JP3645317B2

JP3645317B2 - リポ蛋白質分離用樹脂

Info

Publication number: JP3645317B2
Application number: JP18326895A
Authority: JP
Inventors: 憲細矢; 淳萩中; 優山口
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1995-06-28
Filing date: 1995-06-28
Publication date: 2005-05-11
Anticipated expiration: 2020-05-11
Also published as: JPH0912629A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、リポ蛋白質分離用樹脂に関するものである。詳しくは、本発明は高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ）、低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）、超低比重リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）及び変性リポ蛋白質を高精度で分離するのに有用な樹脂に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
血漿や血清中にはコレステロール、リン脂質、中性脂肪（トリグリセリド）が含まれているが、これらの脂質の内、コレステロールの定量は動脈硬化、肝疾患、糖尿病あるいは一時的な脂質代謝障害のスクリーニング検査として利用されており、また、中性脂肪の定量はコレステロールと共に脂質代謝異常の鑑別に不可欠な検査となって来ている。
リポ蛋白質の分画には超遠心法が広く用いられているが、この方法では処理に長時間を要するばかりでなく、リポ蛋白質の性状がヒトとは異なるラットやマウスのような動物種においては、その正確な分画が困難である。また、高速液体クロマトグラフィーにより分離する方法では、例えばJournal of Chromatography,570,382-389(1991)に記載されているように、これまで一般的に分子サイズにより分画を行うゲルろ過法が用いられてきたが、精密な分離を行うには、長時間を要し、その場合でも各リポ蛋白質分画の間に混合が生じ、完全な分離は達成出来ないという問題があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上述のごとき問題点を有しないリポ蛋白質分離用樹脂を提供することを目的とし、特にリポ蛋白質、高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ）、低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）、超低比重リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）及び変性リポ蛋白質を短時間で高精度に分離する樹脂を提供することを目的とするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、有機重合体粒子からなる種粒子に、シード重合法により親水基を有するビニル単量体を含浸させて重合することにより得られる、多孔質構造を有し、細孔表面を含めた粒子表面が親水化されている多孔性均一粒径重合体粒子で、しかもイオン交換基を有している粒子が、高精度でリポ蛋白質を分離し得る事を見いだし本発明を達成した。
すなわち、本発明の要旨は、水不溶性、親水性のマトリックスに陰イオン交換基が導入された陰イオン交換体からなり、該マトリックスが、平均細孔半径１０〜２０００オングストローム、細孔容積０．２〜１．８ｍｌ／ｇ、細孔表面積１〜１０００ｍ ^２／ｇの水不溶性、親水性多孔性重合体粒子であることよりなり、且つ該イオン交換体の陰イオン交換容量が乾燥樹脂１ｇ当たり０．１〜１．５ミリ当量であることよりなるリポ蛋白質分離用樹脂に存する。かかる水不溶性、親水性のマトリックスはモノビニル単量体から誘導される単位を重量分率で０〜８０％、架橋性ポリビニル単量体から誘導される単位を重量分率で２０〜１００％含有し、モノビニル単量体単位または架橋性ポリビニル単量体単位の少なくとも一方は親水性基を有しているものから構成される多孔性架橋重合体であり、また、陰イオン交換体の陰イオン交換容量は乾燥樹脂重量１ｇあたり０．１〜１．５ミリ当量である。
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のリポ蛋白質分離用樹脂は、粒子分布の狭い（粒子径単分散の）種粒子を用い、これに更に親水性基を有するビニル単量体を含浸させて重合する、所謂シード重合法を利用して製造することにより容易に得られる。また、シード重合時に多孔質化剤を存在させることにより、更に優れた性能を有する分離用樹脂が製造出来る。
本発明のシード重合において、種粒子として用いられる有機重合体粒子は、乳化重合、ソープフリー乳化重合、分散重合、懸濁重合等の一般に良く知られた造球重合により製造出来る。中でも、乳化重合、ソープフリー乳化重合、分散重合で得られる重合体粒子は、懸濁重合により製造されたものに比較して、その粒子径分布が狭く種粒子として好ましい。
【０００６】
種粒子としての重合体粒子は、芳香族モノビニル単量体及び／又は脂肪族モノビニル単量体からなる重合体が好適である。これらは、単独重合体もしくは２種以上の単量体の共重合体の何れでも良く、１重量％以下の架橋性ポリビニル単量体との共重合体であっても良い。代表的には、ポリスチレンもしくはポリメタクリル酸エステルからなる粒子が好ましい。粒子の大きさは、０．１〜１０００μｍの範囲で、目的に応じ任意に選ぶ事が出来る。
【０００７】
