JPH0373848A - 液体クロマトグラフィー用充填剤とその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、クロマトグラフィー用充填剤、特に水系のゲ
ル浸透クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグ
ラフィーに適した液体クロマトグラフィー用充填剤およ
びその製造法に関する。

（従来の技術） 各種物質の分離または検出に液体クロマトグラフィーが
使用され、生体試料からのタンパクの分離など、特に親
水性物質の分離には、水系のゲル浸透クロマトグラフィ
ー（以下、ＧＰＣとする）、イオン交換クロマトグラフ
ィー（以下、ＩＥＣとする）などが利用されている。Ｇ
ＰＣ法は、充填剤内部の細孔に試料中の分子を拡散させ
ると、小さい分子は細孔内部に入り込むため溶離時間に
遅れを生じ、大きな分子から順に溶出されるという原理
に基づいて、分離を行う方法である。他方、ＩＥＣ法は
イオン交換基を有する充填剤を用い、分離対象成分イオ
ンの充填剤に対するイオン交換吸着性の差違によって分
離する方法である。

親水性物質を分離するための水系ＧＰＣに良く用いられ
る充填剤としては、従来からデキストランゲル、アガロ
ースゲルなどの天然高分子ゲルがある。これらのゲルは
タンパクなどの非特異的吸着が少なく優れた充填剤であ
るが、ゲルが軟質なため、耐圧性に劣り、高速処理が不
可能である。

これらの天然高分子ゲルに比べ高速処理が可能な充填剤
としては、架橋重合体ゲルからなる合成高分子系充填剤
が挙げられる。架橋重合体ゲルの素材としては、ポリエ
チレングリコールジメタクリレート、ビニルアセテート
、ポリエチレングリコールジメタクリレートとヒドロキ
シエチルメタクリレートとの共重合体などがある。上記
素材でなり水系で用いられる合成高分子系充填剤は、通
常、特公昭５８−４５６５８号に開示された方法、つま
り架橋性単量体および親水性単量体に重合開始剤を加え
て懸濁重合することによって調製される。このとき、耐
圧性を向上させるには架橋度をあげる必要があるが、架
橋部分が疎水性なので、架橋度をあげるとゲルの疎水性
が増し、タンパクの非特異的吸着が生じる。このため架
橋剤量が制限され、十分な耐圧性を得ることが難しい。

さらに上記方法で得られた充填剤は、重合体粒子内の全
体に親水性単量体が分散して存在するため、水性溶媒中
では膨潤・収縮しやすく、このような理由からも耐圧性
が不充分である。

耐圧性に優れ、比較的高速処理が可能で分離能に優れた
充填剤として、多孔性シリカゲルの表面に化学処理がな
されたシリカ系充填剤がある。しかし、このゲルは表面
の残存シラノール基の影響によりタンパクなどの塩基性
基を有する物質を吸着する特性を有する。さらにシリカ
ゲルは酸およびアルカリで溶解するため、溶離液のｐＨ
が３〜８に限定される。

ＩＥＣ用充填剤として最もよく用いられているゲルには
、スチレン−ジビニルベンゼンの架橋共重合体粒子の表
面にイオン交換基を導入したゲルおよびスチレン、ジビ
ニルベンゼンとイオン交換基を有する単量体との架橋共
重合体ゲルがある。これらのゲルにおいても、上記ＧＰ
Ｃ用ゲルと同様、架橋度が不充分であるという理由で、
ある″いは、イオン交換基が粒子内部に存在するため膨
潤・収縮しやすいという理由で、耐圧性に劣る。さらに
、シリカ系の充填剤に比較して分離性能が劣る。シリカ
系ＩＥＣ用充填剤は、シリカゲルの表面にイオン交換基
を化学結合させて得られる。この充填剤は、前記のよう
に、分離性能が良好であるが、骨格がシリカゲルである
ため上記ＧＰＣ用ゲルと同様の欠点を有する。

さらに、上記水系ＧＰＣおよびＩＥＣ用充填剤に使用さ
れ得、比較的耐圧性に優れた充填剤を得る方法として、
特開昭５９−１８７０５号、特開昭６２−６３８５６号
および特開昭６３−７９０６４号に、いわゆるシード重
合法が開示されている。これは、架橋重合体粒子に重合
開始剤および単量体を含浸させて、これをさらに懸濁重
合に供し、二層構造の粒子を得ようとする方法である。

この方法において、架橋重合体粒子に含浸させる単量体
として親水性単量体を用いれば、親水性の充填剤が得ら
れる。しかし、得られる粒子内部に親水性基が存在する
ため、上記と同様の理由により、水系溶媒中で膨潤・収
縮しやすく、従って耐圧性はなお不充分である。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は上記従来の欠点を解決するものであり、その目
的とするところは、タンパクなどの親水性物質の分離に
適したクロマトグラフィー用充填剤であって、耐圧性が
高く、膨潤・収縮が少なく、かつタンパクなどの非特異
吸着が少ない充填剤およびその製造法を提供することに
ある。本発明の他の目的は、上記優れた性質を有し、特
にＧＰＣおよびＩＥＣに好適な充填剤およびその製造法
を提供することにある。

