate, polypropylene glycol di (meth) acrylate; tetramethylol methane tri (meth) Tri (meth) acrylic acid esters or tetra (meth) acrylic acid esters such as attalylate, trimethylolpropane tri (meth) acrylate, tetramethylol methane tetra (meth) acrylate, etc .; , Aromatic compounds such as dibulanaphthalene, etc.
  • water solubility refers to the amount of monomer dissolved in water after adding 20 mL of monomer to 10 mL of water, stirring at room temperature for 10 minutes x 3 times, and leaving overnight in a 20 ° C incubator. This is the value calculated by measuring by double bond (PSDB) method using hydrogen flame gas chromatography.
  • PSDB double bond
  • the hydrophobic non-crosslinkable monomer having a water solubility of 5% by weight or less is not particularly limited as long as it is a non-crosslinkable polymerizable organic monomer having a hydrophobic property.
  • (Meth) acrylic such as methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, propyl (meth) acrylate, isopropyl (meth) acrylate, butyl (meth) acrylate, t-butyl (meth) acrylate Acid esters; styrene monomers such as styrene and methylstyrene
  • the hydrophobic crosslinked polymer is a co-polymer of the hydrophobic crosslinkable monomer having a water solubility of 5% by weight or less and the hydrophobic non-crosslinkable monomer having a water solubility of 5% by weight or less. Consisting of polymerization In this case, the amount of the hydrophobic non-crosslinkable monomer having a water solubility of 5% by weight or less is 50 parts by weight based on 100 parts by weight of the hydrophobic crosslinkable monomer having a water solubility of 5% by weight or less. It is preferable that it is below the weight part.
  • the method for hydrophilizing the outermost surface is not particularly limited.
  • the surface of the polymer fine particles is treated with ozone water, ozone gas, plasma, corona, hydrogen peroxide, sodium hypochlorite.
  • Hydrophilic compounds such as proteins, polysaccharides, and other biologically-derived hydrophilic compounds such as proteins and polysaccharides, and polybulal alcohol, polybulurpyrrolidone, polyacrylic acid, phospholipid polymers, etc.
  • a method of physically adsorbing or chemically bonding the functional polymer compound to the surface of the polymer fine particles is not particularly limited.
  • the surface of the polymer fine particles is treated with ozone water, ozone gas, plasma, corona, hydrogen peroxide, sodium hypochlorite.
  • Hydrophilic compounds such as proteins, polysaccharides, and other biologically-derived hydrophilic compounds such as proteins and polysaccharides, and polybulal alcohol, polybulurpyrrolidone, polyacrylic acid,
  • ozone water treatment is preferable in consideration of workability during preparation, Lot management, maintenance of performance over time, and the like.
  • the ozone water means one in which ozone gas is dissolved in water.
  • ozone Although ozone has a strong oxidizing action, it is very difficult to apply a hydrophilization treatment with ozone gas by uniformly oxidizing the surface of the polymer particles.
  • the surface of the polymer fine particles can be easily oxidized and subjected to a hydrophilic treatment simply by dispersing the polymer fine particles in the ozone water.
  • the hydrophobic structure is oxidized, and hydrophilic groups (such as OH, —CHO, —COOH, etc.) are generated.
  • the concentration of the dissolved ozone gas in the ozone water is not particularly limited, but the lower limit is preferably 20 ppm. If it is less than 20 ppm, the hydrophilization process takes time, or the hydrophilization process is not performed sufficiently, and the non-specific adsorption of the measurement target substance etc. is sufficient when the polymer microparticles are used as a packing material for liquid chromatography. There is a force that cannot be suppressed. A more preferred lower limit is 50 ppm. There is no particular upper limit for the concentration.
  • the method for preparing the ozone water is not particularly limited.
  • raw water and ozone gas are allowed to pass through only gas and permeate liquid.
  • membrane to prevent is mentioned.
  • the accelerated oxidation treatment method is a method that enhances the oxidizing action of ozone water.
  • V or use two or more together.
  • the decomposition of dissolved ozone is promoted, and the amount of hydroxy radicals generated by the decomposition of ozone is increased. Since the hydroxy radicals thus generated have a higher acid scent than ozone, the effect of the hydrophilization treatment can be further enhanced.
  • the above accelerated oxidation treatment method it becomes possible to further promote the formation of hydrophilic groups (mono-OH, —CHO, —COOH, etc.) on the surface of the polymer fine particles.
  • the average particle size of the hydrophilic polymer fine particles of the present invention is not particularly limited, and can be applied to a particle size according to the purpose.
  • the particle size distribution (CV value) of the hydrophilic polymer fine particles of the present invention is not particularly limited, but a preferred upper limit is 40%. Above 40%, it is not practical. A more preferred upper limit is 15%.
  • the packing material for ion-exchange liquid chromatography of the present invention is a packing material for ion-exchange liquid chromatography comprising a substrate fine particle and an ion-exchange group present on the surface of the substrate particle,
  • a particle size distribution analyzer When the particle size is measured by a particle size distribution analyzer after being irradiated for 24 minutes at 25 ° C and allowed to equilibrate for 240 hours, when dispersed in water.
  • the ratio D / ⁇ is 2.0 or less and the packing for ion exchange liquid chromatography
  • the contact angle force of water measured by a contact angle meter under a condition of 25 ° C. is less than or equal to 1 ⁇ 20 °.
  • the ion-exchange liquid chromatography according to the present invention which can suppress swelling in an aqueous medium and effectively suppress nonspecific adsorption of proteins and the like. Has been completed.
  • the packing material for ion-exchange liquid chromatography of the present invention is dispersed in water and acetone, irradiated with ultrasonic waves for 15 minutes, allowed to equilibrate for 240 hours at 25 ° C, and then the particle size distribution.
  • the particle diameter is measured with a measuring instrument, the upper limit of the ratio D / ⁇ between the particle diameter D when dispersed in water and the particle diameter D when dispersed in acetone is 2.0.
  • packing materials for ion exchange liquid chromatography tend to shrink in an organic solvent and swell to any degree in an aqueous medium. Therefore, if the degree of swelling in the aqueous medium is large, D / ⁇ increases. Conversely, if the degree of swelling in the aqueous medium is small, D / ⁇
  • the preferred lower limit is 1.0, and the preferred upper limit is 1.8.
  • the particle size distribution measuring device is not particularly limited, and examples thereof include Accusizer780 (manufactured by Particle Sizing Systems).
  • the packing material for ion-exchange liquid chromatography of the present invention has pure water droplets formed on a single layer after the packing materials for ion-exchange liquid chromatography are arranged without gaps at 25 ° C.
  • the upper limit of the contact angle of water measured with a contact angle meter under the above conditions is 60 °.
  • Contact angle measurement is used as a method for evaluating the hydrophilicity and hydrophobicity of surfaces including polymer materials.
  • the upper limit is set to 60 °, so that the hydrophilicity is greatly improved and non-specific when a biological sample such as protein is brought into contact with it. Little adsorption.
  • a more preferred upper limit is 50 °.
  • the contact angle of water can be measured by the same method using the same contact angle meter as in the case of the hydrophilic polymer fine particles of the present invention.
  • the packing material for ion-exchange liquid chromatography of the present invention is such that the degree of swelling satisfies the above range, so that it hardly swells even in an aqueous medium, and when the water contact angle satisfies the above range, Even when a biological sample is brought into contact, non-specific adsorption occurs and the measurement accuracy does not decrease.
  • the packing material for ion exchange liquid chromatography of the present invention is a conventionally known ion exchange liquid. Similar to the chromatographic filler, it consists of substrate fine particles and ion-exchange groups present on the surface of the substrate fine particles.
  • hydrophobic crosslinked polymer and the method for hydrophilizing the outermost surface are the same as in the case of the hydrophilic polymer fine particles of the present invention, and thus detailed description thereof is omitted.
  • the hydrophilization treatment may be performed before introducing the ion exchange group onto the surface of the base particle, or after introducing the ion exchange group onto the surface of the base particle.
  • the ion exchange group is not particularly limited, and examples thereof include a sulfonic acid group, a carboxyl group, and a phosphoric acid group. Among them, the use of a sulfonic acid group is preferable because the performance can be maintained for a long period of time and a high effect can be obtained for the analysis of hemoglobin Ale and the like.
  • the method for introducing the ion exchange group is not particularly limited.
  • a monomer having an ion exchange group is co-polymerized on the surface of the substrate fine particles. And a method of combining them.
  • the hydrophilic monomer having an ion exchange group is not particularly limited, and may be selected from polymerizable monomers that can be dissolved in an aqueous medium depending on the intended use of the packing material for ion exchange liquid chromatography of the present invention.
  • monomers having a carboxyl group such as acrylic acid and methacrylic acid, styrene sulfonic acid, allylic sulfonic acid, 2- (meth) acrylamide 2 —Methylpropane sulfonic acid and other monomers having a sulfonic acid group, such as ((meth) attayllooxychetyl) acid phosphate, (2- (meth) attaroyloxychetyl) acid phosphate
  • monomers having acid groups such as acrylic acid and methacrylic acid, styrene sulfonic acid, allylic sulfonic acid, 2- (meth) acrylamide 2 —Methylpropane sulfonic acid and other monomers having a sulfonic acid group, such as ((meth) attayllooxychetyl) acid phosphate, (2- (meth) attaroyloxychetyl) acid phosphate
  • monomers having sulfonic acid groups are preferably used, and when used in cation exchange liquid chromatography, for example, dimethylaminoethyl Monomers having an amino group such as (meth) acrylate, jetylaminoethyl (meth) acrylate, arylamine and the like are used.
  • At least one monomer containing an ion exchange group is included, it may be copolymerized with a hydrophilic monomer that does not contain an ion exchange group for the purpose of enhancing hydrophilicity.
  • a method may be used in which a monomer having a functional group is copolymerized on the surface of the substrate fine particle, and a compound having an ion exchange group is reacted with the functional group to introduce the ion exchange group onto the surface of the substrate fine particle. it can.
  • the average particle diameter of the packing material for ion-exchange liquid chromatography of the present invention is not particularly limited, but a preferable lower limit is 0.1 m and a preferable upper limit is 20 ⁇ m. If it is less than 0.1 m, the pressure in the column may become too high, resulting in poor separation, and if it exceeds 20 / zm, the dead volume in the column will become too large, resulting in poor separation. is there.
  • the particle size distribution (CV value) of the packing material for ion exchange liquid chromatography of the present invention is not particularly limited, but a preferable upper limit is 40%. Above 40%, the dead volume in the column becomes too large and may cause poor separation. A more preferred upper limit is 15%.
  • the packing material for ion exchange liquid chromatography of the present invention can be used for measurement of hemoglobins (Hb) such as sugar hemoglobin.
  • Hb hemoglobins
  • Such a method for measuring glycated hemoglobins is also one aspect of the present invention.
  • an eluent and a measurement sample are fed to the obtained column under predetermined conditions, thereby causing hemoglobin. Can be measured.
  • eluent conventionally known eluents can be used.
  • liquids containing organic acids, inorganic acids, or salts thereof as components can be used.
  • Another aspect of the packing material for ion-exchange liquid chromatography of the present invention has an ion-exchange group, a water contact angle of 60 ° or less, and a surface coated with a hydrophilic compound. It is not.
  • Another embodiment of the packing material for ion-exchange liquid chromatography of the present invention will be described. Detailed description.
  • the present inventors have determined that the contact angle of water with respect to the surface of the filler is within a certain range without covering the surface with a hydrophilic compound, thereby preventing non-reactivity caused by hydrophobic interaction. It has been found that specific adsorption can be sufficiently prevented and, as a result, high measurement accuracy can be obtained, a filler that is extremely effective for various separations can be obtained, and the present invention has been completed.
  • Another aspect of the packing material for ion-exchange liquid chromatography of the present invention (hereinafter also simply referred to as another aspect of the packing material of the present invention) has a water contact angle of 60 ° or less.
  • the contact angle measurement is used as a method for evaluating the hydrophilicity and hydrophobicity of the surface of a polymer material, and the smaller the water contact angle, the higher the hydrophilicity.
  • the contact angle of water is 60 ° or less
  • the hydrophilicity is greatly improved, and nonspecific adsorption of a substance to be measured such as a protein due to hydrophobic interaction can be sufficiently suppressed.
  • it is 50 ° or less.
  • the contact angle of water is determined by, for example, an automatic contact angle meter by determining the angle force contact angle of the straight line connecting the left and right end points and the vertex of the droplet to the solid surface ( ⁇ Z2 method). can do.
  • the surface is not coated with a hydrophilic compound.
  • the surface is not coated with a hydrophilic compound means a hydrophilic compound derived from a living body including proteins and polysaccharides, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, phosphorus. It means that a synthetic high molecular weight hydrophilic compound such as a lipid polymer is not physically adsorbed or chemically bonded to the surface of the filler substrate.
  • the hydrophilic compound can be maintained for a long period of time without falling off.
  • the method for reducing the contact angle of water to the surface of the filler of the present invention of another embodiment to 60 ° or less is not particularly limited.
  • the substrate of the filler is treated with ozone water, ozone gas, Examples thereof include hydrophilization methods such as surface treatment, corona treatment, surface treatment with hydrogen peroxide, sodium hypochlorite, and the like.
  • hydrophilization methods such as surface treatment, corona treatment, surface treatment with hydrogen peroxide, sodium hypochlorite, and the like.
  • the base material of the filler of the present invention in another embodiment is not particularly limited, and for example, synthetic polymer fine particles, inorganic fine particles and the like using a polymerizable monomer can be used. It is preferably composed of a hydrophobic crosslinked polymer particle made of an organic polymer and a layer having a hydrophilic polymer force having an ion exchange group copolymerized on the surface of the hydrophobic crosslinked polymer particle. Moreover, when using such a base material, it is preferable that the outermost surface is subjected to a hydrophilic treatment with ozone water.
  • hydrophobic particles When such a substrate is used, by using hydrophobic particles, the surface of the particles is covered with a hydrophilic layer while maintaining the mechanical strength as a filler, and further subjected to a hydrophilization treatment. Non-specific adsorption due to hydrophobic interaction can be sufficiently prevented, and as a result, high measurement accuracy can be obtained, resulting in an extremely effective packing material for various separation analyses.
  • Another aspect of the filler of the present invention has an ion exchange group.
  • the ion exchange group include a sulfonic acid group, a carboxyl group, and a phosphoric acid group. Of these, sulfonic acid groups are preferred.
  • hydrophobic crosslinked polymer particles made of a synthetic organic polymer and ion exchange copolymerized on the surface of the hydrophobic crosslinked polymer particles.
  • a filler for ion exchange liquid chromatography comprising a layer having a hydrophilic polymer power having a group, and the outermost surface is subjected to a hydrophilization treatment with ozone water.
  • the filler of the present invention in yet another aspect is a parent having a hydrophobic crosslinked polymer particle made of a synthetic organic polymer and an ion exchange group copolymerized on the surface of the hydrophobic crosslinked polymer particle. It consists of a layer with aqueous polymer strength.
  • the hydrophobic cross-linked polymer is a hydrophobic cross-linked polymer obtained by homopolymerizing one type of hydrophobic cross-linkable monomer, and a copolymer of two or more types of hydrophobic cross-linkable monomers.
  • the hydrophobic crosslinkable monomer is not particularly limited as long as it has two or more vinyl groups in one monomer molecule.
  • ethylene glycol di (meth) acrylate polyethylene Di (meth) acrylic acid esters such as glycol di (meth) acrylate, propylene glycol di (meth) acrylate, polypropylene glycol di (meth) acrylate; tetramethylol methane tri (meth) acrylate, trimethylol propane tri (meta ) Tri (meth) acrylate or tetra (meth) acrylate such as attalylate, tetramethylolmethanetetra (meth) acrylate; dibutenebenzene, dibutyltoluene, dibutylxylene, divinylnaphthalene, etc. An aromatic compound etc. are mentioned.
  • the hydrophobic non-crosslinkable monomer is not particularly limited as long as it is a non-crosslinkable polymerizable organic monomer having hydrophobic properties, and examples thereof include methyl (meth) acrylate and ethyl. (Meth) acrylate, propyl (meth) acrylate, isopropyl (meth) acrylate, (meth) acrylate such as butyl (meth) acrylate, t-butyl (meth) acrylate; styrene, methyl styrene, etc. Examples thereof include styrene monomers.
  • the hydrophobic cross-linked polymer has a copolymerization force between the hydrophobic cross-linkable monomer and the hydrophobic non-cross-linkable monomer
  • the hydrophobic cross-linkable monomer is a complete unit.
  • the amount is preferably 10 parts by weight or more with respect to 100 parts by weight of the monomer, more preferably 20 parts by weight or more.
  • the hydrophilic polymer having an ion exchange group is composed of a hydrophilic monomer having an ion exchange group, and it is sufficient to include at least one hydrophilic monomer having an ion exchange group. That is, there is a method in which a hydrophilic monomer having an ion exchange group is polymerized alone, or a hydrophilic monomer having an ion exchange group and a hydrophilic monomer having no ion exchange group are copolymerized. Can be mentioned.
  • the hydrophilic monomer having an ion exchange group is not particularly limited, and may be selected from polymerizable monomers that can be dissolved in an aqueous dispersion medium according to the purpose of use of the filler of the present invention.
  • monomers having a carboxyl group such as acrylic acid and methacrylic acid, styrene sulfonic acid, allylic sulfonic acid, 2- (meth) acrylamide 2-methylpropane
  • Monomers having a sulfonic acid group such as sulfonic acid, ((meth) atalylooxychetyl) acid phosphate, (2- (meth) ax
  • monomers having a phosphoric acid group such as (Liloyloxetyl) acid phosphate.
  • monomers having a sulfonic acid group are preferably used and used for anion exchange liquid chromatography.
  • a monomer having an amino group such as dimethylaminoethyl (meth) acrylate, jetylaminoethyl (meth) acrylate, allylamin, or the like is used.
  • the hydrophilic monomer having no ion exchange group is not particularly limited, and may be selected from polymerizable monomers that can be dissolved in an aqueous dispersion medium, depending on the intended use of the filler of the present invention.
  • polymerizable monomers that can be dissolved in an aqueous dispersion medium, depending on the intended use of the filler of the present invention.
  • 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, glycerol mono (meth) acrylate, polyethylene glycol mono (meth) acrylate, methoxypolyethylene glycol mono (meth) acrylate, acrylamide, methacryl Examples include amide and bull pyrrolidone.
  • the mixing ratio is not particularly limited and is necessary.
  • the mixing ratio should be determined according to the ion exchange group capacity.
  • the outermost surface is subjected to a hydrophilic treatment with ozone water.
  • ozone is highly reactive with a double bond. Ozone that has reacted with the double bond forms an intermediate, an ozonide, and then a carboxyl group and the like are formed.
  • the structure of the hydrophobic crosslinked polymer exposed on the surface after coating with a hydrophilic polymer is considered to be an unreacted vinyl group, that is, a double bond.
  • the acid and soot treatment can be effectively performed.
  • the ozone water means that ozone gas is dissolved in water.
  • the dissolved ozone gas concentration and the preparation method of the ozone water are the same as in the case of the packing material for ion exchange liquid chromatography of the present invention, and therefore detailed description thereof is omitted.
  • the contact angle of the filler of the present invention of still another embodiment is preferably 60 ° or less as described above, more preferably 50 ° or less.
  • the method for producing the filler of the present invention according to another embodiment is not particularly limited, and is conventionally known.
  • the coated polymer particles may be produced by a method, and the coated polymer particles may be dispersed in ozone water to further perform a hydrophilic treatment.
  • the average particle diameter of the filler according to another embodiment of the present invention described above and the filler according to another embodiment of the present invention is not particularly limited, but a preferable lower limit is 0.1 m, and a preferable upper limit is 20 ⁇ m. is there. 0 .: Less than L m, the inside of the column may become too high pressure and cause poor separation, and if it exceeds 20 / zm, the dead volume in the column becomes too large and poor separation may occur. is there.
  • the particle size distribution (C V value) of the filler of another embodiment of the present invention described above and the filler of the present invention of still another embodiment is not particularly limited, but a preferable upper limit is 40%. If it exceeds 40%, the dead volume in the force ram becomes too large, which may cause poor separation. A more preferred upper limit is 15%.
  • the present invention according to another aspect described above and the filler according to another aspect of the present invention can be used for measurement of hemoglobins (Hb) such as glycated hemoglobin.
  • Hb hemoglobins
  • Such a method for measuring hemoglobins is also one aspect of the present invention.
  • the eluent and measurement are performed under predetermined conditions on the obtained column.
  • hemoglobins can be measured.
  • eluent a conventionally known eluent can be used, and for example, an organic acid, an inorganic acid, or a liquid containing these salts as components can be used.
  • the method for producing a packing material for ion-exchange liquid chromatography of the present invention comprises a hydrophilic material that is made hydrophilic by washing the surface of the packing material particles having an ion-exchange group with ozone water having a dissolved ozone gas concentration of 20 ppm or more.
  • the hydrophilization step is performed by the accelerated oxidation method.
  • the present inventors By washing the surface of the filler particles having ion exchange groups with ozone water, the present inventors have so far made only the surface of the filler particles hydrophilic, and if they swell even in an aqueous medium, shrinkage occurs. It is possible to effectively suppress non-specific adsorption of proteins, etc. It has been found that a packing material for ion exchange liquid chromatography can be produced. However, even when such a method is used, the surface of the obtained filler for ion exchange liquid chromatography may not be sufficiently hydrophilized.
  • the surface of the packing material particles having an ion exchange group is hydrophilized by washing with ozone water having a dissolved ozone gas concentration of 20 ppm or more.
  • ozone water has a strong acid-oxidizing action, and the dissolved ozone gas gradually decomposes and has no persistence. Therefore, the semiconductor resist removal described in JP-A-2001-33069, 2003—024464 has been used in a wide variety of ways, such as the decomposition of harmful substances described in Japanese Patent Publication No. 024464.
  • the hydrophilization treatment when the hydrophilization treatment is performed by such a method, only the surface portion directly touched with ozone water is hydrophilized, so that it cannot swell or shrink even in an aqueous medium. Non-specific adsorption of proteins or the like does not occur on the hydrophilic surface. Furthermore, since it is a chemical hydrophilization treatment, the hydrophilicity can be maintained for a long period of time without causing the hydrophilic compound to fall off as in the physical hydrophilization treatment method.
  • the accelerated oxidation method means a method for enhancing the oxidizing action of ozone water, and a method for promoting the decomposition of dissolved ozone such as ultraviolet irradiation, ultrasonic irradiation, addition of alkaline water, etc. is used alone. Or the combination of two or more.
  • the decomposition of dissolved ozone is accelerated, and the amount of hydroxy radicals generated by the decomposition of ozone is increased.
  • the hydroxy radical generated in this way has a higher acid scent than ozone, so it is considered possible to further enhance the effect of the hydrophilization treatment.
  • the generation of hydrophilic groups one OH, —CHO, —COOH, etc.
  • hydrophilic groups one OH, —CHO, —COOH, etc.
  • the treatment by the accelerated oxidation method it is preferable to use a method in which the pH of ozone water is set to 7.0 or higher and ultrasonic irradiation is performed.
  • the pH of the ozone water usually shows a low value of 4.0 to 5.0, but the solubility becomes unstable and the decomposition is accelerated when the pH is high.
  • the generation of hydroxy radicals can be further promoted by the cavity action that occurs during ultrasonic irradiation. Therefore, by combining these, it becomes possible to further enhance the effect of the hydrophilic treatment.
  • the method for adjusting the pH of the ozone water to 7.0 or higher is not particularly limited.
  • an aqueous solution of an alkali metal hydroxide such as sodium hydroxide or potassium hydroxide is used.
  • a method of adding can be used.
  • the preferable lower limit of the frequency of the ultrasonic waves is 20 kHz, and the preferable upper limit is 1 MHz.
  • a more preferable upper limit is 500 kHz, and a more preferable upper limit is 100 kHz.
  • the ultrasonic irradiation apparatus for performing the ultrasonic irradiation is not particularly limited as long as it can irradiate the ultrasonic wave having the above-mentioned frequency.
  • a preferable lower limit of the wavelength of ultraviolet light is 160 nm, and a preferable upper limit is 280 nm.
  • the accelerated oxidation treatment can be performed by irradiating ultraviolet rays having a wavelength region within this range.
  • the ultraviolet ray includes a wavelength of 254 nm.
  • Ultraviolet rays with a wavelength of 254 nm directly act on ozone molecules and have the function of decomposing. In this decomposition process, hydroxy radicals are generated, so that the effect of the hydrophilization treatment can be further enhanced.
  • the ultraviolet lamp used for the ultraviolet irradiation is not particularly limited, but those which can irradiate ultraviolet rays having a wavelength of 254 nm are preferable, as described above, for example, a low pressure mercury lamp, a high pressure mercury lamp, a metal lamp. ⁇ Ride lamp and the like.
  • the irradiation intensity and irradiation time of the ultraviolet rays are not particularly limited, and may be adjusted as appropriate. It is preferable to irradiate with an irradiation intensity of 0.5 to 200 mWZcm 2 for 1 to 1200 seconds 60 It is more preferable to irradiate for ⁇ 600 seconds.
  • the irradiation intensity is too low or the irradiation time is too short, hydrophilicity of the filler particle surface may be insufficient and non-specific adsorption of proteins and the like may not be sufficiently prevented. If the time is too long, the strength of the filler particles may be reduced.
  • the treatment by the accelerated oxidation method is performed, it is preferably performed at 20 ° C or higher.
  • a more preferred upper limit is 80 ° C. If the temperature exceeds 80 ° C, there is a high possibility that dissolved ozone gas will be bubbled as it is, and conversely, the reaction efficiency may be reduced.
  • filler particles those conventionally used as filler particles for ion exchange liquid chromatography can be used.
  • inorganic particles such as silica and zircoure; cellulose, polyamino acid And organic particles having natural polymer power such as chitosan; organic particles having synthetic polymer power such as polystyrene and polyacrylate.
  • organic particles such as synthetic polymer chains are preferred because high V, pressure resistance and swelling resistance can be obtained by adjusting the degree of crosslinking.
  • the ion exchange group is not particularly limited, and may be a cation exchange group or an anion exchange group.
  • the cation exchange group is not particularly limited, and examples thereof include a carboxyl group, a phosphate group, and a sulfonate group.
  • the anion exchange group is not particularly limited, and examples thereof include a tertiary amino group and a quaternary amino group. Among these, when a sulfonic acid group is used, it is preferable because the performance can be maintained for a long period of time and a high effect can be obtained in the analysis of hemoglobin Ale.
  • the filler particles having an ion exchange group include a method in which an ion exchange group is introduced on the surface of the particle, or a monomer mixture containing a monomer having an ion exchange group is polymerized to form particles. Can be prepared.
  • the method for introducing an ion exchange group onto the surface of the particle is not particularly limited, and a conventionally known method can be used.
  • a method of chemically reacting a compound having an ion exchange group with the functional group, etc. can be mentioned.
  • As a method of polymerizing a monomer mixture containing a monomer having an ion exchange group into particles for example, a monomer having an ion exchange group and a crosslinkable monomer are mixed. And a method of polymerizing in the presence of a polymerization initiator.
