KR20080077599A - 친수성 고분자 미립자, 이온 교환 액체 크로마토그래피용충전제 및 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의제조방법 - Google Patents

친수성 고분자 미립자, 이온 교환 액체 크로마토그래피용충전제 및 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 수계 매체 중에서의 팽윤을 억제하고, 또한 수계 매체에 대한 분산성이 우수한 친수성 고분자 미립자, 단백질 등의 비특이 흡착을 효과적으로 억제할 수 있는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제, 상기 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 사용한 당화 헤모글로빈의 분석방법, 팽윤, 비특이적 흡착 등의 억제 효과를 장기간에 걸쳐서 유지할 수 있는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방법, 상기 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방법을 사용하여 제조되는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제, 및 당화 헤모글로빈 분석용 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 물 및 아세톤에 각각 분산시켜 초음파를 15분간 조사하고, 25℃에서 240시간 방치하여 평형화시킨 후, 입도 분포 측정기에 의해 입자지름을 각각 측정했을 때, 물에 분산시켰을 때의 입자지름 DW와 아세톤에 분산시켰을 때의 입자지름 DA의 비 DW/DA가 2.0 이하이고, 또한 상기 친수성 고분자 미립자를 단층으로 간격없이 나열한 후에 순수의 액적을 형성시켜서 25℃의 조건하에서 접촉각계에 의해 측정한 물의 접촉각이 70°이하인 것을 특징으로 하는 친수성 고분자 미립자이다.
친수성 고분자 미립자, 이온 교환 크로마토그래피용 충전제, 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방법

Description

친수성 고분자 미립자, 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제 및 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방법{HYDROPHILIC POLYMER MICROPARTICLE, FILLER FOR ION EXCHANGE LIQUID CHROMATOGRAPHY, AND METHOD FOR PRODUCTION OF FILLER FOR ION EXCHANGE LIQUID CHROMATOGRAPHY}
본 발명은 수계 매체 중에서의 팽윤을 억제하고, 또한 수계 매체에 대한 분산성이 우수한 친수성 고분자 미립자, 단백질 등의 비특이 흡착을 효과적으로 억제할 수 있는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제, 상기 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 사용한 당화 헤모글로빈의 분석방법, 팽윤, 비특이 흡착 등의 억제 효과를 장기간에 걸쳐 유지할 수 있는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방법, 상기 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방법을 사용하여 제조되는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제, 및 당화 헤모글로빈 분석용 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제에 관한 것이다.
서브미크론으로부터 미크론 사이즈의 고분자 미립자는 유기 안료, 토너 입자, 액정용 스페이서, 라텍스 미립자, 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제 등, 다방면에 걸쳐서 사용되고 있다. 그 중에서도, 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제로의 응용이 최근 주목되고 있다.
이온 교환 액체 크로마토그래피법은 각종 생체 관련 물질의 분리분석에 매우유효한 방법으로서 알려져 있다. 특히, 최근에는 당화 헤모글로빈류(이하, 헤모글로빈 A1c이라고도 함)의 분석방법으로서 주목되고 있다.
헤모글로빈 A1c은 혈액 중의 당이 헤모글로빈의 β사슬 N말단과 화학적으로 결합한 것으로, 헤모글로빈 중에 차지하는 헤모글로빈 A1c가 차지하는 비율, 즉, 헤모글로빈 A1c와 비당화 헤모글로빈의 합계에 대한 헤모글로빈 A1c의 비율은 1~2개월 기간의 혈당치의 평균을 반영한다고 말해지고 있다. 그 때문에, 헤모글로빈 A1c가 차지하는 비율을 나타내는 헤모글로빈 A1c치(%)는 일시적으로 크게 변동할 수 있는 혈당치 대신에 당뇨병 진단의 지표로서 널리 사용되어오고 있다.
수계 매체에서 사용되는 고분자 미립자의 경우, 수계 매체의 환경 변화에 의한 형상 변화를 억제하는 것을 목적으로 수계 매체에서의 팽윤이 작고, 또한 분산성 향상 등을 목적으로 입자 표면의 친수성이 높은 것이 요구되지만, 특히 이온 교환 액체 크로마토그래피법에 있어서의 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제로서 사용할 경우에는 컬럼내의 압력변동을 작게 하여 평형화를 빠르게 할 목적에서, 수계 용매에 대한 팽윤이 극히 작은 것이 요구된다.
수계 매체에서의 팽윤을 작게 하기 위해서는, 종래 공지의 방법으로서 소수성 가교성 단량체를 많이 사용하여 가교도를 높이는 것으로 대응할 수 있다.
그러나, 소수성 가교성 단량체를 사용하여 이루어지는 미립자에서는 표면의 소수성이 높기 때문에, 수계 매체에서의 분산성이 나쁘다고 하는 문제가 있었다. 또한, 이러한 미립자를 액체 크로마토그래피용 충전제로서 사용했을 경우에는 단백 질 등의 생체 시료를 접촉시킴으로써, 비특이적인 흡착이 일어난다고 하는 문제도 있었다.
이 비특이 흡착은 소수성 상호작용에 의해 야기된다고 생각되기 때문에, 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제 표면의 친수성을 가능한 한 높일 필요가 있다.
이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 친수성을 높이는 방법으로는, 예컨대 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 기재 미립자 부분에 친수성 단량체를 많이 함유시키는 방법 등이 열거된다.
그러나, 친수성 단량체의 함량을 많게 하면 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제 내부의 친수성도 높아져 버려서, 결과적으로 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 기계적 강도가 약해져 버리기 때문에, 고속 분리를 할 수 없거나, 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제 자체가 팽윤을 일으켜서 측정 정밀도의 저하를 초래하거나 한다고 하는 문제가 발생한다.
이들 문제를 해결하는 방법으로는, 예컨대 실리카계 화합물로 이루어진 기제에 이온 교환기를 도입한 것이나, 유기합성 고분자로 이루어진 가교성 입자에 이온 교환기 함유 화합물을 반응시켜서 얻어진 것(특허문헌 1 등)이 알려져 있다. 또한, 가교성 단량체와 이온 교환기 함유 화합물을 반응시켜서 얻어진 것(특허문헌 2 등) 등이 알려져 있다.
또한, 특허문헌 3에는 소수성 가교중합체 미립자의 표면에 친수성 중합체의 층이 형성된 피복 중합체 미립자가 개시되어 있다. 소수성 가교중합체 미립자는 구 성하는 소수성 가교성 단량체에 의해 강하게 가교되어 있기 때문에, 기계적 강도가 높아서 팽윤을 억제할 수 있다. 또한, 형성되는 친수성 중합체의 층의 두께를 1~30nm로 함으로써, 분석 대상물질 등의 비특이 흡착의 방지 및 친수성을 유지한 채 친수성 중합체의 층에 의한 팽윤의 억제를 실현할 수 있다고 되어 있다.
그러나, 현실적으로는 이러한 친수성 중합체의 층의 두께 범위에서 소수성 가교중합체 미립자의 노출을 방지하는 것은 곤란하여, 결과적으로 소수성 상호작용에 기인하는 비특이 흡착을 충분히 방지할 수 없었다.
특히, 당화 헤모글로빈과 같이 임상검사 등에 사용되는 물질을 측정할 경우에는 한층 높은 레벨로 측정 정밀도가 요구되기 때문에, 소수성 상호작용에 기인하는 비특이 흡착을 가능한 한 방지할 필요가 있다.
이것에 반하여 특허문헌 4에는, 이온 교환기를 갖는 충전제 입자 표면을 친수화 처리한, 구체적으로는 이온 교환기를 갖는 충전제 입자 표면에 단백질 등의 친수기를 갖는 화합물을 흡착시켜 친수화한 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제가 개시되어 있다. 이러한 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제에서는 기재가 팽윤하거나 수축하거나 하지 않는 한편, 친수성 표면에 의해 단백질 등의 비특이 흡착을 효과적으로 방지할 수 있다. 그러나, 이렇게 물리흡착에 의해 친수성 화합물이 고정화되어 있을 경우, 사용 초기의 단계에서는 높은 성능을 발휘할 수 있지만, 장기간 사용하고 있는 동안에 충전제 입자의 표면으로부터 친수성 화합물이 탈리하여 버려서 유지시간이나 측정치가 변동하는 일이 있다는 문제가 있었다. 또한, 흡착시키는 친수성 화합물의 로트(lot)간 차이에 의해서도 유지시간이나 측정 치가 변동한다고 하는 문제점도 있었다.
특허문헌 1: 일본 특허공개 평1-262468호 공보
특허문헌 2: 일본 특허공고 소63-59463호 공보
특허문헌 3: 일본 특허공고 평8-7197호 공보
특허문헌 4: 일본 특허공개 2001-91505호 공보
본 발명은 상기 현재의 상황을 감안하여, 수계 매체 중에서의 팽윤을 억제하고, 또한 수계 매체에 대한 분산성이 우수한 친수성 고분자 미립자, 단백질 등의 비특이 흡착을 효과적으로 억제할 수 있는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제, 상기 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 사용한 당화 헤모글로빈의 분석방법, 팽윤, 비특이 흡착 등의 억제 효과를 장기간에 걸쳐 유지할 수 있는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방법, 상기 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방법을 사용하여 제조되는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제, 및 당화 헤모글로빈 분석용 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은, 물 및 아세톤에 각각 분산시켜 초음파를 15분간 조사하고, 25℃에서 240시간 방치하여 평형화시킨 후, 입도 분포 측정기에 의해 입자지름을 각각 측정했을 때, 물에 분산시켰을 때의 입자지름 DW와 아세톤에 분산시켰을 때의 입자지름 DA의 비 DW/DA가 2.0 이하이고, 또한 상기 친수성 고분자 미립자를 단층으로 간격없이 나열한 후에 순수의 액적을 형성시켜서 25℃의 조건하에서 접촉각계에 의해 측정한 물의 접촉각이 70°이하인 친수성 고분자 미립자이다.
또한, 본 발명은 기재 미립자와 상기 기재 미립자의 표면에 존재하는 이온 교환기로 이루어진 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제로서, 물 및 아세톤에 각각 분산시켜 초음파를 15분간 조사하고, 25℃에서 240시간 방치하여 평형화시킨 후, 입도 분포 측정기에 의해 입자지름을 각각 측정했을 때, 물에 분산시켰을 때의 입자지름 DW와 아세톤에 분산시켰을 때의 입자지름 DA의 비 DW/DA가 2.0 이하이고, 또한 상기 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 단층으로 간격없이 나열한 후에 순수의 액적을 형성시켜서 25℃의 조건하에서 접촉각계에 의해 측정한 물의 접촉각이 60°이하인 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제이다.
본 발명은 이온 교환기를 갖고, 물의 접촉각이 60°이하이고, 표면이 친수성 화합물로 피복되어 있지 않은 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제이다.
또한, 본 발명은 합성 유기고분자로 이루어진 소수성 가교중합체 입자와 상기 소수성 가교중합체 입자의 표면에 공중합된 이온 교환기를 갖는 친수성 중합체로 이루어진 층으로 이루어진 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제로서, 최표면이 오존수에 의해 친수화 처리가 실시되어 있는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제이다.
또한, 본 발명은 이온 교환기를 갖는 충전제 입자 표면을 용존 오존가스 농도가 20ppm 이상인 오존수를 사용하여 세정함으로써 친수화하는 친수화 공정을 포함하는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방법으로서, 상기 친수화 공정에 있어서, 촉진 산화법에 의한 처리를 행하는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방법이다.
이하에, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 예의 검토한 결과, 고분자 미립자의 DW/DA(이하, 팽윤도라고도 함) 및 표면에 대한 물의 접촉각을 일정 범위로 함으로써, 수계 매체에서의 팽윤을 억제하고, 또한 수계 매체에 대한 분산성이 우수한 친수성 고분자 미립자를 얻을 수 있다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 친수성 고분자 미립자는, 물 및 아세톤에 각각 분산시켜 초음파를 15분간 조사하고, 25℃에서 240시간 방치하여 평형화시킨 후, 입도 분포 측정기에 의해 입자지름을 각각 측정했을 때, 물에 분산시켰을 때의 입자지름 DW와 아세톤에 분산시켰을 때의 입자지름 DA의 비 DW/DA가 2.0이다.
일반적으로, 고분자 미립자는 유기용매 중에서는 수축하고, 수계 매체 중에서는 정도에 상관없이 팽윤하는 경향이 있다. 따라서, 수계 매체 중에서의 팽윤의 정도가 크면 DW/DA가 커지고, 반대로 수계 매체 중에서의 팽윤의 정도가 작으면 DW/DA가 작아진다. DW/DA가 2.0을 초과하면, 수계 매체 중에서의 팽윤의 정도가 지나치게 크기 때문에, 예컨대 액체 크로마토그래피용 충전제에 사용했을 경우에는 압력변동이 커져서, 평형화에 시간이 걸리기 때문에 실용적이지는 않다. 또한, 수성도료에 사용했을 경우에는 도장 전의 점도 상승을 초래하여 작업성이 나빠져서 실용적이지 않다. 바람직한 하한은 1.0, 바람직한 상한은 1.8이다.
상기 입도 분포 측정기로는 특별히 한정하지 않고, 예컨대 Accusizer 780(Particle Sizing Systems 제품) 등이 열거된다.
또한, 본 발명의 친수성 고분자 미립자는 상기 친수성 고분자 미립자를 단층으로 간격없이 나열한 후에 순수 액적을 형성시켜서 25℃의 조건하에서 접촉각계에 의해 측정한 물의 접촉각이 70°이하이다.
접촉각 측정은 고분자 재료를 비롯해, 표면의 친수성, 소수성을 평가하는 방법으로서 사용된다. 물의 접촉각이 작을 수록 친수성이 높다고 판단되고, 본 발명에 있어서는 상한을 70°로 함으로써 친수성이 대폭 향상되어 물로의 분산성이 향상되고, 또한 본 발명의 친수성 고분자 미립자를 액체 크로마토그래피용 충전제로서 사용했을 경우에는 단백질 등의 생체 시료를 접촉시켜도 비특이적인 흡착을 일으키는 일이 거의 없다. 또한, 수성 도료에 사용했을 경우에는 분산성이 양호하기 때문에, 도장 작업성이 향상된다. 바람직한 상한은 60°이다.
상기 접촉각계로는, 예컨대 Kyowa Interface Science Co., Ltd. 제품의 Dropmaster 500 등의 자동 접촉각계를 사용할 수 있다.
상기 물의 접촉각은 상술한 바와 같은 접촉각계를 사용하여, 액적의 좌우단점과 정점을 연결하는 직선의 고체 표면에 대한 각도로부터 접촉각을 구하는 방법(θ/2법) 등에 의해 측정할 수 있고, 구체적으로는 이하와 동일한 방법이 열거된다.
마이크로스코프(microscope)로 확인하면서, 건조시킨 친수성 고분자 미립자를 슬라이드 유리 상에 부착한 양면 테이프 상에 단층으로 간격없이 적재하고, 그 후 에어 스프레이로 여분의 친수성 고분자 미립자를 제거하고, 양면 테이프 상에 친수성 고분자 미립자를 고정화한다. 25℃의 순수 1μL의 액적을 제조하고, 슬라이드 유리 상에 고정화한 친수성 고분자 미립자에 착액시키고, 접촉각계를 사용하여 접촉각을 θ/2법에 의해 산출한다. 또한, 접촉각이 90°보다 작을 경우, 착액후의 액적은 퍼져 나가려고 하기 때문에, 착액후의 접촉각은 경시적으로 작아진다. 그래서, 착액후 0.5초 후의 접촉각치를 사용하여 평가를 행한다.
