JP3927322B2 - 液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法、更に詳しくはカチオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
イオン交換基としてカルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基などのカチオン交換基を有する充填剤を用いた液体クロマトグラフィー分析法は、糖化ヘモグロビン類の分析をはじめとして、各種生体関連物質の分析等に極めて有用な方法である。
【０００３】
上記カチオン交換基を有する充填剤の製造方法としては、例えば、以下の４つの方法が開示されている。
（１）架橋性粒子に、カチオン交換基を有する化合物を反応させる方法。
すなわち、反応性官能基を有する無機系又は有機系粒子に、該反応性官能基と反応する基及びカチオン交換基を有する化合物を反応させることにより、上記無機系又は有機系粒子に、カチオン交換基を導入する方法。具体的には、例えば、特開平１−２６２４６８号公報には、粒子中のエポキシ基にカルボキシル基含有化合物又はスルホン酸基含有化合物を反応させる方法が開示されている。
【０００４】
（２）カチオン交換基を有する単量体を、架橋性単量体と混合して共重合する方法。
例えば、特公昭６３−５９４６３号公報には、カルボキシル基含有単量体５〜９０重量％、架橋性単量体１０〜９５重量％、非架橋性単量体０〜８５重量％を混合して重合する方法が開示されている。
【０００５】
（３）疎水性架橋性単量体の重合途中にカチオン交換基を有する単量体を添加し、更に重合を継続する方法。
例えば、Y.Ohtsuka et al の文献[J. Applied Polym. Sci.,27(1982)3279-3288]には、イオン交換樹脂の製造法ではないが、疎水性架橋性単量体としてエチレングリコールジメタクリレートを用い、該単量体を１０〜６０分重合した後、アクリル酸やメタクリル酸などのカチオン交換基含有単量体を反応系に添加して、更に重合を２４時間継続して行う方法が開示されている。
【０００６】
（４）疎水性架橋重合体粒子の表面付近で、カチオン交換基含有単量体を重合させる方法。
特公平８−７１９７号公報には、重合開始剤を含浸させた疎水性架橋重合体粒子を水性分散媒に分散した後、カチオン交換基含有単量体を添加して重合し、粒子表面付近で該単量体を重合させる方法が開示されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記（１）〜（４）の方法には、以下の問題点が残っている。
上記（１）の方法：
・後処理によりイオン性基を導入する方法においては、イオン交換基を有する化合物を定量的に導入することは困難であることが一般的に知られており、上記（２）や（４）の方法のような単量体由来のイオン交換基導入に比べ、製造の再現性の点で劣る（吉廻、細矢、木全、田中：Chromatography,16(1)7-12(1995)）。
・また後処理の方法が極めて煩雑で長時間を要する。
・カチオン交換基含有化合物と反応させるための官能基としては、水酸基、グリシジル基、アミノ基などがあるが、いずれも親水性基であり、これらの親水性基を有する単量体を多量に用いて重合を行って粒子を調製するため、耐圧性・耐膨潤性に劣る。
【０００８】
上記（２）の方法：
・上記（１）の方法に比べ、充填剤にカチオン交換基を定量的に含有させることが可能であり、操作も簡単であるが、カチオン交換基が粒子内部にも存在するため、耐圧性が劣るとともに、溶離液の変更等による外部環境の変化に対して、平衡化に時間がかかり、結果的に測定時間の延長を招く、等の欠点を有する。
【０００９】
上記（３）の方法：
・重合途中で親水性単量体を添加する方法では、同一条件で重合を行っても再現性が悪く、生産上極めて不都合である。すなわち、重合途中で、主に親水性単量体由来の重合物が凝集してしまい使用不可能となることが多い；液体クロマトグラフィー用充填剤として使用した場合、保持時間やカラム圧力などの性能にばらつきが大きい；微調整すること（例えば：粒径を最適化するなど）も可能であるが、非常に煩雑でありコストもかかる；重合時間が長い（２４時間）ため凝集が発生しやすい、などの欠点がある。
【００１０】
上記（４）の方法：
・一連の重合作業で行えないため、作業が繁雑である。
・疎水性架橋重合体に重合開始剤を、定量的に含浸させることが困難なため、液体クロマトグラフィー用充填剤としての性能の再現性が悪い。
・重合の途中で、カチオン交換基含有単量体を添加する連続法も記載されているが、添加された該単量体が均一に分散しない状態で、すぐに重合が開始されるため、ロット間差が大きい。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、煩雑で再現性の低下を招く後処理によるカチオン交換基の導入方法を用いず、粒子内部に親水性基が多く存在することによる膨潤・収縮や、平衡化時間の延長がなく、更に、長時間又は煩雑な操作をすることなく、しかも製造再現性に優れ、製造ロット間差の少ない、液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法は、以下の工程よりなることを特徴とする。
（ｉ）疎水性架橋性単量体と重合開始剤とを含む重合性混合物を水性分散媒に分散する第１工程、
（ii）第１工程で得られた分散系を５０〜１００℃に昇温して、２０〜２４０分間重合反応を行う第２工程、
（iii ）その後、１０〜４０℃に反応系を冷却する第３工程、
（iv）該反応系にカチオン交換基含有単量体を添加する第４工程、
（ｖ）添加終了後、該反応系を１０〜４０℃で０．５〜２４時間撹拌する第５工程、
（vi）該反応系を５０〜１００℃に昇温して重合反応を行い、重合開始後２０〜２４０分間で、かつカチオン交換基含有単量体の添加量の０．１〜２０％の重合率の段階において重合反応を終了する第６工程、
（vii ）得られた重合体を、水及び／又は有機溶媒で洗浄する第７工程。
【００１３】
以下、本発明の詳細を工程を追って説明する。
第１工程は、疎水性架橋性単量体と重合開始剤とを含む重合性混合物を水性分散媒に分散する工程である。
【００１４】
（疎水性架橋性単量体）
上記疎水性架橋性単量体とは、イオン交換基を有さないか又は有していても微量である単量体であって、１分子中にビニル基を２個以上有し、第４工程で用いるカチオン交換基含有単量体よりも疎水性であるものを言う。このような、疎水性架橋性単量体としては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルエチルベンゼン、ジビニルナフタレン等のスチレン誘導体；エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，３−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサングリコールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタントリ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステルの誘導体；１，３−ブタジエン、イソプレン、１，４−ヘキサンジエン等の脂肪族ジエン化合物；および上記単量体の誘導体などが挙げられる。これらは２種以上が混合されて用いられてもよい。
【００１５】
（重合開始剤）
上記重合開始剤としては、特に限定されず、水溶性又は油溶性の公知のラジカル重合開始剤が用いられる。上記重合開始剤の具体的な例としては、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウムなどの過硫酸塩；クメンハイドロパーオキサイド、ベンゾイルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド、オクタノイルパーオキサイド、ｏ−クロロベンゾイルパーオキサイド、アセチルパーオキサイド、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシアセテート、ｔ−ブチルパーオキシイソブチレート、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイドなどの有機過酸化物；２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、４，４’−アゾビス（４−シアノペンタン酸）、２，２’−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、アゾビスシクロヘキサンカルボニトリルなどのアゾ化合物；および上記重合開始剤の誘導体類などが挙げられる。
【００１６】
上記重合開始剤の使用量は、疎水性架橋性単量体１００重量部に対し、０．０５〜５重量部が好ましい。重合開始剤の使用量が０．０５重量部未満になると、重合反応が不十分となったり、重合に長時間を要することがあり、５重量部を越えると、急激な反応の進行により、凝集物が発生することがある。この重合開始剤は、上記疎水性架橋性単量体に溶解して用いられる。
【００１７】
（重合性混合物）
上記重合性混合物は、疎水性架橋性単量体と重合開始剤とを必須成分として含むが、更に必要に応じて、その他の単量体（ａ）、その他の添加物（ｂ）などが混合されてもよい。
【００１８】
上記その他の単量体（ａ）は、例えば、非架橋性単量体が挙げられ、具体的には、スチレン、α−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、クロロメチルスチレンなどのスチレン誘導体類；塩化ビニルなどのハロゲン化ビニル類；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ステアリン酸ビニルなどのビニルエステル類；アクリル酸メチル、メタクリル酸メチル、アクリル酸エチル、メタクリル酸エチル、アクリル酸ブチル、メタクリル酸ブチル、アクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸ステアリル、メタクリル酸ステアリルなどの（メタ）アクリル酸エステル類が挙げられる。
【００１９】
上記非架橋性単量体の使用量は、疎水性架橋性単量体１００重量部に対して、好ましくは０〜５０重量部である。
【００２０】
但し、非架橋性単量体のうち、親水性単量体、例えば、水酸基を有する２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、グリセロール（メタ）アクリレート；エポキシ基を有するグリシジル（メタ）アクリレート；第４工程で用いられるカチオン交換基含有単量体；アニオン交換基含有単量体などは用いられない。これらが充填剤粒子を構成するための素材として用いられると粒子内部に存在するこれらの親水性基のため、充填剤粒子の耐圧性・耐膨潤性が低下するからである。
【００２１】
上記その他の添加物（ｂ）としては、例えば、多孔質化剤（ｂ−１）、疎水性重合体粒子（ｂ−２）などが挙げられるが、これらに限定されるわけではなく、公知の添加物が添加され得る。
【００２２】
上記多孔質化剤（ｂ−１）としては、単量体を溶解するが、重合体を溶解しない有機溶媒が挙げられ、これを添加することにより、得られる重合体を多孔質にすることができる。多孔質化剤（ｂ−１）としては、例えば、トルエン、キシレン、ジエチルベンゼン、ドデシルベンゼン等の芳香族炭化水素類；ヘキサン、ヘプタン、オクタン、デカン等の飽和炭化水素類；イソアミルアルコール、ヘキシルアルコール、オクチルアルコール等のアルコール類などが挙げられる。
【００２３】
上記多孔質化剤（ｂ−１）の使用量は、上記疎水性架橋性単量体１００重量部に対して、０〜１００重量部が好ましい。
【００２４】
上記疎水性重合体粒子（ｂ−２）とは、粒度分布の揃った疎水性の重合体粒子のことを指し、これに上記疎水性架橋性単量体と重合開始剤を吸収させた後、重合を行うことにより、粒度分布の揃った充填剤を得ることができる。上記重合体粒子（ｂ−２）としては、例えば、上記その他の単量体（ａ）に示した単量体などの単独重合体又は共重合体からなる非架橋重合体粒子が挙げられ、例えば、スチレン重合体、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、（メタ）アクリル酸メチル重合体、（メタ）アクリル酸エチル重合体などが挙げられる。
また、上記重合体粒子（ｂ−２）として、上記その他の単量体（ａ）と上記疎水性架橋性単量体の共重合体である架橋共重合体粒子も使用できるが、この場合は、疎水性架橋性単量体の割合を１０重量％以下として共重合して得られる低架橋重合体粒子が好ましい。
【００２５】
上記疎水性重合体粒子（ｂ−２）の製造方法は、公知の重合方法でよく、例えば、乳化重合、ソープフリー重合、分散重合、懸濁重合などが挙げられる。
【００２６】
上記疎水性重合体粒子（ｂ−２）の平均粒径は、０．１〜１０μｍが好ましく、粒径のばらつきは変動係数（ＣＶ）（＝標準偏差÷平均粒径×１００）として１５％以下が好ましい。
【００２７】
上記疎水性重合体粒子（ｂ−２）の使用量は、疎水性架橋性単量体１００重量部に対して、０．５〜１００重量部が好ましい。
【００２８】
（水性分散媒）
上記水性分散媒としては、水、又は水に溶解する適宜の水溶性有機溶媒と水との混合物が挙げられる。上記水溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどのアルコール類；アセトン；アセトニトリルなどを例示することができるが、特にこれらに限定されるものではない。水溶性有機溶媒と水との混合物の場合、上記有機溶媒は２０重量％以下が好ましい。
【００２９】
上記水性分散媒には、必要に応じて、分散剤（ｃ）、その他の添加剤（ｄ）が含まれてもよい。上記分散剤（ｃ）としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、デンプン、ヒドロキシセルロース、ポリビニルエーテルなどの高分子化合物；リン酸カルシウムなどの無機塩類；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム、ジアルキルスルホコハク酸ナトリウムなどのイオン性界面活性剤；ポリオキシエチレンノニルフェニールエーテル、ポリエチレングリコールモノステアリレート、ソルビタンモノステアリレートなどの非イオン性界面活性剤などが挙げられ、その使用量は、上記水性分散媒の０．０１〜２０重量％溶液として用いるのが好ましい。
【００３０】
上記その他の添加剤（ｄ）としては、例えば、ｐＨ調節剤；使用する単量体の溶解度を調整するための物質；消泡剤などが挙げられる。
【００３１】
上記ｐＨ調節剤としては、例えば、塩酸、硝酸、リン酸などの無機酸類；酢酸などの有機酸類；水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの塩基類；リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液などの各種の無機及び有機系の緩衝液などが挙げられる。
【００３２】