  • a monomer having an ion exchange group is added, and ion exchange groups are formed near the surface of the polymer particles.
  • a method of polymerizing a monomer having; a polymerizable ester compound such as methyl (meth) acrylate and ethyl (meth) acrylate is mixed with a crosslinkable monomer and the like, and polymerized in the presence of a polymerization initiator;
  • a method of hydrolyzing the obtained particles and converting the ester compound to a cation exchange group can also be used.
  • the average particle diameter of the filler particles having an ion-exchange group is not particularly limited, but a preferable lower limit is 0.1 m, and a preferable upper limit is 20 ⁇ m. If it is less than 0.1 m, the inside of the force ram may become too high, resulting in poor separation. If it exceeds 20 m, the dead volume in the column may become too large, resulting in poor separation.
  • a preferred upper limit of the CV value of the particle size is 40%. If it exceeds 40%, the dead volume in the column becomes too large and may cause poor separation. A more preferred upper limit is 15%.
  • the ozone water used in the present invention has a lower limit of the dissolved ozone gas concentration of 20 ppm. If it is less than 20 ppm, non-specific adsorption of proteins cannot be sufficiently prevented without sufficient hydrophilic treatment.
  • a preferred lower limit is 50 ppm.
  • Such high-concentration ozone water is passed through an ozone gas permeable membrane that passes raw material water and ozone gas only through gas and blocks liquid permeation, as described in, for example, JP-A-2001-330969. And the like.
  • the ion-exchange liquid chromatography filler produced by the method for producing the ion-exchange liquid chromatography filler of the present invention is hydrophilized only on the surface portion in direct contact with ozone water. It does not swell or shrink even in an aqueous medium, and proteins and the like are not non-specifically adsorbed. Therefore, extremely accurate measurement can be performed. In addition, such performance can be maintained over a long period of time, and there is little variation in holding time and measured values even after long-term use. In addition, retention time and There is very little fixed noise! /.
  • the packing material for ion exchange liquid chromatography which is produced by the method for producing the packing material for ion exchange liquid chromatography of the present invention, is also one aspect of the present invention.
  • the water contact angle of the packing material for ion exchange liquid chromatography of the present invention is preferably 60 ° or less.
  • the contact angle measurement is used as a method for evaluating the hydrophilicity and hydrophobicity of the surface of a polymer material, and the smaller the water contact angle, the higher the hydrophilicity.
  • the present invention it is necessary to sufficiently suppress nonspecific adsorption of a substance to be measured such as protein, and the above range is preferable. More preferably, it is 50 ° or less.
  • the filler for ion exchange liquid chromatography produced by the method for producing the filler for ion exchange liquid chromatography of the present invention can be suitably used particularly for the analysis of sugar hemoglobin.
  • a packing material for ion-exchange liquid chromatography for sugar-hemoglobin analysis produced by the method for manufacturing a packing material for ion-exchange liquid chromatography of the present invention is also one aspect of the present invention.
  • the method for analyzing glycated hemoglobin using the packing material for ion-exchange liquid chromatography for analyzing glycated hemoglobin of the present invention is also one aspect of the present invention.
  • the eluent and the measurement sample are sent to the obtained column under predetermined conditions.
  • sugar hemoglobin can be analyzed.
  • eluent conventionally known eluents can be used.
  • a liquid containing an organic acid, an inorganic acid, or a salt thereof as a component can be used.
  • ions that can suppress swelling in an aqueous medium and can effectively suppress nonspecific adsorption of hydrophilic polymer fine particles, proteins, and the like that are excellent in dispersibility in an aqueous medium.
  • a method for producing an agent, a filler for ion exchange liquid chromatography produced by using the method for producing a filler for ion exchange liquid chromatography, and a filler for ion exchange liquid chromatography for analyzing glycated hemoglobin can be provided.
  • the obtained polymer fine particles were measured with a laser diffraction particle size distribution analyzer, and the average particle diameter was 5 ⁇ m and the CV value was 14%.
  • a spot type UV irradiation device (UP-made by I-Graphics Co., Ltd.) that can irradiate UV light containing a wavelength of 254 nm while being stirred by immersing 10 g of the resulting polymer fine particles in 300 mL of ozone water with a dissolved ozone gas concentration of 1 lOppm. 200G) was used for hydrophilic treatment by irradiating ultraviolet rays for 300 seconds at an irradiation intensity of 95 mWZcm 2 from a distance of 1 cm. After ultraviolet irradiation, the mixture was centrifuged using a centrifuge (Himac CR20G manufactured by Hitachi, Ltd.), and the supernatant was removed. This operation was repeated twice to give a hydrophilic treatment to obtain hydrophilic polymer fine particles.
  • a centrifuge Himac CR20G manufactured by Hitachi, Ltd.
  • ozone water is a hollow tubular ozone gas permeable membrane made of perfluoroalkoxy resin having a diameter of 0.5 mmX, a thickness of 0.04 mm, and a length of 350 cm. It was prepared using an ozone water production system (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.) including the accommodated ozone dissolution module.
  • the obtained fine polymer particles were measured using a laser diffraction particle size distribution analyzer, and the average particle size was 5 ⁇ m and the CV value was 13%.
  • hydrophilic polymer particles were prepared by performing a hydrophilic treatment with ozone water in the same manner as in Example 1.
  • Polymer fine particles were produced in the same manner as in Example 1 except that the hydrophilization treatment with ozone water was not performed.
  • Polymer fine particles were prepared in the same manner as in Example 2 except that the hydrophilization treatment with ozone water was not performed.
  • the obtained filler particles were measured using a laser diffraction particle size distribution analyzer, and the average particle diameter was 10 ⁇ m and the CV value was 14%.
  • the degree of swelling was measured for the (hydrophilic) polymer fine particles obtained in Example 2 and Comparative Examples 1 to 3. Measurement is performed using the particle size analyzer Accusizer780 (Particle Sizing Systems Used). Pure water or acetone (30 mL) was added to the dried (hydrophilic) polymer fine particles (lg), and the mixture was stirred well and irradiated with ultrasonic waves for 15 minutes to obtain a dispersion. After dispersion, let stand for 240 hours at 25 ° C until equilibrium swelling is reached.
  • the diameter D was measured, and D ZD was defined as the degree of swelling.
  • the contact angle measurement was performed on the (hydrophilic) polymer fine particles obtained in Example 2 and Comparative Examples 1 to 3. Measurement, automatic contact angle meter (manufactured by Kyowa Interface Science Co., Ltd., Dropma S ter500) went use V, and the. The dried (hydrophilic) fine polymer particles were placed on a double-sided tape affixed on a 25 mm X 75 mm slide glass without gaps, and then excess particles were removed by air spray. Thereby, the polymer fine particles were fixed on the double-sided tape. This situation was confirmed with a microscope.
  • a liquid droplet of 1 ⁇ L of pure water was prepared under the condition of 25 ° C., and was placed on a polymer particle fixed on a slide glass, and the contact angle was calculated by the ⁇ 2 method. If the contact angle is less than 90 °, water droplets after landing will try to spread. Therefore, the contact angle after the liquid landing decreases with time. Therefore, the evaluation was performed using the contact angle value 0.5 seconds after the landing.
  • the (hydrophilic) polymer fine particles obtained in Example 2 and Comparative Examples 1 to 3 were evaluated for dispersibility.
  • 30 mL of pure water was added to the dried (hydrophilic) polymer fine particles lg at 25 ° C., stirred well, irradiated with ultrasonic waves for 15 minutes, and then left for 30 minutes. Thereafter, a lightly stirred dispersion was dropped on a slide glass, covered with a cover glass, and observed with a microscope, and evaluated according to the following criteria.
  • Example 2 both the swelling degree and the contact angle were small. Accordingly, the shape change due to the environmental change of water was small, and the hydrophilicity was high, so the dispersibility was also good.
  • Comparative Examples 1 and 2 had a small degree of swelling but a large contact angle. Therefore, the shape change due to the water environment was small, but the hydrophobicity was high, and the dispersibility was bad.
  • the obtained coated polymer particles were measured using a laser diffraction particle size distribution analyzer, and the average particle diameter was 8 ⁇ m and the CV value was 14%.
  • ozone water is a hollow tubular ozone gas permeable membrane made of perfluoroalkoxy resin having a diameter of 0.5 mmX, a thickness of 0.04 mm, and a length of 350 cm. It was prepared using an ozone water production system (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.) including the accommodated ozone dissolution module.
  • Coated polymer particles and a packing material for ion exchange liquid chromatography were obtained in the same manner as in Example 3 except that the treatment with ozone water was not performed.
  • the degree of swelling was measured for the filler for ion exchange liquid chromatography obtained in Example 3 and Comparative Examples 4 and 5.
  • a particle size distribution analyzer Accusizer780 manufactured by Particle Sizing Systems
  • the mixture was stirred well and irradiated with ultrasonic waves for 15 minutes to obtain a dispersion.
  • the mixture was allowed to stand at 25 ° C for 240 hours until equilibrium swelling was reached.
  • the particle size D in water and the particle size D in acetone were measured, and D / ⁇ was defined as the degree of swelling.
  • the contact angle measurement was performed on the packing materials for ion exchange liquid chromatography obtained in Example 3 and Comparative Examples 4 and 5. The measurement was performed using an automatic contact angle meter (Kyowa Interface Science Co., Ltd., Dropmas ter500).
  • the dried packing materials for ion exchange liquid chromatography were arranged on a double-sided tape affixed on a glass slide of 25 mm ⁇ 75 mm without gaps, and then excess particles were removed by air spray. As a result, the packing material for ion exchange liquid chromatography was fixed on the double-sided tape. This situation was confirmed with a microscope.
  • Droplets of 1 ⁇ L of pure water were prepared under conditions of 25 ° C, placed on a packing material for ion-exchange liquid chromatography fixed on a slide glass, and the contact angle was calculated by the ⁇ ⁇ 2 method. . If the contact angle is less than 90 °, the water droplets after landing will wet and spread. Therefore, the contact angle after landing is reduced with time. Therefore, the evaluation was performed using the contact angle value 0.5 seconds after the landing.
  • the packing for ion exchange liquid chromatography prepared in Example 3 and Comparative Examples 4 and 5 was packed in a column of a liquid chromatography system. Eluents with different ⁇ are passed through a column packed with packing material for ion exchange liquid chromatography, and the time required for the column pressure to change and the column pressure to stabilize (equilibrium time) is calculated. It was measured. Specifically, a 50 mM phosphate buffer solution ( ⁇ 5.7: saline) was passed through for 30 minutes. After the column pressure became constant, 300 mM phosphate buffer solution (pH 8.5: B solution) was passed through to check the fluctuation of the column pressure. [0117] (4) Evaluation of Hb recovery by hemoglobin Ale measurement
  • Example 3 The column for ion exchange liquid chromatography prepared in Example 3 and Comparative Example 5 was packed in a column of a liquid chromatography system.
  • Glyco Hb Control Level 2 (manufactured by Kokusai Reagent, reference numerical value 10.4 ⁇ 0.5%) was dissolved in 200; z L of water for injection and diluted (containing 0.1% Triton X-100).
  • a sample diluted 100-fold with phosphate buffer (pH 7.0) was prepared and used as a measurement sample.
  • the amount of hemoglobin Ale in the measurement sample and the total amount of hemoglobin Ale and non-glycohemoglobin were evaluated in the chromatogram peak area under the following conditions.
  • the measurement was performed on 10 consecutive samples, and the area value of the hemoglobin Ale peak and the average value of the area values of the hemoglobin Ale peak and the non-sugar hemoglobin peak were used as the measurement values.
  • FIG. 1 shows the hemoglobin Ale peak area value obtained in Example 3 and the total area value of hemoglobin Ale and non-sugar hemoglobin peak as 100%, and the peak areas obtained in Example 3 and Comparative Example 5 are shown. Compared.
  • Liquid feed pump LC-9A manufactured by Shimadzu Corporation
  • Example 3 As shown in Table 2, in Example 3, both the degree of swelling and the contact angle are small. As a result, the pressure fluctuation in the column is small, and there is no nonspecific adsorption of the hemoglobin component.
  • Example 3 a surface of water contact angle of 60 ° or less can be obtained by forming a hydrophilic polymer layer containing ion exchange groups and further hydrophilizing with ozone water.
  • Comparative Example 4 is a filler having a low degree of crosslinking, the pressure fluctuation in the column having a large degree of swelling is very large. Since the contact angle is small, nonspecific adsorption of hemoglobin is considered to be suppressed, but the pressure fluctuation in the column is too large to evaluate (4). Therefore, it is very important to keep the degree of swelling within a certain range.
  • the obtained coated polymer particles were measured using a laser diffraction particle size distribution analyzer, and the average particle diameter was 8 ⁇ m and the CV value was 14%.
  • ozone water is a hollow tubular ozone gas permeable membrane made of perfluoroalkoxy resin having a diameter of 0.5 mmX, a thickness of 0.04 mm, and a length of 350 cm.
  • Ozone water production system including housed ozone dissolution module It was prepared using a stem (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.).
  • Coated polymer particles and a packing for ion exchange liquid chromatography were obtained in the same manner as in Example 4 except that the treatment with ozone water was not performed.
  • the coated polymer particles obtained in the same manner as in Example 4 were subjected to protein coating treatment instead of ozone water treatment.
  • BSA Ushi Serum Albumin
  • the contact angle measurement was performed on the coated polymer particles obtained in Examples 4 to 5 and Comparative Examples 6 to 7. Measurements automatic contact angle meter (Kyowa Interface Science Co., Dropma S ter500) rows with ivy.
  • the dried coated polymer particles were placed uniformly on a double-sided tape affixed on a slide glass, and then excess particles were removed by air spray. As a result, one layer of the coated polymer particles was fixed on the double-sided tape. This can be confirmed with a microscope. I confirmed.
  • Droplets of 1 ⁇ L of ion-exchanged water were prepared and allowed to land on coated polymer particles fixed on a slide glass, and the contact angle was calculated by the ⁇ 2 method. If the contact angle is less than 90 °, the water droplets after landing will try to spread. Therefore, the contact angle after the liquid landing decreases with time. Therefore, the evaluation was performed using the contact angle value 0.5 seconds after the landing.
  • the amount of hemoglobin Ale in the measurement sample and the total amount of hemoglobin Ale and non-glycohemoglobin were evaluated in the chromatogram peak area under the following conditions.
  • the measurement was performed on 10 consecutive samples, and the area value of the hemoglobin Ale peak and the average value of the area values of the hemoglobin Ale peak and the non-sugar hemoglobin peak were used as the measurement values.
  • FIG. Figure 2 shows the hemoglobin Ale peak area value obtained in Example 4 and the total area values of hemoglobin Ale and non-sugar hemoglobin peak as 100%, and each peak area obtained in Comparative Example 6 and Comparative Example 7 Compared.
  • Liquid feed pump LC-9A manufactured by Shimadzu Corporation
  • a loading sample healthy human blood was collected from NaF, and hemolyzed with a hemolysis dilution (phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 wt% Triton X-100) and diluted 150-fold. A thing was used.
  • phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 wt% Triton X-100
  • hemoglobin Ale value %
  • Liquid feed pump LC-9A manufactured by Shimadzu Corporation
  • the water contact angle is 60 ° or less.
  • a protein that is a hydrophilic compound is also coated.
  • the surface of the water contact angle was 60 ° or less.
  • the contact angle was clearly increased as compared with Example 4.
  • Comparative Example 6 which has a larger contact angle compared to Example 4, the hemoglobin Ale peak area value and the total area value of hemoglobin Ale peak and non-sugar hemoglobin peak are reduced. It was.
  • Comparative Example 7 with a small contact angle, the hemoglobin Ale peak area value and the total area values of the hemoglobin Ale peak and the non-sugar hemoglobin peak were the same level as in Example 4. That is, when the contact angle is 60 ° or more, it is adsorbed on the surface of hemoglobin Ale or other hemoglobin component force filler particles.
  • ozone water is a hollow tubular ozone gas permeable membrane made of perfluoroalkoxy resin having a diameter of 0.5 mmX, a thickness of 0.04 mm, and a length of 350 cm. It was prepared using an ozone water production system (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.) including the accommodated ozone dissolution module.
  • Polyethylene glycol metaacrylate is glyceryl metaacrylate (manufactured by NOF Corporation)
  • Example 6 Except for the replacement, the coated polymer particles and the packing for ion-exchange liquid chromatography were obtained in the same manner as in Example 6.
  • Coated polymer particles and a filler for ion-exchange liquid chromatography were obtained in the same manner as in Example 6 except that the addition of polyethylene glycol metaacrylate was strong.
  • Coated polymer particles and a packing material for ion exchange liquid chromatography were obtained in the same manner as in Example 6 except that the treatment with ozone water was not performed.
  • 1% hydrogen peroxide-hydrogen water 300 mL of 1% hydrogen peroxide-hydrogen water was immersed in the coated polymer particles lOg and stirred for 30 minutes.
  • the 1% hydrogen peroxide solution was prepared using 30% hydrogen peroxide hydrogen water (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). After stirring, the mixture was centrifuged using a centrifuge (Himac CR20G, manufactured by Hitachi, Ltd.), and the supernatant was removed. This operation was repeated twice to obtain a packing material for ion exchange liquid chromatography.
  • the thickness of the layer made of the hydrophilic polymer is disclosed in Japanese Patent Publication No. 8-7197. It was measured according to “Measurement method of average thickness of coating layer”. As a result, the thickness of the coating layer of the obtained coated polymer particles was 5 to: LOnm, and it was confirmed that it was in the range of 1 to 30 nm, which is a preferable range.
  • the contact angle measurement was performed on the coated polymer particles obtained in Examples 6 to 9 and Comparative Examples 8 to 9.
  • the measurement was performed using a Dropmaster 500 manufactured by Kyowa Interface Science.
  • the dried coated polymer particles were placed uniformly on a double-sided tape affixed on a slide glass, and then excess particles were removed by air spray. As a result, one layer of the coated polymer particles was fixed on the double-sided tape. This situation was confirmed with a microscope.
  • Droplets of 1 ⁇ L of ion-exchanged water were prepared and allowed to land on coated polymer particles fixed on a slide glass, and the contact angle was calculated by the ⁇ 2 method. If the contact angle is less than 90 °, the water droplets after landing will try to spread. Therefore, the contact angle after the liquid landing decreases with time. Therefore, the evaluation was performed using the contact angle value 0.5 seconds after the landing.
  • the packing material for ion exchange liquid chromatography prepared in Example 6 and Comparative Examples 8 and 9 was used as a liquid. Packed in a column of a body chromatography system. On the other hand, after dissolving Glyco Hb Control Level 2 (manufactured by Kokusai Reagent, reference value 10.4 ⁇ 0.5%) with 200 L of water for injection, dilute solution (phosphorus containing 0.1% Triton X-100) A sample diluted 100 times with an acid buffer (pH 7.0) was prepared and used as a measurement sample.
  • the amount of hemoglobin Ale in the measurement sample and the total amount of hemoglobin Ale and non-glycohemoglobin were evaluated in the chromatogram peak area under the following conditions.
  • the measurement was performed on 10 consecutive samples, and the area value of the hemoglobin Ale peak and the average value of the area values of the hemoglobin Ale peak and the non-sugar hemoglobin peak were used as the measurement values.
  • FIG. Fig. 3 shows the comparison of the peak areas obtained in Comparative Examples 8 and 9 with the hemoglobin Ale peak area value obtained in Example 6 and the total area value of hemoglobin Ale and non-sugar hemoglobin peak being 100%. did.
  • Liquid feed pump LC-9A manufactured by Shimadzu Corporation
  • hemoglobin Ale value %
  • Liquid feed pump LC-9A manufactured by Shimadzu Corporation
  • Example 6 As shown in Table 6, in Examples 6 to 9, a hydrophilic polymer layer containing an ion exchange group was formed, and a hydrophilization treatment was further performed with ozone water, whereby the contact angle of water was increased.
  • the surface could be less than 60 °.
  • Example 6 does not contain an ion exchange group, and no hydrophilic monomer is added, so that the exposed surface of the hydrophobic polymer is increased, so that the contact angle is slightly increased. Conceivable.
  • Comparative Examples 8 and 9 the contact angle was clearly larger than that in Example 6. From the results of Comparative Example 9, it was found that the oxidation treatment method using hydrogen peroxide solution is insufficient.
  • the average particle size was 8 ⁇ m and the CV value was 14%.
  • the obtained filler particles 1 Og were immersed in 300 mL of ozone water having a dissolved ozone gas concentration of 150 ppm, and 1N NaOH (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added dropwise with stirring to adjust the pH of the solution to 11.0. After adjusting the pH, immediately, ultrasonic waves with a frequency of 28 kHz were irradiated for 30 minutes in an ultrasonic irradiation apparatus (USD-1 manufactured by Azwan Corporation) in which the temperature in the water tank was set to 50 ° C.
  • USD-1 ultrasonic irradiation apparatus
  • ozone water is a hollow tubular ozone gas permeable membrane made of perfluoroalkoxy resin having a diameter of 0.5 mmX, a thickness of 0.04 mm, and a length of 350 cm. It was prepared using an ozone water production system (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.) including the accommodated ozone dissolution module.
  • the filler particles having a sulfonic acid group prepared in Example 10 were directly used as a filler for ion-exchange liquid chromatography without being hydrophilized with ozone water.
  • hydrophilization treatment with ozone water, it is the same except that the dissolved ozone gas concentration is lOppm. Hydrophilic treatment was performed in the same manner as in Example 10 to obtain a packing material for ion exchange liquid chromatography.
  • the hydrophilization treatment was carried out in the same manner as in Example 10 except that pH adjustment and ultrasonic irradiation were not performed, and a packing material for ion exchange liquid chromatography was added. Obtained.
  • Filler particles having a sulfonic acid group prepared in Example 10 1 Og was dissolved in a phosphate buffer (pH 5.7), 0.2 ml of 0.2% by weight urine serum albumin (BSA) was added for 2 minutes. After ultrasonic treatment and gentle stirring in a constant temperature bath at 80 ° C for 24 hours, the sample was taken out of the constant temperature bath and left to reach room temperature. Thereafter, the supernatant was removed by centrifugation, 200 mL of phosphate buffer (pH 8.5) was added, and the supernatant was removed again by centrifugation.
  • BSA urine serum albumin
  • Example 10 The following evaluation was performed on the packing for ion-exchange liquid chromatography obtained in Example 10 and Comparative Examples 10 to 13.
  • the packing material for ion exchange liquid chromatography prepared in Example 10 and Comparative Examples 10 to 12 was packed in a column of a liquid chromatography system.
  • Glyco Hb Control Level 2 Korean Chemical Company, Ltd., reference value 10.4 ⁇ 0.5%) was dissolved in 200 / zL of water for injection, and then diluted with 0.1% Triton X-100.
  • the amount of hemoglobin Ale and non-sugar hemoglobin in the measurement sample was measured under the following conditions, and the ratio of hemoglobin Ale to the total of hemoglobin Ale and non-sugar hemoglobin (hemoglobin Ale Value (%)).
  • the measurement was performed continuously for 10 samples, and the average value of the latter 5 samples was taken as the measurement value.
  • NaF blood of healthy humans was collected, hemolyzed with a hemolysis dilution (phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 wt% Triton X-100), and diluted 150 times. Using 300, 300 samples were measured per day.
  • phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 wt% Triton X-100
  • hemoglobin Ale value %
  • Liquid feed pump LC-9A manufactured by Shimadzu Corporation
  • the obtained filler particles were measured using a laser diffraction particle size distribution analyzer, and the average particle size was 8 ⁇ m and the CV value was 14%.
  • the resulting filler particle 1 Og is immersed in 300 mL of ozone water with a dissolved ozone gas concentration of 130 ppm. While stirring, a spot type UV irradiation device (UP-200G manufactured by Eye Graphics Co., Ltd.) that can irradiate ultraviolet rays including a wavelength of 254 nm is used. Then, a hydrophilic treatment was performed by irradiating ultraviolet rays for 300 seconds at an irradiation intensity of 95 mW Zcm 2 from a distance of 1 cm. After ultraviolet irradiation, the mixture was centrifuged using a centrifuge (Himac CR20G manufactured by Hitachi, Ltd.), and the supernatant was removed. This operation was repeated twice to give a hydrophilic treatment to obtain a packing material for ion exchange liquid chromatography.
  • a spot type UV irradiation device UP-200G manufactured by Eye Graphics Co., Ltd.
  • ozone water is a hollow tubular ozone gas permeable membrane made of perfluoroalkoxy resin having a diameter of 0.5 mmX, a thickness of 0.04 mm, and a length of 350 cm. It was prepared using an ozone water production system (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.) including the accommodated ozone dissolution module.
  • the filler particles having a sulfonic acid group as an ion exchange group prepared in Example 11 are directly packed for ion exchange liquid chromatography without being hydrophilized with ozone water. An agent was used.
  • the hydrophilization treatment was performed in the same manner as in Example 11 except that the dissolved ozone gas concentration was lOppm, to obtain a packing material for ion exchange liquid chromatography.
  • the hydrophilization treatment was carried out in the same manner as in Example 11 except that the treatment by the accelerated acid method was not performed, thereby obtaining a packing material for ion exchange liquid chromatography.
  • Example 11 The following evaluation was performed on the packing materials for ion exchange liquid chromatography obtained in Example 11 and Comparative Examples 14 to 17. The results are shown in Tables 11-13.
  • the contact angle measurement was performed on the filler particles obtained in Example 11 and Comparative Examples 14 and 16.
  • the measurement was performed using a Dropmaster 500 manufactured by Kyowa Interface Science.
  • the dried filler particles were placed uniformly on a double-sided tape affixed on a slide glass, and then excess particles were removed by air spray. As a result, one layer of filler particles was fixed on the double-sided tape. This situation was confirmed with a microscope.
  • the contact angle was calculated by the ⁇ Z2 method. If the contact angle is less than 90 °, the droplets after landing will wet and spread. Therefore, the contact angle after the liquid landing decreases with time. Therefore, the evaluation was performed using the contact angle value 0.5 seconds after the landing.
  • the amount of hemoglobin Ale in the measurement sample and the total amount of hemoglobin Ale and non-glycohemoglobin were evaluated in the chromatogram peak area under the following conditions.
  • the measurement was performed on 10 consecutive samples, and the area value of the hemoglobin Ale peak and the average value of the area values of the hemoglobin Ale peak and the non-sugar hemoglobin peak were used as the measurement values.
  • Liquid feed pump LC-9A manufactured by Shimadzu Corporation
  • hemoglobin Ale value %
  • Liquid feed pump LC-9A manufactured by Shimadzu Corporation
  • Example 11 subjected to the treatment by the accelerated oxidation method is larger than Comparative Examples 14 to 16 in both AlcArea and TotalArea. That is, it can be seen that adsorption of the hemoglobin Ale component and other hemoglobin components to the surface of the filler particles is suppressed.
  • ions that suppress swelling in an aqueous medium and can effectively suppress nonspecific adsorption of hydrophilic polymer fine particles, proteins, and the like that are excellent in dispersibility in an aqueous medium Packing agent for exchange liquid chromatography, ion exchange liquid that can maintain the effect of suppressing sugar, hemoglobin, etc., and swelling, nonspecific adsorption, etc.
  • a method for producing a packing material for chromatography, a packing material for ion-exchange liquid chromatography produced using the method for producing a packing material for ion-exchange liquid chromatography, and an ion-exchange liquid chromatography for analysis of sugar hemoglobin A filler can be provided.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of recovery of hemoglobin (Hb) by hemoglobin Ale measurement in Example 3 and Comparative Example 5.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of Hb recovery by hemoglobin Ale measurement for Example 4, Comparative Example 6, and Comparative Example 7.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of Hb recovery by hemoglobin Ale measurement for Example 6, Comparative Example 8, and Comparative Example 9.
  • FIG. 4 is a graph showing fluctuations in measured values in hemoglobin Ale measurement for durability evaluation.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of hemoglobin (Hb) recovery by hemoglobin Ale measurement for Example 11 and Comparative Examples 14 to 16.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)