（問題点を解決するための手段） 本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤は、疎水性架
橋重合体粒子の表面部分に親水性重合体の層が形成され
た被覆重合体粒子からなり、該親水性重合体の層の厚さ
が１０〜３００大であり、そのことにより上記目的が達
成される。

本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤の製造法は、
重合開始剤を含浸させた疎水性架橋重合体粒子を調製す
る工程；および該疎水性架橋重合体粒子を分散させた水
性分散液に親水性単量体を添加し、該疎水性架橋重合体
粒子の表面部分で該親水性単量体を重合させ、該疎水性
架橋重合体粒子の表面部分に親水性重合体の層が形成さ
れた被覆重合体粒子を得る工程を包含し、そのことによ
り上記目的が遠戚される。

本発明に使用される疎水性架橋重合体粒子の素材として
は、１種の疎水性架橋性単量体を単独重合して得られる
疎水性架橋重合体、２種以上の疎水性架橋性単量体を共
重合して得られる疎水性架橋重合体、または１種以上の
疎水性架橋性単量体と１種以上の疎水性非架橋性単量体
との共重合体が用いられる。

上記疎水性架橋性単量体としては、例えばエチレングリ
コールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコー
ルジ（メタ）アクリレート、プロビレングリコールジ（
メタ）アクリレート、ボリブロビレングリコールジ（メ
タ）アクリレートなどのジ（メタ）アクリル酸エステル
；テトラメチロールメタントリ　（メタ）アクリレート
、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレート
などの多価アルコールのポリ（メタ）アクリル酸エステ
ル；ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキ
シレン、ジビニルナフタレンなどの２個以上のビニル基
を有する芳香族系化合物などが用いられる。上記疎水性
非架橋性単量体としては、疎水性の性質を有する非架橋
性の重合性単量体であれば、いずれもが使用され得る。

例えばメチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）ア
クリレート、プロピル（メタ）アクリレート、イソプロ
ピル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレー
ト、ｔ−ブチル（メタ）アクリレートなどの（メタ）ア
クリル酸エステル：酢酸ビニル；およびスチレン、メチ
ルスチレンなどのスチレン系単量体が用いられる。上記
架橋性および非架橋性の単量体を混合して用いる場合に
は、架橋性単量体が全単量体１００重量部に対し１０重
量部以上、好ましくは２０重量部以上となるように使用
される。

本発明において、疎水性架橋重合体粒子を被覆する親水
性重合体に使用される親水性単量体は、水性分散媒中に
溶解可能な重合性単量体の中から、得られる充填剤の使
用目的に応じて選択される。

例えば陽イオン交換クロマトグラフィーに用いる充填剤
を調製する場合には、アクリル酸、メタクリル酸、また
は他のカルボキシル基を有する重合性単量体が用いられ
る。陰イオン交換クロマトグラフィーに用いる充填剤を
調製する場合には、ジメチルアミノエチル（メタ）アク
リレート、ジエチルアミノエチル（メタ）クリレート、
アリルアミン、メタクリレートハイドロオキシプロピル
トリメチルアンモニウムクロライド、メタクリレートジ
メチルアミノエチルトリメチルアンモニウムクロライド
などが用いられる。ＧＰＣに用いる充填剤を調製する場
合には、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、
グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレン
グリコールモノ　（メタ）アクリレートなどが用いられ
る。

上記親水性単量体は、必要に応じて二種以上が混合して
用いられ得る。親水性単量体の使用量は単１体の種類に
よって異なるが疎水性架橋重合体１００重量部に対して
５〜５０重量部の割合である。

本発明の方法により液体クロマトグラフィー用充填剤を
調製するには、まず、疎水性架橋重合体粒子が調製され
る。この疎水性架橋重合体粒子は既知の任意の水性懸濁
重合法により調製され得る。

例えば、上記疎水性架橋性単量体および必要に応じて疎
水性非架橋性単量体と重合開始剤とを希釈剤に溶解させ
る。単量体を希釈剤に溶解させると、得られる重合体粒
子中に希釈剤である有機溶媒が分散して存在するため、
重合終了後に有機溶媒を除去することにより、多孔性の
球状粒子が得られる。希釈剤として上記疎水性単量体混
合物と相溶性の異なる種々の有機溶媒を使用することに
より、多孔性重合体の細孔の大きさを任意に変化させる
ことが可能である。イオン交換クロマトグラフィー用充
填剤を調製する場合には、重合体粒子は多孔性である必
要はないので、必ずしも希釈剤を添加する必要はない。

この単量体の希釈液、または、単量体と重合開始剤とを
、ポリビニルアルコール、リン酸カルシウムなどの懸濁
安定剤を溶解させた水相に添加し、窒素置換後撹拌しな
がら４０〜１００°Ｃに加熱することにより懸濁重合を
行う。