본 발명의 친수성 고분자 미립자는 팽윤도가 상기 범위를 만족시킴으로써 수계 매체 중에서라도 거의 팽윤하지 않게 되어, 물의 접촉각이 상기 범위를 만족시킴으로써 수계 매체에 대한 분산성이 우수한 것이 된다.
상기 팽윤도의 범위와 상기 물의 접촉각의 범위를 만족시키는 친수성 고분자 미립자로는 구체적으로는, 예컨대 물용해도가 5중량% 이하인 소수성 가교성 단량체 및/또는 소수성 비가교성 단량체로 이루어진 소수성 가교중합체로 이루어지고, 최표면에 친수화 처리가 실시되어 있는 미립자를 열거할 수 있다.
상기 소수성 가교중합체는 1종의 물용해도가 5중량% 이하인 소수성 가교성 단량체를 단독 중합해서 얻어지는 소수성 가교중합체(예컨대, 에틸렌글리콜 디메타아크릴레이트 단독으로 이루어진 중합체, 디비닐벤젠 단독으로 이루어진 중합체 등); 2종 이상의 물용해도가 5중량% 이하인 소수성 가교성 단량체를 공중합하여 얻어지는 소수성 가교중합체(예컨대, 에틸렌글리콜 디메타아크릴레이트와 트리메티롤프로판 트리메타아크릴레이트로 이루어진 공중합체, 디비닐벤젠과 디비닐 톨루엔으로 이루어진 공중합체 등); 적어도 1종의 물용해도가 5중량% 이하인 소수성 가교성 단량체와 적어도 1종의 물용해도가 5중량% 이하인 소수성 비가교성 단량체를 공중합하여 얻어지는 소수성 가교중합체(예컨대, 에틸렌글리콜 디메타아크릴레이트, 트리메티롤프로판 트리메타아크릴레이트 및 부틸 메타아크릴레이트로 이루어진 공중합체, 디비닐벤젠과 스티렌으로 이루어진 공중합체 등) 중 어느 것이어도 좋다.
상기 물용해도가 5중량% 이하인 소수성 가교성 단량체로는 단량체 1분자 중에 비닐기를 2개 이상 갖는 것이면 특별히 한정하지 않고, 예컨대 에틸렌글리콜 디(메타)아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 디(메타)아크릴레이트, 프로필렌글리콜 디(메타)아크릴레이트, 폴리프로필렌글리콜 디(메타)아크릴레이트 등의 디(메타)아크릴산 에스테르; 테트라메티롤메탄 트리(메타)아크릴레이트, 트리메티롤프로판 트리(메타)아크릴레이트, 테트라메티롤메탄 테트라(메타)아크릴레이트 등의 트리(메타)아크릴산 에스테르 또는 테트라(메타)아크릴산 에스테르; 디비닐벤젠, 디비닐 톨루엔, 디비닐크실렌, 디비닐나프탈렌 등의 방향족계 화합물 등이 열거된다.
여기에서, 물용해도란 물 100mL에 단량체 20mL을 가하고, 실온에서 10분간×3회 교반하여 20℃의 보온기에서 밤새 방치하고, 그 후 물에 용해된 단량체량을 수소불꽃 가스크로마토그래피로 이중결합(PSDB)법에 의해 측정하여 산출한 값이다.
상기 물용해도가 5중량% 이하인 소수성 비가교성 단량체로는 소수성 성질을 갖는 비가교성의 중합성 유기 단량체이면 특별히 한정하지 않고, 예컨대 메틸(메타)아크릴레이트, 에틸(메타)아크릴레이트, 프로필(메타)아크릴레이트, 이소프로필(메타)아크릴레이트, 부틸(메타)아크릴레이트, t-부틸(메타)아크릴레이트 등의 (메타)아크릴산 에스테르; 스티렌, 메틸스티렌 등의 스티렌계 단량체 등이 열거된다.
상기 소수성 가교중합체가 상기 물용해도가 5중량% 이하인 소수성 가교성 단량체와 상기 물용해도가 5중량% 이하인 소수성 비가교성 단량체의 공중합으로 이루어진 경우에는 물용해도가 5중량% 이하인 소수성 비가교성 단량체의 사용량은 물용해도가 5중량% 이하인 소수성 가교성 단량체 100중량부에 대해서 50중량부 이하인 것이 바람직하다.
최표면을 친수화 처리하는 방법으로는 특별히 한정하지 않고, 예컨대 고분자 미립자의 표면에 오존수 처리, 오존가스 처리, 플라스마 처리, 코로나 처리, 과산화수소수, 차아염소산 나트륨 등에 의한 표면 산화처리 등을 실시하는 방법이나 단백질이나 다당류를 비롯한 생체 유래의 친수성 화합물이나 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴산, 인지질 폴리머 등의 친수성 고분자 화합물을 고분자 미립자의 표면에 대해서 물리흡착 또는 화학결합시키는 방법 등이 열거된다.
그 중에서도, 제조시의 작업성, 로트 관리의 용이성, 경시적 성능 유지 등을 고려하면, 오존수 처리가 바람직하다.
상기 오존수란 오존가스가 물에 용해된 것을 의미한다. 오존에는 강력한 산화작용이 있지만, 오존가스에서는 고분자 미립자 표면을 균일하게 산화시킴으로써 친수화 처리를 실시하는 것이 매우 어렵다.
그러나, 오존수를 사용함으로써, 오존수 중에 고분자 미립자를 분산시키는 것만으로 고분자 미립자 표면을 간편하게 산화시켜 친수화 처리를 실시할 수 있다. 친수화 처리의 결과, 소수성 구조 부분이 산화되어 친수성기(-OH, -CHO, -COOH 등)가 생성된다고 생각된다.
상기 오존수에 있어서의 용존 오존가스의 농도로는 특별히 한정하지 않지만, 바람직한 하한은 20ppm이다. 20ppm 미만이면, 친수화 처리에 시간이 걸리거나, 충분한 친수화 처리를 실시할 수 없어, 고분자 미립자를 액체 크로마토그래피용 충전제로서 사용했을 경우에 측정 대상물질 등의 비특이 흡착을 충분히 억제할 수 없게 된다. 보다 바람직한 하한은 50ppm이다. 또한, 농도의 바람직한 상한은 특별히 없다.
상기 오존수의 제조방법으로는 특별히 한정하지 않고, 예컨대 일본 특허공개 2001-330969호 공보 등에 기재되어 있는 바와 같이, 원료수와 오존가스를 기체만을 투과시키고 액체의 투과를 저지하는 오존가스 투과막을 거쳐서 접촉시키는 방법 등이 열거된다.
또한, 상기 오존수 처리를 행할 때에는 촉진 산화 처리법을 사용하는 것이 바람직하다. 촉진 산화 처리법이란 오존수의 산화작용을 증강시키는 방법을 말하고, 자외선 조사, 초음파 조사, 알칼리수 첨가 등의 용존 오존의 분해를 촉진하는 방법을 단독으로 사용하거나 또는 2종 이상을 병용하는 것을 말한다.
이와 같은 촉진 산화 처리법에 의한 처리를 행함으로써 용존 오존의 분해가 촉진되고, 오존의 분해에 의해서 생성되는 히드록시 라디칼의 생성량이 증가한다. 이와 같이 하여 생성된 히드록시라디칼은 오존 보다도 더욱 높은 산화력을 갖기 때문에, 친수화 처리의 효과를 더욱 높이는 것이 가능하게 된다고 생각된다. 상기 촉진 산화 처리법을 이용한 경우, 고분자 미립자의 표면에 있어서의 친수기(-OH, -CHO, -COOH 등)의 생성을 더욱 촉진하는 것이 가능하게 된다.
또한, 친수성 처리를 행하지 않아도, 고분자 미립자의 표면에 대한 물의 접촉각이 70° 이하인 경우에는 특별히 친수화 처리를 행할 필요가 없다.
본 발명의 친수성 고분자 미립자의 평균 입자지름으로는 특별히 한정하지 않고, 목적에 따른 입자지름에 적용할 수 있다.
본 발명의 친수성 고분자 미립자의 입도분포(CV치)로는 특별히 한정하지 않지만, 바람직하게는 상한은 40%이다. 40%를 초과하면 실용적이지 않다. 보다 바람직하게는 상한은 15%이다.
본 발명의 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제는 기재 미립자와 상기 기재미립자의 표면에 존재하는 이온 교환기로 이루어진 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제로서, 물 및 아세톤에 각각 분산시켜 초음파를 15분간 조사하고, 25℃에서 240시간 방치하여 평형화시킨 후, 입도 분포 측정기에 의해 입자지름을 각각 측정했을 때, 물에 분산시켰을 때의 입자지름 DW와 아세톤에 분산시켰을 때의 입자지름 DA의 비 DW/DA가 2.0 이하이고, 또한 상기 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 단층으로 간격없이 나열한 후에 순수의 액적을 형성시켜서 25℃의 조건하에서 접촉각계에 의해 측정한 물의 접촉각이 60°이하이다.
이하에 본 발명의 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 상술한다.
본 발명자들은 예의 검토한 결과, 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 DW/DA(이하, 팽윤도이라고도 함) 및 표면에 대한 물의 접촉각을 일정 범위로 함으로써, 수계 매체 중에서의 팽윤을 억제하고, 또한 단백질 등의 비특이 흡착을 효과적으로 억제할 수 있다는 것을 발견하고, 본 발명의 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제는 물 및 아세톤에 각각 분산시켜 초음파를 15분간 조사하고, 25℃에서 240시간 방치하여 평형화시킨 후, 입도 분포 측정기에 의해 입자지름을 각각 측정했을 때, 물에 분산시켰을 때의 입자지름 DW와 아세톤에 분산시켰을 때의 입자지름 DA의 비 DW/DA의 상한이 2.0이다. 일반적으로, 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제는 유기용매 중에서는 수축하고, 수계 매체에서는 정도에 상관없이 팽윤하는 경향이 있다. 따라서, 수계 매체 중에서의 팽윤의 정도가 크면 DW/DA가 커지고, 반대로 수계 매체 중에서의 팽윤의 정도가 작으면 DW/DA가 작아진다.
DW/DA가 2.0을 초과하면, 수계 매체 중에서의 팽윤의 정도가 지나치게 크기 때문에, 컬럼내의 압력변동이 커져서 평형화에 시간이 걸리기 때문에 실용적이지 않다. 바람직한 하한은 1.0, 바람직한 상한은 1.8이다.
상기 입도 분포 측정기로는 특별히 한정하지 않고, 예컨대 Accusizer 780(Particle Sizing Systems제품) 등이 열거된다.
또한, 본 발명의 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제는 상기 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 단층으로 간격없이 나열한 후에 순수의 액적을 형성시켜서 25℃의 조건하에서 접촉각계에 의해 측정한 물의 접촉각의 상한이 60°이다. 접촉각 측정은 고분자 재료를 비롯해, 표면의 친수성, 소수성을 평가하는 방법으로서 사용된다. 물의 접촉각이 작을 수록 친수성이 높다고 판단되고, 본 발명에 있어서는 상한을 60°으로 함으로써 친수성이 대폭 향상되어, 단백질 등의 생체 시료를 접촉시켰을 경우의 비특이적 흡착이 적다. 보다 바람직한 상한은 50°이다. 또한, 물의 접촉각은 본 발명의 친수성 고분자 미립자의 경우와 동일한 접촉각계를 사용하여, 동일한 방법으로 측정할 수 있다.
본 발명의 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제는 팽윤도가 상기 범위를 만족함으로써 수계 매체에서도 거의 팽윤하지 않는 것으로 되고, 물의 접촉각이 상기 범위를 만족함으로써 단백질 등의 생체 시료를 접촉시켜도 비특이적인 흡착이 일어나 측정 정밀도가 저하하는 일이 없다.
본 발명의 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제는 종래 공지의 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제와 마찬가지로 기재 미립자와 상기 기재 미립자의 표면에 존재하는 이온 교환기로 이루어진 것이다.
상기 팽윤도의 범위와 상기 물의 접촉각의 범위를 만족시키는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제로는 구체적으로는, 예컨대 물용해도가 5중량% 이하인 소수성 가교성 단량체 및/또는 소수성 비가교성 단량체로 이루어진 소수성 가교중합체로 이루어진 기재 미립자와 상기 기재 미립자의 표면에 존재하는 이온 교환기로 이루어지고, 최표면에 친수화 처리가 실시되어 있는 것을 열거할 수 있다.
또한, 상기 소수성 가교중합체 및 최표면을 친수화 처리하는 방법에 대해서는 본 발명의 친수성 고분자 미립자의 경우와 동일하기 때문에, 그 상세한 설명은 생략한다.
상기 친수화 처리는 기재 미립자의 표면에 이온 교환기를 도입하기 전에 행해도 좋고, 기재 미립자의 표면에 이온 교환기를 도입한 후에 행해도 좋다.
또한, 친수화 처리를 행하지 않아도 표면에 대한 물의 접촉각이 60°이하일 경우에는 특별히 친수화 처리를 행할 필요가 없다.
상기 이온 교환기로는 특별히 한정하지 않고, 예컨대 술폰산기, 카르복실기, 인산기 등이 열거된다. 그 중에서도, 술폰산기를 사용할 경우에는 장기간에 걸쳐 성능을 유지할 수 있고, 또한 헤모글로빈 A1c 등의 분석에도 높은 효과가 얻어지기 때문에 적합하다.
상기 이온 교환기의 도입방법으로는 특별히 한정하지 않고, 예컨대 일본 특허공고 평8-7197호 공보에 기재되어 있는 바와 같이 기재 미립자 표면에 이온 교환기를 갖는 단량체를 공중합시키는 방법 등이 열거된다.
상기 이온 교환기를 갖는 친수성 단량체는 특별히 한정하지 않고, 수계 매체 중에 용해가능한 중합성 단량체 중에서 본 발명의 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 사용 목적에 따라서 선택하면 좋고, 양이온 교환 액체 크로마토그래피에 사용할 경우에는, 예컨대 아크릴산, 메타크릴산 등의 카르복실기를 갖는 단량체, 스티렌술폰산, 알릴술폰산, 2-(메타)아크릴아미드-2-메틸프로판 술폰산 등의 술폰산기를 갖는 단량체, ((메타)아크릴로일옥시에틸)산 포스페이트, (2-(메타)아크릴로일옥시에틸)산 포스페이트 등의 인산기를 갖는 단량체 등이 열거되고, 그 중에서도 술폰산기를 갖는 단량체가 적합하게 사용되고, 음이온 교환 액체 크로마토그래피에 사용할 경우에는, 예컨대 디메틸아미노에틸 (메타)아크릴레이트, 디에틸아미노에틸 (메타)아크릴레이트, 알릴아민 등의 아미노기를 갖는 단량체 등이 사용된다.
또한, 이온 교환기를 포함하는 단량체를 1종 이상 포함하면 친수성을 높일 목적에서 이온 교환기를 포함하지 않는 친수성 단량체와 공중합시켜도 좋다.
또한, 관능기를 갖는 단량체를 기재 미립자 표면에서 공중합시키고, 그 관능기에 이온 교환기를 갖는 화합물을 반응시켜서 기재 미립자 표면에 이온 교환기를 도입하는 방법을 사용할 수도 있다.
본 발명의 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 평균 입자지름으로는 특별히 한정하지 않지만, 바람직한 하한은 0.1㎛, 바람직한 상한은 20㎛이다. 0.1㎛ 미만이면, 컬럼내가 지나치게 고압으로 되어서 분리 불량이 일어나는 경우가 있고, 20㎛를 초과하면 컬럼내의 데드볼륨(Dead Volume)이 지나치게 커져서 분리 불량이 일어나는 경우가 있다.