上記使用する単量体の溶解度を調整するための物質としては、例えば、酢酸ナトリウムなどの塩類が挙げられる。
【００３３】
上記消泡剤としては、例えば、各種界面活性剤など公知の消泡剤が挙げられる。
【００３４】
上記水性分散媒の使用量は、重合性混合物１００重量部に対して２００〜１００００重量部が好ましい。
【００３５】
第１工程における、重合性混合物を水性分散媒に分散させる方法は、特に限定されるわけではないが、例えば、重合性混合物を、上記水性分散媒に添加して、１０〜４０℃の状態で撹拌する方法が挙げられる。上記分散系には、不活性ガスを封入又は通気するのが好ましい。
【００３６】
第２工程は、第１工程で得られた分散系を５０〜１００℃に昇温して、２０〜２４０分間重合反応を行う工程である。
以下、この重合反応のことを１次重合と言い、また第６工程の重合反応のことを２次重合と言う。
１次重合の重合温度は、５０〜１００℃に限定される。５０℃未満では重合速度が遅すぎて重合に時間がかかりすぎ、１００℃を超えると、重合速度が早すぎて凝集が起こりやすくなる。１次重合の重合時間は２０〜２４０分間に限定される。２０分未満では、重合率が低すぎて、液体クロマトグラフィー用充填剤として用いた場合、その性能の再現性が低下する。２４０分を超えると、重合率が高すぎて、第６工程の２次重合の重合率の低下又は上記２次重合において凝集を引き起こす可能性が高くなる。
【００３７】
第３工程は、第２工程の重合反応系を１０〜４０℃に冷却する工程である。
１０〜４０℃に冷却されることにより、１次重合反応は、重合が完全に終了する以前に中断される。「重合が完全に終了する以前」とは、疎水性架橋重合体を含む単量体類の重合率が、好ましくは９８％以下の状態であり、重合開始剤が理論上、添加量の５％以上残存する状態をいう。この工程において、１０℃未満までへの冷却は、作業が繁雑となり、作業時間が延長するとともに、また内容物によっては、溶解度の大きな低下により析出する場合があるので好ましくなく、４０℃を超えると、重合が徐々に進行するため、重合率の制御が困難となり、再現性が低下する。重合を行った温度から１０〜４０℃への冷却までに要する時間は、１２０分以内が好ましく、６０分以内がより好ましい。
【００３８】
第４工程は、上記反応系にカチオン交換基含有単量体を添加する工程である。上記カチオン交換基とは、あるｐＨにおいてカチオン交換能を示す官能基を言い、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基などが挙げられる。カチオン交換基含有単量体とは、１分子中にカチオン交換基を１個以上および重合性官能基を１個以上有する単量体のことを言い、例えば、カルボキシル基を有する単量体としては、（メタ）アクリル酸、クロトン酸、イタコン酸、シトラコン酸、メサコン酸、マレイン酸、フマル酸及びこれらの誘導体など；リン酸基を有する単量体としては、例えば、（（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（２−（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル）アシッドホスフェート及びこれらの誘導体など；スルホン酸基を有する単量体としては、例えば、スチレンスルホン酸、アリルスルホン酸、２−（メタ）アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、（３−スルホプロピル）−イタコン酸、３−スルホプロピル（メタ）アクリル酸及びこれらの誘導体など；上記単量体の、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩などの塩類、などが挙げられる。
【００３９】
上記カチオン交換基含有単量体の他に、化学反応によりカチオン交換基に変換し得る官能基を有する単量体を用い、かつ該化学反応を重合後に行うことによっても、同様のカチオン交換基含有重合体を調製し得る。該化学反応とは、加水分解反応や転移反応などが挙げられる。上記化学反応によって変換し得る官能基としては、例えば、加水分解反応によってカチオン交換基に変換し得る基が挙げられ、例えば、エステル基などが挙げられる。この方法の一例を挙げると、例えば、メチルメタクリレートを単量体として用い、重合後、アルカリ性下で加温してエステル結合を分解してカルボキシル基に変化させることにより、カチオン交換基含有充填剤を調製し得る。
【００４０】
上記第４工程に用いる単量体は複数種を混合して用いても良い。
【００４１】
上記第４工程に用いる単量体の使用量は、上記重合性混合物１００重量部に対して１０〜２００重量部が好ましい。
【００４２】
第４工程に用いる単量体の添加については、反応系の温度が１０〜４０℃において添加する。添加は、一括して添加してもよいし、滴下してもよい。滴下する場合は、６０分以内に添加を終了するのが好ましい。
【００４３】
第５工程は、上記の添加終了後、該反応系を１０〜４０℃で０．５〜２４時間撹拌する工程である。
この工程は、カチオン交換基含有単量体を、水性分散媒に均一に分散させ、かつ１次重合粒子又は残存する単量体類と水性分散媒の間における分配平衡を安定させるために行う。撹拌時間は、用いるカチオン交換基含有単量体又は水性分散媒の組成などにより異なるが、０．５〜２４時間に限定される。０．５時間未満では、カチオン交換基含有単量体が反応系に均一になりにくく、その結果、重合の再現性が低下し、２４時間を超えて撹拌を行っても効果はそれ以上に向上しないばかりでなく、単量体種によっては、１０〜４０℃においても重合が進行し、この進行具合のバラツキにより製造再現性の低下の恐れがある。
【００４４】
上記撹拌時の温度が１０〜４０℃に限定される理由は、１０℃未満までへの冷却は、作業が繁雑となり、作業時間が延長するとともに、また内容物によっては、溶解度の大きな低下により析出する場合があるので好ましくなく、４０℃を超えると、重合が徐々に進行するため、重合率の制御が困難となり、再現性が低下するためである。
【００４５】
第６工程は、該反応系を５０〜１００℃に昇温して重合反応を行い、重合開始後２０〜２４０分間で、かつカチオン交換基含有単量体の添加量の０．１〜２０％の重合率の段階において重合反応を終了する工程である。
この２次重合の重合温度は、５０〜１００℃に限定されるが、この温度は１次重合の温度と異なってもよい。上記温度が５０℃未満になると重合速度が遅すぎて重合に時間がかかりすぎ、１００℃を超えると重合速度が早すぎて凝集が起こりやすくなる。上記２次重合の重合時間は２０〜２４０分に限定される。上記時間が２０分未満では、カチオン交換基含有単量体の重合率が低すぎて、液体クロマトグラフィー用充填剤として用いた場合、イオン交換容量が小さすぎて、十分なイオン交換反応がなされず、その結果分離が不十分となる。また、上記時間が２４０分を超えると、カチオン交換基含有単量体の単独重合体による凝集が発生しやすくなり好ましくない。
【００４６】
上記工程においては、カチオン交換基含有単量体の添加量の０．１〜２０％の重合率の段階で重合を終了する。上記重合率が０．１％未満では、重合率が低すぎて、液体クロマトグラフィー用充填剤として用いた場合、イオン交換容量が小さすぎて、測定対象物質との十分なイオン交換反応がなされず、その結果分離が不十分となる。上記重合率が２０％を超えると、凝集が発生しやすく、再現性が大きく低下するとともに、液体クロマトグラフィー用充填剤として用いた場合、カラム圧力が上昇し、使用上極めて都合が悪くなる。
なお、ここで言う重合率とは、添加量に対する、最終的に得られた重合生成物中のカチオン交換基含有単量体量を示し、下記の第７工程の洗浄によって除去され得る、カチオン交換基含有単量体の単独重合体などは含まない。
【００４７】
第７工程は、得られた重合体を、水及び／又は有機溶媒で洗浄する工程である。この工程は、生成した重合体を水及び／又は有機溶媒で洗浄し、余剰の添加物、不要の生成物などを除去するために行う。上記洗浄は水と有機溶媒双方で洗浄する必要は必ずしもない。水と有機溶媒双方を使用する場合、洗浄の順序は特に問わない。
【００４８】
上記洗浄により除去される物質は、分散剤、残存単量体、非架橋の重合体などが挙げられる。特にカチオン交換基含有単量体は第４工程において大過剰に添加するので、該単量体及びその重合体を除去するために、洗浄を行う必要がある。
【００４９】
有機溶媒による洗浄の場合に使用する有機溶媒は、得られた重合体粒子が溶解しないこと、及び除去すべき物質の溶解度を考慮して選択されるが、例えば、アセトン、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどが挙げられる。
【００５０】
上記洗浄方法は、重合生成物に、水又は有機溶媒、場合によってはこれらの混合物を添加して撹拌する；又は重合生成物を有機溶媒に浸漬したり、重合生成物に有機溶媒を循環させて抽出するなど、或いはその他公知の方法により行うことができる。また、洗浄工程において、重合体粒子が破損しない程度に加温してもよい。洗浄に用いられた水や有機溶媒は、例えば、デカンテーション又は遠心分離などの方法により除去する。
【００５１】
（液体クロマトグラフィー用充填剤への適用）
上記工程によって得られた重合体粒子は、以下の粒径及び粒度分布を満足することにより液体クロマトグラフィー用充填剤とされる。
上記平均粒径は０．１〜５０μｍが好ましく、０．５〜２０μｍがより好ましい。粒度分布は、ＣＶが２０％以下が好ましく、１５％以下がより好ましい。
前記工程によって得られた重合体粒子は、必要に応じて分級することにより、上記条件を満足させ得る。分級は、乾式又は湿式など公知の方法が用いられ得る。
【００５２】
液体クロマトグラフィー用充填剤として用いる場合、上記充填剤をステンレス製又は樹脂製などのカラムに充填することにより、液体クロマトグラフィー用カラムを構成することができる。充填に際しては、適宜の方法を用いることができるが、充填剤を溶離液に用いる溶媒などの分散媒に所定量分散し、カラム内にパッカーなどを経由して圧入する湿式法（スラリー法）が特に好ましい。
【００５３】
本発明で得られる液体クロマトグラフィー用充填剤を用いて分離測定する際の測定対象物質としては、従来からカチオン交換液体クロマトグラフィー又はイオンクロマトグラフィーで分離されていたものの全てである。特に、カテコールアミン誘導体類、ヌクレオチド類、ペプチド類、タンパク質類などの生体関連物質が好適である。
【００５４】
本発明で得られる充填剤を適用できる液体クロマトグラフは公知のものでよく、例えば、送液ポンプ、試料導入装置、カラム、検出器などから構成される。また、これらに他の付属品（恒温槽や溶離液の脱気装置など）が適宜付属されてもよい。
【００５５】
本発明で得られる充填剤を用いた液体クロマトグラフィー分析には、公知の溶離液が用いられる。例えば、以下の物質などを含む各種緩衝液などが挙げられる。リン酸、硝酸、塩酸、過塩素酸などの無機酸及びその塩；酢酸、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸、クエン酸などの有機酸及びその塩又はハロゲン化物；水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの塩基性物質；その他の無機又は有機塩類。また、Ｇｏｏｄの緩衝液も使用可能である。
また、例えば、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、メタノール、エタノールなどの有機溶媒も使用可能であり、また、水若しくは上記緩衝液と有機溶媒の混合物も使用可能である。
【００５６】
【作 用】
本発明では、まず、架橋度が高く、粒子骨格内部にイオン交換基などの親水性基が少ない疎水性架橋重合体粒子を調製し、しかる後、該粒子の表面付近でカチオン交換基含有単量体を重合させる。従って、（１）得られた充填剤は、膨潤・収縮が少ないので、溶離液の変化に対する平衡化が早いため、特に複数の溶離液を用いた各種のグラディエント溶出法においても測定時間を短くできる；（２）得られた充填剤は、耐圧性が大きいので、高流速分析が行え、従って測定時間の短縮に有利である。また同様に高圧下でのカラム充填が可能となるため、カラム寿命の延長が図ることができる。
また、本発明の方法では、カチオン交換基含有単量体を添加する際には、温度を室温付近（１０〜４０℃）まで一度冷却してから添加し、また室温付近で一定時間撹拌を行うことにより、製造安定性を飛躍的に高めている。
また、カチオン交換基含有単量体は、大過剰量添加し、かつ低重合率の段階で停止させているので、極めて凝集しやすい単量体であっても、再現性良く重合を行うことができる。
【００５７】
【実施例】
以下に本発明方法の実施例を示す。
（実施例１）
トリエチレングリコールジメタクリレート（疎水性架橋性単量体：新中村化学社製）４００ｇにベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤：和光純薬社製）１．５ｇを混合して溶解した。これを２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製、ゴーセノールＧＨ−２０）水溶液に分散させ、窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、７５℃で１．２時間重合した。１．２時間経過後、反応系を約３０分間で３５℃に冷却し、メタクリル酸（カルボキシル基含有単量体：和光純薬社製）２００ｇを一括添加した。その後２５℃で６０分間撹拌した後、８０℃に昇温して１時間重合した。
重合後、生成物を水及びアセトンで洗浄し、分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００５８】
（実施例２）
ジビニルベンゼン（疎水性架橋性単量体：キシダ化学社製）２５０ｇ、スチレン（非架橋性単量体：和光純薬社製）５０ｇを混合し、これにトルエン１００ｇ及びベンゾイルパーオキサイド１．５ｇを混合して溶解した。これを２．５リットルの５重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させ、窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で２．５時間重合した。２．５時間経過後、反応系を約４０分間で３０℃に冷却し、アクリル酸（カルボキシル基含有単量体：和光純薬社製）１５０ｇを一括添加した。その後２５℃で６０分間撹拌した後、再び８０℃に昇温して１時間重合した。
重合後、生成物を水及びアセトンで洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００５９】
（実施例３）
テトラエチレングリコールジメタクリレート（疎水性架橋性単量体：新中村化学社製）３５０ｇ、テトラメチロールメタンテトラアクリレート（疎水性架橋性単量体：新中村化学社製）５０ｇにベンゾイルパーオキサイド１．５ｇを混合して溶解した。これを２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させ、窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で１．３時間重合した。１．３時間経過後、反応系を約３０分間で３５℃に冷却し、メタクリル酸（カルボキシル基含有単量体：和光純薬社製）８０ｇ及びイタコン酸（カルボキシル基含有単量体：東京化成社製）８０ｇを一括添加した。その後２５℃で６０分間撹拌した後、８０℃に昇温して１時間重合した。重合後、生成物を水及びアセトンで洗浄し、分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００６０】