ここで用いられる重合開始剤、および得られた疎水性架
橋重合体粒子（後述）に含浸させる重合開始剤は、ラジ
カルを発生する触媒であり、疎水性であれば特に限定さ
れない。例えばベンゾイルパーオキサイド、アセチルパ
ーオキサイド、クメンパーオキサイドなどの有機過酸化
物；アゾビスイソブチロニトリル、アゾビスイソブチロ
アミドなどのアゾ化合物など既知のラジカル発生触媒の
いずれもが使用され得る。

希釈剤としては、上記単量体を溶解させ、かつその重合
体を溶解しない有機溶媒のいずれもが使用可能である。

例えば、トルエン、キシレン、ジエチルベンゼン、ドデ
シルベンゼンなどの芳香族炭化水素類；ヘキサン、ヘプ
タン、オクタン、デカンなどの飽和炭化水素類；イソア
ミルアルコール、ヘキシルアルコール、オクチルアルコ
ールなどのアルコール類があげられる。その使用量は何
ら限定されないが上記単量体１００重量部に対して１５
〜２００重量部の割合であることが好ましい。

次に、得られた疎水性架橋重合体粒子に重合開始剤を含
浸させる。重合開始剤を含浸させるには、該重合開始剤
を、低沸点で、かつ疎水性架橋重合体と親和性の良い溶
媒に溶解させ、これに上記疎水性架橋重合体粒子を浸漬
する。このことにより重合開始剤が粒子中に浸透する。

これを必要に応じて重合開始剤の分解点以下の温度で加
熱して、溶媒を留去すれば重合開始剤を疎水性架橋重合
体粒子中に含有する粒子が得られる。この重合開始剤含
有粒子を上記親水性単量体が溶解する水性分散媒中に分
散させ、あるいは、該粒子が分散する水性媒体中に親水
性単量体を添加し、溶解させて、窒素置換後撹拌下に加
熱して重合を行なう。水性分散媒には疎水性架橋重合体
の分散性を安定させるため、カルボキシメチルセルロー
ス、ポリビニルアルコールなどの分散安定剤を添加して
もよい。

重合の温度および時間は、反応させる親水性単量体の種
類と、重合開始剤の種類によっても異なるが、４０〜１
００℃で０．５〜４０時間程度である。

上記重合開始剤を含浸させた架橋重合体粒子を親水性単
量体の重合反応に供する方法の他、疎水性架橋重合体粒
子の調製に引き続いて親水性単量体を反応させる連続法
によっても上記二層構造の重合体粒子が調製され得る。

この方法においては、まず、上記架橋重合体粒子を調製
するための重合反応を開始させる。重合がある程度進行
し、かつ未反応の重合開始剤が残存しているときに上記
親水性単量体を反応系に加える。このような状態におい
ては、系内の油相および生成した疎水性架橋重合体粒子
内部に重合開始剤が存在するため、引き続いて親水性単
量体の重合が起こり、しかも該疎水性架橋重合体粒子の
表面部分を被覆する形で親水性重合体の層が形成される
。

上記各方法で得られた重合体粒子を熱水、有機溶媒など
で十分洗浄し、粒子に含有されている、あるいは付着し
ている懸濁安定剤、溶媒、残存単量体などを除去する。

さらに必要に応じて粒子を分級して、クロマトグラフィ
ー用の充填剤が得られる。

ただし、本発明の充填剤は上記の製造方法によって得ら
れるものに限定されるものではない。

本発明の充填剤は、疎水性架橋重合体を骨格とし、親水
性重合体で該疎水性架橋重合体の表面部分が被覆された
２層構造の重合体粒子である。そして、親水性重合体か
らなる被覆層の平均的な厚さは、１０〜３０ＯＡである
。被覆層の厚さは、後述の実施例中に記載の「被覆層の
平均厚さの測定方法」に従って測定される。平均厚さが
１０λより小さい場合は被覆が不完全であり、疎水性架
橋重合体粒子の表面が露出している部分が生じやすい。

このような露出部分があると、被分離物質（例えば、タ
ンパク）が充填剤に非特異的に吸着する可能性がある。

平均厚さが３００Åを越える場合は、被覆層自身の膨潤
・収縮が無視できなくなり、分析中に、充填剤の分離能
が低下したり、圧力が上昇したりする。さらに、溶離液
との平衡化に時間がかかるようになるために分析時間が
長くなるか、あるいは、分離能が低下する。

本発明の充填剤は、骨格部分に架橋度の高い重合体を用
いているので、機械的強度が極めて大きく耐圧性に優れ
た液体クロマトグラフィー用充填剤を得ることができる
。さらに、この充填剤の骨格部分には親水性の基が存在
しないため、膨潤および収縮の度合が極めて低い。表面
は親水性の重合体で被覆されるためタンパクなどの非特
異的吸着がない。適当な親水性単量体を選択することに
より、粒子表面の親水性の度合、イオン交換能などが調
節できるので、分析あるいは分離を目的とする親水性物
質の種類に応じた所望のＩＥＣあるいはＧＰＣ用の充填
剤が得られう、る。この充填剤は広いｐＨ範囲において
使用することが可能である。さらに、上記のように耐圧
性が大きく、膨潤・収縮の度合が極めて低いため、粒径
の微小化が図れ、その結果、高精度での分離が可能とな
る。高圧条件下での使用が可能なため、迅速分析がなさ
れ得る。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