본 발명의 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 입도 분포(CV치)로는 특별히 한정하지 않지만, 바람직한 상한은 40%이다. 40%를 초과하면 컬럼내의 데드볼륨이 지나치게 커져서 분리 불량이 일어나는 경우가 있다. 보다 바람직한 상한은 15%이다.
본 발명의 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제는 당화 헤모글로빈 등의 헤모글로빈류(Hb)의 측정에 사용할 수 있다. 이러한 당화 헤모글로빈류의 측정 방법도 또한 본 발명의 하나이다.
구체적으로는, 예컨대 본 발명의 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 공지의 컬럼에 충전한 후, 얻어진 컬럼에 소정의 조건에서 용리액 및 측정 시료를 송액함으로써 헤모글로빈류를 측정할 수 있다.
상기 용리액으로는 종래 공지의 것을 사용할 수 있고, 예컨대 유기산, 무기산 또는 이들의 염류를 성분으로 하는 액 등을 사용할 수 있다.
다른 실시형태의 본 발명의 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제는 이온 교환기를 갖고, 물의 접촉각이 60°이하이고, 표면이 친수성 화합물로 피복되어 있지 않은 것이다. 이하에 다른 실시형태의 본 발명의 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 예의 검토한 결과, 표면을 친수성 화합물로 피복하지 않고, 충전제 표면에 대한 물의 접촉각을 일정한 범위로 함으로써, 소수성 상호작용에 기인하는 비특이 흡착을 충분히 억제할 수 있어, 결과적으로 높은 측정 정밀도를 갖기 때문에, 각종 분리 분석에 매우 유효한 충전제를 얻을 수 있다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
다른 실시형태의 본 발명의 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제(이하, 간단히 다른 실시형태의 본 발명의 충전제이라고도 함)은 물의 접촉각이 60°이하이다.
여기에서, 접촉각 측정은 고분자 재료를 비롯해, 표면의 친수성, 소수성을 평가하는 방법으로서 사용되고, 물의 접촉각이 작을 수록 친수성이 높다고 판단된다.
따라서, 물의 접촉각을 60°이하로 함으로써 친수성이 대폭 향상되고, 소수성 상호작용에 기인하는 단백질 등의 측정 대상물질의 비특이 흡착을 충분히 억제할 수 있다. 바람직하게는 50°이하이다.
또한, 상기 물의 접촉각은, 예컨대 자동 접촉각계를 사용하여, 액적의 좌우단점과 정점을 연결하는 직선의 고체 표면에 대한 각도로부터 접촉각을 구하는 방법(θ/2법) 등에 의해 측정할 수 있다.
다른 실시형태의 본 발명의 충전제는 표면이 친수성 화합물로 피복되어 있지 않다. 또한, 본 명세서에 있어서, 「표면이 친수성 화합물로 피복되어 있지 않은」이란 단백질이나 다당류를 비롯한 생체 유래의 친수성 화합물이나 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 인지질 폴리머 등의 합성 고분자 친수성 화합물이 충전제의 기재표면에 대해서 물리흡착 또는 화학결합하지 않는 것을 의미한다.
표면이 친수성 화합물로 피복되어 있지 않음으로써, 친수성 화합물이 탈락하거나 하는 일도 없어서 장기간에 걸쳐 친수성을 유지할 수 있다.
다른 실시형태의 본 발명의 충전제의 표면에 대한 물의 접촉각을 60°이하로 하는 방법으로는 특별히 한정하지 않고, 예컨대 충전제의 기재에 오존수 처리, 오존가스 처리, 플라스마 처리, 코로나 처리, 과산화수소수, 차아염소산 나트륨 등에 의한 표면 산화 처리 등의 친수화 처리하는 방법 등이 열거된다. 그 중에서도, 오존수에 의해 친수화 처리하는 것이 바람직하다.
또한, 충전제의 기재가 친수화 처리를 행하지 않아도 물의 접촉각이 60°이하일 경우에는 특별히 친수화 처리를 행할 필요가 없다.
다른 실시형태의 본 발명의 충전제의 기재로는 특별히 한정하지 않고, 예컨대 중합성 단량체 등을 사용한 합성 고분자 미립자, 무기미립자 등을 사용할 수 있지만, 합성 유기고분자로 이루어진 소수성 가교중합체 입자와 상기 소수성 가교중합체 입자의 표면에 공중합된 이온 교환기를 갖는 친수성 중합체로 이루어진 층으로 이루어지는 것이 바람직하다. 또한, 이러한 기재를 사용할 경우에는 최표면이 오존수에 의해 친수화 처리가 실시되어 있는 것이 바람직하다.
이러한 기재를 사용한 경우, 소수성 입자를 사용함으로써 충전제로서의 기계적 강도를 유지하면서, 입자 표면을 친수성 층에 의해 피복하고, 친수화 처리를 더 행함으로써, 소수성 상호작용에 기인하는 비특이 흡착을 충분히 억제할 수 있어, 결과적으로 높은 측정 정밀도를 가지기 때문에 각종 분리분석에 매우 유효한 충전제를 얻을 수 있다.
다른 실시형태의 본 발명의 충전제는 이온 교환기를 갖는다. 상기 이온 교환기로는, 예컨대 술폰산기, 카르복실기, 인산기 등이 열거된다. 이들 중 특히 술폰산기가 바람직하다.
다른 실시형태의 본 발명의 충전제의 또 다른 실시형태로서, 합성 유기고분자로 이루어진 소수성 가교중합체 입자와 상기 소수성 가교중합체 입자의 표면에 공중합된 이온 교환기를 갖는 친수성 중합체로 이루어진 층으로 이루어진 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제로서, 최표면이 오존수에 의해 친수화 처리가 실시되어 있는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제가 있다.
또 다른 실시형태의 본 발명의 충전제는 합성 유기고분자로 이루어진 소수성 가교중합체 입자와 상기 소수성 가교중합체 입자의 표면에 공중합된 이온 교환기를 갖는 친수성 중합체로 이루어진 층으로 이루어진다.
상기 소수성 가교중합체는 1종의 소수성 가교성 단량체를 단독 중합해서 얻어지는 소수성 가교중합체, 2종 이상의 소수성 가교성 단량체를 공중합하여 얻어진 소수성 가교중합체, 적어도 1종의 소수성 가교성 단량체와 적어도 1종의 소수성 비가교성 단량체를 공중합하여 얻어지는 소수성 가교중합체 중 어느 것이어도 좋다.
상기 소수성 가교성 단량체로는 단량체 1분자 중에 비닐기를 2개 이상 갖는 것이면 특별히 한정하지 않고, 예컨대 에틸렌글리콜 디(메타)아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 디(메타)아크릴레이트, 프로필렌글리콜 디(메타)아크릴레이트, 폴리프로필렌글리콜 디(메타)아크릴레이트 등의 디(메타)아크릴산 에스테르; 테트라메티롤메탄 트리(메타)아크릴레이트, 트리메티롤프로판 트리(메타)아크릴레이트, 테트라메티롤메탄 테트라(메타)아크릴레이트 등의 트리(메타)아크릴산 에스테르 또는 테트라(메타)아크릴산 에스테르; 디비닐벤젠, 디비닐톨루엔, 디비닐크실렌, 디비닐나프탈렌 등의 방향족계 화합물 등이 열거된다.
상기 소수성 비가교성 단량체로는 소수성 성질을 갖는 비가교성의 중합성 유기 단량체이면 특별히 한정하지 않고, 예컨대 메틸(메타)아크릴레이트, 에틸 (메타)아크릴레이트, 프로필(메타)아크릴레이트, 이소프로필(메타)아크릴레이트, 부틸(메타)아크릴레이트, t-부틸(메타)아크릴레이트 등의 (메타)아크릴산 에스테르; 스티렌, 메틸스티렌 등의 스티렌계 단량체 등이 열거된다.
상기 소수성 가교중합체가 상기 소수성 가교성 단량체와 상기 소수성 비가교성 단량체의 공중합으로 이루어진 경우에는 상기 소수성 가교성 단량체가 전체 단량체 100중량부에 대해서 10중량부 이상인 것이 바람직하고, 20중량부 이상인 것이 보다 바람직하다.
상기 이온 교환기를 갖는 친수성 중합체는 이온 교환기를 갖는 친수성 단량체로 구성된 것으로, 이온 교환기를 갖는 친수성 단량체를 1종 이상 포함하면 좋고, 즉 이온 교환기를 갖는 친수성 단량체 단독으로 중합시키고, 이온 교환기를 갖는 친수성 단량체와 이온 교환기를 갖지 않은 친수성 단량체를 공중합시키는 방법 등이 열거된다.
상기 이온 교환기를 갖는 친수성 단량체로는 특별히 한정하지 않고, 수성 분산매 중에 용해가능한 중합성 단량체 중에서 본 발명의 충전제의 사용 목적에 따라서 선택하면 좋고, 양이온 교환 액체 크로마토그래피에 사용할 경우에는, 예컨대 아크릴산, 메타크릴산 등의 카르복실기를 갖는 단량체, 스티렌술폰산, 알릴술폰산, 2-(메타)아크릴아미드-2-메틸프로판 술폰산 등의 술폰산기를 갖는 단량체, ((메타)아크릴로일옥시에틸)산 포스페이트, (2-(메타)아크릴로일옥시에틸)산 포스페이트 등의 인산기를 갖는 단량체 등이 열거되고, 그 중에서도 술폰산기를 갖는 단량체가 적합하게 사용되고, 음이온 교환 액체 크로마토그래피에 사용할 경우에는, 예컨대 디메틸아미노에틸 (메타)아크릴레이트, 디에틸아미노에틸 (메타)아크릴레이트, 알릴아민 등의 아미노기를 갖는 단량체 등이 사용된다.
상기 이온 교환기를 갖지 않은 친수성 단량체로는 특별히 한정하지 않고, 수성 분산매 중에 용해가능한 중합성 단량체 중에서 본 발명의 충전제의 사용 목적에 따라서 선택하면 좋고, 예컨대 2-히드록시에틸 (메타)아크릴레이트, 글리세롤 모노(메타)아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 모노(메타)아크릴레이트, 메톡시폴리에틸렌글리콜 모노(메타)아크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 비닐피롤리돈 등이 열거된다.
상기 이온 교환기를 갖는 친수성 단량체와 상기 이온 교환기를 갖지 않은 친수성 단량체를 혼합해서 사용할 경우에는 혼합비율로는 특별히 한정하지 않고, 필요한 이온 교환기 용량에 따라 혼합비율을 결정하면 좋다.
또 다른 실시형태의 본 발명의 충전제는 최표면이 오존수에 의해 친수화 처리가 실시되어 있다.
오존은 이중결합과의 반응성이 높은 것이 알려져 있다. 이중결합과 반응한 오존은 중간체인 오조나이드를 형성하고, 그 후에 카르복실기 등이 형성된다. 본 발명에 있어서는 친수성 중합체로 피복한 후, 표면에 노출되는 소수성 가교중합체의 구조는 미반응의 비닐기, 즉 이중결합이라고 생각되기 때문에 오존에 의해 효과적으로 산화 처리를 실시할 수 있다.
상기 오존수란 오존가스가 물에 용해된 것을 의미한다.
또한, 상기 오존수의 용존 오존가스 농도, 제조방법에 대해서는 본 발명의 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 경우와 동일하기 때문에 그 자세한 설명을 생략한다.
또 다른 실시형태의 본 발명의 충전제의 접촉각도 상술한 바와 마찬가지로 60°이하인 것이 바람직하고, 50°이하인 것이 보다 바람직하다.
또 다른 실시형태의 본 발명의 충전제의 제조방법으로는 특별히 한정하지 않고, 종래 공지의 방법에 의해 상기 피복 중합체 입자를 제조하고, 오존수 중에 상기 피복 중합체 입자를 분산시킴으로써, 친수화 처리를 더 실시하면 좋다.
상술한 다른 실시형태의 본 발명 및 또 다른 실시형태의 본 발명의 충전제의 평균 입자지름으로는 특별히 한정하지 않지만, 바람직한 하한은 0.1㎛, 바람직한 상한은 20㎛이다. 0.1㎛ 미만이면, 컬럼내가 지나치게 고압으로 되어서 분리 불량이 일어나는 경우가 있고, 20㎛를 초과하면 컬럼내의 데드볼륨이 지나치게 커져서 분리 불량이 일어나는 경우가 있다.
상술한 다른 실시형태의 본 발명 및 또 다른 실시형태의 본 발명의 충전제의 입도 분포(CV치)로는 특별히 한정하지 않지만, 바람직한 상한은 40%이다. 40%를 초과하면 컬럼내의 데드볼륨이 지나치게 커져서 분리 불량이 일어나는 경우가 있다. 보다 바람직한 상한은 15%이다.
상기 다른 실시형태의 본 발명 및 또 다른 실시형태의 본 발명의 충전제는 당화 헤모글로빈 등의 헤모글로빈류(Hb)의 측정에 사용할 수 있다. 이러한 당화 헤모글로빈류의 측정 방법도 또한 본 발명의 하나이다.
구체적으로는, 예컨대 상기 다른 실시형태의 본 발명 및 또 다른 실시형태의 본 발명의 충전제를 공지의 컬럼에 충전한 후, 얻어진 컬럼에 소정의 조건에서 용리액 및 측정 시료를 송액함으로써 헤모글로빈류를 측정할 수 있다.
상기 용리액으로는 종래 공지의 것을 사용할 수 있고, 예컨대 유기산, 무기산 또는 이것들의 염류를 성분으로 하는 액 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방법은 이온 교환기를 갖는 충전제 입자 표면을 용존 오존가스 농도가 20ppm 이상인 오존수를 사용하여 세정함으로써 친수화하는 친수화 공정을 포함하는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방법으로서, 상기 친수화 공정에 있어서 촉진 산화법에 의한 처리를 행하는 것이다.
이하에 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 지금까지 이온 교환기를 갖는 충전제 입자 표면을 오존수에 의해 세정함으로써, 충전제 입자의 표면만을 친수화시켜 수계 매체 중에서도 팽윤이나 수축이 발생하지 않고, 단백질 등의 비특이 흡착을 효과적으로 억제하는 것이 가능한 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 제조할 수 있는 것을 발견하였다.
그러나, 이러한 방법을 사용했을 경우에도, 얻어지는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 표면이 충분히 친수화되지 않는 경우가 있었다. 그래서, 더욱 예의 검토한 결과, 오존수를 사용한 친수화 공정에 있어서, 촉진 산화법에 의한 처리를 행함으로써, 용존 오존의 분해가 촉진되고 분해에 의해 생기는 히드록시 라디칼에 의해서 친수화 처리의 효과를 더욱 높이는 것이 가능하게 되는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방법에서는 이온 교환기를 갖는 충전제 입자 표면을 용존 오존가스 농도가 20ppm 이상인 오존수를 사용하여 세정함으로써 친수화하는 친수화 공정을 행함으로써, 충전제 입자의 표면만을 친수화한다. 상기 오존수에는 강력한 산화작용이 있고, 또한 용존 오존가스는 서서히 분해되어 잔류성이 없기 때문에, 일본 특허공개 2001-33069호 공보에 기재된 반도체의 레지스트 제거나, 일본 특허공개 2003-024464호 공보에 기재된 유해물질의 분해처리 등 다방면에 걸쳐서 사용되고 있다.