（実施例４）
トリエチレングリコールジメタクリレート３５０ｇ及びテトラメチロールメタントリアクリレート（疎水性架橋性単量体：新中村化学社製）５０ｇの混合物にベンゾイルパーオキサイド１．０ｇを混合して溶解した。これを２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させ、窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で１．５時間重合した。１．５時間経過後、反応系を約２０分間で室温まで冷却し、反応系内の温度が３０℃となったところで、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（スルホン酸基含有単量体：東京化成社製）の５０％水溶液４００ｍｌを１０分間で滴下し添加した。その後２５℃で６０分間撹拌した後、再び８０℃に昇温して１時間重合した。
重合後、生成物を水及びアセトンで洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００６１】
（実施例５）
メチルメタクリレート（和光純薬社製）２００ｇを、イオン交換水１２００ｇに添加した。撹拌しながら窒素雰囲気下で７０℃に昇温した後、０．５重量％の過硫酸カリウム（Ｅ．Ｍｅｒｋ社製）水溶液１０ｍｌ及び２重量％のスチレンスルホン酸ナトリウム（和光純薬社製）水溶液１０ｍｌを反応系に添加した。７０℃で２４時間重合を行った後、反応生成物を濾過して、平均粒径０．７μｍ、粒径のＣＶ３．５％の単分散粒子を得た。
【００６２】
上記単分散粒子１ｇを分散させた０．５重量％ラウリル硫酸ナトリウム（和光純薬社製）水溶液４００ｍｌに、３重量％ポリビニルアルコール水溶液２００ｍｌを添加し、１時間室温で撹拌した（単分散粒子分散液）。一方でトリエチレングリコールジメタクリレート５０ｇにベンゾイルパーオキサイド１．０ｇを溶解した。これに０．５重量％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液９００ｍｌを添加し、ホモジナイザー（IKA Labotechnik 社製）を用いて、２４０００ｒｐｍで１５分間撹拌した。得られた乳化液を、上記単分散粒子分散液に添加して２４時間室温で撹拌し、単量体及び重合開始剤を、単分散粒子に吸収させた。その後、窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で１．５時間重合した。１．５時間経過後、反応系を約３０分間で３５℃まで冷却し、メタクリル酸３０ｇを一括添加した。その後２５℃で６０分間撹拌した後、再び８０℃に昇温して１時間重合した。
重合後、生成物を水及びアセトンで洗浄し分級して平均粒径３．５μｍの充填剤を得た。
【００６３】
（実施例６）
実施例５における、メタクリル酸３０ｇの代わりに、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸２５ｇを用いた以外は、実施例５と同様に操作して、平均粒径３．５μｍの充填剤を得た。
【００６４】
（比較例１）
ジエチレングリコールジメタクリレート（疎水性架橋性単量体）４００ｇ及びメタクリル酸（カルボキシル基を有する単量体）２００ｇの混合物に、ベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤）１．５ｇを混合して溶解した。これを２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させ、窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で８時間重合した。
重合後、生成物を洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００６５】
（比較例２）
ジビニルベンゼン（疎水性架橋性単量体：キシダ化学社製）２５０ｇ、スチレン（非架橋性単量体：和光純薬社製）５０ｇ、トルエン１００ｇ、アクリル酸１５０ｇ及びベンゾイルパーオキサイド１．５ｇを混合して溶解した。これを２．５リットルの５重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させ、窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で８時間重合した。
重合後、生成物を水及びアセトンで洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００６６】
（比較例３）後処理によるカルボキシル基の導入例：
グリシジルメタクリレート（日本油脂社製）３５０ｇ、エチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）５０ｇ及びアゾビスイソブチロニトリル１０ｇを混合し、４重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させ、窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、６０℃で１０時間重合した。
得られた重合体を洗浄した後、分級して平均粒径５μｍの重合体を得た。
該重合体１００ｇをキシレン３００ｇに添加した。キシレンを含浸させた重合体を、１５ｇの濃硫酸を含む４重量％ポリビニルアルコール水溶液１リットルに添加し、撹拌しながら８０℃で１時間加温した。その後水及びアセトンで洗浄して乾燥した。得られた重合体１００ｇをジオキサン５００ｍｌ中に分散させ、三フッ化ホウ素エーテラート（５５％）５ｍｌを加えて５０℃で８時間加温した。アセトン洗浄した後、乾燥した。
【００６７】
さらに該重合体２０ｇを１０００ｍｌの水に分散させ、モノクロル酢酸ナトリウム３５ｇ、ヨウ化カリウム２０ｇ、５０重量％水酸化ナトリウム６０ｇを加え、撹拌しながら６０℃で３時間反応させた。得られた重合体を洗浄して乾燥させ、平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００６８】
（比較例４）後処理によるスルホン酸基の導入例：
２−ヒドロキシエチルメタクリレート４００ｇ、ジエチレングリジールジメタクリレート５０ｇ、メチルメタクリレート５０ｇ及びベンゾイルパーオキサイド１．５ｇを混合し、２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で８時間重合した。
得られた重合体を洗浄した後、分級して平均粒径５μｍの重合体を得た。
該重合体１００ｇを２０重量％の水酸化ナトリウム水溶液１００ｍｌ中に分散させた。これにエピクロルヒドリン４０ｇを添加して５時間反応させた。得られたエポキシ基含有重合体１００ｇを２０重量％の硫酸ナトリウム水溶液１００ｍｌに分散させた後、８０℃で１５時間反応させた。得られた重合体を洗浄して乾燥させ、平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００６９】
（比較例５）Y. Ohtsuka et al の文献 [J. Applied Polym. Sci., 27 (1982) 3279-3288 ] による方法：
エチレングリコールジメタクリレート（疎水性架橋性単量体：新中村化学社製）１００ｇ及びベンゾイルパーオキサイド１．０ｇを混合して溶解した。これを２．５リットルの１重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させ、窒素雰囲気下で撹拌しながら８０℃に昇温した。１時間経過後、メタクリル酸５０ｇを反応系に添加し、さらに８０℃で２４時間重合した。
重合後、生成物を洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００７０】
（比較例６）Y. Ohtsuka et al の文献 [J. Applied Polym. Sci., 27 (1982) 3279-3288 ] による方法：
比較例５における、メタクリル酸５０ｇの代わりに、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム（スルホン酸基含有単量体：和光純薬社製）５０ｇを用いた以外は、比較例５と同様に操作し、充填剤を得た。
【００７１】
（比較例７）２段重合 官能基（ＣＯＯＨ）（特公平８−７１９７号公報の方法分割法）：
トリエチレングリコールジメタクリレート４００ｇにベンゾイルパーオキサイド１．５ｇを溶解し、５重量％ポリビニルアルコール水溶液２．５リットルに分散させた。撹拌しながら昇温し、８０℃で８時間重合を行った。得られた生成物を水およびアセトンで洗浄して、架橋重合体粒子を得た。
この粒子３００ｇを、ベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤）１．０ｇを含むアセトン溶液１リットルに添加し、粒子に重合開始剤を含浸させた。次に２０℃において減圧下でアセトンを留去した。１重量％ポリビニルアルコール水溶液２．５リットルに、得られた重合開始剤含有粒子を分散させ、撹拌しながらメタクリル酸２００ｇを添加し、窒素置換後８０℃で１時間重合を行った。
重合後、洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００７２】
（比較例８）２段重合 官能基（ＣＯＯＨ）（特公平８−７１９７号公報の方法連続法）：
トリエチレングリコールジメタクリレート４００ｇにベンゾイルパーオキサイド１．５ｇを溶解し、５重量％ポリビニルアルコール水溶液２．５リットルに分散させた。撹拌しながら昇温し、８０℃で１時間重合を行った。１時間後、反応系にメタクリル酸２００ｇを添加し、さらに８０℃で１時間重合を行った。
重合後、洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００７３】
（性能評価）
実施例１〜６及び比較例１〜８の充填剤について、以下のようにして性能評価をした。
（１）液体クロマトグラフィー用カラムの製造：
充填剤０．７ｇを採取し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０ｍｌに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製空カラム（４．６φ×３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力２００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填して、液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００７４】
（２）耐膨潤性試験：
カルボキシル基含有充填剤を充填したカラムに、以下のようにして、ｐＨの異なる溶離液を通液して、その際のカラム圧力の変動；およびカラム圧力が安定するまでに要した時間（平衡化までの時間）から、膨潤度合いを測定・比較した。
すなわち、実施例１〜３、５；比較例１〜３で得られた充填剤を各々充填したカラムに、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７：Ａ液）を３０分間通液した。カラム圧力が一定になった後、３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５：Ｂ液）を通液し、カラム圧力の変動を観察した。得られた結果を表１に示した。
【００７５】
【表１】
【００７６】
実施例１〜３及び５の充填剤は、比較例１〜３の充填剤に比べ、より圧力値の上昇が少なく、圧力値の安定までに要した時間（平衡化までの時間）が極めて短いことがわかった。
【００７７】
次に、実施例４及び６；比較例４で得られたスルホン酸基を有する充填剤を各々充填したカラムに、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ３．０：Ｃ液）を３０分間通液した。カラム圧力が一定になった後、３００リン酸緩衝液（ｐＨ８．５：Ｄ液）を通液し、カラム圧力の変動及びカラム圧力が安定するまでに要した時間（平衡化までの時間）を観察した。結果を表２に示した。
【００７８】
【表２】
【００７９】
実施例４及び６の充填剤は、比較例４の充填剤に比べ、より圧力値の上昇が少なく、圧力値の安定までに要した時間（平衡化までの時間）が極めて短いことがわかった。
【００８０】
以上より、本発明の方法により得られた実施例１〜６の充填剤は、従来の１段階の重合法による充填剤（比較例１及び２）又は後処理によるカチオン交換基導入法による充填剤（比較例３及び４）に比べて、溶離液の変化に対する平衡化が早く、膨潤しにくいことがわかった。
【００８１】
（３）ヘモグロビン類の測定：
実施例及び比較例で得られた充填剤を各々充填したカラムを用いて、糖尿病診断の指標となる、ヒト血液中の糖化ヘモグロビン（Ｈｂ）類を含むＨｂ類の測定を行った。
（測定条件）
システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：リン酸塩及び過塩素酸塩を含む緩衝液２種によるステップグラディエント法で溶出した。
溶離液１：最初からヘモグロビンＡ０（ＨｂＡ０）の前までを溶出。安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（安定型ＨｂＡ１ｃ）が最も適当な保持時間に溶出されるよう、濃度を１０〜２００ｍＭ、ｐＨを５．０〜５．８の間で調節した。
溶離液２：ＨｂＡ０を溶出。濃度は３００ｍＭ、ｐＨ７．２とした。
流速：１．５ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
【００８２】
（測定試料）
健常人血をフッ化ナトリウム採血し、以下の試料を調製した。
試料ａ）糖負荷血：健常人血に、５００ｍｇ／ｄｌとなるようグルコース水溶液を添加し、３７℃で５時間反応させ、次いで、溶血希釈液（０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）（東京化成社製）のリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０））で溶血し、１５０倍に希釈して試料ａとした。
試料ｂ）カルバミル化Ｈｂ（ＣＨｂ）含有試料：健常人血１０ｍｌに、０．３重量％のシアン酸ナトリウムの生理食塩水溶液１ｍｌを添加し、３７℃で３時間反応させ、次いで、溶血希釈液（０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）（東京化成社製）のリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０））で溶血し、１５０倍に希釈して試料ｂとした。