以下の実施例および比較例において得られた充填剤の物
性測定および性能評価の方法は次の通りである。

「被覆層の平均厚さの測定方法」 充填剤に用いる被覆重合体粒子をエポキシ樹脂に包埋し
た後、Ｒｅｉｃｈａｒｔ−Ｊｕｎｇ社製ミクロトームＵ
ＬＴＲＡＣＵＴＥを用いて厚さ約９００Ａの切片を得る
。この切片を、カチオン交換型充填剤は硝酸銀溶液（容
量分析用、和光純薬工業■製）を用いて、アニオン交換
型充填剤またはＧＰＣ用充填剤ではオスミウム酸溶液（
１１子顕微鏡用、和光純薬工業■製）を用いて、ラベル
または染色し、日本電子■型透過型電子顕微鏡ＪＥＭ１
００Ｓにて観察および写真撮影を行い、親水性基の分布
状態および親水性重合体からなる被覆層の平均厚さを測
定した。

「充填剤の評価方法」 ＩＥＣ用充填剤については、これを内径６ｍｍおよび長
さ７５ｍｍのステンレス製カラムに充填し、耐圧性およ
び水に対する膨潤性を調べた。耐圧性はカラムに精製水
を流し、流速を変えて流速と圧力損失との関係より測定
した。膨潤性は、イオン強度の異なる液を流した時のカ
ラム圧の変化より求めた。

京都電子工業■製電位差自動滴定装置ＡＴ−３１０によ
り充填剤表面のイオン交換基を定量した。さらに、積木
化学工業■製液体クロマトグラフシステム５ＳＬＣ−２
０を用いてタンパクの分離を行った。

陽イオン交換クロマトグラフィー用充填剤では、さらに
、■京都筒−科学製１１１−ＡＵＴＯＡｔ。でヒト血液
の分析を行い分離能などを従来品と比較した。

測定方法は次の通りである。ヒト血液検体として、同一
人（健常人）の血液を採取後直ちにヘパリンを添加した
ものを用いた。血液検体は、本装置付属の専用溶血液２
１Ｌ＜ノニオン系界面活性剤を含むリン酸緩衝液）によ
って、　自動的に２９０倍に希釈・溶血される。溶離液
は本装置付属の専用試薬であるＡ液（ｐＨ５，９のリン
酸緩衝液）、　Ｂ液（ｐＨ７，２のリン酸緩衝液）およ
びＣ液（ｐＨ５，９のリン酸緩衝液）を使用した。

ＧＰＣ用充填剤については、これを内径７．５ｍｍおよ
び長さ５００ＩＩｍのステンレス製カラムに充填し、Ｉ
ＥＣ用充填剤と同様にして、耐圧性を評価した。膨潤性
については、乾燥状態と精製水に浸漬した状態の粒径の
違いを、遠心沈降式粒度分布測定装置５Ａ−ＣＦ２　（
■島津製作所製）で測定することにより評価した。

さらに、分子量既知の標準サンプルを用いて較正曲線を
作成し排除限界分子量（以下Ｍ　Ｌｉｒａと略す）を求
めた。ＧＰＣにおける較正曲線とは被分離物質の分子量
とクロマトグラムにおける溶出容量との関係を表わす曲
線であり、第１図に示すように縦軸に被分離物質（ポリ
マーまたはオリゴマー）の分子量（Ｍ）の対数を、横軸
に溶出容量（Ｖｅ）を目盛ったグラフ上にプロットして
得られる曲線である。第１図で傾斜した直線の延長と縦
軸に平行な線の延長が交わる点の縦軸の値が、排除限界
分子ＪＩＭＬｉｍである。較正曲線作成時の分析条件を
以下に示す。

相尤縄楽工果■製 本°リエチレンク゛す〕−ル　　０．５％水溶液溶離液
　　　精製水 流速　　　　ｉ、ｏ鰍／分 検出器　　　昭和電工■製　示差屈折計５Ｅ−５１各実
施例のＧＰＣ用充填剤についてＭ　Ｌｉｍを求めた。さ
らに、５０ｎ＋Ｍリン酸緩衝液を溶離液として各種タン
パクのＧＰＣ分析を行い、較正曲線を描いた。

寛凰姓よ 疎水性架橋重合体粒子として積木化学工業■製ポリスチ
レン系ゲルＨＳＧ−５０２００ｇを用い、これをベンゾ
イルパーオキサイド（重合開始剤）０．５ｇが溶解して
いるアセトン１込に浸漬して該重合開始剤を含浸させた
。次に、アセトンを２０℃において減圧下で留去した。