따라서, 이러한 방법에 의해 친수화 처리를 행했을 경우에는 오존수가 직접 접한 표면 부분만이 친수화되므로, 수계 매체 중에서도 팽윤하거나 수축하거나 하는 일이 없고, 한편 그 친수화 표면에는 단백질 등이 비특이 흡착하는 일도 없다. 또한, 화학적인 친수화 처리이기 때문에, 물리적인 친수화 처리방법과 같이 친수성 화합물이 탈락하거나 하는 않아서 장기간에 걸쳐 친수성을 유지할 수 있다.
본 발명에서는 상기 친수화 공정에 있어서, 촉진 산화법에 의한 처리를 행한다.
본 명세서에 있어서, 촉진 산화법이란 오존수의 산화작용을 증강시키는 방법을 말하고, 자외선 조사, 초음파 조사, 알칼리수 첨가 등의 용존 오존의 분해를 촉진하는 방법을 단독으로 사용하거나 또는 2종 이상을 병용하는 것을 말한다.
이러한 촉진 산화법에 의한 처리를 행함으로써 용존 오존의 분해가 촉진되어, 오존의 분해에 의해 생기는 히드록시 라디칼의 생성량이 증가한다. 이렇게 하여 생성한 히드록시 라디칼은 오존보다도 더욱 높은 산화력을 갖기 때문에, 친수화 처리의 효과를 더욱 높이는 것이 가능하게 된다고 생각된다. 상기 촉진 산화법을 사용했을 경우, 충전제 입자의 표면에 있어서의 친수기(-OH, -CHO, -COOH 등)의 생성을 더욱 촉진하는 것이 가능해 진다.
상기 촉진 산화법에 의한 처리로는 오존수의 pH를 7.0 이상으로 하고, 또한 초음파를 조사하는 방법을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 오존수의 pH는 보통 4.0~5.0의 낮은 값을 나타내지만, pH가 높아지면 용해성이 불안정해져서 분해가 촉진된다. 또한, 오존수에 초음파를 조사함으로써, 초음파 조사시에 발생하는 캐비테이션(cavitation) 작용에 의해, 한층 히드록시 라디칼의 생성을 촉진할 수 있다. 따라서, 이것들을 조합함으로써 친수화 처리의 효과를 보다 한층 높이는 것이 가능해 진다.
상기 오존수의 pH를 7.0 이상으로 조정하는 방법으로는 특별히 한정하지 않지만, 예컨대 수산화나트륨이나 수산화칼륨 등의 알칼리 금속 수산화물의 수용액을 첨가하는 방법 등을 사용할 수 있다.
상기 촉진 산화법에 의한 처리에 있어서, 초음파를 조사하는 경우에는 초음파 주파수의 바람직한 하한은 20kHz, 바람직한 상한은 1MHz이다. 캐비테이션이 저주파수측에서 발생하기 쉽다는 것을 생각하면, 보다 바람직한 상한은 500kHz, 더욱 바람직한 상한은 100kHz이다.
또한, 초음파의 조사를 행할 때의 초음파 조사장치로는 상기 주파수를 갖는 초음파를 조사할 수 있는 것이면 특별히 한정하지 않는다.
또한, 상기 촉진 산화법에 의한 처리로는 오존수에 자외선 조사를 행하는 것도 적합하다.
상기 촉진 산화법에 의한 처리로서 자외선 조사를 행하는 경우에는 자외선 파장의 바람직한 하한은 160nm, 바람직한 상한은 280nm이다. 파장영역이 이 범위에 있는 자외선을 조사함으로써, 촉진 산화처리를 행할 수 있다.
또한, 자외선은 파장 254nm을 포함하는 것이 특히 바람직하다. 파장 254nm의 자외선은 오존 분자에 직접 작용하여 분해하는 기능이 있다. 이 분해과정에서 히드록시 라디칼이 발생하기 때문에, 친수화 처리의 효과를 한층더 높이는 것이 가능해 진다.
상기 자외선 조사시에 사용하는 자외선 램프로는 특별히 한정하지 않지만, 상술한 바와 같이 파장 254nm을 포함하는 자외선을 조사할 수 있는 것이 바람직하고, 예컨대 저압 수은 램프, 고압 수은 램프, 메탈할라이드 램프 등이 열거된다.
상기 자외선의 조사 강도 및 조사 시간으로는 특별히 한정하지 않고, 적당하게 조정하면 좋지만, 파장 254nm의 조사 강도 0.5~200mW/㎠에서 1~1200초간 조사하는 것이 바람직하고, 60~600초간 조사하는 것이 보다 바람직하다. 조사 강도가 지나치게 작거나 조사 시간이 지나치게 짧거나 하면, 충전제 입자 표면의 친수화가 불충분하여 단백질 등의 비특이 흡착을 충분히 방지할 수 없는 경우가 있고, 조사 강도가 지나치게 강하거나 조사 시간이 지나치게 길거나 할 경우에는 충전제 입자의 강도 저하를 초래할 우려가 있다.
상기 촉진 산화법에 의한 처리를 행하는 경우에는 20℃ 이상에서 행하는 것이 바람직하다. 보다 바람직한 상한은 80℃이다. 80℃를 초과하면, 용존 오존가스가 그대로 기포화될 가능성이 높아지고, 반대로 반응 효율의 저하를 초래할 우려가 있다.
상기 충전제 입자로는 종래부터 이온 교환 액체 크로마토그래피법의 충전제 입자로서 사용되고 있는 것을 사용할 수 있고, 예컨대 실리카, 지르코니아 등의 무기계 입자; 셀룰로오스, 폴리아미노산, 키토산 등의 천연 고분자로 이루어진 유기계 입자; 폴리스티렌, 폴리아크릴산 에스테르 등의 합성 고분자로 이루어진 유기계 입자 등이 열거된다. 그 중에서도, 합성 고분자로 이루어진 유기계 입자는 가교도 등을 조정함으로써 높은 내압성이나 내팽윤성을 얻을 수 있기 때문에 바람직하다.
상기 이온 교환기로는 특별히 한정하지 않고, 양이온 교환기이어도 음이온 교환기이어도 좋다. 상기 양이온 교환기로는 특별히 한정하지 않고, 예컨대 카르복실기, 인산기, 술폰산기 등이 열거된다. 상기 음이온 교환기로는 특별히 한정하지 않고, 예컨대 3급 아미노기, 4급 아미노기 등이 열거된다. 그 중에서도, 술폰산기를 사용할 경우에는 장기간에 걸쳐서 성능을 유지할 수 있고, 또한 헤모글로빈 A1c의 분석에도 높은 효과가 얻어지기 때문에 적합하다.
상기 이온 교환기를 갖는 충전제 입자는 입자의 표면에 이온 교환기를 도입하거나 이온 교환기를 갖는 단량체를 포함하는 단량체 혼합물을 중합하여 입자로 하거나 하는 방법에 의해 제조할 수 있다.
상기 입자의 표면에 이온 교환기를 도입하는 방법으로는 특별히 한정하지 않고, 종래 공지의 방법을 사용할 수 있다. 예컨대, 고분자로 이루어진 유기계 입자의 경우에는 관능기를 갖는 고분자로 이루어진 입자를 제조한 후, 상기 관능기에 이온 교환기를 갖는 화합물을 화학적으로 반응시키는 방법 등이 열거된다.
상기 이온 교환기를 갖는 단량체를 포함하는 단량체 혼합물을 중합하여 입자로 하는 방법으로는, 예컨대 이온 교환기를 갖는 단량체와 가교성 단량체를 혼합하고, 중합개시제의 존재 하에서 중합하는 방법 등이 열거된다. 또한, 일본 특허공고 평8-7197호 공보에 기재된 방법과 같이, 가교성 중합체 입자를 제조한 후, 이온 교환기를 갖는 단량체를 첨가하고, 중합체 입자의 표면부근에 이온 교환기를 갖는 단량체를 중합시키는 방법; (메타)아크릴산 메틸이나 (메타)아크릴산 에틸 등의 중합성 에스테르 화합물을 가교성 단량체 등과 혼합하고, 중합개시제의 존재 하에서 중합한 후, 얻어진 입자를 가수분해처리하고, 에스테르 화합물을 양이온 교환기로 변환하는 방법 등도 사용할 수 있다.
상기 이온 교환기를 갖는 충전제 입자의 평균 입자지름으로는 특별히 한정하지 않지만, 바람직한 하한은 0.1㎛, 바람직한 상한은 20㎛이다. 0.1㎛ 미만이면 컬럼내가 지나치게 고압으로 되어 분리 불량이 일어나는 경우가 있고, 20㎛를 초과하면 컬럼내의 데드볼륨이 지나치게 커져서 분리 불량이 일어나는 경우가 있다.
상기 이온 교환기를 갖는 충전제 입자의 입도 분포에 대해서 입자지름의 CV치의 바람직한 상한은 40%이다. 40%를 초과하면 컬럼내의 데드볼륨이 지나치게 커져서 분리 불량이 일어나는 경우가 있다. 보다 바람직한 상한은 15%이다.
본 발명에 있어서 사용되는 오존수는 용존 오존가스 농도의 하한이 20ppm이다. 20ppm 미만이면 충분한 친수화 처리를 실시하지 않고 단백질의 비특이 흡착을 충분히 방지할 수 없다. 바람직한 하한은 50ppm이다. 또한, 용존 오존가스 농도의 상한은 특별히 없다.
이러한 고농도의 오존수는, 예컨대 일본 특허공개 2001-330969호 공보 등에 기재되어 있는 바와 같이, 원료물과 오존가스를 기체만 통과하고 액체의 투과를 저지하는 오존가스 투과막을 거쳐서 접촉시키는 방법 등에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방법에 의해 제조된 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제는 오존수가 직접 접촉한 표면 부분만이 친수화되어 있기 때문에, 수계 매체 중에서도 팽윤하거나 수축하거나 하는 일이 없고, 또한 단백질 등이 비특이 흡착할 일도 없으므로 매우 정확한 측정을 행할 수 있다. 또한, 장기간에 걸쳐 이러한 성능을 유지할 수 있고, 장기간 사용후에서도 유지시간이나 측정치의 불균형이 적다. 또한, 로트간 차이에 의한 유지시간이나 측정치의 불균형도 극히 적다.
본 발명의 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방법에 의해 제조된 것인 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제도 또한 본 발명의 하나이다.
본 발명의 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 물의 접촉각은 60°이하인 것이 바람직하다.
여기에서, 접촉각 측정은 고분자 재료를 비롯해, 표면의 친수성, 소수성을 평가하는 방법으로서 사용되고, 물의 접촉각이 작을 수록 친수성이 높다고 판단된다.
본 발명에 있어서는 단백질 등의 측정 대상물질의 비특이 흡착을 충분히 억제하는 것이 필요하여 상기 범위가 바람직하다. 보다 바람직하게는 50°이하이다.
본 발명의 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방법에 의해 제조되어 이루어진 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제는 특히 당화 헤모글로빈의 분석에 적합하게 사용될 수 있다.
본 발명의 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방법이 의해 제조되어 이루어진 당화 헤모글로빈 분석용 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제도 또한 본 발명의 하나이다.
또한, 본 발명의 당화 헤모글로빈 분석용 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 사용하는 당화 헤모글로빈의 분석방법도 또한 본 발명의 하나이다.
구체적으로는, 예컨대 본 발명의 당화 헤모글로빈 분석용 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 공지의 컬럼에 충전한 후, 얻어진 컬럼에 소정의 조건에서 용리액 및 측정 시료를 송액함으로써, 당화 헤모글로빈을 분석할 수 있다.
상기 용리액으로는 종래 공지의 것을 사용할 수 있고, 예컨대 유기산, 무기산 또는 이것들의 염류를 성분으로 하는 액 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 의하면, 수계 매체 중에서의 팽윤을 억제하고, 또한 수계 매체에 대한 분산성이 우수한 친수성 고분자 미립자, 단백질 등의 비특이 흡착을 효과적으로 억제할 수 있는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제, 상기 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 사용한 당화 헤모글로빈의 분석방법, 팽윤, 비특이 흡착 등의 억제 효과를 장기간에 걸쳐 유지할 수 있는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방법, 상기 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방법을 사용하여 제조되는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제, 및 당화 헤모글로빈 분석용 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 제공할 수 있다.
도 1은 실시예 3, 비교예 5에 대해서 헤모글로빈 A1c 측정에 의한 헤모글로빈류(Hb) 회수율의 결과를 그래프로 나타낸 도이다.
도 2는 실시예 4, 비교예 6, 비교예 7에 대해서 헤모글로빈 A1c 측정에 의한 Hb 회수율의 결과를 그래프로 나타낸 도이다.
도 3은 실시예 6, 비교예 8, 비교예 9에 대해서 헤모글로빈 A1c 측정에 의한 Hb 회수율의 결과를 그래프로 나타낸 도이다.
도 4는 내구성 평가에 있어서, 헤모글로빈 A1c 측정에 있어서의 측정치 변동을 그래프로 나타낸 도이다.
도 5는 실시예 11, 비교예 14~16에 대해서 헤모글로빈 A1c 측정에 의한 헤모글로빈류(Hb) 회수율의 결과를 그래프로 나타낸 도이다.
이하에, 실시예를 들어서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1)
교반기 부착 반응기에, 3% 폴리비닐알콜(Nippon Synthetic Chemical Industry Co., Ltd. 제품) 수용액에 테트라에틸렌글리콜 디메타아크릴레이트(Shin-nakamura Chemical Co. Ltd. 제품) 300g, 트리에틸렌글리콜 디메타아크릴레이트(Shin-nakamura Chemical Co. Ltd. 제품) 100g 및 과산화 벤조일(Kishida Chemical Co., Ltd. 제품) 1.0g의 혼합물을 첨가하였다. 교반하면서 가열하고, 질소분위기 하에서 80℃, 1시간 중합하였다. 얻어진 중합 조성물을 물 및 아세톤으로 세정함으로써 고분자 미립자를 얻었다.
얻어진 고분자 미립자에 대해서, 레이저 회절식 입도 분포 측정장치를 사용하여 측정한 바, 평균 입자지름은 5㎛, CV치는 14%이었다.
얻어진 고분자 미립자 10g을 용존 오존가스 농도 110ppm의 오존수 300mL에 침지하고, 교반하면서 파장 254nm을 포함한 자외선을 조사할 수 있는 스폿타입 UV 조사장치(EYEGRAPHICS CO., LTD. 제품 UP-200G)를 사용하여, 1cm의 거리로부터 조사강도 95mW/㎠로 30O초간 자외선을 조사해서 친수화 처리를 실시하였다. 자외선 조사후, 원심분리기(Hitachi, Ltd.제품, Himac CR20G)를 사용하여 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 이 조작을 2회 반복하여 친수화 처리를 실시하여 친수성 고분자 미립자를 얻었다.
또한, 오존수는 내경 15cm×길이 20cm의 원주형을 갖는 외투내에, 퍼플루오로알콕시 수지로 이루어진 내경 0.5mm×두께 0.04mm×길이 350cm의 중공관 형상의 오존가스 투과막 400개가 수용된 오존 용해 모듈을 포함하는 오존수 제조 시스템(Sekisui Chemical Co., Ltd. 제품)을 사용하여 제조하였다.
(실시예 2)
교반기 부착 반응기에, 3% 폴리비닐알콜(Nippon Synthetic Chemical Industry Co., Ltd. 제품) 수용액에 디비닐벤젠(Kishida Chemical Co., Ltd. 제품) 300g, 스티렌(Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제품) 100g 및 과산화 벤조 일(Kishida Chemical Co., Ltd. 제품) 1.0g의 혼합물을 첨가하였다. 교반하면서 가열하고, 질소분위기 하에서 80℃, 1시간 중합하였다. 얻어진 중합 조성물을 물 및 아세톤으로 세정함으로써 고분자 미립자를 얻었다.