試料ｃ）アセチル化Ｈｂ（ＡＨｂ）含有試料：健常人血１０ｍｌに、０．３重量％のアセトアルデヒドの生理食塩水溶液１ｍｌを添加し、室温で３時間反応させ、次いで、溶血希釈液（０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）（東京化成社製）のリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０））で溶血し、１５０倍に希釈して試料ｃとした。
【００８３】
（測定結果）
（イ）実施例１〜６の充填剤：
（試料ａ）
実施例１の充填剤を用いて、試料ａを測定して得られたクロマトグラムを図１（ａ）に示す。
図１（ａ）において、ピーク１はヘモグロビンＡ１ａ及びｂ（ＨｂＡ１ａ及びｂ）；ピーク２はヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）；ピーク３は不安定型ＨｂＡ１ｃ；ピーク４は安定型ＨｂＡ１ｃ；ピーク５はＨｂＡ０を示す。
ＨｂＦ（ピーク２）及び糖尿病診断の指標となる安定型ＨｂＡ１ｃピーク（ピーク４）の良好な定量性を維持するためには、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０の順に溶出される必要がある。特にＨｂＦは通常、ＨｂＡ１ｃ類やＨｂＡ０に比較してピークが小さいため、例えば安定型ＨｂＡ１ｃとＨｂＡ０の間などに溶出されると、ＨｂＦの定量性は極めて低下する。
図１（ａ）では、上記順序で各ピークが溶出され、またＨｂＦや安定型ＨｂＡ１ｃが他成分のピークと良好に分離されている。
【００８４】
（試料ｂ）
実施例１の充填剤を用いて、試料ｂを測定して得られたクロマトグラムを図１（ｂ）に示す。
図１（ｂ）において、ピーク６はＣＨｂを示す。ＣＨｂが安定型ＨｂＡ１ｃから良好に分離されている。
（試料ｃ）
実施例１の充填剤を用いて、試料ｃを測定して得られたクロマトグラムを図１（ｃ）に示す。
図１（ｃ）において、ピーク７はＡＨｂを示す。ＡＨｂが安定型ＨｂＡ１ｃから良好に分離されている。
【００８５】
また、実施例２〜６の充填剤を用いた場合でも、同様の結果が得られた。
【００８６】
（ロ）比較例１〜３の充填剤：
（試料ａ）
比較例１の充填剤を用いて、試料ａを測定して得られたクロマトグラムを図２（ａ）に示す。
ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃの順で溶出されているが、測定時間が長いにもかかわらず、不安定型ＨｂＡ１ｃと安定型ＨｂＡ１ｃとの分離が悪い。
（試料ｂ）
比較例１の充填剤を用いて、試料ｂを測定して得られたクロマトグラムを図２（ｂ）に示す。
ＣＨｂと安定型ＨｂＡ１ｃの分離が悪い。
（試料ｃ）
比較例１の充填剤を用いて、試料ｃを測定して得られたクロマトグラムを図２（ｃ）に示す。
ＡＨｂと安定型ＨｂＡ１ｃの分離が悪い。
【００８７】
また、比較例２及び３の充填剤を用いた場合でも、同様の結果が得られた。
【００８８】
（ハ）比較例４の充填剤：
（試料ａ）
比較例４の充填剤を用いて、試料ａを測定して得られたクロマトグラムを図３（ａ）に示す。
不安定型ＨｂＡ１ｃと安定型ＨｂＡ１ｃは分離されているが、ＨｂＦが測定できなかった。また、測定時間が長い。
（試料ｂ）
比較例４の充填剤を用いて、試料ｂを測定して得られたクロマトグラムを図３（ｂ）に示す。
ＣＨｂと安定型ＨｂＡ１ｃの分離が悪い。
（試料ｃ）
比較例４の充填剤を用いて、試料ｃを測定して得られたクロマトグラムを図３（ｃ）に示す。
ＡＨｂと安定型ＨｂＡ１ｃの分離が悪い。
【００８９】
（ニ）比較例５及び６の充填剤：
（試料ａ）
比較例５の充填剤を用いて、試料ａを測定して得られたクロマトグラムを図４（ａ）に示す。
（試料ｂ）
比較例５の充填剤を用いて、試料ｂを測定して得られたクロマトグラムを図４（ｂ）に示す。
（試料ｃ）
比較例５の充填剤を用いて、試料ｃを測定して得られたクロマトグラムを図４（ｃ）に示す。
いずれの場合も、測定時間が長いにもかかわらず、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃの分離が悪い。
【００９０】
また、比較例６の充填剤を用いた場合でも、同様の結果が得られた。
【００９１】
（ホ）比較例７及び８の充填剤：
（試料ａ）
比較例７の充填剤を用いて、試料ａを測定して得られたクロマトグラムを図５（ａ）に示す。
（試料ｂ）
比較例７の充填剤を用いて、試料ｂを測定して得られたクロマトグラムを図５（ｂ）に示す。
不安定型ＨｂＡ１ｃやＣＨｂは、実施例と同様、安定型ＨｂＡ１ｃと良好に分離できた。
（試料ｃ）
比較例７の充填剤を用いて、試料ｃを測定して得られたクロマトグラムを図５（ｃ）に示す。
ＡＨｂは、安定型ＨｂＡ１ｃと分離できなかった。
【００９２】
また、比較例８の充填剤を用いた場合でも、同様の結果が得られた。
【００９３】
以上から、本発明の方法の実施例による充填剤を用いると、従来技術ではできなかった、不安定型ＨｂＡ１ｃ、ＣＨｂ、ＡＨｂの影響を受けることなく安定型ＨｂＡ１ｃを定量し、ＨｂＦも定量できることがわかる。
【００９４】
（ヘ）カラム耐久性：
実施例４及び比較例４の充填剤について、カラム耐久性を比較した。
上記試料ａを繰り返し測定し、得られたクロマトグラムから以下の式により算出される安定型ＨｂＡ１ｃ値の変化を調べた。
安定型ＨｂＡ１ｃ（％）＝（安定型ＨｂＡ１ｃのピーク面積）÷（全ピーク面積）×１００
【００９５】
得られた結果を図６に示す。測定初期の値を１００とした場合の相対値で示す。図６より、実施例４の充填剤では、比較例４の充填剤に比べて、安定型ＨｂＡ１ｃ値が長期間安定であり、カラム耐久性が優れていることがわかる。
【００９６】
（ト）重合再現性：
実施例１及び４、比較例３〜８の充填剤を、各々３０回同一条件下で調製し、各ロット間差を調べた。
（測定方法）
上記測定方法において、安定型ＨｂＡ１ｃピークの保持時間が、約10分となるように溶離液１を調製した。
各ロットの充填剤を用い、上記試料ａを測定し、安定型ＨｂＡ１ｃピークの保持時間を調べた。
３０ロットにおいて、重合状態が良好であったものについて測定した時の、安定型ＨｂＡ１ｃピークの保持時間の平均値、標準偏差及び変動係数を表３に示す。なお、調製途中で凝集が発生し、充填剤としての評価が不可能であったロット数についても表３に示した。
【００９７】
【表３】
【００９８】
表３より明らかなように、本発明方法による実施例では、重合途中での凝集を起こすことなく、かつ充填剤としての性能の再現性が極めて良い。一方、従来技術である後処理による製造方法（比較例３及び４）では、充填剤の性能としてばらつきが大きい。さらに重合途中でカチオン交換基含有単量体を添加する方法や、架橋粒子に重合開始剤を含浸させてカチオン交換基含有単量体を重合する方法（比較例５〜８）では、性能のばらつきに加えて、重合途中での凝集が発生しやすいことが分かる。
【００９９】
（４）タンパク質混合物の分析例：
カルボキシル基含有充填剤（実施例１〜３、比較例１〜３、５、７、８）を用いて、タンパク質標準物質の混合物を分析した。
（測定条件）
システム：上記（３）ヘモグロビン類の測定のシステムと同様
溶離液：リン酸ナトリウムを含む緩衝液２種によるリニアグラディエント法で溶出した。
溶離液３：３０ｍＭ（ｐＨ７．１）
溶離液４：溶離液３＋３００ｍＭ Ｎａ2 ＳＯ4
溶離液３の１００％から溶離液４の１００％へのリニアグラディエント
流速：１．５ｍｌ／分
検出波長：２８０ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
【０１００】
（測定試料）
ミオグロビン、α−キモトリプシノーゲン、リボヌクレアーゼＡ、リゾチーム（Ｓｉｇｍａ社製）混合物
【０１０１】
（測定結果）
得られたクロマトグラムを図７に示す。図７（ａ）は、実施例１〜３の充填剤を用いた場合のクロマトグラム、図７（ｂ）は、比較例１〜３、５、７、８の充填剤を用いた場合のクロマトグラムを示す。図７中、ピーク８はミオグロビン、ピーク９はα−キモトリプシノーゲン、ピーク１０はリボヌクレアーゼＡ、ピーク１１はリゾチームを示す。図より、実施例１〜３の充填剤を用いた場合は、各ピークが短時間で良好に分離されているが、比較例１〜３、５、７、８の充填剤を用いた場合は、測定時間が長いにもかかわらず、各ピークがシャープさに欠けることがわかる。
【０１０２】
（５）ペプチド混合物の分析例：
スルホン酸基含有充填剤（実施例４、６、比較例４、６）を用いて、ペプチド標準物質の混合物を分析した。
（測定条件）
システム：上記（３）ヘモグロビン類の測定のシステムと同様
溶離液：酢酸を含む緩衝液２種によるリニアグラディエント法で溶出した。
溶離液５：３０ｍＭ（ｐＨ２．８）
溶離液６：溶離液５＋３００ｍＭ Ｎａ2 ＳＯ4
溶離液５の１００％から溶離液６の１００％へのリニアグラディエント
流速：１．５ｍｌ／分
検出波長：２１５ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
【０１０３】
（測定試料）
γ−エンドルフィン、カルシトニン、サブスタンスＰ、インシュリン、β−エンドルフィン（Ｓｉｇｍａ社製）混合物
【０１０４】
（測定結果）
得られたクロマトグラムを図８に示す。図８（ａ）は、実施例４及び６の充填剤を用いた場合のクロマトグラム、図８（ｂ）は、比較例４の充填剤を用いた場合のクロマトグラム、図８（ｃ）は、比較例６の充填剤を用いた場合のクロマトグラムを示す。図８中、ピーク１２はγ−エンドルフィン、ピーク１３はカルシトニン、ピーク１４はサブスタンスＰ、ピーク１５はインシュリン、ピーク１６はβ−エンドルフィンを示す。図より、実施例４及び６の充填剤を用いた場合は、各ピークが短時間で良好に分離されているが、比較例４の充填剤を用いた場合は、測定時間が長いにもかかわらず、各ピークがシャープさに欠けることがわかり、比較例６の充填剤を用いた場合は、各ピークが分離されなかった。
【０１０５】
（重合の再現性）
実施例４、６；比較例４、６の重合方法を、各々３０回同一条件下で調製し、各ロット間差を調べた。
（測定方法）
上記測定方法において、β−エンドルフィン（ピーク１６）ピークの保持時間が、約２０分となるよう溶離液５を調製した。
各ロットの充填剤を用い、上記試料を測定し、β−エンドルフィンピークの保持時間を調べた。
３０ロットにおいて、重合状態が良好であったものについて測定した時の、β−エンドルフィンピークの保持時間の平均値、標準偏差及び変動係数を表４に示す。なお、調製途中で凝集が発生し、充填剤としての評価が不可能であったロット数についても表４に示した。
【０１０６】
【表４】
【０１０７】
以上から、本発明方法で得られたスルホン酸基含有充填剤は、従来の製造方法による充填剤に比べて、より短時間で高精度にペプチド類を分離でき、また重合ロット間のばらつきも非常に少ないことがわかる。
【０１０８】
【発明の効果】
本発明方法により得られる液体クロマトグラフィー用充填剤は、骨格部分が疎水性架橋粒子で構成され、イオン交換能を有する官能基は表面付近に偏在しているため、溶離液の組成変化などによる外部環境に対して平衡が早く、耐膨潤性に優れている。従って従来より行われていた、架橋性単量体とカチオン交換基含有単量体を混合して重合することにより得られる充填剤や、親水性単量体と架橋性単量体を共重合させた後、後処理によってカチオン交換基を導入する方法により得られる充填剤のように、粒子内部に多くの親水性官能基を有する充填剤よりも短い測定時間内で高分離能を有する。
【０１０９】
また本発明方法は、カチオン交換基含有単量体を添加する際に、重合系を室温付近の温度まで冷却して重合反応を停止または重合速度を極度に遅くすること；及び該単量体添加後に室温付近の温度で一定時間撹拌することにより、添加したカチオン交換基含有単量体を反応系内で安定状態としてから、該単量体の重合を行う。これにより、従来行われていた、重合途中でカチオン交換基含有単量体を添加したり、架橋性重合体に重合開始剤を含浸させてからカチオン交換基含有単量体を重合させる方法に比べて重合安定性が極めて高くなる。
【０１１０】
さらに従来法では、カチオン交換基含有単量体を添加してから２４時間程度重合を行い、重合率を高めていたが、これでは重合途中での凝集が発生しやすく、使用できる単量体も制限される。またイオン交換反応に十分なカチオン交換基を導入する条件と凝集を防ぐための条件が矛盾し、条件設定が難しい。本発明では、カチオン交換基含有単量体を大過剰添加して、低重合率の段階で停止する方法により、凝集しやすい単量体でも、重合再現性の低下を招くことなく、イオン交換反応に十分なイオン交換容量を充填剤に付与できる。
【０１１１】
また一連の重合操作で完了するため、後処理によるカチオン交換基の導入法に比べて操作が簡便で、かつ簡便であるために再現性も良い。またカチオン交換基は全て単量体由来であるから、液クロ充填剤に適用した場合の性能の再現性もよく、製造上極めて有利である。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１により得られた充填剤を用いて、Ｈｂ類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図２】比較例１により得られた充填剤を用いて、Ｈｂ類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図３】比較例４により得られた充填剤を用いて、Ｈｂ類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図４】比較例５により得られた充填剤を用いて、Ｈｂ類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図５】比較例７により得られた充填剤を用いて、Ｈｂ類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図６】カラム耐久性試験の結果を示す図。
【図７】タンパク質混合物の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図８】ペプチド混合物の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【符号の説明】
１ ＨｂＡ１ａ及びｂ
２ ＨｂＦ
３ 不安定型ＨｂＡ１ｃ
４ 安定型ＨｂＡ１ｃ
５ ＨｂＡ０
６ カルバミル化Ｈｂ
７ アセチル化Ｈｂ
８ ミオグロビン
９ α−キモトリプシノーゲン
１０ リボヌクレアーゼＡ
１１ リゾチーム
１２ γ−エンドルフィン
１３ カルシトニン
１４ サブスタンスＰ
１５ インシュリン
１６ β−エンドルフィン
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法、更に詳しくはカチオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
イオン交換基としてカルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基などのカチオン交換基を有する充填剤を用いた液体クロマトグラフィー分析法は、糖化ヘモグロビン類の分析をはじめとして、各種生体関連物質の分析等に極めて有用な方法である。