Abstract

本発明は、水系媒体中での膨潤を抑制し、かつ、水系媒体に対する分散性に優れる親水性高分子微粒子、タンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤、該イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた糖化ヘモグロビンの分析方法、膨潤、非特異吸着等の抑制効果を長期間にわたって維持することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法、該イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法を用いて製造されるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤、及び、糖化ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を提供することを目的とする。 本発明は、水及びアセトンにそれぞれ分散させ、超音波を１５分間照射し、２５°Cで２４０時間放置して平衡化させた後、粒度分布測定機により粒子径をそれぞれ測定したとき、水に分散させたときの粒子径ＤＷとアセトンに分散させたときの粒子径ＤＡとの比ＤＷ／ＤＡが２．０以下であり、かつ、該親水性高分子微粒子を単層に隙間なく並べた上に純水の液滴を形成させ、２５°Cの条件下で接触角計により測定した水の接触角が７０°以下である親水性高分子微粒子である。

Description

親水性高分子微粒子、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤及びィ オン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、水系媒体中での膨潤を抑制し、かつ、水系媒体に対する分散性に優れる 親水性高分子微粒子、タンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することができる イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤、該イオン交換液体クロマトグラフィー用 充填剤を用いた糖化ヘモグロビンの分析方法、膨潤、非特異吸着等の抑制効果を 長期間にわたって維持することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤 の製造方法、該イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法を用いて製 造されるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤、及び、糖ィ匕ヘモグロビン分析 用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤に関する。
背景技術
[0002] サブミクロン力 ミクロンサイズの高分子微粒子は、有機顔料、トナー粒子、液晶用ス ぺーサ一、ラテックス微粒子、イオン交換液体クロマトグラフィー用の充填剤等、多岐 に渡って用いられている。なかでも、イオン交換液体クロマトグラフィー用の充填剤へ の応用が近年注目されて 、る。
[0003] イオン交換液体クロマトグラフィー法は、各種生体関連物質の分離分析に極めて有 効な方法として知られている。なかでも、近年では糖ィ匕ヘモグロビン類 (以下、へモグ ロビン Aleとも 、う）の分析方法として注目されて 、る。
ヘモグロビン Aleは、血液中の糖がヘモグロビンの β鎖 Ν末端と化学的に結合した ものであり、ヘモグロビン中に占めるヘモグロビン Aleが占める割合、すなわち、へモ グロビン Aleと非糖ィ匕ヘモグロビンとの合計に対するヘモグロビン Aleの割合は、 1 〜2ヶ月の期間の血糖値の平均を反映するものと言われている。そのため、へモグロ ビン Aleが占める割合を示すヘモグロビン Ale値（％)は、一時的に大きく変動し得 る血糖値に代えて、糖尿病診断の指標として広く用いられるようになってきて!/、る。
[0004] 水系媒体で用いられる高分子微粒子の場合、水系媒体の環境変化による形状変化 を抑制することを目的に水系媒体における膨潤が小さぐかつ、分散性向上等を目 的に粒子表面の親水性が高いことが要求される力 特に、イオン交換液体クロマトグ ラフィ一法におけるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤として使用する場合は 、カラム内の圧力変動を小さくし平衡ィ匕を早くする目的で、水系溶媒に対する膨潤が 極めて小さ 、ことが要求される。
[0005] 水系媒体における膨潤を小さくするためには、従来公知の方法として、疎水性架橋 性単量体を多く用い、架橋度を高めることで対応できる。
しかしながら、疎水性架橋性単量体を用いてなる微粒子では、表面の疎水性が高い ため、水系媒体での分散性が悪いという問題があった。更に、このような微粒子を液 体クロマトグラフィー用充填剤として用いた場合には、タンパク質等の生体試料を接 触させることにより、非特異的な吸着が起こるという問題もあった。
[0006] この非特異吸着は、疎水性相互作用によって引き起こされると考えられるため、ィォ ン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の表面の親水性をできるだけ高める必要があ る。
イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の親水性を高める方法としては、例えば、 イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の基材微粒子部分に親水性単量体を多 く含有させる方法等が挙げられる。
しかしながら、親水性単量体の含量を多くすると、イオン交換液体クロマトグラフィー 用充填剤内部の親水性も高まってしまい、結果としてイオン交換液体クロマトグラフィ 一用充填剤の機械的強度が弱くなつてしまうため、高速分離ができなくなったり、ィォ ン交換液体クロマトグラフィー用充填剤自体が膨潤を起こし、測定精度の低下を招い たりするといつた問題が生じる。
[0007] これらの問題を解決する方法としては、例えば、シリカ系化合物力もなる基剤にィォ ン交換基を導入したものや、有機合成高分子からなる架橋性粒子にイオン交換基含 有化合物を反応して得られたもの (特許文献 1等)が知られている。また、架橋性単量 体とイオン交換基含有化合物とを反応させて得られたもの (特許文献 2等)等が知ら れている。
また、特許文献 3には、疎水性架橋重合体微粒子の表面に、親水性重合体の層が 形成された被覆重合体微粒子が開示されている。疎水性架橋重合体微粒子は、構 成する疎水性架橋性単量体によって強度に架橋されているため、機械的強度が高く
、膨潤を抑制することができる。また、形成される親水性重合体の層の厚みを 1〜30 nmとすることで、分析対象物質等の非特異吸着の防止、及び、親水性を維持したま ま、親水性重合体の層による膨潤の抑制を実現できるとして 、る。
[0008] しかしながら、現実的には、このような親水性重合体の層の厚みの範囲で、疎水性架 橋重合体微粒子の露出を防ぐことは難しぐ結果的に疎水性相互作用に起因する非 特異吸着を充分に防ぐことができな力つた。
特に、糖ィ匕ヘモグロビンのように臨床検査等に用いられる物質を測定する場合には、 一段と高いレベルで測定精度が要求されるため、疎水性相互作用に起因する非特 異吸着を可能な限り防止する必要がある。
[0009] これに対して特許文献 4には、イオン交換基を有する充填剤粒子表面を親水化処理 した、具体的には、イオン交換基を有する充填剤粒子表面にタンパク質等の親水基 を有する化合物を吸着して親水化したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤が 開示されている。このようなイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤では、基材が 膨潤したり収縮したりしない一方で、親水性表面によりタンパク質等の非特異吸着を 効果的に防止することができる。しかしながら、このように物理吸着により親水性ィ匕合 物が固定化されている場合、使用初期の段階では高い性能を発揮できるものの、長 期間使用しているうちに充填剤粒子の表面力 親水性ィ匕合物が脱離してしまい、保 持時間や測定値が変動することがあるという問題があった。また、吸着させる親水性 化合物のロット間差によっても保持時間や測定値が変動するという問題点もあった。 特許文献 1：特開平 1― 262468号公報
特許文献 2：特公昭 63 - 59463号公報
特許文献 3：特公平 8 - 7197号公報
特許文献 4:特開 2001—91505号公報
発明の開示
課題を解決するための手段
[0010] 本発明は、上記現状に鑑み、水系媒体中での膨潤を抑制し、かつ、水系媒体に対 する分散性に優れる親水性高分子微粒子、タンパク質等の非特異吸着を効果的に 抑制することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤、該イオン交換液体 クロマトグラフィー用充填剤を用いた糖ィ匕ヘモグロビンの分析方法、膨潤、非特異吸 着等の抑制効果を長期間にわたって維持することができるイオン交換液体クロマトグ ラフィー用充填剤の製造方法、該イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造 方法を用いて製造されるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤、及び、糖ィ匕へ モグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を提供することを目的と する。
[0011] 本発明は、水及びアセトンにそれぞれ分散させ、超音波を 15分間照射し、 25°Cで 2 40時間放置して平衡化させた後、粒度分布測定機により粒子径をそれぞれ測定し たとき、水に分散させたときの粒子径 D とアセトンに分散させたときの粒子径 Dとの
W A
比 D ZDが 2. 0以下であり、かつ、該親水性高分子微粒子を単層に隙間なく並べ
W A
た上に純水の液滴を形成させ、 25°Cの条件下で接触角計により測定した水の接触 角が 70° 以下である親水性高分子微粒子である。
また、本発明は、基材微粒子と、前記基材微粒子の表面に存在するイオン交換基と 力 なるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤であって、水及びアセトンにそれ ぞれ分散させ、超音波を 15分間照射し、 25°Cで 240時間放置して平衡化させた後、 粒度分布測定機により粒子径をそれぞれ測定したとき、水に分散させたときの粒子 径 D とアセトンに分散させたときの粒子径 Dとの比 D ZDが 2. 0以下であり、かつ
W A W A
、該イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を単層に隙間なく並べた上に純水の 液滴を形成させ、 25°Cの条件下で接触角計により測定した水の接触角が 60° 以下 であるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤である。
[0012] 本発明は、イオン交換基を有し、水の接触角が 60° 以下であって、表面が親水性ィ匕 合物で被覆されて ヽな ヽイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤である。
また、本発明は、合成有機高分子からなる疎水性架橋重合体粒子と、前記疎水性架 橋重合体粒子の表面に共重合されたイオン交換基を有する親水性重合体力 なる 層とからなるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤であって、最表面がオゾン水 により親水化処理が施されているイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤である。 更に、本発明は、イオン交換基を有する充填剤粒子表面を溶存オゾンガス濃度が 20 ppm以上のオゾン水を用いて洗浄することにより親水化する親水化工程を有するィ オン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法であって、前記親水化工程に ぉ 、て、促進酸化法による処理を行うイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の 製造方法である。
以下に本発明を詳述する。
[0013] 本発明者らは、鋭意検討の結果、高分子微粒子の D ZD (以下、膨潤度ともいう）
W A
及び表面に対する水の接触角を一定の範囲とすることにより、水系媒体での膨潤を 抑制し、かつ、水系媒体に対する分散性に優れる親水性高分子微粒子を得ることが できるということを見出し、本発明を完成させるに至った。
[0014] 本発明の親水性高分子微粒子は、水及びアセトンにそれぞれ分散させ、超音波を 1 5分間照射し、 25°Cで 240時間放置して平衡化させた後、粒度分布測定機により粒 子径をそれぞれ測定したとき、水に分散させたときの粒子径 D とアセトンに分散させ
W
たときの粒子径 Dとの比 D /Όが 2. 0である。
A W A
一般に、高分子微粒子は、有機溶媒中では収縮し、水系媒体中では程度によらず 膨潤する傾向にある。ゆえに、水系媒体中での膨潤の程度が大きいと、 D /Ό力 S
W A
大きくなり、逆に、水系媒体中での膨潤の程度が小さいと、 D ZDが小さくなる。
W A
D ZDが 2. 0を超えると、水系媒体中での膨潤の程度が大きすぎるため、例えば、
W A
液体クロマトグラフィー用充填剤に用いた場合には、圧力変動が大きくなり、平衡ィ匕 に時間がかかるため実用的ではない。また、水性塗料に用いた場合には、塗装前の 粘度上昇を招くことで作業性が悪くなり実用的でない。好ましい下限は 1. 0、好まし い上限は 1. 8である。
[0015] 上記粒度分布測定機としては特に限定されず、例えば、 Accusizer780 (Particle
Sizing Systems社製）等が挙げられる。
[0016] また、本発明の親水性高分子微粒子は、該親水性高分子微粒子を単層に隙間なく 並べた上に純水の液滴を形成させ、 25°Cの条件下で接触角計により測定した水の 接触角が 70° 以下である。
接触角測定は、高分子材料をはじめ、表面の親水性、疎水性を評価する方法として 用いられる。水の接触角が小さいほど親水性が高いと判断され、本発明においては
、上限を 70° とすることで、親水性が大幅に向上し、水への分散性が向上し、また、 本発明の親水性高分子微粒子を液体クロマトグラフィー用充填剤として用いた場合 には、タンパク質等の生体試料を接触させても非特異的な吸着を起こすことがほとん どない。また、水性塗料に用いた場合には、分散性が良好であるため、塗装作業性 が向上する。好ましい上限は 60° である。
[0017] 上記接触角計としては、例えば、協和界面科学社製、 DropmaSter500等の自動接 触角計を用いることができる。
上記水の接触角は、上述したような接触角計を用い、液滴の左右端点と頂点とを結 ぶ直線の固体表面に対する角度力 接触角を求める方法（ θ Z2法)等によって測 定することができ、具体的には、以下のような方法が挙げられる。
マイクロスコープで確認しながら、乾燥させた親水性高分子微粒子をスライドガラス上 に貼付した両面テープ上に単層に隙間なくのせ、その後エアースプレーで余分な親 水性高分子微粒子を除去し、両面テープ上に親水性高分子微粒子を固定ィ匕する。 25°Cの純水 1 μ Lの液滴を作製し、スライドガラス上に固定ィ匕した親水性高分子微粒 子に着液させ、接触角計を用いて接触角を θ Ζ2法により算出する。なお、接触角が 90° より小さい場合、着液後の水滴は濡れ広がろうとするため、着液後の接触角は 経時的に小さくなる。そこで、着液後 0. 5秒後の接触角値を用いて評価を行う。
[0018] 本発明の親水性高分子微粒子は、膨潤度が上記範囲を満たすことにより水系媒体 中でもほとんど膨潤しないものとなり、水の接触角が上記範囲を満たすことにより水系 媒体に対する分散性が優れたものとなる。
[0019] 上記膨潤度の範囲と上記水の接触角の範囲とを満たす親水性高分子微粒子として は、具体的には、例えば、水溶解度が 5重量％以下の疎水性架橋性単量体及び Ζ 又は疎水性非架橋性単量体力 なる疎水性架橋重合体力 なり、最表面に親水化 処理が施されて!/ヽる微粒子を挙げることができる。
[0020] 上記疎水性架橋重合体は、 1種の水溶解度が 5重量％以下である疎水性架橋性単 量体を単独重合して得られる疎水性架橋重合体 (例えば、エチレングリコールジメタ アタリレート単独力 なる重合体、ジビュルベンゼン単独からなる重合体等）；2種以 上の水溶解度が 5重量％以下である疎水性架橋性単量体を共重合して得られる疎 水性架橋重合体 (例えば、エチレングリコールジメタアタリレートとトリメチロールプロ パントリメタアタリレートからなる共重合体、ジビュルベンゼンとジビュルトルエン力 な る共重合体等）；少なくとも 1種の水溶解度が 5重量％以下である疎水性架橋性単量 体と、少なくとも 1種の水溶解度が 5重量％以下である疎水性非架橋性単量体とを共 重合して得られる疎水性架橋重合体 (例えば、エチレングリコールジメタアタリレートと トリメチロールプロパントリメタアタリレートとブチルメタアタリレートからなる共重合体、 ジビュルベンゼンとスチレン力 なる共重合体等）の 、ずれであってもよ 、。
[0021] 上記水溶解度が 5重量％以下である疎水性架橋性単量体としては、単量体 1分子中 にビニル基を 2個以上有するものであれば特に限定されず、例えば、エチレングリコ ールジ（メタ）アタリレート、ポリエチレングリコールジ (メタ）アタリレート、プロピレングリ コールジ (メタ）アタリレート、ポリプロピレングリコールジ (メタ）アタリレート等のジ (メタ） アクリル酸エステル;テトラメチロールメタントリ（メタ）アタリレート、トリメチロールプロパ ントリ（メタ）アタリレート、テトラメチロールメタンテトラ (メタ）アタリレート等のトリ (メタ)ァ クリル酸エステル又はテトラ（メタ）アクリル酸エステル；ジビュルベンゼン、ジビュルト ルェン、ジビニルキシレン、ジビュルナフタレン等の芳香族系化合物等が挙げられる ここで、水溶解度とは、水 lOOmLに単量体 20mLを加え、室温で 10分間 X 3回攪拌 し 20°Cの保温器で一晩放置し、その後、水に溶解した単量体量を水素炎ガスクロマ トグラフィ一で二重結合 (PSDB)法により測定し、算出した値である。
[0022] 上記水溶解度が 5重量％以下である疎水性非架橋性単量体としては、疎水性の性 質を有する非架橋性の重合性有機単量体であれば特に限定されず、例えば、メチル (メタ）アタリレート、ェチル (メタ）アタリレート、プロピル (メタ）アタリレート、イソプロピル (メタ)アタリレート、ブチル (メタ）アタリレート、 t—ブチル (メタ)アタリレート等の (メタ） アクリル酸エステル;スチレン、メチルスチレン等のスチレン系単量体等が挙げられる
[0023] 上記疎水性架橋重合体が、上記水溶解度が 5重量％以下である疎水性架橋性単量 体と上記水溶解度が 5重量％以下である疎水性非架橋性単量体との共重合からなる 場合には、水溶解度が 5重量％以下である疎水性非架橋性単量体の使用量は、水 溶解度が 5重量％以下である疎水性架橋性単量体 100重量部に対して、 50重量部 以下であることが好ましい。
[0024] 最表面を親水化処理する方法としては特に限定されず、例えば、高分子微粒子の表 面にオゾン水処理、オゾンガス処理、プラズマ処理、コロナ処理、過酸化水素水、次 亜塩素酸ナトリウム等による表面酸ィ匕処理等を施す方法やタンパク質や多糖類をは じめとする生体由来の親水性ィ匕合物やポリビュルアルコール、ポリビュルピロリドン、 ポリアクリル酸、リン脂質ポリマー等の親水性高分子化合物を、高分子微粒子の表面 に対して物理吸着、又は、化学結合させる方法等が挙げられる。
なかでも、調製時の作業性、 Lot管理のしゃすさ、経時的な性能維持等を考慮すると 、オゾン水処理が好ましい。
[0025] 上記オゾン水とは、オゾンガスが水に溶解したものを意味する。
オゾンには強力な酸ィ匕作用があるが、オゾンガスでは、高分子微粒子表面を均一に 酸化することにより親水化処理を施すことが非常に難しい。
しかし、オゾン水を用いることにより、オゾン水中に高分子微粒子を分散させるだけで 高分子微粒子表面を簡便に酸化させ親水化処理を施すことができる。親水化処理の 結果、疎水性の構造部分が酸化され、親水性基（一 OH、— CHO、— COOH等）が 生成すると考えられる。
[0026] 上記オゾン水における溶存オゾンガスの濃度としては特に限定されな 、が、好ま ヽ 下限は 20ppmである。 20ppm未満であると、親水化処理に時間がかかったり、充分 な親水化処理を施せず、高分子微粒子を液体クロマトグラフィー用充填剤として用い た場合に測定対象物質等の非特異吸着を充分に抑制することができな力つたりする 。より好ましい下限は 50ppmである。なお、濃度の好ましい上限は特にない。
[0027] 上記オゾン水の調製方法としては特に限定されず、例えば、特開 2001— 330969 号公報等に記載されているように、原料水とオゾンガスとを、気体のみを透過し液体 の透過を阻止するオゾンガス透過膜を介して接触させる方法等が挙げられる。
[0028] さらに、上記オゾン水処理を行う際には促進酸ィ匕処理法を用いることが好ましい。促 進酸化処理法とは、オゾン水の酸化作用を増強させる方法のことをいい、紫外線照 射、超音波照射、アルカリ水添加等の溶存オゾンの分解を促進する方法を単独で用
V、るか又は 2種以上を併用することを 、う。
このような促進酸化処理法による処理を行うことで、溶存オゾンの分解が促進され、 オゾンの分解によって生じるヒドロキシラジカルの生成量を増加する。このようにして 生成したヒドロキシラジカルは、オゾンよりも更に高い酸ィ匕カを有するため、親水化処 理の効果を更に高めることが可能になるものと考えられる。上記促進酸化処理法を利 用した場合、高分子微粒子の表面における親水基（一 OH、— CHO、— COOH等） の生成を更に促進することが可能となる。
[0029] なお、親水化処理を行わなくても高分子微粒子の表面に対する水の接触角が 70° 以下である場合には、特に親水化処理を行う必要がない。
[0030] 本発明の親水性高分子微粒子の平均粒子径としては特に限定されず、目的に応じ た粒子径に適用できる。
[0031] 本発明の親水性高分子微粒子の粒度分布 (CV値)としては特に限定されないが、好 ましい上限は 40%である。 40%を超えると、実用的ではない。より好ましい上限は 15 %である。
[0032] 本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、基材微粒子と、上記基材微 粒子の表面に存在するイオン交換基とからなるイオン交換液体クロマトグラフィー用 充填剤であって、水及びアセトンにそれぞれ分散させ、超音波を 15分間照射し、 25 °Cで 240時間放置して平衡化させた後、粒度分布測定機により粒子径をそれぞれ測 定したとき、水に分散させたときの粒子径 D とアセトンに分散させたときの粒子径 D
W A
との比 D /Όが 2. 0以下であり、かつ、該イオン交換液体クロマトグラフィー用充填
W A
剤を単層に隙間なく並べた上に純水の液滴を形成させ、 25°Cの条件下で接触角計 により測定した水の接触角力 ½0° 以下である。