얻어진 고분자 미립자에 대해서, 레이저 회절식 입도 분포 측정장치를 사용하여 측정한 바, 평균 입자지름은 5㎛, CV치는 13%이었다.
이하, 실시예 1과 동일하게 하여 오존수에 의한 친수화 처리를 행함으로써 친수성 고분자 미립자를 제조하였다.
(비교예 1)
오존수에 의한 친수화 처리를 행하지 않은 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 고분자 미립자를 제조하였다.
(비교예 2)
오존수에 의한 친수화 처리를 행하지 않은 이외는 실시예 2와 동일하게 하여 고분자 미립자를 제조하였다.
(비교예 3)
교반기 부착 반응기 중에서, 3% 폴리비닐알콜(Nippon Synthetic Chemical Industry Co., Ltd. 제품) 수용액에 테트라에틸렌글리콜 디메타크릴레이트(Shin-nakamura Chemical Co. Ltd. 제품) 100g, 폴리에틸렌글리콜 메타크릴레이트(NOF Corporation 제품, 에틸렌글리콜쇄 n=4) 400g 및 과산화 벤조일(Kishida Chemical Co., Ltd. 제품) 1.0g의 혼합물을 첨가하였다. 교반하면서 가열하고, 질소분위기 하에서 80℃, 1시간 중합하였다. 얻어진 중합 조성물을 물 및 아세톤으로 세정함으 로써 고분자 미립자를 얻었다.
얻어진 충전제 입자에 대해서, 레이저 회절식 입도 분포 측정장치를 사용하여 측정한 바, 평균 입자지름은 10㎛, CV치는 14%이었다.
<평가>
실시예 1, 2 및 비교예 1~3에서 얻어진 (친수성)고분자 미립자에 대해서 이하의 평가를 행하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.
(1) 팽윤도 측정
실시예 1, 2 및 비교예 1~3에서 얻어진 (친수성)고분자 미립자에 대해서 팽윤도 측정을 행하였다. 측정은 입도 분포계 Accusizer 780(Particle Sizing Systems 제품)을 사용하였다. 건조시킨 (친수성)고분자 미립자 1g에 순수 또는 아세톤 30mL을 넣은 후, 잘 교반하고, 초음파를 15분 조사하여 분산액을 얻었다. 분산후, 평형 팽윤에 도달할때 까지 25℃에서 240시간 방치하고, 물 중에서의 입자지름 DW와 아세톤 중에서의 입자지름 DA를 측정하여 DW/DA를 팽윤도로 하였다.
(2) 접촉각 측정
실시예 1, 2 및 비교예 1~3에서 얻어진 (친수성)고분자 미립자에 대해서 접촉각 측정을 행하였다. 측정은 자동 접촉각계(Kyowa Interface Science Co., Ltd. 제품, Dropmaster 500)를 사용하여 행하였다. 건조시킨 (친수성)고분자 미립자를 25mm×75mm 슬라이드 유리 상에 부착한 양면 테이프 상에 단층으로 간격없이 적재하고, 그 후 에어 스프레이로 여분의 입자를 제거하였다. 이것에 의해, 양면 테이 프 상에 고분자 미립자를 고정화하였다. 그 형태를 마이크로스코프로 확인하였다.
25℃의 조건하, 순수 1μL의 액적을 제조하고, 슬라이드 유리 상에 고정화한 고분자 미립자에 착액시켜, 접촉각을 θ/2법에 의해 산출하였다. 또한, 접촉각이 90°보다 작을 경우, 착액 후의 액적은 퍼져 나가려고 한다. 따라서, 착액후의 접촉각은 경시적으로 작아진다. 그래서, 착액후 0.5초 후의 접촉각치를 사용하여 평가를 행하였다.
(3) 분산성 평가
실시예 1, 2 및 비교예 1~3에서 얻어진 (친수성)고분자 미립자에 대해서 분산성 평가를 행하였다. 평가방법은 25℃의 조건 하, 건조시킨 (친수성)고분자 미립자 1g에 순수 30mL을 넣은 후, 잘 교반하고, 초음파를 15분 조사한 후, 30분간 방치하였다. 그 후, 가볍게 교반한 분산액을 소량 슬라이드 유리 상에 적하하고, 커버 유리로 덮어 현미경 관찰을 행하고, 이하의 기준에 의해 평가하였다.
○: 응집하여 있는 미립자가 없었다.
×: 응집하여 있는 미립자가 있었다.
Figure 112008016018907-PCT00001
실시예 1, 2는 팽윤도, 접촉각 모두 작았다. 따라서, 물의 환경변화에 의한 형상의 변화가 작고, 또한 친수성이 높기 때문에 분산성도 양호하였다.
이에 비하여, 비교예 1, 2는 팽윤도는 작지만 접촉각은 컸다. 따라서, 물의 환경에 의한 형상변화는 작지만, 소수성이 높기 때문에 분산성이 나빴다.
비교예 3은 친수성 단량체의 함량을 증가시켰기 때문에, 팽윤도가 크고, 접촉각은 작았다. 따라서, 물의 환경변화에 의한 변화는 크지만, 친수성이 높기 때문에 분산성은 양호하였다.
(실시예 3)
교반기 부착 반응기에, 3% 폴리비닐알콜(Nippon Synthetic Chemical Industry Co., Ltd. 제품) 수용액에 테트라에틸렌글리콜 디메타아크릴레이트(Shin-nakamura Chemical Co. Ltd. 제품) 300g, 트리에틸렌글리콜 디메타아크릴레이트(Shin-nakamura Chemical Co. Ltd. 제품) 100g 및 과산화 벤조일(Kishida Chemical Co., Ltd. 제품) 1.0g의 혼합물을 첨가하였다. 교반하면서 가열하고, 질소분위기 하에서 80℃, 1시간 중합하였다. 다음에, 이온 교환기를 갖는 단량체로서 2-메타아크릴아미드-2-메틸프로판 술폰산(Toagosei Co., Ltd. 제품) 100g, 폴리에틸렌글리콜 메타아크릴레이트(NOF Corporation 제품, 에틸렌글리콜쇄 n=4) 100g을 이온 교환수에 용해하였다. 이 혼합물을 동일 반응기에 첨가하고, 동일하게 하여 교반하면서 질소분위기 하에서 80℃에서 2시간 중합하였다. 얻어진 중합 조성물을 물 및 아세톤으로 세정함으로써, 이온 교환기를 갖는 친수성 피복 중합체 입자(이온 교환기를 갖는 기재 미립자)를 얻었다.
얻어진 피복 중합체 입자에 대해서, 레이저 회절식 입도 분포 측정장치를 사용하여 측정한 바, 평균 입자지름은 8㎛, CV치는 14%이었다.
얻어진 피복 중합체 입자 10g을 용존 오존가스 농도 100ppm의 오존수 300mL에 침지하고, 30분간 교반하였다. 교반 종료후, 원심분리기(Hitachi, Ltd. 제품, Himac CR20G)를 사용하여 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 이 조작을 2회 반복하여 친수화 처리를 실시하여 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 얻었다.
또한, 오존수는 내경 15cm×길이 20cm의 원주형을 갖는 외투 내에 퍼플루오로알콕시 수지로 이루어진 내경 0.5mm×두께 0.04mm×길이 350cm의 중공관 형상의 오존가스 투과막 400개가 수용된 오존 용해 모듈을 포함하는 오존수 제조 시스템(Sekisui Chemical Co., Ltd. 제품)을 사용하여 제조하였다.
(비교예 4)
교반기 부착 반응기에, 3% 폴리비닐알콜(Nippon Synthetic Chemical Industry Co., Ltd. 제품) 수용액에 에틸렌글리콜 디메타아크릴레이트(Shin-nakamura Chemical Co. Ltd. 제품) 240g, n-부틸메타아크릴레이트(Kyoeisha Chemical Co., Ltd. 제품) 160g 및 과산화 벤조일(Kishida Chemical Co., Ltd. 제품) 1.0g의 혼합물을 첨가하였다. 교반하면서 가열하고, 질소분위기 하에서 80℃, 1시간 중합하였다. 다음에, 이온 교환기를 갖는 단량체로서 2-메타아크릴아미드-2-메틸프로판 술폰산(Toagosei Co., Ltd. 제품) 100g, 폴리에틸렌글리콜 메타아크릴레이트(NOF Corporation 제품, 에틸렌글리콜쇄 n=4) 100g을 이온 교환수에 용해하였다. 이 혼합물을 동일 반응기에 첨가하고, 동일한 방법으로 교반하면서 질소분위기 하에서 80℃에서 2시간 중합하였다. 얻어진 중합 조성물을 물 및 아세톤으로 세정함으로써, 이온 교환기를 갖는 친수성 피복 중합체 입자(이온 교환기를 갖는 기재 미립자)를 얻었다. 얻어진 피복 중합체 입자에 대해서, 레이저 회절식 입도 분포 측정장치를 사용하여 측정한 바, 평균 입자지름은 8㎛, CV치는 16%이었다.
얻어진 피복 중합체 입자 10g을 실시예 3과 동일하게 하여 오존수 처리를 행하여 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 얻었다.
(비교예 5)
오존수 처리를 행하지 않은 것 이외는 실시예 3과 동일하게 하여 피복 중합체 입자 및 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 얻었다.
<평가>
실시예 3 및 비교예 4~5에서 얻어진 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제에 대해서 이하의 평가를 행하였다. 결과를 표 2, 도 1에 나타내었다.
(1) 팽윤도 측정
실시예 3 및 비교예 4, 5에서 얻어진 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제에 대해서 팽윤도 측정을 행하였다. 측정은 입도 분포계 Accusizer 780(Particle Sizing Systems 제품)을 사용하였다. 건조시킨 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제 1g에 순수 또는 아세톤 30mL을 넣은 후, 잘 교반하고, 초음파를 15분 조사하여 분산액을 얻었다. 분산후, 평형 팽윤에 도달할 때까지 25℃에서 240시간 방치하고, 물 중에서의 입자지름 DW와 아세톤 중에서의 입자지름 DA를 측정하여 DW/DA를 팽윤도로 하였다.
(2) 접촉각 측정
실시예 3 및 비교예 4, 5에서 얻어진 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제에 대해서 접촉각 측정을 행하였다. 측정은 자동 접촉각계(Kyowa Interface Science Co., Ltd. 제품, Dropmaster 500)를 사용해 행하였다. 건조시킨 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 25mm×75mm의 슬라이드 유리 상에 부착한 양면 테이프 상에 간격없이 나열하고, 그 후 에어 스프레이로 여분의 입자를 제거하였다. 이것에 의해, 양면 테이프 상에 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 고정화하였다. 그 형태를 마이크로스코프로 확인하였다.
25℃의 조건 하, 순수 1μL의 액적을 제조하고, 슬라이드 유리 상에 고정화한 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제에 착액시켜 접촉각을 θ/2법에 의해 산출하였다. 또한, 접촉각이 90°보다 작을 경우, 착액후의 액적은 퍼져 나가려고 한다. 따라서, 착액후의 접촉각은 경시적으로 작아진다. 그래서, 착액후 0.5초 후의 접촉각치를 사용하여 평가를 행하였다.
(3) 압력변동평가
실시예 3 및 비교예 4, 5에서 제조한 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 액체 크로마토그래피 시스템의 컬럼에 충전하였다. 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 충전한 컬럼에 pH가 다른 용리액을 통액시키고, 그 때의 컬럼 압력변동, 및 컬럼 압력이 안정될 때까지 필요한 시간(평형화 시간)을 측정하였다. 구체적으로는 50mM 인산 완충액(pH 5.7: A액)을 30분간 통액하였다. 컬럼 압력이 일정해진 후, 300mM 인산 완충액(pH 8.5: B액)을 통액하고, 컬럼 압력의 변동을 확인하였다.
(4) 헤모글로빈 A1c 측정에 의한 Hb 회수율의 평가
실시예 3 및 비교예 5에서 제조한 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 액체 크로마토그래피 시스템의 컬럼에 충전하였다. 한편, 글리코 Hb 컨트롤 레벨 2(International Reagents Corporation 제품, 참고 수치 10.4±0.5%)를 200μL의 주사용 물에 용해한 후, 희석액(0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 인산 완충액(pH 7.0))으로 100배 희석한 것을 제조하여 측정 시료로 하였다.
얻어진 컬럼을 사용하여, 하기 조건에 의해 측정 시료 중의 헤모글로빈 A1c량 및 헤모글로빈 A1c와 비당화 헤모글로빈의 합계량을 크로마토그램의 피크 면적으로 평가하였다. 측정은 10검체 연속으로 행하고, 그 후반 5검체의 헤모글로빈 A1c 피크의 면적치, 및 헤모글로빈 A1c 피크와 비당화 헤모글로빈 피크의 면적치의 평균치를 측정치로 하였다.
도 1은 실시예 3에서 얻어진 헤모글로빈 A1c 피크 면적치 및 헤모글로빈 A1c와 비당화 헤모글로빈 피크의 면적치 합계를 100%로 하고, 실시예 3, 비교예 5에서 얻어진 각 피크 면적을 비교하였다.
시스템: 송액 펌프 LC-9A(Shimadzu Corporation 제품)
오토 샘플러 ASU-420(Sekisui Chemical Co., Ltd. 제품)
검출기 SPD-6AV(Shimadzu Corporation 제품)
용리액: 제 1 액 170mM 인산 완충액(pH 5.7)
제 2 액 300mM 인산 완충액(pH 8.5)
용출법: 0~3분은 제 1 액으로, 3~3.2분은 제 2 액으로, 3.2~4분은 제 1 액으로 용출
유속: 1.0mL/분
검출 파장: 415nm
시료 주입량: 10μL
Figure 112008016018907-PCT00002
표 2에 나타나 있는 바와 같이, 실시예 3은 팽윤도, 접촉각 모두 작고, 결과적으로 컬럼내 압력변동이 작고, 또한 헤모글로빈 성분의 비특이 흡착도 전혀 없다.
또한, 실시예 3에서는 이온 교환기를 포함하는 친수성 중합체의 층을 형성하고, 오존수로 친수화 처리를 더 행함으로써, 물의 접촉각이 60°이하인 표면으로 할 수 있었다.
한편, 비교예 4는 가교도가 낮은 충전제이기 때문에, 팽윤도가 크고, 컬럼내의 압력변동이 매우 크다. 접촉각이 작기 때문에, 헤모글로빈의 비특이 흡착은 억제된다고 생각되지만, 컬럼 내의 압력변동이 지나치게 커서 평가(4)를 실시할 수 없다. 따라서, 팽윤도를 일정한 범위 내에 들도록 하는 것은 매우 중요하다.
비교예 5는 충전제의 가교도가 실시예 3과 동일하기 때문에, 팽윤도는 작고, 컬럼 내의 압력변동도 작다. 그러나, 접촉각이 크기 때문에, 헤모글로빈 성분의 비특이 흡착이 일어나기 쉽다. 따라서, 접촉각을 일정한 범위내에 들도록 하는 것은 팽윤도와 마찬가지로 매우 중요하다.