１％ポリビニルアルコール水溶液２．５込に上記の含浸
処理した疎水性架橋重合体を懸濁させ、撹拌しなからオ
クタエチレングリコールモノメタクリレート（親水性単
量体）ＳＯｇを添加し、窒素置換後８０°Ｃで２時間重
合反応を行った。生成物を熱水およびアセトンで順次洗
浄し、乾燥した。得られた微小のポリマー粒子を日清エ
ンジニアリング■製空気分級機ターボクラシファイアＴ
Ｃ−１５Ｎにより分級して粒径が８〜１０μｍの粒子を
集め、ＧＰＣ用充填剤を得た。これを内径７．５０およ
び長さ５００ｍｍのステンレス製カラムに充填した。

充填は精製水１２０胤に充填剤２０ｇを取り１０分間撹
拌した後、　２．Ｏｍａ／分で定流量充填することによ
り行った。

上記の方法により耐圧性および膨潤性の評価を行った。

耐圧性評価においては、１２０ｋｇ／ａｍ２まで圧力損
失が流速と比例した。膨潤性試験を行ったところ、乾燥
状態と精製水に浸漬した状態での粒径の違いはなく、水
系溶媒中で膨潤しないことがわかった。

充填剤を上記の方法によりオスミウム酸で染色して、被
覆層の平均厚さを測定したところ、約５０λであった。

さらに上記の評価方法に従って、較正曲線を作成した。

得られた較正曲線を第２図に示す。Ｍ　Ｌｆｍは５．０
ＸＩ０５であった。ここで、第２図および後述の第４ｒ
ＸＪ、第５図、第７図の較正曲線におけるプロット１〜
６はデキストランサンプルを用いて得られた結果であり
、デキストランの分子量は、それぞれ１が２０００００
０．２が５００ＱＯＯ１３が１０００００．４が７００
００．５が４００００．モして６が１００００である。

プロット７〜１０はポリエチレングリコールサンプルを
用いて得られた結果であり、分子量はそれぞれ、７が１
００００．８が６０００．　９が２０００゜モして１０
が６００である。

種々のタンパク（Ｓｉｇ＋ａａ社製）の分析を行った結
果、得られた較正曲線を第３図に示す。ここで、第３図
および後述の第６図、第８図におけるプロット１１〜２
０はそれぞれ、１１はチログロブリン（分子量６６００
００、以下括弧内は分子量を示す）、１２はγ−グロブ
リン（１５６０００）　、１３は牛血清アルブミン（６
７０００）、１４はオブアルブミン（４３０００）、１
５はベルオキシダーゼク４０２００）、１６はβ−ラク
トグロブリン（３５０００）、１７はミオグロビン（１
６９００）、１８はリボヌクレアーゼＡ　（１３７００
）、１９はチトクロームＣ（１２４００）、２０はグリ
シン４量体（２４６）を用いて得られた結果である。

里狡園工 疎水性非架橋性単量体であるスチレン１００ｇ、疎水性
架橋性単量体であるジビニルベンゼン２００ｇ。

親水性単量体であるオクタエチレングリコールモノメタ
クリレート１００ｇおよび重合開始剤であるベンゾイル
パーオキサイド１ｇをトルエン２７０　ｇに溶解し、４
％ポリビニルアルコール水溶液２．５ＪＺに添加して、
撹拌しながら調粒した後、窒素雰囲気下で８０°Ｃに加
熱し懸濁重合した。８０℃で８時間重合した後、生成物
を実施例１と同様な操作により分級、充填し評価した。

耐圧性については６０ｋｇ／ｃｍ２まで圧力損失が流速
と比例した。膨潤性試験を行ったところ、平均粒径が９
．２μｌから１２．５μｌに変化し、充填剤の膨潤の度
合が高いことがわかった。オスミウム酸染色後上記の方
法により充填剤粒子の被覆層の厚さを測定しようとした
ところ、充填剤粒子の内部にも水酸基が一様に分布して
いた。

較正曲線を描いてＭ　Ｌｉｍを求めようとしたところ、
ポリエチレングリコールは分子量が大きいほど溶離液へ
の溶解性が低くなり、充填剤の疎水性相互作用により、
分子量の大きいものが後に溶出される結果となった。得
られた較正曲線を第４図に示す。

及狂皿主 親水性単量体として２−ヒドロキシエチルメタクリレー
トを用いたこと以外は実施例１と同様にしてＧＰＣ用充
填剤の調製を行い、これを評価した。

耐圧性については１２０ｋｇ／ａｍ２まで圧力損失と流
速とが比例した。膨潤性試験を行ったところ乾燥状態と
精製水に浸漬した状態での粒径の違いはなかった。被覆
層の厚さは、約１００　Ａであった。ＭＬｉｍは、　１
．０Ｘ１０６であった。得られた較正曲線を第５図に、
そしてタンパクの分析結果を第６図に示す。