以下に本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を詳述する。
[0033] 本発明者らは、鋭意検討の結果、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の D
W
ZD (以下、膨潤度ともいう)及び表面に対する水の接触角を一定の範囲とすること
A
により、水系媒体中での膨潤を抑制し、かつ、タンパク質等の非特異吸着を効果的に 抑制することができるということを見出し、本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー 用充填剤を完成させるに至った。
[0034] 本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、水及びアセトンにそれぞれ 分散させ、超音波を 15分間照射し、 25°Cで 240時間放置して平衡化させた後、粒 度分布測定機により粒子径をそれぞれ測定したとき、水に分散させたときの粒子径 D とアセトンに分散させたときの粒子径 Dとの比 D /Όの上限が 2. 0である。
W A W A
一般に、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、有機溶媒中では収縮し、水 系媒体では程度によらず膨潤する傾向にある。ゆえに、水系媒体での膨潤の程度が 大きいと、 D /Όが大きくなり、逆に、水系媒体での膨潤の程度が小さいと、 D /
W A W
D
A力 、さくなる。
D ZDが 2. 0を超えると、水系媒体での膨潤の程度が大きすぎるため、カラム内の
W A
圧力変動が大きくなり、平衡ィ匕に時間が力かるため実用的ではない。好ましい下限 は 1. 0、好ましい上限は 1. 8である。
[0035] 上記粒度分布測定機としては特に限定されず、例えば、 Accusizer780 (Particle Sizing Systems社製）等が挙げられる。
[0036] また、本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、該イオン交換液体クロ マトグラフィー用充填剤を単層に隙間なく並べた上に純水の液滴を形成させ、 25°C の条件下で接触角計により測定した水の接触角の上限が 60° である。
接触角測定は、高分子材料をはじめ、表面の親水性、疎水性を評価する方法として 用いられる。水の接触角が小さいほど親水性が高いと判断され、本発明においては 、上限を 60° とすることで、親水性が大幅に向上し、タンパク質等の生体試料を接触 させた場合の非特異的吸着が少ない。より好ましい上限は 50° である。
なお、水の接触角は、本発明の親水性高分子微粒子の場合と同様の接触角計を用 い、同様の方法で測定することができる。
[0037] 本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、膨潤度が上記範囲を満た すことにより水系媒体でもほとんど膨潤しないものとなり、水の接触角が上記範囲を 満たすことにより、タンパク質等の生体試料を接触させても、非特異的な吸着が起こり 測定精度が低下することがな 、。
[0038] 本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、従来公知のイオン交換液体 クロマトグラフィー用充填剤と同様に、基材微粒子と、上記基材微粒子の表面に存在 するイオン交換基とからなるものである。
上記膨潤度の範囲と上記水の接触角の範囲とを満たすイオン交換液体クロマトダラ フィー用充填剤としては、具体的には、例えば、水溶解度が 5重量％以下の疎水性 架橋性単量体及び Z又は疎水性非架橋性単量体からなる疎水性架橋重合体から なる基材微粒子と、上記基材微粒子の表面に存在するイオン交換基とからなり、最表 面に親水化処理が施されているものを挙げることができる。
[0039] なお、上記疎水性架橋重合体、及び、最表面を親水化処理する方法については、 本発明の親水性高分子微粒子の場合と同様であるため、その詳しい説明を省略す る。
上記親水化処理は、基材微粒子の表面にイオン交換基を導入する前に行ってもよい し、基材微粒子の表面にイオン交換基を導入した後に行ってもよい。
また、親水化処理を行わなくても表面に対する水の接触角が 60° 以下である場合に は、特に親水化処理を行う必要がない。
[0040] 上記イオン交換基としては特に限定されず、例えば、スルホン酸基、カルボキシル基 、リン酸基等が挙げられる。なかでも、スルホン酸基を用いる場合には、長期間にわ たって性能を維持することができ、また、ヘモグロビン Ale等の分析にも高い効果が 得られることから好適である。
[0041] 上記イオン交換基の導入方法としては特に限定されず、例えば、特公平 8— 7197号 公報に記載されて 、るように基材微粒子表面にイオン交換基を有する単量体を共重 合させる方法等が挙げられる。
上記イオン交換基を有する親水性単量体としては特に限定されず、水系媒体中に溶 解可能な重合性単量体の中から本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填 剤の使用目的に応じて選択すればよぐカチオン交換液体クロマトグラフィーに用い る場合には、例えば、アクリル酸、メタクリル酸等のカルボキシル基を有する単量体、 スチレンスルホン酸、ァリルスルホン酸、 2- (メタ）アクリルアミドー 2—メチルプロパン スルホン酸等のスルホン酸基を有する単量体、 ( (メタ）アタリロイルォキシェチル）ァ シッドホスフェート、 (2- (メタ）アタリロイルォキシェチル）アシッドホスフェート等のリ ン酸基を有する単量体等が挙げられ、なかでも、スルホン酸基を有する単量体が好 適に用いられ、ァ-オン交換液体クロマトグラフィーに用いる場合には、例えば、ジメ チルアミノエチル (メタ）アタリレート、ジェチルアミノエチル (メタ）アタリレート、ァリルァ ミン等のアミノ基を有する単量体等が用いられる。
[0042] なお、イオン交換基を含む単量体を 1種以上含めば、親水性を高める目的でイオン 交換基を含まな!/ヽ親水性単量体と共重合させてもょ ヽ。
また、官能基を有する単量体を基材微粒子表面で共重合させ、その官能基にイオン 交換基を有する化合物を反応させて基材微粒子表面にイオン交換基を導入する方 法を用いることちできる。
[0043] 本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の平均粒子径としては特に限 定されないが、好ましい下限は 0. 1 m、好ましい上限は 20 μ mである。 0. 1 m未 満であると、カラム内が高圧になりすぎて分離不良を起こすことがあり、 20 /z mを超え ると、カラム内のデッドボリュームが大きくなり過ぎて分離不良を起こすことがある。
[0044] 本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の粒度分布 (CV値）としては特 に限定されないが、好ましい上限は 40%である。 40%を超えると、カラム内のデッド ボリュームが大きくなりすぎ、分離不良を起こすことがある。より好ましい上限は 15% である。
[0045] 本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、糖ィ匕ヘモグロビン等のへモ グロビン類 (Hb)の測定に用いることができる。このような糖ィ匕ヘモグロビン類の測定 方法もまた、本発明の 1つである。
具体的には、例えば、本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を公知の カラムに充填した後、得られたカラムに所定の条件で溶離液及び測定試料を送液す ることにより、ヘモグロビン類を測定することができる。
上記溶離液としては、従来公知のものを使用することができ、例えば、有機酸、無機 酸、又は、これらの塩類を成分とする液等を用いることができる。
[0046] 別の態様の本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、イオン交換基を 有し、水の接触角が 60° 以下であって、表面が親水性ィ匕合物で被覆されていないも のである。以下に別の態様の本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を 詳述する。
[0047] 本発明者らは、鋭意検討の結果、表面を親水性化合物で被覆せずに、充填剤表面 に対する水の接触角を一定の範囲にすることにより、疎水性相互作用に起因する非 特異吸着を充分に防ぐことができ、結果的に高い測定精度をもっため、各種分離分 祈に極めて有効な充填剤を得ることができるということを見出し、本発明を完成させる に至った。
[0048] 別の態様の本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤（以下、単に別の態 様の本発明の充填剤ともいう）は、水の接触角が 60° 以下である。
ここで、接触角測定は、高分子材料をはじめ、表面の親水性、疎水性を評価する方 法として用いられ、水の接触角が小さ ヽほど親水性が高 ヽと判断される。
従って、水の接触角を 60° 以下とすることで、親水性が大幅に向上し、疎水性相互 作用に起因するタンパク質等の測定対象物質の非特異吸着を充分に抑制すること ができる。好ましくは 50° 以下である。
なお、上記水の接触角は、例えば、自動接触角計を用い、液滴の左右端点と頂点を 結ぶ直線の、固体表面に対する角度力 接触角を求める方法（ θ Z2法)等によって 柳』定することができる。
[0049] 別の態様の本発明の充填剤は、表面が親水性ィ匕合物で被覆されていない。なお、 本明細書において、「表面が親水性ィ匕合物で被覆されていない」とは、タンパク質や 多糖類をはじめとする生体由来の親水性ィ匕合物やポリビニルアルコール、ポリビニル ピロリドン、リン脂質ポリマー等の合成高分子親水性化合物が、充填剤の基材表面に 対して物理吸着、又は、化学結合していないことを意味する。
表面が親水性ィ匕合物で被覆されていないことにより、親水性ィ匕合物が脱落したりする こともなく、長期間にわたつて親水性を維持することができる。
[0050] 別の態様の本発明の充填剤の表面に対する水の接触角を 60° 以下にする方法とし ては特に限定されず、例えば、充填剤の基材にオゾン水処理、オゾンガス処理、ブラ ズマ処理、コロナ処理、過酸化水素水、次亜塩素酸ナトリウム等による表面酸ィ匕処理 等の親水化処理する方法等が挙げられる。なかでも、オゾン水によって親水化処理 することが好ましい。 なお、充填剤の基材が親水化処理を行わなくても水の接触角が 60° 以下である場 合には特に親水化処理を行う必要がない。
[0051] 別の態様の本発明の充填剤の基材としては、特に限定されず、例えば、重合性単量 体等を用いた合成高分子微粒子、無機微粒子等を用いることができるが、合成有機 高分子からなる疎水性架橋重合体粒子と、上記疎水性架橋重合体粒子の表面に共 重合されたイオン交換基を有する親水性重合体力もなる層とからなることが好ましい 。また、このような基材を用いる場合には、最表面がオゾン水により親水化処理が施さ れていることが好ましい。
このような基材を用いた場合、疎水性の粒子を用いることにより充填剤としての機械 的強度を保ちつつ、粒子表面を親水性の層により被覆し、更に親水化処理を施すこ とにより、疎水性相互作用に起因する非特異吸着を充分に防ぐことができ、結果的に 高い測定精度をもっため、各種分離分析に極めて有効な充填剤を得ることができる
[0052] 別の態様の本発明の充填剤は、イオン交換基を有する。上記イオン交換基としては 、例えば、スルホン酸基、カルボキシル基、リン酸基等が挙げられる。これらのなかで は、スルホン酸基が好ましい。
[0053] 別の態様の本発明の充填剤の更に別の態様として、合成有機高分子からなる疎水 性架橋重合体粒子と、上記疎水性架橋重合体粒子の表面に共重合されたイオン交 換基を有する親水性重合体力もなる層とからなるイオン交換液体クロマトグラフィー用 充填剤であって、最表面がオゾン水により親水化処理が施されているイオン交換液 体クロマトグラフィー用充填剤がある。
[0054] 更に別の態様の本発明の充填剤は、合成有機高分子からなる疎水性架橋重合体粒 子と、上記疎水性架橋重合体粒子の表面に共重合されたイオン交換基を有する親 水性重合体力 なる層とからなる。
[0055] 上記疎水性架橋重合体は、 1種の疎水性架橋性単量体を単独重合して得られる疎 水性架橋重合体、 2種以上の疎水性架橋性単量体を共重合して得られる疎水性架 橋重合体、少なくとも 1種の疎水性架橋性単量体と少なくとも 1種の疎水性非架橋性 単量体とを共重合して得られる疎水性架橋重合体の!/、ずれであってもよ ヽ。 [0056] 上記疎水性架橋性単量体としては、単量体 1分子中にビニル基を 2個以上有するも のであれば特に限定されず、例えば、エチレングリコールジ (メタ）アタリレート、ポリエ チレングリコールジ (メタ）アタリレート、プロピレングリコールジ (メタ）アタリレート、ポリ プロピレングリコールジ (メタ）アタリレート等のジ (メタ）アクリル酸エステル;テトラメチロ ールメタントリ（メタ）アタリレート、トリメチロールプロパントリ (メタ)アタリレート、テトラメ チロールメタンテトラ (メタ)アタリレート等のトリ（メタ)アクリル酸エステル又はテトラ (メ タ）アクリル酸エステル；ジビュルベンゼン、ジビュルトルエン、ジビュルキシレン、ジビ 二ルナフタレン等の芳香族系化合物等が挙げられる。
[0057] 上記疎水性非架橋性単量体としては、疎水性の性質を有する非架橋性の重合性有 機単量体であれば特に限定されず、例えば、メチル (メタ）アタリレート、ェチル (メタ） アタリレート、プロピル (メタ）アタリレート、イソプロピル (メタ）アタリレート、ブチル (メタ） アタリレート、 t—ブチル (メタ）アタリレート等の（メタ）アクリル酸エステル;スチレン、メ チルスチレン等のスチレン系単量体等が挙げられる。
[0058] 上記疎水性架橋重合体が、上記疎水性架橋性単量体と上記疎水性非架橋性単量 体との共重合力 なる場合には、上記疎水性架橋性単量体が全単量体 100重量部 に対して 10重量部以上であることが好ましぐ 20重量部以上であることがより好まし い。
[0059] 上記イオン交換基を有する親水性重合体は、イオン交換基を有する親水性単量体 力 構成されるものであり、イオン交換基を有する親水性単量体を 1種以上含めばよ ぐすなわち、イオン交換基を有する親水性単量体単独で重合させる、イオン交換基 を有する親水性単量体とイオン交換基を有さない親水性単量体とを共重合させる方 法等が挙げられる。
[0060] 上記イオン交換基を有する親水性単量体としては特に限定されず、水性分散媒中に 溶解可能な重合性単量体の中から本発明の充填剤の使用目的に応じて選択すれ ばよぐカチオン交換液体クロマトグラフィーに用いる場合には、例えば、アクリル酸、 メタクリル酸等のカルボキシル基を有する単量体、スチレンスルホン酸、ァリルスルホ ン酸、 2—（メタ）アクリルアミドー 2—メチルプロパンスルホン酸等のスルホン酸基を有 する単量体、（（メタ）アタリロイルォキシェチル）アシッドホスフェート、（2— (メタ）ァク リロイルォキシェチル)アシッドホスフェート等のリン酸基を有する単量体等が挙げら れ、なかでも、スルホン酸基を有する単量体が好適に用いられ、ァニオン交換液体ク 口マトグラフィ一に用いる場合には、例えば、ジメチルアミノエチル (メタ)アタリレート、 ジェチルアミノエチル (メタ）アタリレート、ァリルァミン等のアミノ基を有する単量体等 が用いられる。
[0061] 上記イオン交換基を有さない親水性単量体としては特に限定されず、水性分散媒中 に溶解可能な重合性単量体の中から本発明の充填剤の使用目的に応じて選択す ればよぐ例えば、 2—ヒドロキシェチル (メタ）アタリレート、グリセロールモノ (メタ）ァク リレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アタリレート、メトキシポリエチレングリコー ルモノ (メタ）アタリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、ビュルピロリドン等が挙げら れる。
[0062] 上記イオン交換基を有する親水性単量体と、上記イオン交換基を有さない親水性単 量体とを混合して用いる場合には、混合比率としては特に限定されず、必要なイオン 交換基容量に応じて混合比率を決定すればょ ヽ。
[0063] 更に別の態様の本発明の充填剤は、最表面がオゾン水により親水化処理が施され ている。
[0064] オゾンは二重結合との反応性が高いことが知られている。二重結合と反応したオゾン は、中間体であるォゾナイドを形成し、その後、カルボキシル基などが形成される。 本発明においては、親水性重合体で被覆した後、表面に露出する疎水性架橋重合 体の構造は、未反応のビニル基、すわなち、二重結合であると考えられるため、ォゾ ンによって効果的に酸ィ匕処理を施すことができる。
[0065] 上記オゾン水とは、オゾンガスが水に溶解したものを意味する。
なお、上記オゾン水の溶存オゾンガス濃度、調製方法については、本発明のイオン 交換液体クロマトグラフィー用充填剤の場合と同様であるため、その詳しい説明を省 略する。
[0066] 更に別の態様の本発明の充填剤の接触角も上記同様に 60° 以下であることが好ま しぐ 50° 以下であることがより好ましい。
[0067] 更に別の態様の本発明の充填剤の製造方法としては特に限定されず、従来公知の 方法により上記被覆重合体粒子を製造し、オゾン水中に該被覆重合体粒子を分散さ せることにより、更に親水化処理を施せばよい。
[0068] 上述した別の態様の本発明、及び、更に別の態様の本発明の充填剤の平均粒子径 としては特に限定されないが、好ましい下限は 0. 1 m、好ましい上限は 20 μ mであ る。 0.： L m未満であると、カラム内が高圧になりすぎて分離不良を起こすことがあり 、 20 /z mを超えると、カラム内のデッドボリュームが大きくなり過ぎて分離不良を起こ すことがある。
[0069] 上述した別の態様の本発明、及び、更に別の態様の本発明の充填剤の粒度分布 (C V値）としては特に限定されないが、好ましい上限は 40%である。 40%を超えると、力 ラム内のデッドボリュームが大きくなりすぎ、分離不良を起こすことがある。より好まし い上限は 15%である。
[0070] 上記別の態様の本発明、及び、更に別の態様の本発明の充填剤は、糖化へモグロ ビン等のヘモグロビン類 (Hb)の測定に用いることができる。このような糖ィ匕へモグロ ビン類の測定方法もまた、本発明の 1つである。
具体的には、例えば、上記別の態様の本発明、及び、更に別の態様の本発明の充 填剤を公知のカラムに充填した後、得られたカラムに所定の条件で溶離液及び測定 試料を送液することにより、ヘモグロビン類を測定することができる。
[0071] 上記溶離液としては、従来公知のものを使用することができ、例えば、有機酸、無機 酸、又は、これらの塩類を成分とする液等を用いることができる。
[0072] 本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法は、イオン交換基を 有する充填剤粒子表面を溶存オゾンガス濃度が 20ppm以上のオゾン水を用いて洗 浄することにより親水化する親水化工程を有するイオン交換液体クロマトグラフィー用 充填剤の製造方法であって、前記親水化工程において、促進酸化法による処理を 行うものである。
以下に本発明を詳述する。
[0073] 本発明者らは、これまでに、イオン交換基を有する充填剤粒子表面をオゾン水により 洗浄することにより、充填剤粒子の表面のみが親水化され、水系媒体中でも膨潤ゃ 収縮を生じることなぐタンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することが可能な イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を製造できることを見出した。 しかしながら、このような方法を用いた場合であっても、得られるイオン交換液体クロ マトグラフィー用充填剤の表面が充分に親水化されないことがあった。
そこで、更に鋭意検討した結果、オゾン水を用いた親水化工程において、促進酸ィ匕 法による処理を行うことにより、溶存オゾンの分解が促進され、分解によって生じるヒド ロキシラジカルによって、親水化処理の効果を更に高めることが可能となることを見出 し、本発明を完成させるに至った。
[0074] 本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法では、イオン交換基 を有する充填剤粒子表面を溶存オゾンガス濃度が 20ppm以上のオゾン水を用いて 洗浄することにより親水化する親水化工程を行うことにより、充填剤粒子の表面のみ を親水化する。上記オゾン水には強力な酸ィ匕作用があり、また、溶存オゾンガスは徐 々に分解し、残留性がないことから、特開 2001— 33069号公報に記載の半導体の レジスト除去や、特開 2003— 024464号公報に記載の有害物質の分解処理等多岐 に渡って利用されている。
従って、このような方法により親水化処理を行った場合には、オゾン水が直接触れた 表面部分のみが親水化されることから、水系媒体中でも膨潤したり収縮したりすること がなぐ一方、その親水化表面にはタンパク質等が非特異吸着することもない。更に 、化学的な親水化処理であることから、物理的な親水化処理方法のように親水性ィ匕 合物が脱落したりすることもなぐ長期間にわたって親水性を維持することができる。
[0075] 本発明では、上記親水化工程において、促進酸化法による処理を行う。
本明細書において、促進酸化法とは、オゾン水の酸化作用を増強させる方法のこと をいい、紫外線照射、超音波照射、アルカリ水添加等の溶存オゾンの分解を促進す る方法を単独で用いるか又は 2種以上を併用することをいう。
このような促進酸ィ匕法による処理を行うことで、溶存オゾンの分解が促進され、オゾン の分解によって生じるヒドロキシラジカルの生成量を増加する。このようにして生成し たヒドロキシラジカルは、オゾンよりも更に高い酸ィ匕カを有するため、親水化処理の効 果を更に高めることが可能になるものと考えられる。上記促進酸化法を利用した場合 、充填剤粒子の表面における親水基（一 OH、— CHO、— COOH等）の生成を更に 促進することが可能となる。
[0076] 上記促進酸化法による処理としては、オゾン水の pHを 7. 0以上とし、かつ、超音波を 照射する方法を用いることが好まし 、。
上記オゾン水の pHは通常 4. 0〜5. 0の低い値を示すが、 pHが高くなると溶解性が 不安定になり、分解が促進される。また、オゾン水に超音波を照射することにより、超 音波照射時に発生するキヤビテーシヨン作用により、一段とヒドロキシラジカルの生成 を促進できる。従って、これらを組み合わせることで、親水化処理の効果をより一層高 めることが可能となる。
[0077] 上記オゾン水の pHを 7. 0以上に調整する方法としては、特に限定されないが、例え ば、水酸ィ匕ナトリウムや水酸ィ匕カリウム等のアルカリ金属水酸ィ匕物の水溶液を添加す る方法等を用いることができる。
[0078] 上記促進酸化法による処理において、超音波を照射する場合は、超音波の周波数 の好ましい下限は 20kHz、好ましい上限は 1MHzである。キヤビテーシヨンが低周波 数側で発生しやすいことを考えると、より好ましい上限は 500kHz、更に好ましい上限 は 100kHzである。
なお、超音波の照射を行う際の超音波照射装置としては、上記周波数を有する超音 波を照射できるものであれば、特に限定されな 、。
[0079] また、上記促進酸化法による処理としては、オゾン水に紫外線の照射を行うことも好 適である。