(실시예 4)
교반기 부착 반응기에, 3% 폴리비닐알콜(Nippon Synthetic Chemical Industry Co., Ltd. 제품) 수용액에 테트라에틸렌글리콜 디메타아크릴레이트(Shin-nakamura Chemical Co. Ltd. 제품) 300g, 트리에틸렌글리콜 디메타아크릴레이트(Shin-nakamura Chemical Co. Ltd. 제품) 100g 및 과산화 벤조일(Kishida Chemical Co., Ltd. 제품) 1.0g의 혼합물을 첨가하였다. 교반하면서 가열하고, 질소분위기 하에서 80℃, 1시간 중합하였다. 다음에, 이온 교환기를 갖는 단량체로서 2-메타아크릴아미드-2-메틸프로판 술폰산(Toagosei Chemical Industry Co., Ltd. 제품) 100g, 폴리에틸렌글리콜 메타아크릴레이트(NOF Corporation 제품, 에틸렌글리콜쇄 n=4) 100g을 이온 교환수에 용해하였다. 이 혼합물을 동일 반응기에 첨가하고, 동일하게 하여 교반하면서 질소분위기 하에서 80℃에서 2시간 중합하였다. 얻어진 중합 조성물을 물 및 아세톤으로 세정함으로써, 이온 교환기를 갖는 친수성 피복 중합체 입자를 얻었다.
얻어진 피복 중합체 입자에 대해서, 레이저 회절식 입도 분포 측정장치를 사용하여 측정한 바, 평균 입자지름은 8㎛, CV치는 14%이었다.
얻어진 피복 중합체 입자 10g을 용존 오존가스 농도 100ppm의 오존수 300mL에 침지하고, 30분간 교반하였다. 교반 종료후, 원심분리기(Hitachi, Ltd.제Himac CR20G)를 사용하여 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 이 조작을 2회 반복하고, 친수화 처리를 실시하여 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 얻었다.
또한, 오존수는 내경 15cm×길이 20cm의 원주형을 갖는 외투내에 퍼플루오로알콕시 수지로 이루어진 내경 0.5mm×두께 0.04mm×길이 350cm의 중공관 형상 오존가스 투과막 400개가 수용된 오존 용해 모듈을 포함하는 오존수 제조 시스템(Sekisui Chemical Co., Ltd. 제품)를 사용하여 제조하였다.
(실시예 5)
폴리에틸렌글리콜 메타아크릴레이트를 메톡시 폴리에틸렌글리콜 메타아크릴레이트(NOF Corporation 제품, 에틸렌글리콜쇄 n=4)로 변경한 이외는 실시예 4와 동일하게 하여 피복 중합체 입자 및 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 얻었다.
(비교예 6)
오존수 처리를 행하지 않은 것 이외는, 실시예 4와 동일하게 하여 피복 중합체 입자 및 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 얻었다.
(비교예 7)
실시예 4와 동일하게 하여 얻어진 피복 중합체 입자에 있어서, 오존수 처리 대신에 단백질 코팅처리를 실시하였다. 상기 충전제 입자 10g에 인산 완충액(pH 5.7)에 용해시킨 0.2% BSA(소 혈청 알부민) 200㎖를 가하고, 2분간 초음파 처리하고, 60℃의 항온 수조 중에서 24시간 서서히 교반한 후, 항온 수조로부터 꺼내어 실온이 될 때까지 방치하였다. 그 후, 원심분리에 의해 상청을 제거하고, 거기에 인산 완충액(pH 8.5)를 200㎖ 첨가하고, 재차 원심분리에 의해 상청을 제거하였다. 거기에 인산 완충액(pH 5.7)를 200㎖ 첨가하고, 여러번 원심분리에 의해 상청을 제거하여, 물리흡착에 의한 단백질 코팅을 행한 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 얻었다.
<평가>
실시예 4~5 및 비교예 6~7에서 얻어진 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제에 대해서 이하의 평가를 행하였다.
(1) 접촉각 측정
실시예 4~5 및 비교예 6~7에서 얻어진 피복 중합체 입자에 대해서 접촉각 측정을 행하였다. 측정은 자동 접촉각계(Kyowa Interface Science Co., Ltd. 제품, Dropmaster 500)를 사용하여 행하였다. 건조시킨 피복 중합체 입자를 슬라이드 유리 상에 부착한 양면 테이프 상에 균일해지도록 적재하고, 그 후 에어 스프레이로 여분의 입자를 제거하였다. 이것에 의해, 양면 테이프 상에 피복 중합체 입자 1층분을 고정화하였다. 그 형태를 마이크로스코프로 확인하였다.
이온 교환수 1μL의 액적을 제조하고, 슬라이드 유리 상에 고정화한 피복 중합체 입자 상에 착액시켜 접촉각을 θ/2법에 의해 산출하였다. 또한, 접촉각이 90°보다 작을 경우, 착액후의 액적은 퍼져 나가려고 한다. 따라서, 착액후의 접촉각은 경시적으로 작아진다. 그래서, 착액후 0.5초 후의 접촉각치를 사용하여 평가를 행하는 것으로 하였다.
결과를 표 3에 나타내었다.
(2) 헤모글로빈 A1c 측정에 의한 Hb 회수율의 평가
실시예 4 및 비교예 6, 7에서 제조한 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 액체 크로마토그래피 시스템의 컬럼에 충전하였다. 한편, 글리코 Hb 컨트롤 레벨 2(International Reagents Corporation 제품, 참고 수치 10.4±0.5%)를 200μL의 주사용 물에 용해한 후, 희석액(0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 인산 완충액(pH 7.0))으로 100배 희석한 것을 제조하여 측정 시료로 하였다.
얻어진 컬럼을 사용하여, 하기 조건에 의해 측정 시료 중의 헤모글로빈 A1c량 및 헤모글로빈 A1c와 비당화 헤모글로빈의 합계량을 크로마토그램의 피크 면적으로 평가하였다. 측정은 10검체 연속으로 행하고, 그 후반 5검체의 헤모글로빈 A1c 피크의 면적치, 및 헤모글로빈 A1c 피크와 비당화 헤모글로빈 피크의 면적치의 평균치를 측정치로 하였다.
결과를 표 4, 도 2에 나타내었다. 도 2는 실시예 4에서 얻어진 헤모글로빈 A1c 피크 면적치 및 헤모글로빈 A1c와 비당화 헤모글로빈 피크의 면적치 합계를 100%으로 하여 비교예 6, 비교예 7에서 얻어진 각 피크 면적을 비교하였다.
시스템: 송액 펌프 LC-9A(Shimadzu Corporation 제품)
오토 샘플러 ASU-420(Sekisui Chemical Co., Ltd. 제품)
검출기 SPD-6AV(Shimadzu Corporation 제품)
용리액: 제 1 액 170mM 인산 완충액(pH 5.7)
제 2 액 300mM 인산 완충액(pH 8.5)
용출법: 0~3분은 제 1 액으로, 3~3.2분은 제 2 액으로, 3.2~4분은 제 1 액으로 용출
유속: 1.0mL/분
검출 파장: 415nm
시료 주입량: 10μL
(3) 헤모글로빈 A1c 측정에 있어서의 측정치 변동의 평가(내구성 평가)
실시예 4, 비교예 6 및 비교예 7에서 제조한 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 액체 크로마토그래피 시스템의 컬럼에 충전하였다. 한편, 글리코 Hb 컨트롤 레벨 2(International Reagents Corporation 제품, 참고 수치 10.4±0.5%)를 200μL의 주사용 물에 용해한 후, 희석액(0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 인산 완충액(pH 7.0))으로 100배 희석한 것을 제조하여 측정 시료로 하였다. 또한, 부하 시료로서, 건강한 보통 사람의 피를 NaF 채혈하고, 용혈 희석액(0.1중량% 트리톤 X-100을 함유하는 인산 완충액(pH 7.0))으로 용혈하고, 150배로 희석한 것을 사용하였다.
측정 시료, 부하 시료를 합해서 약 1000검체의 측정을 행하고, 임의의 간격으로 측정 시료 10검체를 연속으로 측정하여 그 평균치를 사용하여 평가하였다. 하기 조건에 의해 측정 시료 중의 헤모글로빈 A1c량 및 비당화 헤모글로빈량을 측정하고, 헤모글로빈 A1c와 비당화 헤모글로빈의 합계에 대한 헤모글로빈 A1c의 비율(헤모글로빈 A1c치(%))을 구하였다. 또한, 헤모글로빈 A1c의 유지시간도 측정하였다.
결과를 표 5에 나타내었다.
시스템: 송액 펌프 LC-9A(Shimadzu Corporation 제품)
오토 샘플러 ASU-420(Sekisui Chemical Co., Ltd. 제품)
검출기 SPD-6AV(Shimadzu Corporation 제품)
용리액: 제 1 액 170mM 인산 완충액(pH 5.7)
제 2 액 300mM 인산 완충액(pH 8.5)
용출법: 0~3분은 제 1 액으로, 3~3.2분은 제 2 액으로, 3.2~4분은 제 1 액으로 용출
유속: 1.0mL/분
검출 파장: 415nm
시료 주입량: 10μL
Figure 112008016018907-PCT00003
Figure 112008016018907-PCT00004
Figure 112008016018907-PCT00005
표 3에 나타나 있는 바와 같이, 실시예 4, 5에서는 이온 교환기를 포함하는 친수성 중합체의 층을 형성하고, 오존수로 친수화 처리를 더 행함으로써 물의 접촉각을 60°이하의 표면으로 할 수 있었다. 또한, 비교예 7에 있어서도, 친수성 화합물인 단백질로 코팅함으로써, 물의 접촉각을 60°이하의 표면으로 할 수 있었다. 비교예 6에서는 실시예 4와 비교하여 분명하게 접촉각이 커졌다.
도 2에 나타나 있는 바와 같이, 실시예 4와 비교하여 접촉각이 큰 비교예 6에서는 헤모글로빈 A1c 피크 면적치, 및 헤모글로빈 A1c 피크와 비당화 헤모글로빈 피크의 면적치 합계는 저하되는 결과로 되었다. 또한, 접촉각이 작은 비교예 7에서는 헤모글로빈 A1c 피크 면적치, 및 헤모글로빈 A1c 피크와 비당화 헤모글로빈 피크의 면적치 합계가 모두 실시예 4와 동 레벨이었다. 즉, 접촉각이 60°이상일 경우에는 헤모글로빈 A1c이나 다른 헤모글로빈 성분이 충전제 입자 표면에 흡착되어 있는 것을 나타낸다.
표 4에 나타나 있는 바와 같이, 실시예 4에서 제조한 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 사용했을 경우에는 1000검체 측정 사이에, 헤모글로빈 A1c치(%)의 변동, 유지시간의 변동 모두가 매우 작아서, 정확한 측정이 가능한 것을 알았다. 한편, 비교예 6의 경우에는 헤모글로빈 A1c치가 크게 변동하였다. 이것은 헤모글로빈 A1c이나 다른 헤모글로빈 성분이 비특이 흡착을 일으키고 있는 것에 기인한다고 생각된다. 또한, 비교예 7의 경우에는 유지시간이 변동하였다. 이것은 친수성을 향상시키기 위해서 코팅한 단백질이 측정 중에 탈리되는 것에 기인한다고 생각된다.
(실시예 6)
교반기 부착 반응기에, 3% 폴리비닐알콜(Nippon Synthetic Chemical Industry Co., Ltd. 제품) 수용액에 테트라에틸렌글리콜 디메타아크릴레이트(Shin-nakamura Chemical Co. Ltd. 제품) 300g, 트리에틸렌글리콜 디메타아크릴레이트(Shin-nakamura Chemical Co. Ltd. 제품) 100g 및 과산화 벤조일(Kishida Chemical Co., Ltd. 제품) 1.0g의 혼합물을 첨가하였다. 교반하면서 가열하고, 질소분위기 하에서 80℃, 1시간 중합하였다. 다음에, 이온 교환기를 갖는 단량체로서 2-메타아크릴아미드-2-메틸프로판 술폰산(Toagosei Co., Ltd. 제품) 100g, 폴리에틸렌글리콜 메타아크릴레이트(NOF Corporation 제품, 에틸렌글리콜쇄 n=4) 100g을 이온 교환수에 용해하였다. 이 혼합물을 동일 반응기에 첨가하고, 동일하게 하여 교반하면서 질소분위기 하에서 80℃에서 2시간 중합하였다. 얻어진 중합 조성물을 물 및 아세톤으로 세정함으로써, 이온 교환기를 갖는 친수성 피복 중합체 입자를 얻었다.
얻어진 피복 중합체 입자에 대해서, 레이저 회절식 입도 분포 측정장치를 사용하여 측정한 바, 평균 입자지름은 8㎛, CV치는 14%이었다.
얻어진 피복 중합체 입자 10g을 용존 오존가스 농도 100ppm의 오존수 300mL에 침지하고, 30분간 교반하였다. 교반 종료후, 원심분리기(Hitachi, Ltd.제Himac CR20G)를 사용하여 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 이 조작을 2회 반복하여 친수화 처리를 실시하여 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 얻었다.
또한, 오존수는 내경 15cm×길이 20cm의 원주형을 갖는 외투내에 퍼플루오로알콕시 수지로 이루어진 내경 0.5mm×두께 0.04mm×길이 350cm의 중공관 형상의 오존가스 투과막 400개가 수용된 오존 용해 모듈을 포함하는 오존수 제조 시스템(Sekisui Chemical Co., Ltd. 제품)을 사용하여 제조하였다.
(실시예 7)
폴리에틸렌글리콜 메타아크릴레이트를 메톡시 폴리에틸렌글리콜 메타아크릴레이트(NOF Corporation 제품, 에틸렌글리콜쇄 n=4)로 변경한 것 이외는 실시예 6과 동일하게 하여 피복 중합체 입자 및 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 얻었다.
(실시예 8)
폴리에틸렌글리콜 메타아크릴레이트를 글릴세릴롤 메타크릴레이트(NOF Corporation 제품)로 변경한 것 이외는 실시예 6과 동일하게 하여 피복 중합체 입자 및 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 얻었다.
(실시예 9)
폴리에틸렌글리콜 메타아크릴레이트를 첨가하지 않은 것 이외는 실시예 6과 동일하게 하여 피복 중합체 입자 및 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 얻었다.
(비교예 8)
오존수 처리를 행하지 않은 것 이외는 실시예 6과 동일하게 하여 피복 중합체 입자 및 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 얻었다.
(비교예 9)
오존수 처리 대신에 과산화수소수를 사용하여 산화처리를 실시한 것 이외는 실시예 6과 동일하게 하여 피복 중합체 입자 및 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 얻었다. 과산화수소수를 사용한 산화 처리 방법을 이하에 나타낸다.
피복 중합체 입자 10g에 1% 과산화수소수 300mL를 침지하고, 30분 교반하였다. 또한, 1% 과산화수소수는 30% 과산화수소수(Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제품)을 사용하여 제조하였다. 교반 종료후, 원심분리기(Hitachi, Ltd.제, Himac CR20G)를 사용하여 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 이 조작을 2회 반복하여 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 얻었다.
<평가>
실시예 6~9 및 비교예 8~9에서 얻어진 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제에 대해서, 이하의 평가를 행하였다.
(4) 친수성 중합체로 이루어진 층의 두께의 측정
실시예 6~9 및 비교예 8~9에서 제조된 이온 교환기를 갖는 친수성 피복 중합체 입자에 대해서, 친수성 중합체로 이루어진 층의 두께를 일본 특허공고 평8-7197호에 개시되어 있는 「피복층의 평균 두께의 측정방법」을 따라 측정하였다. 그 결과, 얻어진 피복 중합체 입자의 피복층의 두께는 5~10nm이고, 바람직한 범위가 되는 1~30nm의 범위내인 것을 확인하였다.