【０００３】
上記カチオン交換基を有する充填剤の製造方法としては、例えば、以下の４つの方法が開示されている。
（１）架橋性粒子に、カチオン交換基を有する化合物を反応させる方法。
すなわち、反応性官能基を有する無機系又は有機系粒子に、該反応性官能基と反応する基及びカチオン交換基を有する化合物を反応させることにより、上記無機系又は有機系粒子に、カチオン交換基を導入する方法。具体的には、例えば、特開平１−２６２４６８号公報には、粒子中のエポキシ基にカルボキシル基含有化合物又はスルホン酸基含有化合物を反応させる方法が開示されている。
【０００４】
（２）カチオン交換基を有する単量体を、架橋性単量体と混合して共重合する方法。
例えば、特公昭６３−５９４６３号公報には、カルボキシル基含有単量体５〜９０重量％、架橋性単量体１０〜９５重量％、非架橋性単量体０〜８５重量％を混合して重合する方法が開示されている。
【０００５】
（３）疎水性架橋性単量体の重合途中にカチオン交換基を有する単量体を添加し、更に重合を継続する方法。
例えば、Y.Ohtsuka et al の文献[J. Applied Polym. Sci.,27(1982)3279-3288]には、イオン交換樹脂の製造法ではないが、疎水性架橋性単量体としてエチレングリコールジメタクリレートを用い、該単量体を１０〜６０分重合した後、アクリル酸やメタクリル酸などのカチオン交換基含有単量体を反応系に添加して、更に重合を２４時間継続して行う方法が開示されている。
【０００６】
（４）疎水性架橋重合体粒子の表面付近で、カチオン交換基含有単量体を重合させる方法。
特公平８−７１９７号公報には、重合開始剤を含浸させた疎水性架橋重合体粒子を水性分散媒に分散した後、カチオン交換基含有単量体を添加して重合し、粒子表面付近で該単量体を重合させる方法が開示されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記（１）〜（４）の方法には、以下の問題点が残っている。
上記（１）の方法：
・後処理によりイオン性基を導入する方法においては、イオン交換基を有する化合物を定量的に導入することは困難であることが一般的に知られており、上記（２）や（４）の方法のような単量体由来のイオン交換基導入に比べ、製造の再現性の点で劣る（吉廻、細矢、木全、田中：Chromatography,16(1)7-12(1995)）。
・また後処理の方法が極めて煩雑で長時間を要する。
・カチオン交換基含有化合物と反応させるための官能基としては、水酸基、グリシジル基、アミノ基などがあるが、いずれも親水性基であり、これらの親水性基を有する単量体を多量に用いて重合を行って粒子を調製するため、耐圧性・耐膨潤性に劣る。
【０００８】
上記（２）の方法：
・上記（１）の方法に比べ、充填剤にカチオン交換基を定量的に含有させることが可能であり、操作も簡単であるが、カチオン交換基が粒子内部にも存在するため、耐圧性が劣るとともに、溶離液の変更等による外部環境の変化に対して、平衡化に時間がかかり、結果的に測定時間の延長を招く、等の欠点を有する。
【０００９】
上記（３）の方法：
・重合途中で親水性単量体を添加する方法では、同一条件で重合を行っても再現性が悪く、生産上極めて不都合である。すなわち、重合途中で、主に親水性単量体由来の重合物が凝集してしまい使用不可能となることが多い；液体クロマトグラフィー用充填剤として使用した場合、保持時間やカラム圧力などの性能にばらつきが大きい；微調整すること（例えば：粒径を最適化するなど）も可能であるが、非常に煩雑でありコストもかかる；重合時間が長い（２４時間）ため凝集が発生しやすい、などの欠点がある。
【００１０】
上記（４）の方法：
・一連の重合作業で行えないため、作業が繁雑である。
・疎水性架橋重合体に重合開始剤を、定量的に含浸させることが困難なため、液体クロマトグラフィー用充填剤としての性能の再現性が悪い。
・重合の途中で、カチオン交換基含有単量体を添加する連続法も記載されているが、添加された該単量体が均一に分散しない状態で、すぐに重合が開始されるため、ロット間差が大きい。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、煩雑で再現性の低下を招く後処理によるカチオン交換基の導入方法を用いず、粒子内部に親水性基が多く存在することによる膨潤・収縮や、平衡化時間の延長がなく、更に、長時間又は煩雑な操作をすることなく、しかも製造再現性に優れ、製造ロット間差の少ない、液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法は、以下の工程よりなることを特徴とする。
（ｉ）疎水性架橋性単量体と重合開始剤とを含む重合性混合物を水性分散媒に分散する第１工程、
（ii）第１工程で得られた分散系を５０〜１００℃に昇温して、２０〜２４０分間重合反応を行う第２工程、
（iii ）その後、１０〜４０℃に反応系を冷却する第３工程、
（iv）該反応系にカチオン交換基含有単量体を添加する第４工程、
（ｖ）添加終了後、該反応系を１０〜４０℃で０．５〜２４時間撹拌する第５工程、
（vi）該反応系を５０〜１００℃に昇温して重合反応を行い、重合開始後２０〜２４０分間で、かつカチオン交換基含有単量体の添加量の０．１〜２０％の重合率の段階において重合反応を終了する第６工程、
（vii ）得られた重合体を、水及び／又は有機溶媒で洗浄する第７工程。
【００１３】
以下、本発明の詳細を工程を追って説明する。
第１工程は、疎水性架橋性単量体と重合開始剤とを含む重合性混合物を水性分散媒に分散する工程である。
【００１４】
（疎水性架橋性単量体）
上記疎水性架橋性単量体とは、イオン交換基を有さないか又は有していても微量である単量体であって、１分子中にビニル基を２個以上有し、第４工程で用いるカチオン交換基含有単量体よりも疎水性であるものを言う。このような、疎水性架橋性単量体としては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルエチルベンゼン、ジビニルナフタレン等のスチレン誘導体；エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，３−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサングリコールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタントリ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステルの誘導体；１，３−ブタジエン、イソプレン、１，４−ヘキサンジエン等の脂肪族ジエン化合物；および上記単量体の誘導体などが挙げられる。これらは２種以上が混合されて用いられてもよい。
【００１５】
（重合開始剤）
上記重合開始剤としては、特に限定されず、水溶性又は油溶性の公知のラジカル重合開始剤が用いられる。上記重合開始剤の具体的な例としては、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウムなどの過硫酸塩；クメンハイドロパーオキサイド、ベンゾイルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド、オクタノイルパーオキサイド、ｏ−クロロベンゾイルパーオキサイド、アセチルパーオキサイド、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシアセテート、ｔ−ブチルパーオキシイソブチレート、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイドなどの有機過酸化物；２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、４，４’−アゾビス（４−シアノペンタン酸）、２，２’−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、アゾビスシクロヘキサンカルボニトリルなどのアゾ化合物；および上記重合開始剤の誘導体類などが挙げられる。
【００１６】
上記重合開始剤の使用量は、疎水性架橋性単量体１００重量部に対し、０．０５〜５重量部が好ましい。重合開始剤の使用量が０．０５重量部未満になると、重合反応が不十分となったり、重合に長時間を要することがあり、５重量部を越えると、急激な反応の進行により、凝集物が発生することがある。この重合開始剤は、上記疎水性架橋性単量体に溶解して用いられる。
【００１７】
（重合性混合物）
上記重合性混合物は、疎水性架橋性単量体と重合開始剤とを必須成分として含むが、更に必要に応じて、その他の単量体（ａ）、その他の添加物（ｂ）などが混合されてもよい。
【００１８】
上記その他の単量体（ａ）は、例えば、非架橋性単量体が挙げられ、具体的には、スチレン、α−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、クロロメチルスチレンなどのスチレン誘導体類；塩化ビニルなどのハロゲン化ビニル類；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ステアリン酸ビニルなどのビニルエステル類；アクリル酸メチル、メタクリル酸メチル、アクリル酸エチル、メタクリル酸エチル、アクリル酸ブチル、メタクリル酸ブチル、アクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸ステアリル、メタクリル酸ステアリルなどの（メタ）アクリル酸エステル類が挙げられる。
【００１９】
上記非架橋性単量体の使用量は、疎水性架橋性単量体１００重量部に対して、好ましくは０〜５０重量部である。
【００２０】
但し、非架橋性単量体のうち、親水性単量体、例えば、水酸基を有する２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、グリセロール（メタ）アクリレート；エポキシ基を有するグリシジル（メタ）アクリレート；第４工程で用いられるカチオン交換基含有単量体；アニオン交換基含有単量体などは用いられない。これらが充填剤粒子を構成するための素材として用いられると粒子内部に存在するこれらの親水性基のため、充填剤粒子の耐圧性・耐膨潤性が低下するからである。
【００２１】
上記その他の添加物（ｂ）としては、例えば、多孔質化剤（ｂ−１）、疎水性重合体粒子（ｂ−２）などが挙げられるが、これらに限定されるわけではなく、公知の添加物が添加され得る。
【００２２】
上記多孔質化剤（ｂ−１）としては、単量体を溶解するが、重合体を溶解しない有機溶媒が挙げられ、これを添加することにより、得られる重合体を多孔質にすることができる。多孔質化剤（ｂ−１）としては、例えば、トルエン、キシレン、ジエチルベンゼン、ドデシルベンゼン等の芳香族炭化水素類；ヘキサン、ヘプタン、オクタン、デカン等の飽和炭化水素類；イソアミルアルコール、ヘキシルアルコール、オクチルアルコール等のアルコール類などが挙げられる。
【００２３】
上記多孔質化剤（ｂ−１）の使用量は、上記疎水性架橋性単量体１００重量部に対して、０〜１００重量部が好ましい。
【００２４】
上記疎水性重合体粒子（ｂ−２）とは、粒度分布の揃った疎水性の重合体粒子のことを指し、これに上記疎水性架橋性単量体と重合開始剤を吸収させた後、重合を行うことにより、粒度分布の揃った充填剤を得ることができる。上記重合体粒子（ｂ−２）としては、例えば、上記その他の単量体（ａ）に示した単量体などの単独重合体又は共重合体からなる非架橋重合体粒子が挙げられ、例えば、スチレン重合体、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、（メタ）アクリル酸メチル重合体、（メタ）アクリル酸エチル重合体などが挙げられる。
また、上記重合体粒子（ｂ−２）として、上記その他の単量体（ａ）と上記疎水性架橋性単量体の共重合体である架橋共重合体粒子も使用できるが、この場合は、疎水性架橋性単量体の割合を１０重量％以下として共重合して得られる低架橋重合体粒子が好ましい。
【００２５】
上記疎水性重合体粒子（ｂ−２）の製造方法は、公知の重合方法でよく、例えば、乳化重合、ソープフリー重合、分散重合、懸濁重合などが挙げられる。
【００２６】
上記疎水性重合体粒子（ｂ−２）の平均粒径は、０．１〜１０μｍが好ましく、粒径のばらつきは変動係数（ＣＶ）（＝標準偏差÷平均粒径×１００）として１５％以下が好ましい。
【００２７】
上記疎水性重合体粒子（ｂ−２）の使用量は、疎水性架橋性単量体１００重量部に対して、０．５〜１００重量部が好ましい。
【００２８】
（水性分散媒）
上記水性分散媒としては、水、又は水に溶解する適宜の水溶性有機溶媒と水との混合物が挙げられる。上記水溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどのアルコール類；アセトン；アセトニトリルなどを例示することができるが、特にこれらに限定されるものではない。水溶性有機溶媒と水との混合物の場合、上記有機溶媒は２０重量％以下が好ましい。
【００２９】
上記水性分散媒には、必要に応じて、分散剤（ｃ）、その他の添加剤（ｄ）が含まれてもよい。上記分散剤（ｃ）としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、デンプン、ヒドロキシセルロース、ポリビニルエーテルなどの高分子化合物；リン酸カルシウムなどの無機塩類；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム、ジアルキルスルホコハク酸ナトリウムなどのイオン性界面活性剤；ポリオキシエチレンノニルフェニールエーテル、ポリエチレングリコールモノステアリレート、ソルビタンモノステアリレートなどの非イオン性界面活性剤などが挙げられ、その使用量は、上記水性分散媒の０．０１〜２０重量％溶液として用いるのが好ましい。
【００３０】
上記その他の添加剤（ｄ）としては、例えば、ｐＨ調節剤；使用する単量体の溶解度を調整するための物質；消泡剤などが挙げられる。
【００３１】
上記ｐＨ調節剤としては、例えば、塩酸、硝酸、リン酸などの無機酸類；酢酸などの有機酸類；水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの塩基類；リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液などの各種の無機及び有機系の緩衝液などが挙げられる。
【００３２】
上記使用する単量体の溶解度を調整するための物質としては、例えば、酢酸ナトリウムなどの塩類が挙げられる。
【００３３】
上記消泡剤としては、例えば、各種界面活性剤など公知の消泡剤が挙げられる。
【００３４】
上記水性分散媒の使用量は、重合性混合物１００重量部に対して２００〜１００００重量部が好ましい。
【００３５】
第１工程における、重合性混合物を水性分散媒に分散させる方法は、特に限定されるわけではないが、例えば、重合性混合物を、上記水性分散媒に添加して、１０〜４０℃の状態で撹拌する方法が挙げられる。上記分散系には、不活性ガスを封入又は通気するのが好ましい。