尖１駆−工 疎水性架橋性単量体であるジエチレングリコールジメタ
クリレートｔｓｏ　ｇおよびテトラメチロールメタンテ
トラアクリレートｌ５０ｇと重合開始剤であるベンゾイ
ルパーオキサイド１ｇとを希釈剤であるトルエン２００
ｇに溶解させた。これを４％ポリビニルアルコール水溶
液２．５Ｉ２．に添加して、撹拌しながら調粒した後、
窒素置換下で８０°Ｃに加熱し懸濁重合を行った。８０
　’Ｃで８時間重合した後、生成物を熱水およびアセト
ンで順次洗浄し、乾燥して微小の疎水性架橋重合体粒子
を得た。この疎水性架橋重合体粒子２００ｇを用い、親
水性単量体としてオクタエチレングリコールモノメタク
リレートを用いて、実施例１に準じて充填剤を調製し、
その評価を行った。

耐圧性については１００ｋｇ　／　ａｍ２まで圧力損失
と流速とが比例した。膨潤性試験を行ったところ、乾燥
状態と精製水に浸漬した状態での粒径の違いはなかった
。被覆層の厚さは約１００大であった。ＭＬｉｍは７．
０Ｘ１０５であった。得られた較正曲線を第７図に、そ
してタンパクの分析結果を第８図に示す。

奥Ｊｌｌ工 疎水性架橋性単量体であるジエチレングリコールジメタ
クリレート１５０ｇおよびテトラメチロールメタンテト
ラアクリレート１５０　ｇ、　そして親水性単量体であ
るオクタエチレングリコールモノメタクリレート７５ｇ
を用いたこと以外は比較例１と同様にして微小のポリマ
ー粒子を得た。得られたポリマー粒子を実施例１と同様
に分級し、充填しようとしたところ、ゲルが軟質のため
充填液が流れず、充填ができなかった。充填剤粒子の被
覆層の厚さを測定しようとしたところ、充填剤粒子の内
部に一様に水酸基が観察された。

支血園土 疎水性架橋性単量体としてジエチレングリコールジメタ
クリレート３００ｇを用い、実施例３に準じて疎水性架
橋重合体を調製した。親水性単量体として陰イオン交換
能を有するジエチルアミノエチルメタクリレート５０ｇ
を用い、実施例１と同様の操作でＩＥＣ用充填剤を調製
した。前記ＩＥＣ用充填剤の評価方法に従い、充填剤の
評価を行った。

その結果、耐圧性については１５０ｋｇ／ｃ＋ｍ２まで
圧力損失と流速とが比例した。膨潤性試験を行ったとこ
ろ、溶離液を精製水から０，５ＭのＮａＣ１溶液ζこ変
えた場合、カラム圧力の上昇は認められなかった。

滴定により充填剤表面のイオン交換能を測定したところ
、０．０５ｍｅｑ／ｇであった。充填剤粒子の被覆層の
厚さは、約５０Ａであった。さらに積木化学工業■製液
体クロマトグラフシステム５ＳＬＣ−２０を用い、数種
のタンパク（Ｓｉｇｍａ社製）の混合物の分析を行った
。溶離は、２０ｍＭピペラジン−塩酸緩衝液（ｐＨ６，
０、以下Ａ液と表す）；およびＡ液と０．５ＭＮａＣ１
（ｐＨ６，０）との等量混合物（以下Ｂ液と表す）を用
い、Ａ液１００％からＢ液１００％へのリニアグラジェ
ント法により行った。その結果得られたクロマトグラム
を第９図に示す。第９図において、ピーク２１はコナル
ブミン、２２はトランスフェリン、そして２３はオブア
ルブミンに起因するピークである。

実１０ｔｉ 疎水性重合性単量体として疎水性非架橋性単量体である
スチレン１００ｇと疎水性架橋性単量体であるジビニル
ベンゼン２００ｇを用い、実施例３に準じて疎水性架橋
重合体を調製した。さらに親水性単量体として陽イオン
交換能を有するアクリル酸５０ｇを用い、実施例１と同
様に操作してＩＥＣ用充填剤を得、その評価を行った。

その結果、耐圧性については１５０ｋｇ／　ａｍ２まで
圧力損失と流速とが比例した。膨潤性試験を行ったとこ
ろ、溶離液を４０ｍＭのリン酸緩衝液から２００ｍＭの
リン酸緩衝液に変えた場合、カラム圧力の上昇は認めら
れなかった。滴定により充填剤表面のイオン交換能を定
量したところ０．０８ｍｅｑ／ｇであった。

充填剤を硝酸銀溶液で処理して上記の方法にしたがって
被覆層の厚さを測定したところ、約８ＯＡであった。さ
らに積木化学工業■製液体クロマトグラフシステム５Ｓ
ＬＣ−２０を用い、数種のタンパク（Ｓｉｇｍａ社製）
の混合物の分析を行った。溶離は、５０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０，以下Ａ液と表す）；およびＡ液とＳＯ
ｈＭ　ＮａＣ１（ｐＨ７，０）との等Ｊｌ−混合物（以
下Ｂ液と表す）を用い、Ａｌｌｏｏ％からＢ液１００％
へのリニアグラジェント法により行った。その結果得ら
れたクロマトグラムを第１０図に示す。