(5) 접촉각 측정
실시예 6~9 및 비교예 8~9에서 얻어진 피복 중합체 입자에 대해서 접촉각 측정을 행하였다. 측정은 Kyowa Interface Science Co., Ltd. 제품의 Dropmaster 500을 사용하여 행하였다. 건조시킨 피복 중합체 입자를 슬라이드 유리 상에 부착한 양면 테이프 상에 균일해지도록 적재하고, 그 후 에어 스프레이로 여분의 입자를 제거하였다. 이것에 의해, 양면 테이프 상에 피복 중합체 입자 1층분을 고정화하였다. 그 형태를 마이크로스코프로 확인하였다.
이온 교환수 1μL의 액적을 제조하고, 슬라이드 유리 상에 고정화한 피복 중합체 입자 상에 착액시켜 접촉각을 θ/2법에 의해 산출하였다. 또한, 접촉각이 90°보다 작을 경우, 착액후의 액적은 퍼져 나가려고 한다. 따라서, 착액후의 접촉각은 경시적으로 작아진다. 그래서, 착액후 0.5초 후의 접촉각치를 사용하여 평가를 행하는 것으로 하였다.
결과를 표 6에 나타내었다.
(6) 헤모글로빈 A1c 측정에 의한 Hb 회수율의 평가
실시예 6 및 비교예 8, 9에서 제조한 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 액체 크로마토그래피 시스템의 컬럼에 충전하였다. 한편, 글리코 Hb 컨트롤 레벨 2(International Reagents Corporation 제품, 참고 수치 10.4±0.5%)를 200μL의 주사용 물에 용해한 후, 희석액(0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 인산 완충액(pH 7.0))으로 100배 희석한 것을 제조하여 측정 시료로 하였다.
얻어진 컬럼을 사용하여 하기의 조건에 의해 측정 시료 중의 헤모글로빈 A1c량 및 헤모글로빈 A1c와 비당화 헤모글로빈의 합계량을 크로마토그램의 피크 면적으로 평가하였다. 측정은 10검체 연속으로 행하고, 그 후반 5검체의 헤모글로빈 A1c 피크의 면적치, 및 헤모글로빈 A1c 피크와 비당화 헤모글로빈 피크의 면적치의 평균치를 측정치로 하였다.
결과를 표 7, 도 3에 나타내었다. 도 3은 실시예 6에서 얻어진 헤모글로빈 A1c 피크 면적치 및 헤모글로빈 A1c와 비당화 헤모글로빈 피크의 면적치 합계를 100%으로 해서 비교예 8, 9에서 얻어진 각 피크 면적을 비교하였다.
시스템: 송액 펌프 LC-9A(Shimadzu Corporation 제품)
오토 샘플러 ASU-420(Sekisui Chemical Co., Ltd. 제품)
검출기 SPD-6AV(Shimadzu Corporation 제품)
용리액: 제 1 액 170mM 인산 완충액(pH 5.7)
제 2 액 300mM 인산 완충액(pH 8.5)
용출법: 0~3분은 제 1 액으로, 3~3.2분은 제 2 액으로, 3.2~4분은 제 1 액으로 용출
유속: 1.0mL/분
검출 파장: 415nm
시료 주입량: 10μL
(7) 헤모글로빈 A1c 측정에 있어서의 측정치 변동의 평가(내구성 평가)
실시예 6 및 비교예 8, 9에서 제조한 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 액체 크로마토그래피 시스템의 컬럼에 충전하였다. 한편, 글리코 Hb 컨트롤 레벨 2(International Reagents Corporation 제품, 참고 수치 10.4±0.5%)를 200μL의 주사용 물에 용해한 후, 희석액(0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 인산 완충액(pH 7.0))으로 100배 희석한 것을 제조하여 측정 시료로 하였다. 또한, 부하 시료로서 건강한 보통사람의 피를 NaF 채혈하고, 용혈 희석액(0.1중량% 트리톤 X-100을 함유하는 인산 완충액(pH 7.0))으로 용혈하고, 150배로 희석한 것을 사용하였다.
측정 시료, 부하 시료를 합쳐서 약 1000검체의 측정을 행하고, 임의의 간격으로 측정 시료 10검체를 연속으로 측정하고, 그 평균치를 사용하여 평가하였다. 하기 조건에 의해 측정 시료 중의 헤모글로빈 A1c량 및 비당화 헤모글로빈량을 측정하고, 헤모글로빈 A1c와 비당화 헤모글로빈의 합계에 대한 헤모글로빈 A1c의 비율(헤모글로빈 A1c치(%))을 구하였다.
결과를 표 8, 도 4에 나타내었다.
시스템: 송액 펌프 LC-9A(Shimadzu Corporation 제품)
오토 샘플러 ASU-420(Sekisui Chemical Co., Ltd. 제품)
검출기 SPD-6AV(Shimadzu Corporation 제품)
용리액: 제 1 액 170mM 인산 완충액(pH 5.7)
제 2 액 300mM 인산 완충액(pH 8.5)
용출법: 0~3분은 제 1 액으로, 3~3.2분은 제 2 액으로, 3.2~4분은 제 1 액으로 용출
유속: 1.0mL/분
검출 파장: 415nm
시료 주입량: 10μL
Figure 112008016018907-PCT00006
Figure 112008016018907-PCT00007
Figure 112008016018907-PCT00008
표 6에 나타나 있는 바와 같이, 실시예 6~9에서는 이온 교환기를 포함하는 친수성 중합체의 층을 형성하고, 오존수로 친수화 처리를 더 행함으로써 물의 접촉각을 60°이하의 표면으로 할 수 있었다. 실시예 6은 이온 교환기를 포함하지 않는 친수성 단량체를 첨가하지 않음으로써 소수성 중합체의 노출면이 커져 있기 때문에 접촉각이 약간 커져 있다고 생각된다. 비교예 8, 9는 실시예 6과 비교하여 분명하게 접촉각이 커졌다. 비교예 9의 결과로부터, 과산화수소수를 사용한 산화 처리 방법으로는 불충분한 것을 알았다.
표 7, 도 3으로부터, 실시예 6과 비교하여 비교예 8, 9 모두 헤모글로빈 A1c 피크 면적치, 및 헤모글로빈 A1c 피크와 비당화 헤모글로빈 피크의 면적치 합계가 저하하는 결과로 되었다. 즉, 헤모글로빈 A1c이나 다른 헤모글로빈 성분이 충전제 입자 표면에 흡착되어 있는 것을 나타낸다.
표 8, 도 4로부터, 실시예 6에서 제조한 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 사용했을 경우에는, 1000검체 측정 사이 헤모글로빈 A1c치(%)의 변동이 매우 작아서, 정확한 측정이 가능한 것을 알았다. 한편, 비교예 8, 9에서 제조한 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 사용했을 경우에는, 초기 300검체 측정까지 헤모글로빈 A1c치(%)가 크게 변동하는 것을 알았다. 이것은 평가(6)에서 보여진 헤모글로빈 A1c이나 다른 헤모글로빈 성분이 비특이 흡착을 일으키는 것에 기인한다고 생각된다.
(실시예 10)
(1)이온 교환기를 갖는 충전제 입자의 제조
2-아크릴아미드-2-메틸프로판 술폰산 200g, 디에틸렌글리콜 디메타크릴레이트 400g, 2-히드록시-1,3-디메타크릴옥시프로판 80g 및 벤조일 퍼옥사이드 1.5g을 혼합하고, 2.5L의 4중량% 폴리비닐알콜 수용액에 분산시켰다. 이것을 질소분위기 하에서 교반하면서 승온하고, 80℃에서 8시간 중합한 후, 세정·분급하여 술폰산기를 갖는 충전제 입자를 얻었다. 얻어진 충전제 입자에 대해서 레이저 회절식 입도 분포 측정장치를 사용하여 측정한 바, 평균 입자지름은 8㎛, CV치는 14%이었다.
(2) 오존수에 의한 친수화 처리
얻어진 충전제 입자 10g을 용존 오존가스 농도 150ppm의 오존수 300mL에 침지하고, 교반하면서 1N의 NaOH(Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제품)을 적하하여 용액의 pH를 11.0으로 조정하였다. pH를 조정한 후, 신속히 수조내의 온도를 50℃로 설정한 초음파 조사장치(As One Corporation 제품, USD-2) 내에서 주파수가 28kHz인 초음파를 30분간 조사하였다. 초음파 조사후, 원심분리기(Hitachi, Ltd.제Himac CR20G)를 사용하여 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 이 조작을 2회 반복해서 친수화 처리를 실시하여 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 얻었다.
또한, 오존수는 내경 15cm×길이 20cm의 원주형을 갖는 외투내에 퍼플루오로알콕시 수지로 이루어진 내경 0.5mm×두께 0.04mm×길이 350cm의 중공관 형상의 오존가스 투과막 400개가 수용된 오존 용해 모듈을 포함하는 오존수 제조 시스템(Sekisui Chemical Co., Ltd. 제품)을 사용하여 제조하였다.
(비교예 10)
실시예 10에서 제조한 술폰산기를 갖는 충전제 입자를 오존수에 의한 친수화 처리를 행하지 않고 그대로 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제로 하였다.
(비교예 11)
오존수에 의한 친수화 처리에 있어서, 용존 오존가스 농도를 10ppm으로 한 이외는 실시예 10과 동일하게 하여 친수화 처리를 행하여 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 얻었다.
(비교예 12)
오존수에 의한 친수화 처리에 있어서, pH 조정 및 초음파 조사의 조작을 행하지 않은 이외는 실시예 10과 동일하게 하여 친수화 처리를 행하여 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 얻었다.
(비교예 13)
실시예 10에서 제조한 술폰산기를 갖는 충전제 입자 10g에 인산 완충액(pH 5.7)에 용해시킨 0.2중량% 소 혈청 알부민(BSA) 200mL을 가하고, 2분간 초음파 처리하고, 80℃의 항온 수조 중에서 24시간 서서히 교반한 후, 항온 수조로부터 꺼내어 실온이 될 때까지 방치하였다. 그 후, 원심분리에 의해 상청을 제거하고, 인산 완충액(pH 8.5)를 200mL 첨가하고, 재차 원심분리에 의해 상청을 제거하였다. 이어서, 인산 완충액(pH 5.7)를 200mL 첨가하고, 여러번 원심분리에 의해 상청을 제거하여, 물리흡착에 의한 BSA가 고정된 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 얻었다.
<평가>
실시예 10 및 비교예 10~13에서 얻어진 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제에 대해서 이하의 평가를 행하였다.
(1) 헤모글로빈 A1c 측정에 있어서의 초기 측정치의 평가
실시예 10 및 비교예 10~12에서 제조한 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 액체 크로마토그래피 시스템의 컬럼에 충전하였다. 한편, 글리코 Hb 컨트롤 레벨 2(International Reagents Corporation 제품, 참고 수치 10.4±0.5%)를 200μL의 주사용 물에 용해한 후, 희석액(0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 인산 완충액(pH 7.0))으로 100배 희석한 것을 제조하여 측정 시료로 하였다.
얻어진 컬럼을 사용하여, 하기 조건에 의해 측정 시료 중의 헤모글로빈 A1c량 및 비당화 헤모글로빈량을 측정하고, 헤모글로빈 A1c와 비당화 헤모글로빈의 합계에 대한 헤모글로빈 A1c의 비율(헤모글로빈 A1c치(%))을 구하였다. 측정은 10검체 연속으로 행하고, 그 후반 5검체의 평균치를 측정치로 하였다.
결과를 표 9에 나타내었다.
시스템: 송액 펌프 LC-9A(Shimadzu Corporation 제품)
오토 샘플러 ASU-420(Sekisui Chemical Co., Ltd. 제품)
검출기 SPD-6AV(Shimadzu Corporation 제품)
용리액: 제 1 액 170mM 인산 완충액(pH 5.7)
제 2 액 300mM 인산 완충액(pH 8.5)
용출법: 0~3분은 제 1 액으로, 3~3.2분은 제 2 액으로, 3.2~4분은 제 1 액으로 용출
유속: 1.0mL/분
검출 파장: 415nm
시료 주입량: 10μL
Figure 112008016018907-PCT00009
표 9로부터, 실시예 10에서 제조한 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 사용했을 경우에는 매우 정확한 측정을 할 수 있었던 것에 비해서, 비교예 10에서 제조한 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 사용했을 경우에는 상정되는 치보다도 상당히 낮은 헤모글로빈 A1c치(%)가 얻어졌다. 이것은 비교예 10의 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 사용했을 경우에는 특히 헤모글로빈 A1c의 비율이 현저하게 저하한 것에 의한 것이고, 즉 헤모글로빈 성분이 충전제 입자 표면에 비특이 흡착하여 있는 것을 나타내는 것이다. 또한, 비교예 11에서 제조한 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 사용했을 경우에는 비교예 10 보다는 개선되어 있지만, 상정되는 치보다는 낮은 헤모글로빈 A1c치(%)가 얻어졌다. 즉, 용존 오존가스 농도가 10ppm에서는 충분한 친수화 효과가 얻어지지 않는 것을 나타낸다. 또한, 비교예 12에서 제조한 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 사용했을 경우에는 실시예 10과 동등한 헤모글로빈 A1c치(%)가 얻어졌다. 그러나, 실시예 10과 비교하여, 헤모글로빈 A1c치(%)를 산출하는 헤모글로빈 A1c량과 비당화 헤모글로빈량이 각각 약 10% 저하하여 있는 것을 알았다. 따라서, 헤모글로빈 A1c치(%)는 동등하여도, 헤모글로빈 성분이 충전제 표면에 비특이 흡착하여 있는 것을 의미하는 것이다.
(2) 헤모글로빈 A1c 측정에 있어서의 측정치 변동의 평가(내구성 평가)
실시예 10 및 비교예 13에서 제조한 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 액체 크로마토그래피 시스템의 컬럼에 충전하였다. 한편, 글리코 Hb 컨트롤 레벨 2(International Reagents Corporation 제품, 참고 수치 10.4±0.5%)를 200μL의 주사용 물에 용해한 후, 희석액(0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 인산 완충액(pH 7.0))으로 100배 희석한 것을 제조하여 측정 시료로 하였다. 또한, 부하 자료로서 건강한 보통사람의 피를 NaF 채혈하고, 용혈 희석액(0.1중량% 트리톤 X-100을 함유하는 인산 완충액(pH 7.0))으로 용혈하고, 150배로 희석한 것을 사용하여 1일에 300검체를 측정하였다.
각 부하 검체수를 측정한 후, 컬럼을 사용하여 하기 조건에 의해 측정 시료 중의 헤모글로빈 A1c량 및 비당화 헤모글로빈량을 측정하고, 헤모글로빈 A1c와 비당화 헤모글로빈의 합계에 대한 헤모글로빈 A1c의 비율(헤모글로빈 A1c치(%))을 구하였다. 측정은 10검체를 연속으로 행하고, 그 평균치를 측정치로 하였다. 또한, 헤모글로빈 A1c의 유지시간도 측정하였다.
결과를 표 10에 나타내었다.
시스템: 송액 펌프 LC-9A(Shimadzu Corporation 제품)
오토 샘플러 ASU-420(Sekisui Chemical Co., Ltd. 제품)
검출기 SPD-6AV(Shimadzu Corporation 제품)
용리액: 제 1 액 170mM 인산 완충액(pH 5.7)
제 2 액 300mM 인산 완충액(pH 8.5)
용출법: 0~3분은 제 1 액으로, 3~3.2분은 제 2 액으로, 3.2~4분은 제 1 액으로 용출
유속: 1.0mL/분
검출 파장: 415nm
시료 주입량: 10μL
Figure 112008016018907-PCT00010
표 10으로부터, 실시예 10에서 제조한 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 사용했을 경우에는, 4500검체의 부하시험을 행한 후에도 거의 헤모글로빈 A1c의 유지시간에 변화가 없어 정확한 헤모글로빈 A1c치(%)가 가능한 것을 알았다. 한편, 비교예 13에서 제조한 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 사용했을 경우에는 부하 검체수가 증가함에 따라 헤모글로빈 A1c의 유지시간이 변화되는 경향이 있어, 얻어진 헤모글로빈 A1c치(%)도 실시예 10의 경우에 비교하여 불균형이 큰 것이었다.