【００３６】
第２工程は、第１工程で得られた分散系を５０〜１００℃に昇温して、２０〜２４０分間重合反応を行う工程である。
以下、この重合反応のことを１次重合と言い、また第６工程の重合反応のことを２次重合と言う。
１次重合の重合温度は、５０〜１００℃に限定される。５０℃未満では重合速度が遅すぎて重合に時間がかかりすぎ、１００℃を超えると、重合速度が早すぎて凝集が起こりやすくなる。１次重合の重合時間は２０〜２４０分間に限定される。２０分未満では、重合率が低すぎて、液体クロマトグラフィー用充填剤として用いた場合、その性能の再現性が低下する。２４０分を超えると、重合率が高すぎて、第６工程の２次重合の重合率の低下又は上記２次重合において凝集を引き起こす可能性が高くなる。
【００３７】
第３工程は、第２工程の重合反応系を１０〜４０℃に冷却する工程である。
１０〜４０℃に冷却されることにより、１次重合反応は、重合が完全に終了する以前に中断される。「重合が完全に終了する以前」とは、疎水性架橋重合体を含む単量体類の重合率が、好ましくは９８％以下の状態であり、重合開始剤が理論上、添加量の５％以上残存する状態をいう。この工程において、１０℃未満までへの冷却は、作業が繁雑となり、作業時間が延長するとともに、また内容物によっては、溶解度の大きな低下により析出する場合があるので好ましくなく、４０℃を超えると、重合が徐々に進行するため、重合率の制御が困難となり、再現性が低下する。重合を行った温度から１０〜４０℃への冷却までに要する時間は、１２０分以内が好ましく、６０分以内がより好ましい。
【００３８】
第４工程は、上記反応系にカチオン交換基含有単量体を添加する工程である。上記カチオン交換基とは、あるｐＨにおいてカチオン交換能を示す官能基を言い、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基などが挙げられる。カチオン交換基含有単量体とは、１分子中にカチオン交換基を１個以上および重合性官能基を１個以上有する単量体のことを言い、例えば、カルボキシル基を有する単量体としては、（メタ）アクリル酸、クロトン酸、イタコン酸、シトラコン酸、メサコン酸、マレイン酸、フマル酸及びこれらの誘導体など；リン酸基を有する単量体としては、例えば、（（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（２−（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル）アシッドホスフェート及びこれらの誘導体など；スルホン酸基を有する単量体としては、例えば、スチレンスルホン酸、アリルスルホン酸、２−（メタ）アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、（３−スルホプロピル）−イタコン酸、３−スルホプロピル（メタ）アクリル酸及びこれらの誘導体など；上記単量体の、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩などの塩類、などが挙げられる。
【００３９】
上記カチオン交換基含有単量体の他に、化学反応によりカチオン交換基に変換し得る官能基を有する単量体を用い、かつ該化学反応を重合後に行うことによっても、同様のカチオン交換基含有重合体を調製し得る。該化学反応とは、加水分解反応や転移反応などが挙げられる。上記化学反応によって変換し得る官能基としては、例えば、加水分解反応によってカチオン交換基に変換し得る基が挙げられ、例えば、エステル基などが挙げられる。この方法の一例を挙げると、例えば、メチルメタクリレートを単量体として用い、重合後、アルカリ性下で加温してエステル結合を分解してカルボキシル基に変化させることにより、カチオン交換基含有充填剤を調製し得る。
【００４０】
上記第４工程に用いる単量体は複数種を混合して用いても良い。
【００４１】
上記第４工程に用いる単量体の使用量は、上記重合性混合物１００重量部に対して１０〜２００重量部が好ましい。
【００４２】
第４工程に用いる単量体の添加については、反応系の温度が１０〜４０℃において添加する。添加は、一括して添加してもよいし、滴下してもよい。滴下する場合は、６０分以内に添加を終了するのが好ましい。
【００４３】
第５工程は、上記の添加終了後、該反応系を１０〜４０℃で０．５〜２４時間撹拌する工程である。
この工程は、カチオン交換基含有単量体を、水性分散媒に均一に分散させ、かつ１次重合粒子又は残存する単量体類と水性分散媒の間における分配平衡を安定させるために行う。撹拌時間は、用いるカチオン交換基含有単量体又は水性分散媒の組成などにより異なるが、０．５〜２４時間に限定される。０．５時間未満では、カチオン交換基含有単量体が反応系に均一になりにくく、その結果、重合の再現性が低下し、２４時間を超えて撹拌を行っても効果はそれ以上に向上しないばかりでなく、単量体種によっては、１０〜４０℃においても重合が進行し、この進行具合のバラツキにより製造再現性の低下の恐れがある。
【００４４】
上記撹拌時の温度が１０〜４０℃に限定される理由は、１０℃未満までへの冷却は、作業が繁雑となり、作業時間が延長するとともに、また内容物によっては、溶解度の大きな低下により析出する場合があるので好ましくなく、４０℃を超えると、重合が徐々に進行するため、重合率の制御が困難となり、再現性が低下するためである。
【００４５】
第６工程は、該反応系を５０〜１００℃に昇温して重合反応を行い、重合開始後２０〜２４０分間で、かつカチオン交換基含有単量体の添加量の０．１〜２０％の重合率の段階において重合反応を終了する工程である。
この２次重合の重合温度は、５０〜１００℃に限定されるが、この温度は１次重合の温度と異なってもよい。上記温度が５０℃未満になると重合速度が遅すぎて重合に時間がかかりすぎ、１００℃を超えると重合速度が早すぎて凝集が起こりやすくなる。上記２次重合の重合時間は２０〜２４０分に限定される。上記時間が２０分未満では、カチオン交換基含有単量体の重合率が低すぎて、液体クロマトグラフィー用充填剤として用いた場合、イオン交換容量が小さすぎて、十分なイオン交換反応がなされず、その結果分離が不十分となる。また、上記時間が２４０分を超えると、カチオン交換基含有単量体の単独重合体による凝集が発生しやすくなり好ましくない。
【００４６】
上記工程においては、カチオン交換基含有単量体の添加量の０．１〜２０％の重合率の段階で重合を終了する。上記重合率が０．１％未満では、重合率が低すぎて、液体クロマトグラフィー用充填剤として用いた場合、イオン交換容量が小さすぎて、測定対象物質との十分なイオン交換反応がなされず、その結果分離が不十分となる。上記重合率が２０％を超えると、凝集が発生しやすく、再現性が大きく低下するとともに、液体クロマトグラフィー用充填剤として用いた場合、カラム圧力が上昇し、使用上極めて都合が悪くなる。
なお、ここで言う重合率とは、添加量に対する、最終的に得られた重合生成物中のカチオン交換基含有単量体量を示し、下記の第７工程の洗浄によって除去され得る、カチオン交換基含有単量体の単独重合体などは含まない。
【００４７】
第７工程は、得られた重合体を、水及び／又は有機溶媒で洗浄する工程である。この工程は、生成した重合体を水及び／又は有機溶媒で洗浄し、余剰の添加物、不要の生成物などを除去するために行う。上記洗浄は水と有機溶媒双方で洗浄する必要は必ずしもない。水と有機溶媒双方を使用する場合、洗浄の順序は特に問わない。
【００４８】
上記洗浄により除去される物質は、分散剤、残存単量体、非架橋の重合体などが挙げられる。特にカチオン交換基含有単量体は第４工程において大過剰に添加するので、該単量体及びその重合体を除去するために、洗浄を行う必要がある。
【００４９】
有機溶媒による洗浄の場合に使用する有機溶媒は、得られた重合体粒子が溶解しないこと、及び除去すべき物質の溶解度を考慮して選択されるが、例えば、アセトン、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどが挙げられる。
【００５０】
上記洗浄方法は、重合生成物に、水又は有機溶媒、場合によってはこれらの混合物を添加して撹拌する；又は重合生成物を有機溶媒に浸漬したり、重合生成物に有機溶媒を循環させて抽出するなど、或いはその他公知の方法により行うことができる。また、洗浄工程において、重合体粒子が破損しない程度に加温してもよい。洗浄に用いられた水や有機溶媒は、例えば、デカンテーション又は遠心分離などの方法により除去する。
【００５１】
（液体クロマトグラフィー用充填剤への適用）
上記工程によって得られた重合体粒子は、以下の粒径及び粒度分布を満足することにより液体クロマトグラフィー用充填剤とされる。
上記平均粒径は０．１〜５０μｍが好ましく、０．５〜２０μｍがより好ましい。粒度分布は、ＣＶが２０％以下が好ましく、１５％以下がより好ましい。
前記工程によって得られた重合体粒子は、必要に応じて分級することにより、上記条件を満足させ得る。分級は、乾式又は湿式など公知の方法が用いられ得る。
【００５２】
液体クロマトグラフィー用充填剤として用いる場合、上記充填剤をステンレス製又は樹脂製などのカラムに充填することにより、液体クロマトグラフィー用カラムを構成することができる。充填に際しては、適宜の方法を用いることができるが、充填剤を溶離液に用いる溶媒などの分散媒に所定量分散し、カラム内にパッカーなどを経由して圧入する湿式法（スラリー法）が特に好ましい。
【００５３】
本発明で得られる液体クロマトグラフィー用充填剤を用いて分離測定する際の測定対象物質としては、従来からカチオン交換液体クロマトグラフィー又はイオンクロマトグラフィーで分離されていたものの全てである。特に、カテコールアミン誘導体類、ヌクレオチド類、ペプチド類、タンパク質類などの生体関連物質が好適である。
【００５４】
本発明で得られる充填剤を適用できる液体クロマトグラフは公知のものでよく、例えば、送液ポンプ、試料導入装置、カラム、検出器などから構成される。また、これらに他の付属品（恒温槽や溶離液の脱気装置など）が適宜付属されてもよい。
【００５５】
本発明で得られる充填剤を用いた液体クロマトグラフィー分析には、公知の溶離液が用いられる。例えば、以下の物質などを含む各種緩衝液などが挙げられる。リン酸、硝酸、塩酸、過塩素酸などの無機酸及びその塩；酢酸、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸、クエン酸などの有機酸及びその塩又はハロゲン化物；水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの塩基性物質；その他の無機又は有機塩類。また、Ｇｏｏｄの緩衝液も使用可能である。
また、例えば、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、メタノール、エタノールなどの有機溶媒も使用可能であり、また、水若しくは上記緩衝液と有機溶媒の混合物も使用可能である。
【００５６】
【作 用】
本発明では、まず、架橋度が高く、粒子骨格内部にイオン交換基などの親水性基が少ない疎水性架橋重合体粒子を調製し、しかる後、該粒子の表面付近でカチオン交換基含有単量体を重合させる。従って、（１）得られた充填剤は、膨潤・収縮が少ないので、溶離液の変化に対する平衡化が早いため、特に複数の溶離液を用いた各種のグラディエント溶出法においても測定時間を短くできる；（２）得られた充填剤は、耐圧性が大きいので、高流速分析が行え、従って測定時間の短縮に有利である。また同様に高圧下でのカラム充填が可能となるため、カラム寿命の延長が図ることができる。
また、本発明の方法では、カチオン交換基含有単量体を添加する際には、温度を室温付近（１０〜４０℃）まで一度冷却してから添加し、また室温付近で一定時間撹拌を行うことにより、製造安定性を飛躍的に高めている。
また、カチオン交換基含有単量体は、大過剰量添加し、かつ低重合率の段階で停止させているので、極めて凝集しやすい単量体であっても、再現性良く重合を行うことができる。
【００５７】
【実施例】
以下に本発明方法の実施例を示す。
（実施例１）
トリエチレングリコールジメタクリレート（疎水性架橋性単量体：新中村化学社製）４００ｇにベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤：和光純薬社製）１．５ｇを混合して溶解した。これを２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製、ゴーセノールＧＨ−２０）水溶液に分散させ、窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、７５℃で１．２時間重合した。１．２時間経過後、反応系を約３０分間で３５℃に冷却し、メタクリル酸（カルボキシル基含有単量体：和光純薬社製）２００ｇを一括添加した。その後２５℃で６０分間撹拌した後、８０℃に昇温して１時間重合した。
重合後、生成物を水及びアセトンで洗浄し、分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００５８】
（実施例２）
ジビニルベンゼン（疎水性架橋性単量体：キシダ化学社製）２５０ｇ、スチレン（非架橋性単量体：和光純薬社製）５０ｇを混合し、これにトルエン１００ｇ及びベンゾイルパーオキサイド１．５ｇを混合して溶解した。これを２．５リットルの５重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させ、窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で２．５時間重合した。２．５時間経過後、反応系を約４０分間で３０℃に冷却し、アクリル酸（カルボキシル基含有単量体：和光純薬社製）１５０ｇを一括添加した。その後２５℃で６０分間撹拌した後、再び８０℃に昇温して１時間重合した。
重合後、生成物を水及びアセトンで洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００５９】
（実施例３）
テトラエチレングリコールジメタクリレート（疎水性架橋性単量体：新中村化学社製）３５０ｇ、テトラメチロールメタンテトラアクリレート（疎水性架橋性単量体：新中村化学社製）５０ｇにベンゾイルパーオキサイド１．５ｇを混合して溶解した。これを２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させ、窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で１．３時間重合した。１．３時間経過後、反応系を約３０分間で３５℃に冷却し、メタクリル酸（カルボキシル基含有単量体：和光純薬社製）８０ｇ及びイタコン酸（カルボキシル基含有単量体：東京化成社製）８０ｇを一括添加した。その後２５℃で６０分間撹拌した後、８０℃に昇温して１時間重合した。重合後、生成物を水及びアセトンで洗浄し、分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００６０】
（実施例４）