第１０図および後述の第１２図、第１４図、第１６図に
おいて、ピーク２４はミオグロビン（ウマ骨格由来）、
２５はα−キモトリプシノーゲン（ウシ膵臓由来）、２
６はリボヌクレアーゼＡ（ウシ膵臓由来）、モして２７
はリゾチームにワトリ卵白由来）に起因するピークであ
る。さらに■京都第−科学製Ｈｉ−ＡＵＴＯＡｌｃでヒ
ト血液の分析を行った。その結果得られたクロマトグラ
ムを第１１図に示す。第１１図および後述の第１３図、
第１５図において、２８はＨｂＡ　ｔｍおよびＡｌｂｓ
　　２９は胎児性Ｈｂ　（Ｆ）、３０は不安定型ＨｂＡ
ｔ。、３１は安定型ＨｂＡ　１゜、　そして３２はＨｂ
Ａｓに起因するピークである。

犬遊μを止 疎水性架橋性単量体としてジエチレングリコールジメタ
クリレート３００　ｇ、　　そして希釈剤としてトルエ
ンに代えてイソアミルアルコール２００　ｇを用い、実
施例３に準じて疎水性架橋重合体粒子を調製した。さら
に、親水性単量体として陽イオン交換能を有するメタク
リル酸５０ｇを用い、実施例１と同様の操作法によりＩ
ＥＣ用充填剤を調製した。

実施例５と同様の評価を行った結果、耐圧性については
１５０ｋｇ／ａｍ２まで圧力損失と流速とが比例した。

膨潤性試験を行ったところ、溶離液を４０ｍＭのリン酸
緩衝液から２０ｈＭのリン酸緩衝液に変えた場合、カラ
ム圧力の上昇は認められなかった。

滴定により測定した充填剤表面のイオン交換能は、０．
０５＋ｍｅＱ／ｇであった。充填剤粒子を硝酸銀溶液で
処理して測定された被覆層の厚さは、約１００入であっ
た。さらに積木化学工業■製液体クロマトグラフ５ＳＬ
Ｃ−２０を用いてタンパクの分離を行った。その結果得
られたクロマトグラムを第１２図に示す。さらに■京都
第−科学製Ｈｉ−ＡＵＴＯＡ＋。でヒト血液の分析を行
った。その結果得られたクロマトグラムを第１３図に示
す。

叉凰凱工 この実施例では、疎水性架橋重合体粒子の調製に続いて
親水性単量体を反応させる連続した重合法を採用した。

疎水性非架橋性単量体としてスチレンｉｏｏｇ、疎水性
架橋性単量体としてジビニルベンゼン２００ｇおよびベ
ンゾイルパーオキサイド１ｇをトルエン２００ｇに溶解
し、４％ポリビニルアルコール水溶液２．５見に添加し
て、撹拌しながら調粒した後、窒素置換下で８０℃に加
熱し懸濁重合を行った。８０°Ｃで２時間重合した後、
アクリル酸５０ｇを添加し、さらにｇ　ｏ　’ｃで２時
間重合し生成物を熱水およびアセトンで順次洗浄し、乾
燥し、分級した。得られた微小のポリマー粒子を実施例
５と同様の方法で評価した。

耐圧性については１５０ｋｇ／ｃｍ２まで圧力損失と流
速とが比例した。膨潤性試験を行ったところ、溶離液を
４０ｍＭのリン酸緩衝液から２００ｍＭのリン酸緩衝液
に変えた場合、カラム圧力の上昇は認められなかった。

滴定により充填剤表面のイオン交換能を測定したところ
、０．０７ｓｅｑ／ｇであった。被覆層の厚さは、約８
０入であった。積木化学工業■製液体クロマトグラフ５
ＳＬＣ−２０を用いてタンパクの分離を行った。その結
果得られたクロマトグラムは第１０図と同様であった。

さらに、■京都第−科学製Ｈｉ−ＡＵＴＯＡ１゜でヒト
血液の分析を行った。その結果得られたクロマトグラム
は第１１図と同様であった。

友嵯皿主 親水性単量体としてアクリル酸１５０ｇを用いたこと以
外は比較例１と同様の操作でＩＥＣ用充填剤を調製した
。

実施例５と同様の評価を行った結果、耐圧性については
８０ｋｇ／ｃｍ２まで圧力損失と流速とが比例した。膨
潤性試験を行ったところ、溶離液を４０ｍＭのリン酸緩
衝液から２００　ｍＭのリン酸緩衝液に変えた場合、カ
ラム圧力が２０　ｋｇ　／　ａｎ２上昇した。このよう
に実施例５の充填剤に比較して耐圧性および耐膨潤性が
劣ることが明らかである。硝酸銀溶液で処理して充填剤
粒子の被覆層の厚さを測定しようとしたところ、充填剤
粒子の内部にもカルボキシル基が存在していることがわ
かった。漬水化学工業■製液体クロマトグラフ５ＳＬＣ
−２０を用いてタンパクの分離を行った。その結果得ら
れたクロマトグラムを第１４図に示す。さらに、■京都
第−科学製Ｈｉ−ＡＵＴＯＡ＋。でヒト血液の分析を行
った。その結果得られたクロマトグラムを第１５図に示
す。第１４図および第１５図の結果を、第１０図および
第１１図と比較すると、明らかに充填剤のタンパクおよ
び糖化ヘモグロビンに対する保持力が弱く、分離能が劣
っていることが明らかである。