(실시예 11)
(1) 이온 교환기를 갖는 충전제 입자의 제조
교반기 부착 반응기 중으로, 3% 폴리비닐알콜(Nippon Synthetic Chemical Industry Co., Ltd. 제품) 수용액에 테트라에틸렌글리콜 디메타크릴레이트(Shin-nakamura Chemical Co. Ltd. 제품) 300g, 트리에틸렌글리콜 디메타크릴레이트(Shin-nakamura Chemical Co. Ltd. 제품) 100g 및 과산화 벤조일(Kishida Chemical Co., Ltd. 제품) 1.0g의 혼합물을 첨가하였다. 교반하면서 가열하고, 질소분위기 하에서 80℃, 1시간 중합하였다. 다음에, 이온 교환기를 갖는 단량체로서 2-메타크릴아미드-2-메틸프로판 술폰산(Toagosei Co., Ltd. 제품) 100g, 폴리에틸렌글리콜 메타크릴레이트(NOF Corporation 제품, 에틸렌글리콜쇄 n=4) 100g을 이온 교환수에 용해하였다. 이 혼합물을 동일 반응기에 첨가하고, 동일하에 하여 교반하면서 질소분위기 하에서 80℃에서 2시간 중합하였다. 얻어진 중합 조성물을 물 및 아세톤으로 세정함으로써, 이온 교환기로서 술폰산기를 갖는 충전제 입자를 얻었다.
얻어진 충전제 입자에 대해서 레이저 회절식 입도 분포 측정장치를 사용하여 측정한 바, 평균 입자지름은 8㎛, CV치는 14%이었다.
(2) 오존수에 의한 친수화 처리
얻어진 충전제 입자 10g을 용존 오존가스 농도 130ppm의 오존수 300mL에 침지하고, 교반하면서 파장 254nm을 포함한 자외선을 조사할 수 있는 스폿 타입 UV 조사장치(EYEGRAPHICS CO., LTD. 제품, UP-200G)를 사용하여, 1cm의 거리로부터 조사 강도 95mW/㎠으로 30O초간 자외선을 조사해서 친수화 처리를 실시하였다. 자외선 조사후, 원심분리기(Hitachi, Ltd.제Himac CR20G)를 사용하여 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 이 조작을 2회 반복 친수화 처리를 실시하여 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 얻었다.
또한, 오존수는 내경 15cm×길이 20cm의 원주형을 갖는 외투내에 퍼플루오로알콕시 수지로 이루어진 내경 0.5mm×두께 0.04mm×길이 350cm의 중공관 형상의 오존가스 투과막 400개가 수용된 오존 용해 모듈을 포함하는 오존수 제조 시스템(Sekisui Chemical Co., Ltd. 제품)을 사용하여 제조하였다.
(비교예 14)
실시예 11에서 제조한 이온 교환기로서 술폰산기를 갖는 충전제 입자를 오존수에 의한 친수화 처리를 행하지 않고 그대로 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제로 하였다.
(비교예 15)
오존수에 의한 친수화 처리에 있어서, 용존 오존가스 농도를 10ppm으로 한 것 이외는 실시예 11과 동일하게 하여 친수화 처리를 행하여 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 얻었다.
(비교예 16)
오존수에 의한 친수화 처리에 있어서, 촉진 산화법에 의한 처리를 행하지 않은 것 이외는 실시예 11과 동일하게 하여 친수화 처리를 행하여 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 얻었다.
(비교예 17)
실시예 11에서 제조한 이온 교환기로서 술폰산기를 갖는 충전제 입자 10g에 인산 완충액(pH 5.7)에 용해시킨 0.2중량% 소 혈청 알부민(BSA) 200mL을 가하고, 2분간 초음파 처리하고, 80℃의 항온 수조 중에서 24시간 완만하게 교반한 후 항온 수조로부터 꺼내어 실온이 될 때까지 방치하였다. 그 후, 원심분리에 의해 상청을 제거하고, 인산 완충액(pH 8.5)를 200mL 첨가하고, 재차 원심분리에 의해 상청을 제거하였다. 이어서, 인산 완충액(pH 5.7)를 200mL 첨가하고, 여러번 원심분리에 의해 상청을 제거하여 물리흡착에 의한 BSA가 고정된 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 얻었다.
<평가>
실시예 11 및 비교예 14~17에서 얻어진 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제에 대해서 이하의 평가를 행하였다. 결과를 표 11~13에 나타내었다.
(3) 접촉각 측정
실시예 11 및 비교예 14, 16에서 얻어진 충전제 입자에 대해서 접촉각 측정을 행하였다. 측정은 Kyowa Interface Science Co., Ltd. 제품의 Dropmaster 500을 사용해 행하였다. 건조시킨 충전제 입자를 슬라이드 유리 상에 부착한 양면 테이프 상에 균일해지도록 적재하고, 그 후 에어 스프레이로 여분의 입자를 제거하였다. 이것에 의해, 양면 테이프 상에 충전제 입자 1층분을 고정화하였다. 그 형태를 마이크로스코프로 확인하였다.
이온 교환수 1μL의 액적을 제조하여 슬라이드 유리 상에 고정화한 충전제 입자 상에 착액시키고, 접촉각을 θ/2법에 의해 산출하였다. 또한, 접촉각이 90°보다 작을 경우, 착액 후의 액적은 퍼져 나가려고 한다. 따라서, 착액후의 접촉각은 경시적으로 작아진다. 그래서, 착액후 0.5초 후의 접촉각치를 사용하여 평가를 행하는 것으로 하였다.
결과를 표 11에 나타내었다.
(4) 헤모글로빈 A1c 측정에 의한 헤모글로빈류(Hb) 회수율의 평가
실시예 11 및 비교예 14~16에서 제조한 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 액체 크로마토그래피 시스템의 컬럼에 충전하였다. 한편, 글리코 Hb 컨트롤 레벨 2(International Reagents Corporation 제품, 참고 수치 10.4±0.5%)를 200μL의 주사용 물에 용해한 후, 희석액(0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 인산 완충액(pH 7.0))으로 100배 희석한 것을 제조하여 측정 시료로 하였다.
얻어진 컬럼을 사용하여 하기 조건에 의해 측정 시료 중의 헤모글로빈 A1c량 및 헤모글로빈 A1c와 비당화 헤모글로빈의 합계량을 크로마토그램의 피크 면적으로 평가하였다. 측정은 10검체 연속으로 행하고, 그 후반 5검체의 헤모글로빈 A1c 피크의 면적치, 및 헤모글로빈 A1c 피크와 비당화 헤모글로빈 피크의 면적치의 평균치를 측정치로 하였다.
결과를 표 12, 도 5에 나타내었다. 실시예 11에서 얻어진 헤모글로빈 A1c 피크 면적치 및 헤모글로빈 A1c와 비당화 헤모글로빈 피크의 면적치 합계를 100%로 하여 비교예 14~16에서 얻어진 각 피크 면적을 비교하였다.
시스템: 송액 펌프 LC-9A(Shimadzu Corporation 제품)
오토 샘플러 ASU-420(Sekisui Chemical Co., Ltd. 제품)
검출기 SPD-6AV(Shimadzu Corporation 제품)
용리액: 제 1 액 170mM 인산 완충액(pH 5.7)
제 2 액 300mM 인산 완충액(pH 8.5)
용출법: 0~3분은 제 1 액으로, 3~3.2분은 제 2 액으로, 3.2~4분은 제 1 액으로 용출
유속: 1.0mL/분
검출 파장: 415nm
시료 주입량: 10μL
(5) 헤모글로빈 A1c 측정에 있어서의 측정치 변동의 평가(내구성 평가)
실시예 11 및 비교예 17에서 제조한 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 액체 크로마토그래피 시스템의 컬럼에 충전하였다. 한편, 글리코 Hb 컨트롤 레벨 2(International Reagents Corporation 제품, 참고 수치 10.4±0.5%)를 200μL의 주사용 물에 용해한 후, 희석액(0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 인산 완충액(pH 7.0))으로 100배 희석한 것을 제조하여 측정 시료로 하였다. 또한, 부하 시료로서 건강한 보통사람의 피를 NaF 채혈하고, 용혈 희석액(0.1중량% 트리톤 X-100을 함유하는 인산 완충액(pH 7.0))으로 용혈하고, 150배로 희석한 것을 사용하였다.
측정 시료, 부하 시료를 합쳐서 약 1000검체의 측정을 행하고, 임의의 간격으로 측정 시료 10검체를 연속으로 측정하고, 그 평균치를 사용하여 평가하였다. 하기 조건에 의해 측정 시료 중의 헤모글로빈 A1c량 및 비당화 헤모글로빈량을 측정하고, 헤모글로빈 A1c와 비당화 헤모글로빈의 합계에 대한 헤모글로빈 A1c의 비율(헤모글로빈 A1c치(%))을 구하였다. 또한 헤모글로빈 A1c의 유지시간도 측정하였다.
결과를 표 13에 나타내었다.
시스템: 송액 펌프 LC-9A(Shimadzu Corporation 제품)
오토 샘플러 ASU-420(Sekisui Chemical Co., Ltd. 제품)
검출기 SPD-6AV(Shimadzu Corporation 제품)
용리액: 제 1 액 170mM 인산 완충액(pH 5.7)
제 2 액 300mM 인산 완충액(pH 8.5)
용출법: 0~3분은 제 1 액으로, 3~3.2분은 제 2 액으로, 3.2~4분은 제 1 액으로 용출
유속: 1.0mL/분검출 파장: 415nm
시료 주입량: 10μL
Figure 112008016018907-PCT00011
Figure 112008016018907-PCT00012
Figure 112008016018907-PCT00013
표 11에 나타나 있는 바와 같이, 실시예 11에서는 비교예 16에 나타낸 오존수 처리만의 접촉각 보다도 8°작아져 있어, 촉진 산화법에 의한 처리에 의해 충전제 입자의 표면의 친수성이 향상되어 있는 것을 알 수 있다.
표 12, 도 5에 나타나 있는 바와 같이, 촉진 산화법에 의한 처리를 행한 실시예 11이 A1cArea, TotalArea 모두 비교예 14~16보다 큰 것을 알 수 있다. 즉, 충전제 입자의 표면으로의 헤모글로빈 A1c 성분이나 다른 헤모글로빈 성분의 흡착이 억제되어 있는 것을 알 수 있다.
표 13에 나타나 있는 바와 같이, 실시예 11에서 제조한 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 사용했을 경우에는, 1000검체 측정 사이, 헤모글로빈 A1c치(%)의 변동, 유지시간의 변동이 모두 매우 작아서 정확한 측정이 가능한 것을 알 수 있다. 한편, 비교예 17의 경우에는 유지시간이 크게 변동하여 있다. 이것은 친수성을 향상시키기 위해서 코팅한 단백질이 측정 중에 탈리되는 것에 기인한다고 생각된다.
본 발명에 의하면, 수계 매체 중에서의 팽윤을 억제하고, 또한 수계 매체에 대한 분산성이 우수한 친수성 고분자 미립자, 단백질 등의 비특이 흡착을 효과적으로 억제할 수 있는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제, 상기 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 사용한 당화 헤모글로빈의 분석방법, 팽윤, 비특이 흡착 등의 억제 효과를 장기간에 걸쳐 유지할 수 있는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방법, 상기 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방 법을 사용하여 제조되는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제, 및 당화 헤모글로빈 분석용 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 제공할 수 있다.

Claims (17)

  1. 물 및 아세톤에 각각 분산시켜 초음파를 15분간 조사하고, 25℃에서 240시간 방치하여 평형화시킨 후, 입도 분포 측정기에 의해 입자지름을 각각 측정했을 때, 물에 분산시켰을 때의 입자지름 DW와 아세톤에 분산시켰을 때의 입자지름 DA의 비 DW/DA가 2.0 이하이고, 또한 상기 친수성 고분자 미립자를 단층으로 간격없이 나열한 후에 순수의 액적을 형성시켜서 25℃의 조건하에서 접촉각계에 의해 측정한 물의 접촉각이 70°이하인 것을 특징으로 하는 친수성 고분자 미립자.
  2. 기재 미립자와 상기 기재 미립자의 표면에 존재하는 이온 교환기로 이루어진 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제로서:
    물 및 아세톤에 각각 분산시켜 초음파를 15분간 조사하고, 25℃에서 240시간 방치하여 평형화시킨 후, 입도 분포 측정기에 의해 입자지름을 각각 측정했을 때, 물에 분산시켰을 때의 입자지름 DW와 아세톤에 분산시켰을 때의 입자지름 DA의 비 DW/DA가 2.0 이하이고, 또한 상기 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 단층으로 간격없이 나열한 후에 순수의 액적을 형성시켜서 25℃의 조건하에서 접촉각계에 의해 측정한 물의 접촉각이 60°이하인 것을 특징으로 하는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제.
  3. 이온 교환기를 갖고, 물의 접촉각이 60°이하이고, 표면이 친수성 화합물로 피복되어 있지 않은 것을 특징으로 하는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제.
  4. 합성 유기고분자로 이루어진 소수성 가교중합체 입자와 상기 소수성 가교중합체 입자의 표면에 공중합된 이온 교환기를 갖는 친수성 중합체로 이루어진 층으로 이루어진 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제로서:
    최표면이 오존수에 의해 친수화 처리가 실시되어 있는 것을 특징으로 하는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제.
  5. 제 4 항에 있어서, 물의 접촉각이 60°이하인 것을 특징으로 하는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제.
  6. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 오존수의 농도가 20ppm 이상인 것을 특징으로 하는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제.
  7. 제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 교환기가 술폰산기인 것을 특징으로 하는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제.
  8. 제 1 항에 기재된 친수성 고분자 미립자 또는 제 2 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제를 사용하는 것을 특징으 로 하는 당화 헤모글로빈의 분석방법.
  9. 이온 교환기를 갖는 충전제 입자 표면을 용존 오존가스 농도가 20ppm 이상인 오존수를 사용하여 세정함으로써 친수화하는 친수화 공정을 포함하는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방법으로서: 상기 친수화 공정에 있어서, 촉진 산화법에 의한 처리를 행하는 것을 특징으로 하는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 촉진 산화법에 의한 처리로서, 오존수의 pH를 7 이상으로 하고, 또한 초음파 조사를 행하는 것을 특징으로 하는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 주파수가 20kHz~1MHz인 초음파를 조사하는 것을 특징으로 하는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방법.
  12. 제 9 항에 있어서, 상기 촉진 산화법에 의한 처리로서, 자외선 조사를 행하는 것을 특징으로 하는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 자외선은 254nm의 파장을 포함하는 것을 특징으로 하는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방법.
  14. 제 9 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 촉진 산화법에 의한 처리를 20℃ 이상에서 행하는 것을 특징으로 하는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방법.
  15. 제 9 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 교환기가 술폰산기인 것을 특징으로 하는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방법.
  16. 제 9 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 기재된 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제.
  17. 제 9 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 기재된 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제의 제조방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 당화 헤모글로빈 분석용 이온 교환 액체 크로마토그래피용 충전제.
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