[0080] 上記促進酸化法による処理として、紫外線照射を行う場合は、紫外線の波長の好ま しい下限は 160nm、好ましい上限は 280nmである。波長領域がこの範囲にある紫 外線を照射することにより、促進酸化処理を行うことができる。
また、紫外線は、波長 254nmを含むことが特に好ましい。波長 254nmの紫外線は オゾン分子に直接作用し、分解する働きがある。この分解過程において、ヒドロキシラ ジカルが発生するため、親水化処理の効果を一段と高めることが可能となる。
[0081] 上記紫外線照射の際に使用する紫外線ランプとしては特に限定されないが、上述し たように波長 254nmを含む紫外線を照射できるものが好ましぐ例えば、低圧水銀ラ ンプ、高圧水銀ランプ、メタルノヽライドランプ等が挙げられる。 [0082] 上記紫外線の照射強度及び照射時間としては特に限定されず、適宜調整すればよ いが、波長 254nmの照射強度 0. 5〜200mWZcm2で 1〜1200秒間照射すること が好ましぐ 60〜600秒間照射することがより好ましい。照射強度が小さすぎたり、照 射時間が短すぎたりすると、充填剤粒子表面の親水化が不充分でタンパク質等の非 特異吸着を充分に防止できないことがあり、照射強度が強すぎたり、照射時間が長 すぎたりする場合には、充填剤粒子の強度低下を招く恐れがある。
[0083] 上記促進酸化法による処理を行う場合は、 20°C以上で行うことが好ましい。より好ま しい上限は 80°Cである。 80°Cを超えると、溶存オゾンガスがそのまま気泡化される可 能性が高くなり、逆に、反応効率の低下を招く恐れがある。
[0084] 上記充填剤粒子としては、従来力 イオン交換液体クロマトグラフィー法の充填剤粒 子として用いられているものを用いることができ、例えば、シリカ、ジルコユア等の無機 系粒子;セルロース、ポリアミノ酸、キトサン等の天然高分子力もなる有機系粒子;ポリ スチレン、ポリアクリル酸エステル等の合成高分子力もなる有機系粒子等が挙げられ る。なかでも、合成高分子カゝらなる有機系粒子は、架橋度等を調整することにより高 V、耐圧性や耐膨潤性を得ることができることから好ま 、。
[0085] 上記イオン交換基としては特に限定されず、陽イオン交換基であっても、陰イオン交 換基であってもよい。上記陽イオン交換基としては特に限定されず、例えば、カルボ キシル基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられる。上記陰イオン交換基としては特 に限定されず、例えば、 3級ァミノ基、 4級ァミノ基等が挙げられる。なかでも、スルホ ン酸基を用いる場合には、長期間にわたって性能を維持することができ、また、へモ グロビン Aleの分析にも高い効果が得られることから好適である。
[0086] 上記イオン交換基を有する充填剤粒子は、粒子の表面にイオン交換基を導入したり 、イオン交換基を有する単量体を含む単量体混合物を重合して粒子としたりする方 法により調製することができる。
上記粒子の表面にイオン交換基を導入する方法としては特に限定されず、従来公知 の方法を用いることができる。例えば、高分子力もなる有機系粒子の場合では、官能 基を有する高分子からなる粒子を調製した後、該官能基にイオン交換基を有する化 合物をィ匕学的に反応させる方法等が挙げられる。 [0087] 上記イオン交換基を有する単量体を含む単量体混合物を重合して粒子とする方法と しては、例えば、イオン交換基を有する単量体と架橋性単量体とを混合し、重合開始 剤の存在下で重合する方法等が挙げられる。また、特公平 8— 7197号公報に記載 された方法ように、架橋性重合体粒子を調製した後、イオン交換基を有する単量体を 添加し、重合体粒子の表面付近にイオン交換基を有する単量体を重合させる方法； (メタ)アクリル酸メチルや (メタ)アクリル酸ェチル等の重合性エステル化合物を架橋 性単量体等と混合し、重合開始剤の存在下で重合した後、得られた粒子を加水分解 処理し、エステルイ匕合物を陽イオン交換基に変換する方法等も用いることができる。
[0088] 上記イオン交換基を有する充填剤粒子の平均粒子径としては特に限定されな ヽが、 好ましい下限は 0. 1 m、好ましい上限は 20 μ mである。 0. 1 m未満であると、力 ラム内が高圧になりすぎ分離不良を起こすことがあり、 20 mを超えると、カラム内の デッドボリュームが大きくなりすぎて分離不良を起こすことがある。
[0089] 上記イオン交換基を有する充填剤粒子の粒度分布について、粒子径の CV値の好ま しい上限は 40%である。 40%を超えると、カラム内のデッドボリュームが大きくなりす ぎ分離不良を起こすことがある。より好ましい上限は 15%である。
[0090] 本発明にお!/、て用いられるオゾン水は、溶存オゾンガス濃度の下限が 20ppmである 。 20ppm未満であると、充分な親水化処理を施せずにタンパク質の非特異吸着を充 分に防止できない。好ましい下限は 50ppmである。なお、溶存オゾンガス濃度の上 限は特にない。
このような高濃度のオゾン水は、例えば、特開 2001— 330969号公報等に記載され て ヽるように、原料水とオゾンガスとを気体のみ通し液体の透過を阻止するオゾンガ ス透過膜を介して接触させる方法等により調製することができる。
[0091] 本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されたィ オン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、オゾン水が直接接触した表面部分のみ が親水化されていることから、水系媒体中でも膨潤したり収縮したりすることがなぐま た、タンパク質等が非特異吸着することもな 、ことから極めて正確な測定を行うことが できる。また、長期間にわたってこのような性能を維持することができ、長期間の使用 後でも保持時間や測定値のバラツキが少ない。更に、ロット間差による保持時間や測 定値のノ ラツキも極めて少な!/、。
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されたも のであるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤もまた、本発明の 1つである。
[0092] 本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の水の接触角は 60° 以下であ ることが好ましい。
ここで、接触角測定は、高分子材料をはじめ、表面の親水性、疎水性を評価する方 法として用いられ、水の接触角が小さ ヽほど親水性が高 ヽと判断される。
本発明にお 、ては、タンパク質等の測定対象物質の非特異吸着を充分に抑制する ことが必要となり、上記範囲が好ましい。より好ましくは 50° 以下である。
[0093] 本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されてな るイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、とりわけ糖ィ匕ヘモグロビンの分析に 好適に用いることができる。
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されてな る糖ィ匕ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤もまた、本発 明の 1つである。
また、本発明の糖ィ匕ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤 を用いる糖ィ匕ヘモグロビンの分析方法もまた、本発明の 1つである。
具体的には、例えば、本発明の糖ィ匕ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトダラ フィー用充填剤を公知のカラムに充填した後、得られたカラムに所定の条件で溶離 液及び測定試料を送液することにより、糖ィ匕ヘモグロビンを分析することができる。
[0094] 上記溶離液としては、従来公知のものを使用することができ、例えば、有機酸、無機 酸、又は、これらの塩類を成分とする液等を用いることができる。
発明の効果
[0095] 本発明によれば、水系媒体中での膨潤を抑制し、かつ、水系媒体に対する分散性に 優れる親水性高分子微粒子、タンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することが できるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤、該イオン交換液体クロマトグラフィ 一用充填剤を用いた糖ィ匕ヘモグロビンの分析方法、膨潤、非特異吸着等の抑制効 果を長期間にわたって維持することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填 剤の製造方法、該イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法を用いて 製造されるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤、及び、糖ィ匕ヘモグロビン分 析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を提供することができる。
発明を実施するための最良の形態
[0096] 以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみ に限定されるものではない。
[0097] (実施例 1)
攪拌機付き反応器に、 3%ポリビュルアルコール（日本合成化学社製)水溶液に、テ トラエチレングリコールジメタアタリレート (新中村ィ匕学社製） 300g、トリエチレングリコ ールジメタアタリレート (新中村化学社製） lOOg及び過酸化ベンゾィル (キシダ化学 社製） 1. Ogの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて 80°C1時 間重合した。得られた重合組成物を水及びアセトンで洗浄することにより、高分子微 粒子を得た。
得られた高分子微粒子につ!ヽて、レーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測定 したところ、平均粒子径は 5 μ m、 CV値は 14%であった。
[0098] 得られた高分子微粒子 10gを溶存オゾンガス濃度 1 lOppmのオゾン水 300mLに浸 漬し、撹拌しながら、波長 254nmを含む紫外線を照射できるスポットタイプ UV照射 装置 (アイグラフィックス社製 UP— 200G)を用いて、 1cmの距離から照射強度 95m WZcm2で 300秒間紫外線を照射して親水化処理を施した。紫外線照射後、遠心分 離機 (日立製作所社製 Himac CR20G)を用いて遠心分離し、上澄みを除去した。 この操作を 2回繰り返し親水化処理を施し、親水性高分子微粒子を得た。
なお、オゾン水は、内径 15cm X長さ 20cmの円柱形を有する外套内に、パーフルォ ロアルコキシ榭脂からなる内径 0. 5mmX厚さ 0. 04mm X長さ 350cmの中空管状 のオゾンガス透過膜 400本収容されたオゾン溶解モジュールを含むオゾン水製造シ ステム (積水化学工業社製)を用いて調製した。
[0099] (実施例 2)
攪拌機付き反応器に、 3%ポリビュルアルコール（日本合成化学社製)水溶液に、ジ ビニルベンゼン（キシダ化学社製） 300g、スチレン（和光純薬社製） lOOg及び過酸 化ベンゾィル (キシダイ匕学社製） 1. Ogの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒 素雰囲気下にて 80°C 1時間重合した。得られた重合組成物を水及びアセトンで洗浄 することにより、高分子微粒子を得た。
得られた高分子微粒子につ!ヽて、レーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測定 したところ、平均粒子径は 5 μ m、 CV値は 13%であった。
以下、実施例 1と同様にしてオゾン水による親水化処理を行うことにより、親水性高分 子微粒子を作製した。
[0100] (比較例 1)
オゾン水による親水化処理を行わな力つた以外は、実施例 1と同様にして高分子微 粒子を作製した。
[0101] (比較例 2)
オゾン水による親水化処理を行わな力つた以外は、実施例 2と同様にして高分子微 粒子を作製した。
[0102] (比較例 3)
攪拌機付き反応器中にて、 3%ポリビニルアルコール（日本合成化学社製)水溶液に 、テトラエチレングリコールジメタタリレート (新中村ィ匕学社製） 100g、ポリエチレンダリ コールメタタリレート（日本油脂社製、エチレングリコール鎖 n=4) 400g及び、過酸化 ベンゾィル (キシダイ匕学社製） 1. Ogの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素 雰囲気下にて 80°C 1時間重合した。得られた重合組成物を水及びアセトンで洗浄す ることにより、高分子微粒子を得た。
得られた充填剤粒子にっ ヽて、レーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測定し たところ、平均粒子径は 10 μ m、 CV値は 14%であった。
[0103] <評価 >
実施例 2及び比較例 1〜3で得られた (親水性)高分子微粒子について、以下の 評価を行った。結果を表 1に示した。
[0104] (1)膨潤度測定
実施例 2及び比較例 1〜3で得られた (親水性)高分子微粒子について、膨潤度 測定を行った。測定は、粒度分布計 Accusizer780 (Particle Sizing Systems 社製)を用いた。乾燥させた (親水性)高分子微粒子 lgに純水又はアセトン 30mLを 入れた後、よく撹拌し、超音波を 15分照射し、分散液を得た。分散後、平衡膨潤に 達するまで 25°Cで 240時間放置し、水中における粒子径 D とアセトン中における粒
W
子径 Dとを測定し、 D ZDを膨潤度とした。
A W A
[0105] (2)接触角測定
実施例 2及び比較例 1〜3で得られた (親水性)高分子微粒子について、接触角 測定を行った。測定は、自動接触角計 (協和界面科学社製、 DropmaSter500)を用 V、て行った。乾燥させた (親水性)高分子微粒子を 25mm X 75mmのスライドガラス 上に貼付した両面テープ上に単層に隙間なくのせ、その後エアースプレーで余分な 粒子を除去した。これにより、両面テープ上に高分子微粒子を固定化した。この様子 は、マイクロスコープで確認した。
25°Cの条件下、純水 1 μ Lの液滴を作製し、スライドガラス上に固定ィ匕した高分子微 粒子に着液させ、接触角を θ Ζ2法により算出した。なお、接触角が 90° より小さい 場合、着液後の水滴は濡れ広がろうとする。従って、着液後の接触角は、経時的に 小さくなる。そこで、着液後 0. 5秒後の接触角値を用いて評価を行った。
[0106] (3)分散性評価
実施例 2及び比較例 1〜3で得られた (親水性)高分子微粒子について、分散性 評価を行った。評価方法は、 25°Cの条件下、乾燥させた (親水性)高分子微粒子 lg に純水 30mLを入れた後、よく撹拌し、超音波を 15分照射した後、 30分間放置した 。その後、軽く撹拌した分散液を少量スライドガラス上に滴下し、カバーガラスで覆い 顕微鏡観察を行い、以下の基準により評価した。
〇：凝集して ヽる微粒子がなカゝつた。
X：凝集している微粒子があった。
[0107] [表 1] 膨潤度 水の接触角（° ) 分散性
実施例 1 1 . 2 52 〇
実施例 2 1 . 1 55 〇
比較例 1 1 . 2 98 X
比較例 2 . 1 1 1 0 X
比較例 3 3. 4 68 〇
[0108] 実施例 2は膨潤度、接触角ともに小さ力つた。従って、水の環境変化による形状の 変化が小さぐかつ、親水性が高いことから分散性も良好であった。
これに対して比較例 1、 2は、膨潤度は小さいが、接触角は大き力つた。従って、水の 環境による形状変化は小さ 、が、疎水性が高 、ために分散性が悪力つた。
比較例 3は、親水性単量体の含量を増やしたために、膨潤度が大きぐ接触角は小 さかった。従って、水の環境変化による変化は大きいが、親水性が高いために分散 '性は良好であった。
[0109] (実施例 3)
攪拌機付き反応器に、 3%ポリビュルアルコール（日本合成化学社製)水溶液に、テ トラエチレングリコールジメタアタリレート (新中村ィ匕学社製） 300g、トリエチレングリコ ールジメタアタリレート (新中村化学社製） lOOg及び過酸化ベンゾィル (キシダ化学 社製） 1. Ogの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて 80°C1時 間重合した。次に、イオン交換基を有する単量体として、 2—メタアクリルアミドー 2— メチルプロパンスルホン酸（東亜合成化学社製） l00g、ポリエチレングリコールメタァ タリレート（日本油脂社製、エチレングリコール鎖 n=4) lOOgをイオン交換水に溶解 した。この混合物を同じ反応器に添加して、同様にして、攪拌しながら窒素雰囲気下 で 80°Cで 2時間重合した。得られた重合組成物を水及びアセトンで洗浄することによ り、イオン交換基を有する親水性の被覆重合体粒子 (イオン交換基を有する基材微 粒子)を得た。
得られた被覆重合体粒子にっ 、て、レーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測 定したところ、平均粒子径は 8 μ m、 CV値は 14%であった。
[0110] 得られた被覆重合体粒子 10gを溶存オゾンガス濃度 lOOppmのオゾン水 300mLに 浸潰し、 30分間攪拌した。攪拌終了後、遠心分離機（日立製作所社製 Himac CR 20G)を用いて遠心分離し、上澄みを除去した。この操作を 2回繰り返し、親水化処 理を施し、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
なお、オゾン水は、内径 15cm X長さ 20cmの円柱形を有する外套内に、パーフルォ ロアルコキシ榭脂からなる内径 0. 5mmX厚さ 0. 04mm X長さ 350cmの中空管状 のオゾンガス透過膜 400本収容されたオゾン溶解モジュールを含むオゾン水製造シ ステム (積水化学工業社製)を用いて調製した。
[0111] (比較例 4)
攪拌機付き反応器に、 3%ポリビュルアルコール（日本合成化学社製)水溶液に、ェ チレングリコールジメタアタリレート (新中村ィ匕学社製） 240g、 n—ブチルメタアタリレ ート (共栄社ィ匕学社製） 160g及び過酸ィ匕ベンゾィル (キシダ化学社製） 1. Ogの混合 物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて 80°C1時間重合した。次に、 イオン交換基を有する単量体として、 2—メタアクリルアミドー 2—メチルプロパンスル ホン酸 (東亜合成化学社製） 100g、ポリエチレングリコールメタアタリレート（日本油脂 社製、エチレングリコール鎖 n=4) 100gをイオン交換水に溶解した。この混合物を 同じ反応器に添加して、同様にして、攪拌しながら窒素雰囲気下で 80°Cで 2時間重 合した。得られた重合組成物を水及びアセトンで洗浄することにより、イオン交換基を 有する親水性の被覆重合体粒子 (イオン交換基を有する基材微粒子)を得た。 得られた被覆重合体粒子にっ 、て、レーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測 定したところ、平均粒子径は 8 μ m、 CV値は 16%であった。
得られた被覆重合体粒子 10gを実施例 3と同様にして、オゾン水処理を行い、イオン 交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
[0112] (比較例 5)
オゾン水処理を行わな力つたこと以外は、実施例 3と同様にして被覆重合体粒子、及 び、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
[0113] <評価 >
実施例 3及び比較例 4〜5で得られたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤に ついて以下の評価を行った。結果を表 2、図 1に示した。 [0114] ( 1)膨潤度測定
実施例 3及び比較例 4、 5で得られたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤につ いて、膨潤度測定を行った。測定は、粒度分布計 Accusizer780 (Particle Sizing Systems社製)を用いた。乾燥させたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤 1 gに純水又はアセトン 30mLを入れた後、よく撹拌し、超音波を 15分照射し、分散液 を得た。分散後、平衡膨潤に達するまで 25°Cで 240時間放置し、水中における粒子 径 D とアセトン中における粒子径 Dとを測定し、 D /Όを膨潤度とした。
W A W A
[0115] (2)接触角測定
実施例 3及び比較例 4、 5で得られたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤につ いて、接触角測定を行った。測定は、自動接触角計 (協和界面科学社製、 Dropmas ter500)を用いて行った。乾燥させたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を 2 5mm X 75mmのスライドガラス上に貼付した両面テープ上に隙間なく並べ、その後 エアースプレーで余分な粒子を除去した。これにより、両面テープ上にイオン交換液 体クロマトグラフィー用充填剤を固定ィ匕した。この様子は、マイクロスコープで確認し た。
25°Cの条件下、純水 1 μ Lの液滴を作製し、スライドガラス上に固定ィ匕したイオン交 換液体クロマトグラフィー用充填剤に着液させ、接触角を θ Ζ2法により算出した。な お、接触角が 90° より小さい場合、着液後の水滴は濡れ広がろうとする。従って、着 液後の接触角は、経時的に小さくなる。そこで、着液後 0. 5秒後の接触角値を用い て評価を行った。
[0116] (3)圧力変動評価
実施例 3及び比較例 4、 5で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を液 体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。イオン交換液体クロマトグラフィー 用充填剤を充填したカラムに ρΗの異なる溶離液を通液して、その際のカラム圧力変 動、及びカラム圧力が安定するまでに要した時間 (平衡ィ匕時間)を測定した。具体的 には、 50mMリン酸緩衝液 (ρΗ5. 7 : Α液)を 30分間通液した。カラム圧力が一定に なった後、 300mMリン酸緩衝液 (pH8. 5 : B液）を通液し、カラム圧力の変動を確認 した。 [0117] (4)ヘモグロビン Ale測定による Hb回収率の評価
実施例 3及び比較例 5で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を液体 クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。一方、グリコ Hbコントロールレベル 2 ( 国際試薬製、参考数値 10. 4±0. 5%)を 200 ;z Lの注射用水で溶解した後、希釈 液 (0. 1%トリトン X— 100を含有するリン酸緩衝液 (pH7. 0) )で 100倍に希釈したも のを調製し、測定試料とした。