塩蝮園工 疎水性重合性単量体として疎水性非架橋性単量体である
スチレン１００ｇと疎水性架橋性単量体であるジビニル
ベンゼン２００ｇを用い、実施例３に準じて疎水性架橋
重合体を調製した。さらに親水性単量体として陽イオン
交換能を有するアクリル酸３００ｇを用い、実施例１と
同様に重合したところ、反応中に凝集が起こり、軟質の
微小ポリマー粒子が得られた。このポリマー粒子を実施
例１と同様に分級し、充填しようとしたところ、粒子が
軟質なため充填液が流れず充填することができなかった
。

硝酸銀溶液で処理後充填剤粒子の被覆層の厚さは、約４
００Åあった。

え灸園工 疎水性重合性単量体として疎水性非架橋性単量体である
スチレンｉｏｏ　ｇと疎水性架橋性単量体であるジビニ
ルベンゼン２００ｇを用い、実施例３に準じて疎水性架
橋重合体を調製した。さらに親水性単量体として陽イオ
ン交換能を有するアクリル酸１゜ｇを用い、実施例１と
同様に操作してＩＥＣ用充填剤を得、その評価を行った
。

その結果、耐圧性については１５０ｋｇ　／　ａｍ２ま
で圧力損失と流速とが比例した。膨潤性試験を行ったと
ころ、溶離液を４０ｍＭのリン酸緩衝液から２００ｍＭ
のリン酸緩衝液に変えた場合、カラム圧力の上昇は認め
られなかった。滴定により充填剤表面のイオン交換能を
定量したところ０．　Ｏ０５ｍｅｑ／ｇであった。

充填剤を硝酸銀溶液で処理して上記の方法にしたがって
被覆層の厚さを測定したところ、約８Ａであり、表面の
１部に被覆されていない箇所が観察された。

さらに漬水化学工業■製液体クロマトグラフ５ＳＬＣ−
２０を用い、数種のタンパク（Ｓｉｇｍａ社製）の混合
物の分析を行った。その結果得られたクロマトグラムを
第１６図に示す。溶出の順序が第１Ｏ図と異なるのは、
非被覆層部分とタンパクとの間に疎水性相互作用が生じ
るためと考えられる。

（発明の効果） 本発明によれば、このように、耐圧性に優れ、かつ膨潤
・収縮が少なく、タンパクの非特異的吸着がない水系の
液体クロマトグラフィー用充填剤が得られる。このよう
な充填剤は、ＧＰＣ用あるいはＩＥＣ用の充填剤として
各種親水性物質の単離もしくは分析に広範囲で利用され
得る。

４、　　　の、　な！Ｈ 第１図はゲル浸透クロマトグラフィーにおいて被分離物
質の分子量と溶離液の溶出容量との関係を表す較正曲線
である。

第２図、第４図、第５図および第７図はそれぞれ実施例
１、比較例１、実施例２および実施例３で得られた充填
剤をカラムに充填し、ＧＰＣ分析を行ったときの較正曲
線を示す。

第３図、第６図および第８図はそれぞれ実施例１．２お
よび３で得られた充填剤をカラムに充填し、タンパクの
分離を行ったときの較正曲線を示す。

第９図は実施例４で得られた充填剤を充填したカラムを
用いてタンパクの分離を行ったときに得られたクロマト
グラムを示す。

第１０図、第１２図、第１４図および第１６図、は、そ
れぞれ実施例５、実施例６、比較例３および比較例５で
得られた充填剤を充填したカラムを用いてタンパクの分
析を行った時に得られたクロマトグラムを示す。

第１１図、第１３図および第１５図は、それぞれ実施例
５、実施例６および比較例３で得られた充填剤を充填し
たカラムを用いて血液の分析を行った時に得られたクロ
マトグラムを示す。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、疎水性架橋重合体粒子の表面部分に親水性重合体の
   層が形成された被覆重合体粒子からなり、該親水性重合
   体の層の厚さが１０〜３００Åである、液体クロマトグ
   ラフィー用充填剤。 ２、液体クロマトグラフィー用充填剤の製造法であって
   、 重合開始剤を含浸させた疎水性架橋重合体粒子を調製す
   る工程；および 該疎水性架橋重合体粒子を分散させた水性分散液に親水
   性単量体を添加し、該疎水性架橋重合体粒子の表面部分
   で該親水性単量体を重合させ、該疎水性架橋重合体粒子
   の表面部分に親水性重合体の層が形成された被覆重合体
   粒子を得る工程；を包含する液体クロマトグラフィー用
   充填剤の製造法。