トリエチレングリコールジメタクリレート３５０ｇ及びテトラメチロールメタントリアクリレート（疎水性架橋性単量体：新中村化学社製）５０ｇの混合物にベンゾイルパーオキサイド１．０ｇを混合して溶解した。これを２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させ、窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で１．５時間重合した。１．５時間経過後、反応系を約２０分間で室温まで冷却し、反応系内の温度が３０℃となったところで、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（スルホン酸基含有単量体：東京化成社製）の５０％水溶液４００ｍｌを１０分間で滴下し添加した。その後２５℃で６０分間撹拌した後、再び８０℃に昇温して１時間重合した。
重合後、生成物を水及びアセトンで洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００６１】
（実施例５）
メチルメタクリレート（和光純薬社製）２００ｇを、イオン交換水１２００ｇに添加した。撹拌しながら窒素雰囲気下で７０℃に昇温した後、０．５重量％の過硫酸カリウム（Ｅ．Ｍｅｒｋ社製）水溶液１０ｍｌ及び２重量％のスチレンスルホン酸ナトリウム（和光純薬社製）水溶液１０ｍｌを反応系に添加した。７０℃で２４時間重合を行った後、反応生成物を濾過して、平均粒径０．７μｍ、粒径のＣＶ３．５％の単分散粒子を得た。
【００６２】
上記単分散粒子１ｇを分散させた０．５重量％ラウリル硫酸ナトリウム（和光純薬社製）水溶液４００ｍｌに、３重量％ポリビニルアルコール水溶液２００ｍｌを添加し、１時間室温で撹拌した（単分散粒子分散液）。一方でトリエチレングリコールジメタクリレート５０ｇにベンゾイルパーオキサイド１．０ｇを溶解した。これに０．５重量％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液９００ｍｌを添加し、ホモジナイザー（IKA Labotechnik 社製）を用いて、２４０００ｒｐｍで１５分間撹拌した。得られた乳化液を、上記単分散粒子分散液に添加して２４時間室温で撹拌し、単量体及び重合開始剤を、単分散粒子に吸収させた。その後、窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で１．５時間重合した。１．５時間経過後、反応系を約３０分間で３５℃まで冷却し、メタクリル酸３０ｇを一括添加した。その後２５℃で６０分間撹拌した後、再び８０℃に昇温して１時間重合した。
重合後、生成物を水及びアセトンで洗浄し分級して平均粒径３．５μｍの充填剤を得た。
【００６３】
（実施例６）
実施例５における、メタクリル酸３０ｇの代わりに、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸２５ｇを用いた以外は、実施例５と同様に操作して、平均粒径３．５μｍの充填剤を得た。
【００６４】
（比較例１）
ジエチレングリコールジメタクリレート（疎水性架橋性単量体）４００ｇ及びメタクリル酸（カルボキシル基を有する単量体）２００ｇの混合物に、ベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤）１．５ｇを混合して溶解した。これを２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させ、窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で８時間重合した。
重合後、生成物を洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００６５】
（比較例２）
ジビニルベンゼン（疎水性架橋性単量体：キシダ化学社製）２５０ｇ、スチレン（非架橋性単量体：和光純薬社製）５０ｇ、トルエン１００ｇ、アクリル酸１５０ｇ及びベンゾイルパーオキサイド１．５ｇを混合して溶解した。これを２．５リットルの５重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させ、窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で８時間重合した。
重合後、生成物を水及びアセトンで洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００６６】
（比較例３）後処理によるカルボキシル基の導入例：
グリシジルメタクリレート（日本油脂社製）３５０ｇ、エチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）５０ｇ及びアゾビスイソブチロニトリル１０ｇを混合し、４重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させ、窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、６０℃で１０時間重合した。
得られた重合体を洗浄した後、分級して平均粒径５μｍの重合体を得た。
該重合体１００ｇをキシレン３００ｇに添加した。キシレンを含浸させた重合体を、１５ｇの濃硫酸を含む４重量％ポリビニルアルコール水溶液１リットルに添加し、撹拌しながら８０℃で１時間加温した。その後水及びアセトンで洗浄して乾燥した。得られた重合体１００ｇをジオキサン５００ｍｌ中に分散させ、三フッ化ホウ素エーテラート（５５％）５ｍｌを加えて５０℃で８時間加温した。アセトン洗浄した後、乾燥した。
【００６７】
さらに該重合体２０ｇを１０００ｍｌの水に分散させ、モノクロル酢酸ナトリウム３５ｇ、ヨウ化カリウム２０ｇ、５０重量％水酸化ナトリウム６０ｇを加え、撹拌しながら６０℃で３時間反応させた。得られた重合体を洗浄して乾燥させ、平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００６８】
（比較例４）後処理によるスルホン酸基の導入例：
２−ヒドロキシエチルメタクリレート４００ｇ、ジエチレングリジールジメタクリレート５０ｇ、メチルメタクリレート５０ｇ及びベンゾイルパーオキサイド１．５ｇを混合し、２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で８時間重合した。
得られた重合体を洗浄した後、分級して平均粒径５μｍの重合体を得た。
該重合体１００ｇを２０重量％の水酸化ナトリウム水溶液１００ｍｌ中に分散させた。これにエピクロルヒドリン４０ｇを添加して５時間反応させた。得られたエポキシ基含有重合体１００ｇを２０重量％の硫酸ナトリウム水溶液１００ｍｌに分散させた後、８０℃で１５時間反応させた。得られた重合体を洗浄して乾燥させ、平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００６９】
（比較例５）Y. Ohtsuka et al の文献 [J. Applied Polym. Sci., 27 (1982) 3279-3288 ] による方法：
エチレングリコールジメタクリレート（疎水性架橋性単量体：新中村化学社製）１００ｇ及びベンゾイルパーオキサイド１．０ｇを混合して溶解した。これを２．５リットルの１重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させ、窒素雰囲気下で撹拌しながら８０℃に昇温した。１時間経過後、メタクリル酸５０ｇを反応系に添加し、さらに８０℃で２４時間重合した。
重合後、生成物を洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００７０】
（比較例６）Y. Ohtsuka et al の文献 [J. Applied Polym. Sci., 27 (1982) 3279-3288 ] による方法：
比較例５における、メタクリル酸５０ｇの代わりに、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム（スルホン酸基含有単量体：和光純薬社製）５０ｇを用いた以外は、比較例５と同様に操作し、充填剤を得た。
【００７１】
（比較例７）２段重合 官能基（ＣＯＯＨ）（特公平８−７１９７号公報の方法分割法）：
トリエチレングリコールジメタクリレート４００ｇにベンゾイルパーオキサイド１．５ｇを溶解し、５重量％ポリビニルアルコール水溶液２．５リットルに分散させた。撹拌しながら昇温し、８０℃で８時間重合を行った。得られた生成物を水およびアセトンで洗浄して、架橋重合体粒子を得た。
この粒子３００ｇを、ベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤）１．０ｇを含むアセトン溶液１リットルに添加し、粒子に重合開始剤を含浸させた。次に２０℃において減圧下でアセトンを留去した。１重量％ポリビニルアルコール水溶液２．５リットルに、得られた重合開始剤含有粒子を分散させ、撹拌しながらメタクリル酸２００ｇを添加し、窒素置換後８０℃で１時間重合を行った。
重合後、洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００７２】
（比較例８）２段重合 官能基（ＣＯＯＨ）（特公平８−７１９７号公報の方法連続法）：
トリエチレングリコールジメタクリレート４００ｇにベンゾイルパーオキサイド１．５ｇを溶解し、５重量％ポリビニルアルコール水溶液２．５リットルに分散させた。撹拌しながら昇温し、８０℃で１時間重合を行った。１時間後、反応系にメタクリル酸２００ｇを添加し、さらに８０℃で１時間重合を行った。
重合後、洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００７３】
（性能評価）
実施例１〜６及び比較例１〜８の充填剤について、以下のようにして性能評価をした。
（１）液体クロマトグラフィー用カラムの製造：
充填剤０．７ｇを採取し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０ｍｌに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製空カラム（４．６φ×３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力２００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填して、液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００７４】
（２）耐膨潤性試験：
カルボキシル基含有充填剤を充填したカラムに、以下のようにして、ｐＨの異なる溶離液を通液して、その際のカラム圧力の変動；およびカラム圧力が安定するまでに要した時間（平衡化までの時間）から、膨潤度合いを測定・比較した。
すなわち、実施例１〜３、５；比較例１〜３で得られた充填剤を各々充填したカラムに、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７：Ａ液）を３０分間通液した。カラム圧力が一定になった後、３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５：Ｂ液）を通液し、カラム圧力の変動を観察した。得られた結果を表１に示した。
【００７５】
【表１】
実施例１〜３及び５の充填剤は、比較例１〜３の充填剤に比べ、より圧力値の上昇が少なく、圧力値の安定までに要した時間（平衡化までの時間）が極めて短いことがわかった。
【００７７】
次に、実施例４及び６；比較例４で得られたスルホン酸基を有する充填剤を各々充填したカラムに、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ３．０：Ｃ液）を３０分間通液した。カラム圧力が一定になった後、３００リン酸緩衝液（ｐＨ８．５：Ｄ液）を通液し、カラム圧力の変動及びカラム圧力が安定するまでに要した時間（平衡化までの時間）を観察した。結果を表２に示した。
【００７８】
【表２】
実施例４及び６の充填剤は、比較例４の充填剤に比べ、より圧力値の上昇が少なく、圧力値の安定までに要した時間（平衡化までの時間）が極めて短いことがわかった。
【００８０】
以上より、本発明の方法により得られた実施例１〜６の充填剤は、従来の１段階の重合法による充填剤（比較例１及び２）又は後処理によるカチオン交換基導入法による充填剤（比較例３及び４）に比べて、溶離液の変化に対する平衡化が早く、膨潤しにくいことがわかった。
【００８１】
（３）ヘモグロビン類の測定：
実施例及び比較例で得られた充填剤を各々充填したカラムを用いて、糖尿病診断の指標となる、ヒト血液中の糖化ヘモグロビン（Ｈｂ）類を含むＨｂ類の測定を行った。
（測定条件）
システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：リン酸塩及び過塩素酸塩を含む緩衝液２種によるステップグラディエント法で溶出した。
溶離液１：最初からヘモグロビンＡ０（ＨｂＡ０）の前までを溶出。安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（安定型ＨｂＡ１ｃ）が最も適当な保持時間に溶出されるよう、濃度を１０〜２００ｍＭ、ｐＨを５．０〜５．８の間で調節した。
溶離液２：ＨｂＡ０を溶出。濃度は３００ｍＭ、ｐＨ７．２とした。
流速：１．５ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
【００８２】
（測定試料）
健常人血をフッ化ナトリウム採血し、以下の試料を調製した。
試料ａ）糖負荷血：健常人血に、５００ｍｇ／ｄｌとなるようグルコース水溶液を添加し、３７℃で５時間反応させ、次いで、溶血希釈液（０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）（東京化成社製）のリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０））で溶血し、１５０倍に希釈して試料ａとした。
試料ｂ）カルバミル化Ｈｂ（ＣＨｂ）含有試料：健常人血１０ｍｌに、０．３重量％のシアン酸ナトリウムの生理食塩水溶液１ｍｌを添加し、３７℃で３時間反応させ、次いで、溶血希釈液（０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）（東京化成社製）のリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０））で溶血し、１５０倍に希釈して試料ｂとした。
試料ｃ）アセチル化Ｈｂ（ＡＨｂ）含有試料：健常人血１０ｍｌに、０．３重量％のアセトアルデヒドの生理食塩水溶液１ｍｌを添加し、室温で３時間反応させ、次いで、溶血希釈液（０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）（東京化成社製）のリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０））で溶血し、１５０倍に希釈して試料ｃとした。