得られたカラムを用いて、下記の条件により測定試料中のヘモグロビン Ale量及び ヘモグロビン Aleと非糖ィ匕ヘモグロビンとの合計量をクロマトグラムのピーク面積で評 価した。測定は 10検体連続で行い、その後半 5検体のヘモグロビン Aleピークの面 積値及びヘモグロビン Aleピークと非糖ィヒヘモグロビンピークとの面積値の平均値を 測定値とした。
図 1は、実施例 3で得られたヘモグロビン Aleピーク面積値及びヘモグロビン Aleと 非糖ィ匕ヘモグロビンピークの面積値合計を 100%とし、実施例 3、比較例 5で得られ た各ピーク面積を比較した。
システム:送液ポンプ LC— 9A (島津製作所社製）
オートサンプラー ASU— 420 (積水化学工業社製） 検出器 SPD— 6AV (島津製作所社製）
溶離液:第 1液 170mMリン酸緩衝液 (pH5. 7)
第 2液 300mMリン酸緩衝液 (pH8. 5)
溶出法: 0〜3分は第 1液を、 3〜3. 2分は第 2液を、 3. 2〜4分は第 1液にて溶出 流速： 1. OmLZ分
検出波長: 415nm
資料注入量： 10 L
[0118] [表 2] 変動力圧衡時化間平 TlAtoarea 〇
触角接°膨度（潤 ) 〇 ！ LO
00
2収率秒回（) (）％ ()Zkgmc
実施例 3
CO sp 較例比 4
〇
》 〇 1 〇
較例比 5
回
〇
CD in
(D
ID
CVJ CO
〇 〇 in
寸 寸 CD
寸 00 寸
「 < r~
表 2に示すように、実施例 3は膨潤度、接触角ともに小さぐ結果として、カラム内圧力 変動が小さぐまた、ヘモグロビン成分の非特異吸着も全くない。
また、実施例 3では、イオン交換基を含む親水性重合体の層を形成し、更に、オゾン 水で親水化処理を行うことにより、水の接触角を 60° 以下の表面にすることができた [0120] 一方、比較例 4は、架橋度の低い充填剤であるため、膨潤度が大きぐカラム内の圧 力変動が非常に大きい。接触角は小さいことから、ヘモグロビンの非特異吸着は抑 制されるものと考えられるが、カラム内の圧力変動が大きすぎて評価 (4)を実施でき ない。従って、膨潤度を一定の範囲内におさめることは非常に重要である。
比較例 5は、充填剤の架橋度は実施例 3と同様であるため、膨潤度は小さぐカラム 内の圧力変動も小さい。しかし、接触角が大きいため、ヘモグロビン成分の非特異吸 着が起こりやすい。従って、接触角を一定の範囲内におさめることは、膨潤度と同様 、非常に重要である。
[0121] (実施例 4)
攪拌機付き反応器に、 3%ポリビュルアルコール（日本合成化学社製)水溶液に、テ トラエチレングリコールジメタアタリレート (新中村ィ匕学社製） 300g、トリエチレングリコ ールジメタアタリレート (新中村化学社製） lOOg及び過酸化ベンゾィル (キシダ化学 社製） 1. Ogの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて 80°C1時 間重合した。次に、イオン交換基を有する単量体として、 2—メタアクリルアミドー 2— メチルプロパンスルホン酸（東亜合成化学社製） l00g、ポリエチレングリコールメタァ タリレート（日本油脂社製、エチレングリコール鎖 n=4) lOOgをイオン交換水に溶解 した。この混合物を同じ反応器に添加して、同様にして、攪拌しながら窒素雰囲気下 で 80°Cで 2時間重合した。得られた重合組成物を水及びアセトンで洗浄することによ り、イオン交換基を有する親水性の被覆重合体粒子を得た。
得られた被覆重合体粒子にっ 、て、レーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測 定したところ、平均粒子径は 8 μ m、 CV値は 14%であった。
[0122] 得られた被覆重合体粒子 10gを溶存オゾンガス濃度 lOOppmのオゾン水 300mLに 浸潰し、 30分間攪拌した。攪拌終了後、遠心分離機（日立製作所社製 Himac CR 20G)を用いて遠心分離し、上澄みを除去した。この操作を 2回繰り返し、親水化処 理を施し、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
なお、オゾン水は、内径 15cm X長さ 20cmの円柱形を有する外套内に、パーフルォ ロアルコキシ榭脂からなる内径 0. 5mmX厚さ 0. 04mm X長さ 350cmの中空管状 のオゾンガス透過膜 400本収容されたオゾン溶解モジュールを含むオゾン水製造シ ステム (積水化学工業社製)を用いて調製した。
[0123] (実施例 5)
ポリエチレングリコーノレメタアタリレートをメトキシポリエチレングリコーノレメタアタリレート (日本油脂社製、エチレングリコール鎖 n=4)に置き換えたこと以外は、実施例 4と同 様にして被覆重合体粒子、及び、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た
[0124] (比較例 6)
オゾン水処理を行わな力つたこと以外は、実施例 4と同様にして被覆重合体粒子、及 び、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
[0125] (比較例 7)
実施例 4と同様にして得られた被覆重合体粒子にぉ 、て、オゾン水処理の変わりに タンパク質のコーティング処理を施した。上記充填剤粒子 10gにリン酸緩衝液 (pH5 . 7)に溶解させた 0. 2%BSA (ゥシ血清アルブミン） 200mlをカ卩え、 2分間超音波処 理し、 60°Cの恒温水槽中で 24時間ゆるやかに撹拌したのち、恒温水槽から取り出し 、室温になるまで放置した。その後、遠心分離にて上清を除去し、そこにリン酸緩衝 液 (pH8. 5)を 200ml添加し、再度遠心分離により上清を除去した。そこへリン酸緩 衝液 (pH5. 7)を 200ml添加し、再々度遠心分離にて上清を除去し、物理吸着によ るタンパク質コーティングを行ったイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た
[0126] <評価 >
実施例 4〜5及び比較例 6〜7で得られたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤 について、以下の評価を行った。
[0127] (1)接触角測定
実施例 4〜5及び比較例 6〜7で得られた被覆重合体粒子にっ ヽて、接触角測定を 行った。測定は、自動接触角計 (協和界面科学社製、 DropmaSter500)を用いて行 つた。乾燥させた被覆重合体粒子をスライドガラス上に貼付した両面テープ上に均一 になるようにのせ、その後エアースプレーで余分な粒子を除去した。これにより、両面 テープ上に被覆重合体粒子 1層分を固定ィ匕した。この様子は、マイクロスコープで確 認した。
イオン交換水 1 μ Lの液滴を作製し、スライドガラス上に固定ィ匕した被覆重合体粒子 上に着液させ、接触角を θ Ζ2法により算出した。なお、接触角が 90° より小さい場 合、着液後の水滴は濡れ広がろうとする。従って、着液後の接触角は、経時的に小さ くなる。そこで、着液後 0. 5秒後の接触角値を用いて評価を行うこととした。
結果を表 3に示した。
(2)ヘモグロビン Ale測定による Hb回収率の評価
実施例 4及び比較例 6、 7で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を液 体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。一方、グリコ Hbコントロールレベル 2 (国際試薬製、参考数値 10. 4±0. 5%)を 200 Lの注射用水で溶解した後、希 釈液 (0. 1%トリトン X— 100を含有するリン酸緩衝液 (pH7. 0) )で 100倍に希釈し たものを調製し、測定試料とした。
得られたカラムを用いて、下記の条件により測定試料中のヘモグロビン Ale量及び ヘモグロビン Aleと非糖ィ匕ヘモグロビンとの合計量をクロマトグラムのピーク面積で評 価した。測定は 10検体連続で行い、その後半 5検体のヘモグロビン Aleピークの面 積値及びヘモグロビン Aleピークと非糖ィヒヘモグロビンピークとの面積値の平均値を 測定値とした。
結果を表 4、図 2に示した。図 2は、実施例 4で得られたヘモグロビン Aleピーク面積 値及びヘモグロビン Aleと非糖ィ匕ヘモグロビンピークの面積値合計を 100%とし、比 較例 6、比較例 7で得られた各ピーク面積を比較した。
システム:送液ポンプ LC— 9A (島津製作所社製）
オートサンプラー ASU— 420 (積水化学工業社製）
検出器 SPD— 6AV (島津製作所社製）
溶離液:第 1液 170mMリン酸緩衝液 (pH5. 7)
第 2液 300mMリン酸緩衝液 (pH8. 5)
溶出法: 0〜3分は第 1液を、 3〜3. 2分は第 2液を、 3. 2〜4分は第 1液にて溶出 流速： 1. OmLZ分
検出波長: 415nm 資料注入量： 10 L
[0129] (3)ヘモグロビン Ale測定における測定値変動の評価 (耐久性評価）
実施例 4、比較例 6及び比較例 7で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填 剤を液体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。一方、グリコ Hbコントロール レベル 2 (国際試薬社製、参考数値 10. 4±0. 5%)を 200 /z Lの注射用水で溶解し た後、希釈液 (0. 1%トリトン X— 100を含有するリン酸緩衝液 (pH7. 0) )で 100倍に 希釈したものを調製し、測定試料とした。また、負荷試料として、健常人血を NaF採 血し、溶血希釈液 (0. 1重量％トリトン X— 100を含有するリン酸緩衝液 (pH7. 0) ) で溶血し、 150倍に希釈したものを用いた。
測定試料、負荷試料合わせて約 1000検体の測定を行い、任意の間隔で測定試料 1 0検体を連続で測定し、その平均値を用いて評価した。下記の条件により測定試料 中のヘモグロビン Ale量及び非糖ィ匕ヘモグロビン量を測定し、ヘモグロビン Aleと非 糖ィ匕ヘモグロビンとの合計に対するヘモグロビン Aleの割合（ヘモグロビン Ale値（ %) )を求めた。また、ヘモグロビン Aleの保持時間も測定した。
結果を表 5に示した。
システム:送液ポンプ LC— 9A (島津製作所社製）
オートサンプラー ASU— 420 (積水化学工業社製） 検出器 SPD— 6AV (島津製作所社製）
溶離液:第 1液 170mMリン酸緩衝液 (pH5. 7)
第 2液 300mMリン酸緩衝液 (pH8. 5)
溶出法: 0〜3分は第 1液を、 3〜3. 2分は第 2液を、 3. 2〜4分は第 1液にて溶出 流速： 1. OmLZ分
検出波長: 415nm
試料注入量： 10 L
[0130] [表 3] 接触角 実施例 4 40° 実施例 5 47° 比較例 6 65° 比較例 7 35°
[0131] [表 4]
Figure imgf000037_0001
[0132] [表 5]
Figure imgf000038_0001
表 3に示すように、実施例 4、 5では、イオン交換基を含む親水性重合体の層を形成 し、更に、オゾン水で親水化処理を行うことにより、水の接触角を 60° 以下の表面に することができた。また、比較例 7においても、親水性ィ匕合物であるタンパク質でコー ティングすることにより、水の接触角を 60° 以下の表面にすることができた。比較例 6 では、実施例 4と比較して明らかに接触角が大きくなつた。
図 2に示すように、実施例 4と比較して、接触角が大きい比較例 6では、ヘモグロビン Aleピーク面積値及びヘモグロビン Aleピークと非糖ィ匕ヘモグロビンピークの面積 値合計は低下する結果となった。また、接触角が小さい比較例 7では、ヘモグロビン Aleピーク面積値及びヘモグロビン Aleピークと非糖ィ匕ヘモグロビンピークの面積 値合計ともの実施例 4と同レベルであった。すなわち、接触角が 60° 以上である場 合には、ヘモグロビン Aleや他のヘモグロビン成分力 充填剤粒子表面に吸着して いることを示す。
表 4に示すように、実施例 4で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を 用いた場合には、 1000検体測定の間、ヘモグロビン Ale値（％)の変動、保持時間 の変動ともにが非常に小さぐ正確な測定が可能であることがわ力つた。一方、比較 例 6の場合には、ヘモグロビン Ale値が大きく変動した。これは、ヘモグロビン Aleや 他のヘモグロビン成分が非特異吸着を起こしていることに起因していると考えられる。 また、比較例 7の場合には、保持時間が変動した。これは、親水性を向上させるため にコーティングしたタンパク質が測定中に脱離して 、ることに起因して 、ると考えられ る。
(実施例 6)
攪拌機付き反応器に、 3%ポリビュルアルコール（日本合成化学社製)水溶液に、テ トラエチレングリコールジメタアタリレート (新中村ィ匕学社製） 300g、トリエチレングリコ ールジメタアタリレート (新中村化学社製） 100g及び過酸化ベンゾィル (キシダ化学 社製） 1. Ogの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて 80°C1時 間重合した。次に、イオン交換基を有する単量体として、 2—メタアクリルアミドー 2— メチルプロパンスルホン酸（東亜合成化学社製） l00g、ポリエチレングリコールメタァ タリレート（日本油脂社製、エチレングリコール鎖 n=4) 100gをイオン交換水に溶解 した。この混合物を同じ反応器に添加して、同様にして、攪拌しながら窒素雰囲気下 で 80°Cで 2時間重合した。得られた重合組成物を水及びアセトンで洗浄することによ り、イオン交換基を有する親水性の被覆重合体粒子を得た。 得られた被覆重合体粒子にっ 、て、レーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測 定したところ、平均粒子径は 8 μ m、 CV値は 14%であった。
[0135] 得られた被覆重合体粒子 10gを溶存オゾンガス濃度 lOOppmのオゾン水 300mLに 浸潰し、 30分間攪拌した。攪拌終了後、遠心分離機（日立製作所社製 Himac CR 20G)を用いて遠心分離し、上澄みを除去した。この操作を 2回繰り返し、親水化処 理を施し、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
なお、オゾン水は、内径 15cm X長さ 20cmの円柱形を有する外套内に、パーフルォ ロアルコキシ榭脂からなる内径 0. 5mmX厚さ 0. 04mm X長さ 350cmの中空管状 のオゾンガス透過膜 400本収容されたオゾン溶解モジュールを含むオゾン水製造シ ステム (積水化学工業社製)を用いて調製した。
[0136] (実施例 7)
ポリエチレングリコーノレメタアタリレートをメトキシポリエチレングリコーノレメタアタリレート (日本油脂社製、エチレングリコール鎖 n=4)に置き換えたこと以外は、実施例 6と同 様にして被覆重合体粒子、及び、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た
[0137] (実施例 8)
ポリエチレングリコールメタアタリレートをグリセリロールメタアタリレート（日本油脂社製
)に置き換えたこと以外は、実施例 6と同様にして被覆重合体粒子、及び、イオン交 換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
[0138] (実施例 9)
ポリエチレングリコールメタアタリレートを添加しな力つたこと以外は、実施例 6と同様 にして被覆重合体粒子、及び、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
[0139] (比較例 8)
オゾン水処理を行わな力つたこと以外は、実施例 6と同様にして被覆重合体粒子、及 び、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
[0140] (比較例 9)
オゾン水処理の代わりに過酸ィ匕水素水を用いて酸ィ匕処理を施したこと以外は、実施 例 6と同様にして被覆重合体粒子、及び、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填 剤を得た。過酸化水素水を用いた酸化処理方法を以下に示す。
被覆重合体粒子 lOgに 1%過酸ィ匕水素水 300mLを浸漬し、 30分攪拌した。なお、 1 %過酸化水素水は、 30%過酸ィ匕水素水 (和光純薬工業社製)を用いて調製した。攪 拌終了後、遠心分離機 (日立製作所社製、 Himac CR20G)を用いて遠心分離し、 上澄みを除去した。この操作を 2回繰り返し、イオン交換液体クロマトグラフィー用充 填剤を得た。
[0141] <評価 >
実施例 6〜9及び比較例 8〜9で得られたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤 について、以下の評価を行った。
[0142] (4)親水性重合体力 なる層の厚さの測定
実施例 6〜9及び比較例 8〜9で作製されたイオン交換基を有する親水性の被覆重 合体粒子について、親水性重合体からなる層の厚さを、特公平 8— 7197〖こ開示され ている「被覆層の平均厚さの測定方法」に従い測定した。その結果、得られた被覆重 合体粒子の被覆層の厚さは 5〜： LOnmであり、好ましい範囲とされる l〜30nmの範 囲内であることを確認した。
[0143] (5)接触角測定
実施例 6〜9及び比較例 8〜9で得られた被覆重合体粒子にっ ヽて、接触角測定を 行った。測定は、協和界面科学社製 Dropmaster500を用いて行った。乾燥させた 被覆重合体粒子をスライドガラス上に貼付した両面テープ上に均一になるようにのせ 、その後エアースプレーで余分な粒子を除去した。これにより、両面テープ上に被覆 重合体粒子 1層分を固定ィ匕した。この様子は、マイクロスコープで確認した。
イオン交換水 1 μ Lの液滴を作製し、スライドガラス上に固定ィ匕した被覆重合体粒子 上に着液させ、接触角を θ Ζ2法により算出した。なお、接触角が 90° より小さい場 合、着液後の水滴は濡れ広がろうとする。従って、着液後の接触角は、経時的に小さ くなる。そこで、着液後 0. 5秒後の接触角値を用いて評価を行うこととした。
結果を表 6に示した。
[0144] (6)ヘモグロビン Ale測定による Hb回収率の評価
実施例 6及び比較例 8、 9で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を液 体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。一方、グリコ Hbコントロールレベル 2 (国際試薬製、参考数値 10. 4±0. 5%)を 200 Lの注射用水で溶解した後、希 釈液 (0. 1%トリトン X— 100を含有するリン酸緩衝液 (pH7. 0) )で 100倍に希釈し たものを調製し、測定試料とした。
得られたカラムを用いて、下記の条件により測定試料中のヘモグロビン Ale量及び ヘモグロビン Aleと非糖ィ匕ヘモグロビンとの合計量をクロマトグラムのピーク面積で評 価した。測定は 10検体連続で行い、その後半 5検体のヘモグロビン Aleピークの面 積値及びヘモグロビン Aleピークと非糖ィヒヘモグロビンピークとの面積値の平均値を 測定値とした。
結果を表 7、図 3に示した。図 3は、実施例 6で得られたヘモグロビン Aleピーク面積 値及びヘモグロビン Aleと非糖ィ匕ヘモグロビンピークの面積値合計を 100%とし、比 較例 8、 9で得られた各ピーク面積を比較した。
システム:送液ポンプ LC— 9A (島津製作所社製）
オートサンプラー ASU— 420 (積水化学工業社製）
検出器 SPD— 6AV (島津製作所社製）
溶離液:第 1液 170mMリン酸緩衝液 (pH5. 7)
第 2液 300mMリン酸緩衝液 (pH8. 5)
溶出法: 0〜3分は第 1液を、 3〜3. 2分は第 2液を、 3. 2〜4分は第 1液にて溶出 流速： 1. OmLZ分
検出波長: 415nm
資料注入量： 10 L
(7)ヘモグロビン Ale測定における測定値変動の評価 (耐久性評価）
実施例 6及び比較例 8、 9で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を液 体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。一方、グリコ Hbコントロールレベル 2 (国際試薬社製、参考数値 10. 4±0. 5%)を 200 ;z Lの注射用水で溶解した後、 希釈液 (0. 1%トリトン X— 100を含有するリン酸緩衝液 (pH7. 0) )で 100倍に希釈 したものを調製し、測定試料とした。また、負荷試料として、健常人血を NaF採血し、 溶血希釈液 (0. 1重量％トリトン X— 100を含有するリン酸緩衝液 (pH7. 0) )で溶血 し、 150倍に希釈したものを用いた。
測定試料、負荷試料合わせて約 1000検体の測定を行い、任意の間隔で測定試料 1 0検体を連続で測定し、その平均値を用いて評価した。下記の条件により測定試料 中のヘモグロビン Ale量及び非糖ィ匕ヘモグロビン量を測定し、ヘモグロビン Aleと非 糖ィ匕ヘモグロビンとの合計に対するヘモグロビン Aleの割合（ヘモグロビン Ale値（ %) )を求めた。
結果を表 8、図 4に示した。
システム:送液ポンプ LC— 9A (島津製作所社製）
オートサンプラー ASU— 420 (積水化学工業社製）
検出器 SPD— 6AV (島津製作所社製）
溶離液:第 1液 170mMリン酸緩衝液 (pH5. 7)
第 2液 300mMリン酸緩衝液 (pH8. 5)
溶出法: 0〜3分は第 1液を、 3〜3. 2分は第 2液を、 3. 2〜4分は第 1液にて溶出 流速： 1. OmLZ分
検出波長: 415nm
試料注入量： 10 L
[表 6] 接触角
実施例 6 40°
実施例 7 47°
実施例 8 35°
実施例 9 58°
比較例 8 65°
比較例 9 64° 表 7]
A1 cArea I otalArea
実施例 6 1 00% 1 00%
比較例 8 90% 85%
比較例 9 91 % 85% [0148] [表 8]
Figure imgf000044_0001
[0149] 表 6に示すように、実施例 6〜9では、イオン交換基を含む親水性重合体の層を形成 し、更に、オゾン水で親水化処理を行うことにより、水の接触角を 60° 以下の表面に することができた。実施例 6はイオン交換基を含まな 、親水性単量体を添加しな 、こ とで、疎水性重合体の露出面が大きくなつていることにより、接触角が若干大きくなつ ているものと考えられる。比較例 8、 9は、実施例 6と比較して、明らかに接触角が大き くなつた。比較例 9の結果から、過酸化水素水を用いた酸化処理方法では、不充分 であることがわかった。
表 7、図 3より、実施例 6と比較して、比較例 8、 9ともにヘモグロビン Aleピーク面積値 及びヘモグロビン Aleピークと非糖ィ匕ヘモグロビンピークの面積値合計は低下する 結果となった。すなわち、ヘモグロビン Aleや他のヘモグロビン成分力 充填剤粒子 表面に吸着して 、ることを示す。
表 8、図 4より、実施例 6で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用い た場合には、 1000検体測定の間、ヘモグロビン Ale値（％)の変動が非常に小さ 正確な測定が可能であることがわ力つた。一方、比較例 8、 9で作製したイオン交換 液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には、初期 300検体測定までへモグロ ビン Ale値（％)が大きく変動することがわ力つた。これは、評価（6)で見られたへモ グロビン Aleや他のヘモグロビン成分が非特異吸着を起こしていることに起因してい ると考免られる。
[0150] (実施例 10)
( 1)イオン交換基を有する充填剤粒子の調製
2 アクリルアミド 2—メチルプロパンスルホン酸 200g、ジエチレングリコールジメタ タリレート 400g、 2 ヒドロキシ一 1, 3 ジメタクリロキシプロパン 80g、及び、ベンゾィ ルパーオキサイド 1. 5gを混合し、 2. 5Lの 4重量％ポリビュルアルコール水溶液に 分散させた。これを窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、 80°Cで 8時間重合した後、 洗浄'分級して、スルホン酸基を有する充填剤粒子を得た。
得られた充填剤粒子にっ ヽてレーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測定した ところ、平均粒子径は 8 μ m、 CV値は 14%であった。
[0151] (2)オゾン水による親水化処理
得られた充填剤粒子 1 Ogを溶存オゾンガス濃度 150ppmのオゾン水 300mLに浸漬 し、撹拌しながら 1Nの NaOH (和光純薬工業社製)を滴下し、溶液の pHを 11. 0に 調整した。 pHを調整後、速やかに水槽内の温度を 50°Cに設定した超音波照射装置 (ァズワン社製 USD— 2)内で周波数が 28kHzの超音波を 30分間照射した。
超音波照射後、遠心分離機 (日立製作所社製 Himac CR20G)を用いて遠心分離 し、上澄みを除去した。この操作を 2回繰り返し親水化処理を施し、イオン交換液体ク 口マトグラフィー用充填剤を得た。
なお、オゾン水は、内径 15cm X長さ 20cmの円柱形を有する外套内に、パーフルォ ロアルコキシ榭脂からなる内径 0. 5mmX厚さ 0. 04mm X長さ 350cmの中空管状 のオゾンガス透過膜 400本収容されたオゾン溶解モジュールを含むオゾン水製造シ ステム (積水化学工業社製)を用いて調製した。
[0152] (比較例 10)
実施例 10で調製したスルホン酸基を有する充填剤粒子を、オゾン水による親水化処 理を行わずにそのままイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤とした。
[0153] (比較例 11)
オゾン水による親水化処理において、溶存オゾンガス濃度を lOppmとした以外は実 施例 10と同様にして親水化処理を行い、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤 を得た。
[0154] (比較例 12)
オゾン水による親水化処理にお 、て、 pH調整及び超音波照射の操作を行わなかつ た以外は、実施例 10と同様にして親水化処理を行い、イオン交換液体クロマトグラフ ィー用充填剤を得た。
[0155] (比較例 13)
実施例 10で調製したスルホン酸基を有する充填剤粒子 1 Ogにリン酸緩衝液 (pH5. 7)に溶解させた 0. 2重量％ゥシ血清アルブミン (BSA) 200mLをカ卩え、 2分間超音 波処理し、 80°Cの恒温水槽中で 24時間ゆるやかに撹拌したのち、恒温水槽から取 り出し、室温になるまで放置した。その後、遠心分離にて上清を除去し、リン酸緩衝 液 (pH8. 5)を 200mL添加し、再度遠心分離により上清を除去した。次いで、リン酸 緩衝液 (PH5. 7)を 200mL添加し、再々度遠心分離にて上清を除去し、物理吸着 による BSAが固定されたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
[0156] <評価 >
実施例 10及び比較例 10〜 13で得られたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填 剤について以下の評価を行った。
[0157] (1)ヘモグロビン Ale測定における初期測定値の評価
実施例 10及び比較例 10〜 12で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填 剤を液体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。一方、グリコ Hbコントロール レベル 2 (国際試薬社製、参考数値 10. 4±0. 5%)を 200 /z Lの注射用水で溶解し た後、希釈液 (0. 1%トリトン X— 100を含有するリン酸緩衝液 (pH7. 0) )で 100倍に 希釈したものを調製し、測定試料とした。
得られたカラムを用いて、下記の条件により測定試料中のヘモグロビン Ale量及び 非糖ィ匕ヘモグロビン量を測定し、ヘモグロビン Aleと非糖ィ匕ヘモグロビンとの合計に 対するヘモグロビン Aleの割合 (ヘモグロビン Ale値（％) )を求めた。測定は 10検体 連続で行 、、その後半 5検体の平均値を測定値とした。
結果を表 9に示した。 システム:送液ポンプ LC— 9A (島津製作所社製）
オートサンプラー ASU— 420 (積水化学工業社製） 検出器 SPD— 6AV (島津製作所社製）
溶離液:第 1液 170mMリン酸緩衝液 (pH5. 7)
第 2液 300mMリン酸緩衝液 (pH8. 5)
溶出法: 0〜3分は第 1液を、 3〜3. 2分は第 2液を、 3. 2〜4分は第 1液にて溶出 流速： 1. OmLZ分
検出波長: 415nm
資料注入量： 10 L
[0158] [表 9]
Figure imgf000047_0001
[0159] 表 9より実施例 10で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた場 合には、極めて正確な測定ができたのに対して、比較例 10で作製したイオン交換液 体クロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には、想定される値よりもかなり低いへモ グロビン Ale値（％)が得られた。これは、比較例 10のイオン交換液体クロマトグラフィ 一用充填剤を用いた場合には、特にヘモグロビン Aleの割合が著しく低下したことに よるものであり、即ち、ヘモグロビン成分が充填剤粒子表面に非特異吸着しているこ とを示すものである。また、比較例 11で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用 充填剤を用いた場合には、比較例 10よりは改善されているものの、想定される値より は低いヘモグロビン Ale値（％)が得られた。即ち、溶存オゾンガス濃度が lOppmで は、充分な親水化効果が得られないことを示すものである。更に、比較例 12で作製し たイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には、実施例 10と同等の ヘモグロビン Ale値（％)が得られた。し力しながら、実施例 10と比較して、へモグロ ビン Ale値（％)を算出するヘモグロビン Ale量と非糖ィ匕ヘモグロビン量がそれぞれ 約 10%低下していることが分かった。従って、ヘモグロビン Ale値（％)は同等であつ ても、ヘモグロビン成分が充填剤表面に非特異吸着して 、ることを意味するものであ る。 [0160] (2)ヘモグロビン Ale測定における測定値変動の評価 (耐久性評価） 実施例 10及び比較例 13で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を液 体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。一方、グリコ Hbコントロールレベル 2 (国際試薬社製、参考数値 10. 4±0. 5%)を 200 ;z Lの注射用水で溶解した後、 希釈液 (0. 1%トリトン X— 100を含有するリン酸緩衝液 (pH7. 0) )で 100倍に希釈 したものを調製し、測定試料とした。また、負荷資料として、健常人血を NaF採血し、 溶血希釈液 (0. 1重量％トリトン X— 100を含有するリン酸緩衝液 (pH7. 0) )で溶血 し、 150倍に希釈したものを用いて、 1日に 300検体を測定した。
各負荷検体数測定した後のカラムを用いて、下記の条件により測定試料中のへモグ ロビン Ale量及び非糖ィ匕ヘモグロビン量を測定し、ヘモグロビン Aleと非糖ィ匕へモグ ロビンとの合計に対するヘモグロビン Aleの割合（ヘモグロビン Ale値（％) )を求め た。測定は 10検体連続で行い、その平均値を測定値とした。また、ヘモグロビン Ale の保持時間も測定した。
結果を表 10に示した。
システム:送液ポンプ LC— 9A (島津製作所社製）
オートサンプラー ASU— 420 (積水化学工業社製） 検出器 SPD— 6AV (島津製作所社製）
溶離液:第 1液 170mMリン酸緩衝液 (pH5. 7)
第 2液 300mMリン酸緩衝液 (pH8. 5)
溶出法: 0〜3分は第 1液を、 3〜3. 2分は第 2液を、 3. 2〜4分は第 1液にて溶出 流速： 1. OmLZ分
検出波長: 415nm
試料注入量： 10 L
[0161] [表 10]
Figure imgf000049_0001
[0162] 表 10より、実施例 10で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた 場合には、 4500検体の負荷試験を行ったあとでも、ほとんどヘモグロビン Aleの保 持時間に変化がなぐ正確なヘモグロビン Ale値（％)が可能であることが判った。一 方、比較例 13で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用 Vヽた場合 には、負荷検体数が増えるに従ってヘモグロビン Aleの保持時間が変化する傾向力 S あり、得られたヘモグロビン Ale値（％)も、実施例 10の場合に比べてバラツキが大き いものであった。
[0163] (実施例 11) ( 1)イオン交換基を有する充填剤粒子の調製
攪拌機付き反応器中にて、 3%ポリビニルアルコール（日本合成化学社製)水溶液に 、テトラエチレングリコールジメタタリレート (新中村ィ匕学社製） 300g、トリエチレンダリ コールジメタタリレート (新中村ィ匕学社製） 100g、及び、過酸化ベンゾィル (キシダイ匕 学社製） 1. Ogの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて 80°C1 時間重合した。次に、イオン交換基を有する単量体として、 2—メタクリルアミドー 2— メチルプロパンスルホン酸（東亜合成化学社製） lOOg、ポリエチレングリコールメタク リレート（日本油脂社製、エチレングリコール鎖 n=4) lOOgをイオン交換水に溶解し た。この混合物を同じ反応器に添加して、同様にして、攪拌しながら窒素雰囲気下で 80°Cで 2時間重合した。得られた重合組成物を水及びアセトンで洗浄することにより 、イオン交換基としてスルホン酸基を有する充填剤粒子を得た。
得られた充填剤粒子にっ ヽて、レーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測定し たところ、平均粒子径は 8 μ m、 CV値は 14%であった。
[0164] (2)オゾン水による親水化処理
得られた充填剤粒子 1 Ogを溶存オゾンガス濃度 130ppmのオゾン水 300mLに浸漬 し、撹拌しながら、波長 254nmを含む紫外線を照射できるスポットタイプ UV照射装 置（アイグラフィックス社製 UP— 200G)を用いて、 1cmの距離から照射強度 95mW Zcm2で 300秒間紫外線を照射して親水化処理を施した。紫外線照射後、遠心分 離機 (日立製作所社製 Himac CR20G)を用いて遠心分離し、上澄みを除去した。 この操作を 2回繰り返し親水化処理を施し、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填 剤を得た。
なお、オゾン水は、内径 15cm X長さ 20cmの円柱形を有する外套内に、パーフルォ ロアルコキシ榭脂からなる内径 0. 5mmX厚さ 0. 04mm X長さ 350cmの中空管状 のオゾンガス透過膜 400本収容されたオゾン溶解モジュールを含むオゾン水製造シ ステム (積水化学工業社製)を用いて調製した。
[0165] (比較例 14)
実施例 11で調製したイオン交換基としてスルホン酸基を有する充填剤粒子を、ォゾ ン水による親水化処理を行わずにそのままイオン交換液体クロマトグラフィー用充填 剤とした。
[0166] (比較例 15)
オゾン水による親水化処理において、溶存オゾンガス濃度を lOppmとしたこと以外 は、実施例 11と同様にして親水化処理を行い、イオン交換液体クロマトグラフィー用 充填剤を得た。
[0167] (比較例 16)
オゾン水による親水化処理において、促進酸ィ匕法による処理を行わな力つたこと以 外は、実施例 11と同様にして親水化処理を行い、イオン交換液体クロマトグラフィー 用充填剤を得た。
[0168] (比較例 17)
実施例 11で調製したイオン交換基としてスルホン酸基を有する充填剤粒子 10gにリ ン酸緩衝液 (PH5. 7)に溶解させた 0. 2重量％ゥシ血清アルブミン（BSA) 200mL を加え、 2分間超音波処理し、 80°Cの恒温水槽中で 24時間ゆるやかに撹拌したの ち、恒温水槽力も取り出し、室温になるまで放置した。その後、遠心分離にて上清を 除去し、リン酸緩衝液 (pH8. 5)を 200mL添加し、再度遠心分離により上清を除去 した。次いで、リン酸緩衝液 (pH5. 7)を 200mL添加し、再々度遠心分離にて上清 を除去し、物理吸着による BSAが固定されたイオン交換液体クロマトグラフィー用充 填剤を得た。
[0169] <評価 >
実施例 11及び比較例 14〜 17で得られたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填 剤につ 、て以下の評価を行った。結果を表 11〜 13に示した。
[0170] (3)接触角測定
実施例 11及び比較例 14、 16で得られた充填剤粒子について、接触角測定を行つ た。測定は、協和界面科学社製 Dropmaster500を用いて行った。乾燥させた充填 剤粒子をスライドガラス上に貼付した両面テープ上に均一になるようにのせ、その後 エアースプレーで余分な粒子を除去した。これにより、両面テープ上に充填剤粒子 1 層分を固定ィ匕した。この様子は、マイクロスコープで確認した。
イオン交換水 1 μ Lの液滴を作製し、スライドガラス上に固定ィ匕した充填剤粒子上に 着液させ、接触角を θ Z2法により算出した。なお、接触角が 90° より小さい場合、 着液後の水滴は濡れ広がろうとする。従って、着液後の接触角は、経時的に小さくな る。そこで、着液後 0. 5秒後の接触角値を用いて評価を行うこととした。
結果を表 11に示した。
[0171] (4)ヘモグロビン Ale測定によるヘモグロビン類 (Hb)回収率の評価
実施例 11及び比較例 14〜 16で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填 剤を液体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。一方、グリコ Hbコントロール レベル 2 (国際試薬社製、参考数値 10. 4±0. 5%)を 200 /z Lの注射用水で溶解し た後、希釈液 (0. 1%トリトン X— 100を含有するリン酸緩衝液 (pH7. 0) )で 100倍に 希釈したものを調製し、測定試料とした。
得られたカラムを用いて、下記の条件により測定試料中のヘモグロビン Ale量及び ヘモグロビン Aleと非糖ィ匕ヘモグロビンとの合計量をクロマトグラムのピーク面積で評 価した。測定は 10検体連続で行い、その後半 5検体のヘモグロビン Aleピークの面 積値及びヘモグロビン Aleピークと非糖ィヒヘモグロビンピークとの面積値の平均値を 測定値とした。
結果を表 12、図 5に示した。実施例 11で得られたヘモグロビン Aleピーク面積値及 びヘモグロビン Aleと非糖ィ匕ヘモグロビンピークの面積値合計を 100%とし、比較例 14〜 16で得られた各ピーク面積を比較した。
システム:送液ポンプ LC— 9A (島津製作所社製）
オートサンプラー ASU— 420 (積水化学工業社製） 検出器 SPD— 6AV (島津製作所社製）
溶離液:第 1液 170mMリン酸緩衝液 (pH5. 7)
第 2液 300mMリン酸緩衝液 (pH8. 5)
溶出法: 0〜3分は第 1液を、 3〜3. 2分は第 2液を、 3. 2〜4分は第 1液にて溶出 流速： 1. OmLZ分
検出波長: 415nm
資料注入量： 10 L
[0172] (5)ヘモグロビン Ale測定における測定値変動の評価 (耐久性評価） 実施例 11及び比較例 17で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を液 体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。一方、グリコ Hbコントロールレベル 2 (国際試薬社製、参考数値 10. 4±0. 5%)を 200 ;z Lの注射用水で溶解した後、 希釈液 (0. 1%トリトン X— 100を含有するリン酸緩衝液 (pH7. 0) )で 100倍に希釈 したものを調製し、測定試料とした。また、負荷試料として、健常人血を NaF採血し、 溶血希釈液 (0. 1重量％トリトン X— 100を含有するリン酸緩衝液 (pH7. 0) )で溶血 し、 150倍に希釈したものを用いた。
測定試料、負荷試料合わせて約 1000検体の測定を行い、任意の間隔で測定試料 1 0検体を連続で測定し、その平均値を用いて評価した。下記の条件により測定試料 中のヘモグロビン Ale量及び非糖ィ匕ヘモグロビン量を測定し、ヘモグロビン Aleと非 糖ィ匕ヘモグロビンとの合計に対するヘモグロビン Aleの割合（ヘモグロビン Ale値（ %) )を求めた。また、ヘモグロビン Aleの保持時間も測定した。
結果を表 13に示した。
システム:送液ポンプ LC— 9A (島津製作所社製）
オートサンプラー ASU— 420 (積水化学工業社製） 検出器 SPD— 6AV (島津製作所社製）
溶離液:第 1液 170mMリン酸緩衝液 (pH5. 7)
第 2液 300mMリン酸緩衝液 (pH8. 5)
溶出法: 0〜3分は第 1液を、 3〜3. 2分は第 2液を、 3. 2〜4分は第 1液にて溶出 流速： 1. OmLZ分
検出波長: 415nm
試料注入量： 10 L
[0173] [表 11]
Figure imgf000053_0001
[0174] [表 12] AlcArea TotalArea
実施例 11 100% 100%
比較例 14 8フ％ 85%
比較例 15 89% 88%
比較例 16 95% 99%
[表 13] 実施例 11 比較例 17
検体数
保持時間（秒） へモク'ロビン A1c値（％) 保持時間（秒） へモゲロビン 1(：値（％)
50 119.2 10.4 120.0 10. 4
100 118.8 10. 5 119.4 10.6
150 118.7 10. 5 119. 1 10. 5
200 118.6 10. 5 118.8 10. 3
250 118.6 10. 4 119.4 10. 5
300 118.6 10. 5 119.9 10.6
400 118.6 10. 5 120.6 10. 5
500 118.5 10.5 121. 1 10. 4
600 118.6 10. 5 121.5 10. 5
700 118. 5 10. 5 121.9 10. 6
800 118. 5 10. 5 122.2 10.4
900 118. 5 10. 5 122. 5 10.5
1000 118. 5 10. 5 122 8 〇 10.5 平均値 118.6 10. 5 120.7 10 o.5 標準偏差 0. 19 0. 04 1. 38
変動係数 0.2 0.4 1. 1 0.9 表 11〖こ示すよう〖こ、実施例 11では、比較例 16に示したオゾン水処理のみの接触角 よりも 8° 小さくなつており、促進酸化法による処理によって充填剤粒子の表面の親 水性が向上していることがわかる。
表 12、図 5に示すように、促進酸化法による処理を行った実施例 11が、 AlcArea, TotalAreaともに比較例 14〜16より大きいことがわかる。すなわち、充填剤粒子の 表面へのヘモグロビン Ale成分や他のヘモグロビン成分の吸着が抑制されているこ とがわかる。
表 13に示すように、実施例 11で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤 を用いた場合には、 1000検体測定の間、ヘモグロビン Ale値（％)の変動、保持時 間の変動がともに非常に小さぐ正確な測定が可能であることがわかる。一方、比較 例 17の場合には、保持時間が大きく変動している。これは、親水性を向上させるため にコーティングしたタンパク質が測定中に脱離して 、ることに起因して 、ると考えられ る。
産業上の利用可能性
[0177] 本発明によれば、水系媒体中での膨潤を抑制し、かつ、水系媒体に対する分散性に 優れる親水性高分子微粒子、タンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することが できるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤、該イオン交換液体クロマトグラフィ 一用充填剤を用いた糖ィ匕ヘモグロビンの分析方法、膨潤、非特異吸着等の抑制効 果を長期間にわたって維持することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填 剤の製造方法、該イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法を用いて 製造されるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤、及び、糖ィ匕ヘモグロビン分 析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を提供することができる。
図面の簡単な説明
[0178] [図 1]実施例 3、比較例 5について、ヘモグロビン Ale測定によるヘモグロビン類 (Hb )回収率の結果をグラフで示した図である。
[図 2]実施例 4、比較例 6、比較例 7について、ヘモグロビン Ale測定による Hb回収 率の結果をグラフで示した図である。
[図 3]実施例 6、比較例 8、比較例 9について、ヘモグロビン Ale測定による Hb回収 率の結果をグラフで示した図である。
[図 4]耐久性評価にぉ 、て、ヘモグロビン Ale測定における測定値変動をグラフで示 した図である。
[図 5]実施例 11、比較例 14〜16について、ヘモグロビン Ale測定によるへモグロビ ン類 (Hb)回収率の結果をグラフで示した図である。