【００８３】
（測定結果）
（イ）実施例１〜６の充填剤：
（試料ａ）
実施例１の充填剤を用いて、試料ａを測定して得られたクロマトグラムを図１（ａ）に示す。
図１（ａ）において、ピーク１はヘモグロビンＡ１ａ及びｂ（ＨｂＡ１ａ及びｂ）；ピーク２はヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）；ピーク３は不安定型ＨｂＡ１ｃ；ピーク４は安定型ＨｂＡ１ｃ；ピーク５はＨｂＡ０を示す。
ＨｂＦ（ピーク２）及び糖尿病診断の指標となる安定型ＨｂＡ１ｃピーク（ピーク４）の良好な定量性を維持するためには、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０の順に溶出される必要がある。特にＨｂＦは通常、ＨｂＡ１ｃ類やＨｂＡ０に比較してピークが小さいため、例えば安定型ＨｂＡ１ｃとＨｂＡ０の間などに溶出されると、ＨｂＦの定量性は極めて低下する。
図１（ａ）では、上記順序で各ピークが溶出され、またＨｂＦや安定型ＨｂＡ１ｃが他成分のピークと良好に分離されている。
【００８４】
（試料ｂ）
実施例１の充填剤を用いて、試料ｂを測定して得られたクロマトグラムを図１（ｂ）に示す。
図１（ｂ）において、ピーク６はＣＨｂを示す。ＣＨｂが安定型ＨｂＡ１ｃから良好に分離されている。
（試料ｃ）
実施例１の充填剤を用いて、試料ｃを測定して得られたクロマトグラムを図１（ｃ）に示す。
図１（ｃ）において、ピーク７はＡＨｂを示す。ＡＨｂが安定型ＨｂＡ１ｃから良好に分離されている。
【００８５】
また、実施例２〜６の充填剤を用いた場合でも、同様の結果が得られた。
【００８６】
（ロ）比較例１〜３の充填剤：
（試料ａ）
比較例１の充填剤を用いて、試料ａを測定して得られたクロマトグラムを図２（ａ）に示す。
ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃの順で溶出されているが、測定時間が長いにもかかわらず、不安定型ＨｂＡ１ｃと安定型ＨｂＡ１ｃとの分離が悪い。
（試料ｂ）
比較例１の充填剤を用いて、試料ｂを測定して得られたクロマトグラムを図２（ｂ）に示す。
ＣＨｂと安定型ＨｂＡ１ｃの分離が悪い。
（試料ｃ）
比較例１の充填剤を用いて、試料ｃを測定して得られたクロマトグラムを図２（ｃ）に示す。
ＡＨｂと安定型ＨｂＡ１ｃの分離が悪い。
【００８７】
また、比較例２及び３の充填剤を用いた場合でも、同様の結果が得られた。
【００８８】
（ハ）比較例４の充填剤：
（試料ａ）
比較例４の充填剤を用いて、試料ａを測定して得られたクロマトグラムを図３（ａ）に示す。
不安定型ＨｂＡ１ｃと安定型ＨｂＡ１ｃは分離されているが、ＨｂＦが測定できなかった。また、測定時間が長い。
（試料ｂ）
比較例４の充填剤を用いて、試料ｂを測定して得られたクロマトグラムを図３（ｂ）に示す。
ＣＨｂと安定型ＨｂＡ１ｃの分離が悪い。
（試料ｃ）
比較例４の充填剤を用いて、試料ｃを測定して得られたクロマトグラムを図３（ｃ）に示す。
ＡＨｂと安定型ＨｂＡ１ｃの分離が悪い。
【００８９】
（ニ）比較例５及び６の充填剤：
（試料ａ）
比較例５の充填剤を用いて、試料ａを測定して得られたクロマトグラムを図４（ａ）に示す。
（試料ｂ）
比較例５の充填剤を用いて、試料ｂを測定して得られたクロマトグラムを図４（ｂ）に示す。
（試料ｃ）
比較例５の充填剤を用いて、試料ｃを測定して得られたクロマトグラムを図４（ｃ）に示す。
いずれの場合も、測定時間が長いにもかかわらず、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃの分離が悪い。
【００９０】
また、比較例６の充填剤を用いた場合でも、同様の結果が得られた。
【００９１】
（ホ）比較例７及び８の充填剤：
（試料ａ）
比較例７の充填剤を用いて、試料ａを測定して得られたクロマトグラムを図５（ａ）に示す。
（試料ｂ）
比較例７の充填剤を用いて、試料ｂを測定して得られたクロマトグラムを図５（ｂ）に示す。
不安定型ＨｂＡ１ｃやＣＨｂは、実施例と同様、安定型ＨｂＡ１ｃと良好に分離できた。
（試料ｃ）
比較例７の充填剤を用いて、試料ｃを測定して得られたクロマトグラムを図５（ｃ）に示す。
ＡＨｂは、安定型ＨｂＡ１ｃと分離できなかった。
【００９２】
また、比較例８の充填剤を用いた場合でも、同様の結果が得られた。
【００９３】
以上から、本発明の方法の実施例による充填剤を用いると、従来技術ではできなかった、不安定型ＨｂＡ１ｃ、ＣＨｂ、ＡＨｂの影響を受けることなく安定型ＨｂＡ１ｃを定量し、ＨｂＦも定量できることがわかる。
【００９４】
（ヘ）カラム耐久性：
実施例４及び比較例４の充填剤について、カラム耐久性を比較した。
上記試料ａを繰り返し測定し、得られたクロマトグラムから以下の式により算出される安定型ＨｂＡ１ｃ値の変化を調べた。
安定型ＨｂＡ１ｃ（％）＝（安定型ＨｂＡ１ｃのピーク面積）÷（全ピーク面積）×１００
【００９５】
得られた結果を図６に示す。測定初期の値を１００とした場合の相対値で示す。図６より、実施例４の充填剤では、比較例４の充填剤に比べて、安定型ＨｂＡ１ｃ値が長期間安定であり、カラム耐久性が優れていることがわかる。
【００９６】
（ト）重合再現性：
実施例１及び４、比較例３〜８の充填剤を、各々３０回同一条件下で調製し、各ロット間差を調べた。
（測定方法）
上記測定方法において、安定型ＨｂＡ１ｃピークの保持時間が、約10分となるように溶離液１を調製した。
各ロットの充填剤を用い、上記試料ａを測定し、安定型ＨｂＡ１ｃピークの保持時間を調べた。
３０ロットにおいて、重合状態が良好であったものについて測定した時の、安定型ＨｂＡ１ｃピークの保持時間の平均値、標準偏差及び変動係数を表３に示す。なお、調製途中で凝集が発生し、充填剤としての評価が不可能であったロット数についても表３に示した。
【００９７】
【表３】
表３より明らかなように、本発明方法による実施例では、重合途中での凝集を起こすことなく、かつ充填剤としての性能の再現性が極めて良い。一方、従来技術である後処理による製造方法（比較例３及び４）では、充填剤の性能としてばらつきが大きい。さらに重合途中でカチオン交換基含有単量体を添加する方法や、架橋粒子に重合開始剤を含浸させてカチオン交換基含有単量体を重合する方法（比較例５〜８）では、性能のばらつきに加えて、重合途中での凝集が発生しやすいことが分かる。
【００９９】
（４）タンパク質混合物の分析例：
カルボキシル基含有充填剤（実施例１〜３、比較例１〜３、５、７、８）を用いて、タンパク質標準物質の混合物を分析した。
（測定条件）
システム：上記（３）ヘモグロビン類の測定のシステムと同様
溶離液：リン酸ナトリウムを含む緩衝液２種によるリニアグラディエント法で溶出した。
溶離液３：３０ｍＭ（ｐＨ７．１）
溶離液４：溶離液３＋３００ｍＭ Ｎａ2 ＳＯ4
溶離液３の１００％から溶離液４の１００％へのリニアグラディエント
流速：１．５ｍｌ／分
検出波長：２８０ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
【０１００】
（測定試料）
ミオグロビン、α−キモトリプシノーゲン、リボヌクレアーゼＡ、リゾチーム（Ｓｉｇｍａ社製）混合物
【０１０１】
（測定結果）
得られたクロマトグラムを図７に示す。図７（ａ）は、実施例１〜３の充填剤を用いた場合のクロマトグラム、図７（ｂ）は、比較例１〜３、５、７、８の充填剤を用いた場合のクロマトグラムを示す。図７中、ピーク８はミオグロビン、ピーク９はα−キモトリプシノーゲン、ピーク１０はリボヌクレアーゼＡ、ピーク１１はリゾチームを示す。図より、実施例１〜３の充填剤を用いた場合は、各ピークが短時間で良好に分離されているが、比較例１〜３、５、７、８の充填剤を用いた場合は、測定時間が長いにもかかわらず、各ピークがシャープさに欠けることがわかる。
【０１０２】
（５）ペプチド混合物の分析例：
スルホン酸基含有充填剤（実施例４、６、比較例４、６）を用いて、ペプチド標準物質の混合物を分析した。
（測定条件）
システム：上記（３）ヘモグロビン類の測定のシステムと同様
溶離液：酢酸を含む緩衝液２種によるリニアグラディエント法で溶出した。
溶離液５：３０ｍＭ（ｐＨ２．８）
溶離液６：溶離液５＋３００ｍＭ Ｎａ2 ＳＯ4
溶離液５の１００％から溶離液６の１００％へのリニアグラディエント
流速：１．５ｍｌ／分
検出波長：２１５ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
【０１０３】
（測定試料）
γ−エンドルフィン、カルシトニン、サブスタンスＰ、インシュリン、β−エンドルフィン（Ｓｉｇｍａ社製）混合物
【０１０４】
（測定結果）
得られたクロマトグラムを図８に示す。図８（ａ）は、実施例４及び６の充填剤を用いた場合のクロマトグラム、図８（ｂ）は、比較例４の充填剤を用いた場合のクロマトグラム、図８（ｃ）は、比較例６の充填剤を用いた場合のクロマトグラムを示す。図８中、ピーク１２はγ−エンドルフィン、ピーク１３はカルシトニン、ピーク１４はサブスタンスＰ、ピーク１５はインシュリン、ピーク１６はβ−エンドルフィンを示す。図より、実施例４及び６の充填剤を用いた場合は、各ピークが短時間で良好に分離されているが、比較例４の充填剤を用いた場合は、測定時間が長いにもかかわらず、各ピークがシャープさに欠けることがわかり、比較例６の充填剤を用いた場合は、各ピークが分離されなかった。
【０１０５】
（重合の再現性）
実施例４、６；比較例４、６の重合方法を、各々３０回同一条件下で調製し、各ロット間差を調べた。
（測定方法）
上記測定方法において、β−エンドルフィン（ピーク１６）ピークの保持時間が、約２０分となるよう溶離液５を調製した。
各ロットの充填剤を用い、上記試料を測定し、β−エンドルフィンピークの保持時間を調べた。
３０ロットにおいて、重合状態が良好であったものについて測定した時の、β−エンドルフィンピークの保持時間の平均値、標準偏差及び変動係数を表４に示す。なお、調製途中で凝集が発生し、充填剤としての評価が不可能であったロット数についても表４に示した。
【０１０６】
【表４】
以上から、本発明方法で得られたスルホン酸基含有充填剤は、従来の製造方法による充填剤に比べて、より短時間で高精度にペプチド類を分離でき、また重合ロット間のばらつきも非常に少ないことがわかる。
【０１０８】
【発明の効果】
本発明方法により得られる液体クロマトグラフィー用充填剤は、骨格部分が疎水性架橋粒子で構成され、イオン交換能を有する官能基は表面付近に偏在しているため、溶離液の組成変化などによる外部環境に対して平衡が早く、耐膨潤性に優れている。従って従来より行われていた、架橋性単量体とカチオン交換基含有単量体を混合して重合することにより得られる充填剤や、親水性単量体と架橋性単量体を共重合させた後、後処理によってカチオン交換基を導入する方法により得られる充填剤のように、粒子内部に多くの親水性官能基を有する充填剤よりも短い測定時間内で高分離能を有する。
【０１０９】
また本発明方法は、カチオン交換基含有単量体を添加する際に、重合系を室温付近の温度まで冷却して重合反応を停止または重合速度を極度に遅くすること；及び該単量体添加後に室温付近の温度で一定時間撹拌することにより、添加したカチオン交換基含有単量体を反応系内で安定状態としてから、該単量体の重合を行う。これにより、従来行われていた、重合途中でカチオン交換基含有単量体を添加したり、架橋性重合体に重合開始剤を含浸させてからカチオン交換基含有単量体を重合させる方法に比べて重合安定性が極めて高くなる。
【０１１０】
さらに従来法では、カチオン交換基含有単量体を添加してから２４時間程度重合を行い、重合率を高めていたが、これでは重合途中での凝集が発生しやすく、使用できる単量体も制限される。またイオン交換反応に十分なカチオン交換基を導入する条件と凝集を防ぐための条件が矛盾し、条件設定が難しい。本発明では、カチオン交換基含有単量体を大過剰添加して、低重合率の段階で停止する方法により、凝集しやすい単量体でも、重合再現性の低下を招くことなく、イオン交換反応に十分なイオン交換容量を充填剤に付与できる。
【０１１１】
また一連の重合操作で完了するため、後処理によるカチオン交換基の導入法に比べて操作が簡便で、かつ簡便であるために再現性も良い。またカチオン交換基は全て単量体由来であるから、液クロ充填剤に適用した場合の性能の再現性もよく、製造上極めて有利である。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１により得られた充填剤を用いて、Ｈｂ類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図２】比較例１により得られた充填剤を用いて、Ｈｂ類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図３】比較例４により得られた充填剤を用いて、Ｈｂ類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図４】比較例５により得られた充填剤を用いて、Ｈｂ類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図５】比較例７により得られた充填剤を用いて、Ｈｂ類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図６】カラム耐久性試験の結果を示す図。
【図７】タンパク質混合物の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図８】ペプチド混合物の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【符号の説明】
１ ＨｂＡ１ａ及びｂ
２ ＨｂＦ
３ 不安定型ＨｂＡ１ｃ
４ 安定型ＨｂＡ１ｃ
５ ＨｂＡ０
６ カルバミル化Ｈｂ
７ アセチル化Ｈｂ
８ ミオグロビン
９ α−キモトリプシノーゲン
１０ リボヌクレアーゼＡ
１１ リゾチーム
１２ γ−エンドルフィン
１３ カルシトニン
１４ サブスタンスＰ
１５ インシュリン
１６ β−エンドルフィン
Claims (1)
- 以下の工程よりなることを特徴とする液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
（ｉ）疎水性架橋性単量体と重合開始剤とを含む重合性混合物を水性分散媒に分散する第１工程、
（ii）第１工程で得られた分散系を５０〜１００℃に昇温して、２０〜２４０分間重合反応を行う第２工程、
（iii ）その後、１０〜４０℃に反応系を冷却する第３工程、
（iv）該反応系にカチオン交換基含有単量体を添加する第４工程、
（ｖ）添加終了後、該反応系を１０〜４０℃で０．５〜２４時間撹拌する第５工程、
（vi）該反応系を５０〜１００℃に昇温して重合反応を行い、重合開始後２０〜２４０分間で、かつカチオン交換基含有単量体の添加量の０．１〜２０％の重合率の段階において重合反応を終了する第６工程、
（vii ）得られた重合体を、水及び／又は有機溶媒で洗浄する第７工程。
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