Claims

請求の範囲
[1] 水及びアセトンにそれぞれ分散させ、超音波を 15分間照射し、 25°Cで 240時間放 置して平衡化させた後、粒度分布測定機により粒子径をそれぞれ測定したとき、水に 分散させたときの粒子径 D とアセトンに分散させたときの粒子径 Dとの比 D /Ό
W A W A
が 2. 0以下であり、かつ、該親水性高分子微粒子を単層に隙間なく並べた上に純水 の液滴を形成させ、 25°Cの条件下で接触角計により測定した水の接触角が 70° 以 下であることを特徴とする親水性高分子微粒子。
[2] 基材微粒子と、前記基材微粒子の表面に存在するイオン交換基とからなるイオン交 換液体クロマトグラフィー用充填剤であって、
水及びアセトンにそれぞれ分散させ、超音波を 15分間照射し、 25°Cで 240時間放 置して平衡化させた後、粒度分布測定機により粒子径をそれぞれ測定したとき、水に 分散させたときの粒子径 D とアセトンに分散させたときの粒子径 Dとの比 D /Ό
W A W A
が 2. 0以下であり、かつ、該イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を単層に隙 間なく並べた上に純水の液滴を形成させ、 25°Cの条件下で接触角計により測定した 水の接触角が 60° 以下である
ことを特徴とするイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤。
[3] イオン交換基を有し、水の接触角が 60° 以下であって、表面が親水性ィ匕合物で被 覆されて ヽな ヽことを特徴とするイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤。
[4] 合成有機高分子からなる疎水性架橋重合体粒子と、前記疎水性架橋重合体粒子の 表面に共重合されたイオン交換基を有する親水性重合体力 なる層とからなるイオン 交換液体クロマトグラフィー用充填剤であって、
最表面がオゾン水により親水化処理が施されている
ことを特徴とするイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤。
[5] 水の接触角が 60° 以下であることを特徴とする請求項 4記載のイオン交換液体クロ マトグラフィー用充填剤。
[6] オゾン水の濃度が 20ppm以上であることを特徴とする請求項 4又は 5記載のイオン 交換液体クロマトグラフィー用充填剤。
[7] イオン交換基は、スルホン酸基であることを特徴とする請求項 2、 3、 4、 5又は 6記載 のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤。
[8] 請求項 1記載の親水性高分子微粒子又は請求項 2、 3、 4、 5、 6若しくは 7記載のィ オン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いることを特徴とする糖ィ匕ヘモグロビン の分析方法。
[9] イオン交換基を有する充填剤粒子表面を溶存オゾンガス濃度が 20ppm以上のォゾ ン水を用いて洗浄することにより親水化する親水化工程を有するイオン交換液体クロ マトグラフィー用充填剤の製造方法であって、前記親水化工程において、促進酸ィ匕 法による処理を行うことを特徴とするイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製 造方法。
[10] 促進酸化法による処理として、オゾン水の pHを 7以上とし、かつ、超音波の照射を行 うことを特徴とする請求項 9記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造 方法。
[11] 周波数が 20kHz〜lMHzの超音波を照射することを特徴とする請求項 10記載のィ オン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
[12] 促進酸化法による処理として、紫外線の照射を行うことを特徴とする請求項 9記載の イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
[13] 紫外線は、 254nmの波長を含むことを特徴とする請求項 12記載のイオン交換液体 クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
[14] 促進酸化法による処理を 20°C以上で行うことを特徴とする請求項 9、 10、 11、 12又 は 13記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
[15] イオン交換基がスルホン酸基であることを特徴とする請求項 9、 10、 11、 12、 13又は
14記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
[16] 請求項 9、 10、 11、 12、 13、 14又は 15記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用 充填剤の製造方法により製造されたものであることを特徴とするイオン交換液体クロ マトグラフィー用充填剤。
[17] 請求項 9、 10、 11、 12、 13、 14又は 15記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用 充填剤の製造方法により製造されたものであることを特徴とする糖ィ匕ヘモグロビン分 析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤。
PCT/JP2006/322670 2005-12-02 2006-11-14 親水性高分子微粒子、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤及びイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法 WO2007063701A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12/085,936 US7811453B2 (en) 2005-12-02 2006-11-14 Hydrophilic polymer microparticle, filler for ion exchange liquid chromatography, and method for production of filler for ion exchange liquid chromatography
EP06832626A EP1955764A4 (en) 2005-12-02 2006-11-14 HYDROPHILIC POLYMERMIC PARTICLES, FILLER FOR ION EXCHANGE LIQUID CHROMATOGRAPHY AND METHOD FOR PRODUCING FILLER FOR ION EXCHANGE LIQUID CHROMATOGRAPHY
CN2006800326033A CN101257969B (zh) 2005-12-02 2006-11-14 亲水性高分子微粒、和离子交换液相色谱用填充剂及其制造方法
US12/875,283 US8968562B2 (en) 2005-12-02 2010-09-03 Hydrophilic polymer microparticle, filler for ion exchange liquid chromatography, and method for production of filler for ion exchange liquid chromatography

Applications Claiming Priority (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005-349543 2005-12-02
JP2005349543 2005-12-02
JP2005-354082 2005-12-07
JP2005354082 2005-12-07
JP2006110221A JP3990713B2 (ja) 2005-12-07 2006-04-12 イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤及び糖化ヘモグロビンの分析方法
JP2006-110221 2006-04-12
JP2006-123569 2006-04-27
JP2006123569A JP3984633B2 (ja) 2005-12-02 2006-04-27 イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法
JP2006158422A JP2007326935A (ja) 2006-06-07 2006-06-07 親水性高分子微粒子
JP2006-158422 2006-06-07
JP2006-158421 2006-06-07
JP2006158421A JP2007327821A (ja) 2006-06-07 2006-06-07 イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤、及び、糖化ヘモグロビンの分析方法

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US12/085,936 A-371-Of-International US7811453B2 (en) 2005-12-02 2006-11-14 Hydrophilic polymer microparticle, filler for ion exchange liquid chromatography, and method for production of filler for ion exchange liquid chromatography
US12/875,283 Division US8968562B2 (en) 2005-12-02 2010-09-03 Hydrophilic polymer microparticle, filler for ion exchange liquid chromatography, and method for production of filler for ion exchange liquid chromatography

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007063701A1 true WO2007063701A1 (ja) 2007-06-07

Family

ID=38092037

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2006/322670 WO2007063701A1 (ja) 2005-12-02 2006-11-14 親水性高分子微粒子、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤及びイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法

Country Status (5)

Country Link
US (2) US7811453B2 (ja)
EP (3) EP2602021B1 (ja)
KR (1) KR101555533B1 (ja)
CN (2) CN101257969B (ja)
WO (1) WO2007063701A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102105062A (zh) * 2008-05-09 2011-06-22 国立大学法人广岛大学 一种固定抗菌剂的方法及由该方法获得的产品

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2602021B1 (en) * 2005-12-02 2016-01-06 Sekisui Chemical Co., Ltd. Filler for ion exchange liquid chromatography, method for production of filler for ion exchange liquid chromatography and method for analyzing a glycosylated hemoglobin
JP5812463B2 (ja) * 2010-07-01 2015-11-11 積水メディカル株式会社 液体クロマトグラフィーによる核酸の分離検出方法
JP2012032395A (ja) * 2010-07-09 2012-02-16 Sekisui Medical Co Ltd ヘモグロビン類の測定方法
EP2674753B1 (en) * 2011-02-10 2020-05-13 Sekisui Medical Co., Ltd. Method for separating and detecting a nucleic acid strand
US9169331B2 (en) 2012-12-21 2015-10-27 Dionex Corporation Separation of glycans by mixed-mode liquid chromatography
US9310344B2 (en) 2013-06-14 2016-04-12 Dionex Corporation HILIC/anion-exchange/cation-exchange multimodal media
US20210299635A1 (en) * 2016-08-29 2021-09-30 Showa Denko K.K. Liquid chromatography packing material, liquid chromatography column and method for analyzing amine compound
EP3586958B1 (en) * 2017-02-27 2022-04-06 Showa Denko K.K. Packing material for size exclusion chromatography and method for producing the same
CN110636899B (zh) * 2017-06-30 2023-03-24 昭和电工株式会社 液相色谱用填充剂及液相色谱用柱
KR102048422B1 (ko) * 2018-04-25 2019-11-25 노예솔 부품점검 및 관리용 식별표시 폴리머 라벨 및 그를 이용한 식별표시방법
EP3721998A1 (de) * 2019-04-10 2020-10-14 Philipps-Universität Marburg Verfahren zur erzeugung einer hydrophilen oberfläche auf ps/dvb copolymerpartikeln
CN110314664A (zh) * 2019-06-05 2019-10-11 南京亘闪生物科技有限公司 一种粒径单分散HbA1C离子交换色谱填料合成方法及其应用
JP7258276B2 (ja) * 2019-10-31 2023-04-17 株式会社レゾナック 糖化ヘモグロビン分析用カラムの充填剤の製造方法
CN111077267B (zh) * 2020-01-14 2022-04-29 东莞东阳光科研发有限公司 测定电子光箔中铅含量的方法

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6359463B2 (ja) 1981-04-27 1988-11-18
JPH01262468A (ja) 1988-04-13 1989-10-19 Showa Denko Kk クロマトグラフィー用担体
JPH03118466A (ja) * 1989-09-29 1991-05-21 Sekisui Chem Co Ltd 糖化ヘモグロビンの定量法
JPH087197B2 (ja) 1989-05-23 1996-01-29 積水化学工業株式会社 液体クロマトグラフィー用充填剤とその製造法
JP2000088826A (ja) * 1998-09-09 2000-03-31 Sekisui Chem Co Ltd 液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法
JP2001033069A (ja) 1999-07-22 2001-02-09 Mitsubishi Electric Corp 蓄熱システム及び蓄熱システムの融解方法
JP2001091505A (ja) 1999-09-21 2001-04-06 Sekisui Chem Co Ltd 液体クロマトグラフィー用充填剤
JP2001330969A (ja) 2000-05-23 2001-11-30 Sekisui Chem Co Ltd フォトレジスト除去装置
JP2003024464A (ja) 2001-07-12 2003-01-28 Sekisui Chem Co Ltd 難分解性化合物の分解方法及び難分解性化合物分解装置
JP2003207497A (ja) * 2002-01-10 2003-07-25 Sekisui Chem Co Ltd 溶離液と溶血試薬及びヘモグロビン類の測定方法
JP2006102698A (ja) * 2004-10-07 2006-04-20 Sekisui Chem Co Ltd イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3278462A (en) * 1963-04-22 1966-10-11 Dow Chemical Co Ion exchange resins from diphenyl ether polymeric derivatives, process for making same and use in removing alkylbenzene sulfonates
US3337479A (en) * 1966-05-31 1967-08-22 Dow Chemical Co Preparation of cation-exchange resins
JPS5858026B2 (ja) * 1976-06-25 1983-12-23 昭和電工株式会社 クロマトグラフイ−用充填剤及びその製造法
US5292818A (en) * 1982-07-20 1994-03-08 Sekisui Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Method for producing a carrier for cation exchange liquid chromatography and a method for determining glycosylated hemoglobins using the carrier
US4732887A (en) * 1984-10-12 1988-03-22 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Composite porous material, process for production and separation of metallic element
IL82511A (en) 1986-05-28 1992-09-06 Procter & Gamble Apparatus for and methods of airlaying fibrous webs having discrete particles therein
DE3886110D1 (de) 1987-01-28 1994-01-20 Membrex Inc Hydrophiles erzeugnis und verfahren zur herstellung.
US5030352A (en) * 1990-01-25 1991-07-09 Purdue Research Foundation Coated media for chromatography
US5503933A (en) * 1994-02-25 1996-04-02 Purdue Research Foundation Covalently bonded coatings
JPH087197A (ja) 1994-06-22 1996-01-12 Sumitomo Electric Ind Ltd 道路交通情報表示装置
CN1045610C (zh) * 1995-03-31 1999-10-13 中国科学院化学研究所 液相色谱用粒度单分散大孔交联聚苯乙烯微球的制备
EP0919570A4 (en) * 1996-07-31 2001-05-30 Mitsubishi Chem Corp CATION EXCHANGERS OR CHELATING AGENTS AND THEIR PREPARATION METHOD
SE9700769D0 (sv) * 1997-03-04 1997-03-04 Pharmacia Biotech Ab Matriser för separation och separation som utnyttjar matriserna
JP2001329088A (ja) * 1999-10-18 2001-11-27 Nippon Sheet Glass Co Ltd 二酸化珪素被覆ポリオレフィン樹脂及びその製造方法
JP2002202297A (ja) 2000-12-28 2002-07-19 Mitsuru Akashi アフィニティクロマトグラフィー用有機−無機ハイブリッド体及びその製造方法
KR20040039422A (ko) * 2001-09-28 2004-05-10 쇼와 덴코 가부시키가이샤 입상 소수성 중합체, 그 제조방법 및 역상 고성능 액체크로마토그래피용 칼럼
WO2004112093A2 (en) * 2003-06-06 2004-12-23 P.C.T. Systems, Inc. Method and apparatus to process substrates with megasonic energy
JP4229394B2 (ja) * 2003-08-06 2009-02-25 日本電信電話株式会社 多孔質材料を用いた分子の検出方法ならびに該多孔質材料及び該多孔質材料の製造方法
EP2602021B1 (en) * 2005-12-02 2016-01-06 Sekisui Chemical Co., Ltd. Filler for ion exchange liquid chromatography, method for production of filler for ion exchange liquid chromatography and method for analyzing a glycosylated hemoglobin

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6359463B2 (ja) 1981-04-27 1988-11-18
JPH01262468A (ja) 1988-04-13 1989-10-19 Showa Denko Kk クロマトグラフィー用担体
JPH087197B2 (ja) 1989-05-23 1996-01-29 積水化学工業株式会社 液体クロマトグラフィー用充填剤とその製造法
JPH03118466A (ja) * 1989-09-29 1991-05-21 Sekisui Chem Co Ltd 糖化ヘモグロビンの定量法
JP2000088826A (ja) * 1998-09-09 2000-03-31 Sekisui Chem Co Ltd 液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法
JP2001033069A (ja) 1999-07-22 2001-02-09 Mitsubishi Electric Corp 蓄熱システム及び蓄熱システムの融解方法
JP2001091505A (ja) 1999-09-21 2001-04-06 Sekisui Chem Co Ltd 液体クロマトグラフィー用充填剤
JP2001330969A (ja) 2000-05-23 2001-11-30 Sekisui Chem Co Ltd フォトレジスト除去装置
JP2003024464A (ja) 2001-07-12 2003-01-28 Sekisui Chem Co Ltd 難分解性化合物の分解方法及び難分解性化合物分解装置
JP2003207497A (ja) * 2002-01-10 2003-07-25 Sekisui Chem Co Ltd 溶離液と溶血試薬及びヘモグロビン類の測定方法
JP2006102698A (ja) * 2004-10-07 2006-04-20 Sekisui Chem Co Ltd イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1955764A4 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102105062A (zh) * 2008-05-09 2011-06-22 国立大学法人广岛大学 一种固定抗菌剂的方法及由该方法获得的产品
JPWO2009136561A1 (ja) * 2008-05-09 2011-09-08 国立大学法人広島大学 抗菌剤固定化方法および該方法により得られる物品
US8859009B2 (en) 2008-05-09 2014-10-14 Hiroshima University Method of fixing antibacterial agent and article obtained by the method
JP5618370B2 (ja) * 2008-05-09 2014-11-05 国立大学法人広島大学 抗菌剤固定化方法および該方法により得られる物品

Also Published As

Publication number Publication date
CN101257969B (zh) 2011-08-24
US8968562B2 (en) 2015-03-03
US20090042307A1 (en) 2009-02-12
EP2602021A1 (en) 2013-06-12
CN102258982A (zh) 2011-11-30
KR20080077599A (ko) 2008-08-25
CN101257969A (zh) 2008-09-03
EP2602021B1 (en) 2016-01-06
EP3040120A1 (en) 2016-07-06
KR101555533B1 (ko) 2015-09-24
EP1955764A4 (en) 2012-08-15
CN102258982B (zh) 2013-09-04
US20100330689A1 (en) 2010-12-30
EP1955764A1 (en) 2008-08-13
US7811453B2 (en) 2010-10-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2007063701A1 (ja) 親水性高分子微粒子、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤及びイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法
US9944784B2 (en) Temperature-responsive polymer particles in protein separation applications
US9579629B2 (en) Production process of film and column for cation chromatography
JP3984633B2 (ja) イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法
JP5378623B2 (ja) イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤及び糖化ヘモグロビンの分析方法
JP3990713B2 (ja) イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤及び糖化ヘモグロビンの分析方法
JP2007327821A (ja) イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤、及び、糖化ヘモグロビンの分析方法
JP2004083561A (ja) リポ蛋白質分離用イオン交換体及びそれを用いたリポ蛋白質の分離方法
JP2007271635A (ja) イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤及び糖化ヘモグロビンの分析方法
JP2010236909A (ja) ヘモグロビン類分離用カラム充填剤、ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法、並びに、ヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法
JP2011047859A (ja) ヘモグロビン類分離用カラム充填剤、ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法、並びに、ヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法
JP4746402B2 (ja) 液体クロマトグラフィー用充填剤及びヘモグロビン類の測定方法
JP5522772B2 (ja) カラム充填剤及びカラム充填剤の製造方法
JP2012168054A (ja) 液体クロマトグラフィー用カラム充填剤、液体クロマトグラフィー用カラム充填剤の製造方法、及び、ヘモグロビン類の測定方法
JP4964470B2 (ja) 高分子被膜の形成方法及びこの方法を用いたイオン交換体
JPH11322997A (ja) 多孔質ビーズの製造方法
JP2007326935A (ja) 親水性高分子微粒子
JP2006088072A (ja) イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法
JP2023109603A (ja) 陽イオンクロマトグラフィー用充填剤および陽イオンクロマトグラフィー分析用カラム
JP2010122060A (ja) ヘモグロビン類測定用カラム充填剤、ヘモグロビン類測定用カラム充填剤の製造方法、及び、液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法
JP2012168053A (ja) 液体クロマトグラフィー用カラム充填剤の製造方法、液体クロマトグラフィーによる試料の測定方法、及び、ヘモグロビン類の測定方法

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200680032603.3

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020087005398

Country of ref document: KR

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006832626

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12085936

Country of ref document: US