本発明において、前述の如く製造された有機重合体粒子からなる種粒子にモノビニル単量体０〜８０重量％を含む架橋性ポリビニル単量体を含浸させる。モノビニル単量体及び架橋性ポリビニル単量体の少なくとも１種は親水性基、例えば水酸基を有しているものである。
該架橋性ポリビニル単量体としては、芳香族ポリビニル単量体、脂肪族ポリビニル単量体が好適であり、芳香族ポリビニル単量体としてはジビニルベンゼン、ビスビフェニルアルカンが、脂肪族ポリビニル単量体としては多価アルコールのポリ（メタ）アクリレートやアルキレンポリ（メタ）アクリルアミドが好ましい。具体的には、例えばエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、グリセリンジ（メタ）アクリレート、アリル（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラヒドロキシブタンジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、メチレンビスアクリルアミド、ピペラジンジアクリルアミド、ジアリル酒石酸ジアミド等が挙げられ、これらは単独でも混合物としても用いられるが、特にグリセリンジ（メタ）アクリレートが好ましい。
【０００８】
架橋性ポリビニル単量体以外のビニル単量体として、モノビニル単量体が使用される。該モノビニル単量体としては、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート等の水酸基を１個以上有する（メタ）アクリル酸の多価アルコールエステル、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド等のＮ−置換（メタ）アクリルアミド、アクリルアミド、メタアクリルアミド、グリシジル（メタ）アクリレートあるいはこれらの混合物等が挙げられる。特にシード重合時に使用する多孔質化剤としての有機溶媒よりも水性媒体の方に分配しやすい親水性ビニル単量体が好適であり、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート或いはこれらの混合物が好ましい。
【０００９】
これらのモノビニル単量体及びポリビニル単量体の種類及び量は、使用する種粒子の大きさと目的とする粒子の大きさを考慮して適宜決定される。
種粒子に含浸させるビニル単量体中の架橋性ポリビニル単量体の量は２０〜１００重量％であり、好ましくは３０〜１００重量％である。
更に、本発明では多孔性架橋重合体粒子の特性を良好にするために、シード重合を多孔質化剤の存在下実施することが望ましい。そのための多孔質化剤、即ち種粒子に含浸させる多孔質化溶媒としては、シード重合時に相分離剤として作用し、粒子の多孔質化を促進する有機溶媒である脂肪族、芳香族炭化水素類、エステル類、ケトン類、エーテル、アルコール類が挙げられる。このような溶媒としては、例えば、トルエン、キシレン、シクロヘキサン、オクタン、酢酸ブチル、フタル酸ジブチル、メチルエチルケトン、ジブチルエーテル、１−ヘキサノール、２−オクタノール、デカノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール等が挙げられ、これらは単独もしくは混合して使用することが出来る。また、場合によっては多孔質化溶媒の種類の選定、例えば芳香族炭化水素類であるか或いはアルコール類であるかによっても架橋共重合体粒子に所望の特性を付与することもできる。
【００１０】
シード重合時のラジカル重合開始剤は、過酸化ベンゾイル、ブチルパーオキシヘキサノエート等の過酸化物系開始剤、アゾビスイソブチロニトリル、アゾビスイソバレロニトリル等のアゾ系開始剤が好ましい。これら重合開始剤は、ビニル単量体或いは多孔質化溶媒に溶解し、ビニル単量体の含浸と同時にまたはその前後に種粒子に含浸させる。
また、これらビニル単量体、多孔質化溶媒、ラジカル重合開始剤等を種粒子に含浸させる際に、場合により種粒子に対して親和性が高い溶媒で希釈し、含浸させる事も出来る。このような溶媒としては、アルコール、アセトン等の水混和性溶媒やジクロロエタン、塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素等が挙げられる。これら含浸を促進する溶媒は、シード重合開始のために、重合温度に昇温される前に減圧留去する事が好ましい。
【００１１】
本発明では、このようにビニル単量体、多孔質化溶媒、重合開始剤を含浸させ、種粒子を肥大化した後、水性媒体中に懸濁して重合を行う。該水性媒体中には、シード重合中に凝集、変形、融着する事を防止し、その分散安定性を増すために、分散安定剤を含有させることが好ましい。該分散安定剤としては、公知のアニオン系、ノニオン系の界面活性剤及びポリビニルピロリドン、ポリエチレンイミン、ビニルアルコール／酢酸エチル共重合体等が好ましい。
シード重合は、重合温度に昇温される事によって開始される。この重合温度は使用する重合開始剤の種類にもよるが、５０℃〜８０℃が好ましい。また、シード重合の重合時間は、重合開始剤の半減期前後、又はそれ以上が好ましく、例えば、３時間〜４８時間が好ましい。
【００１２】
本発明において、シード重合はそれ自体公知の一般的な方法によって実施できる。乳化重合法またはソープフリー乳化重合法で製造された０．１〜１．５μｍの重合体を種粒子とする場合には、まずフタル酸ジメチル等の膨潤助剤による一次膨潤の後、シード重合することにより、１００μｍ程度までの粒子径が均一な多孔質粒子が製造出来る方法（J.Ugelstad et.al.Makromoleculare Chemie,80,737(1979))が好適に用いられる。
また、分散重合により製造された１〜１０μｍの重合体粒子を種粒子としてシード重合する方法（例えば特開昭６４−２６６１７号公報）も好適に使用出来る。
更に、本発明においては、シード重合完結後、種粒子として用いた有機重合体粒子の良溶媒を用いて、生成架橋重合体粒子を洗浄する事により、種粒子由来の重合体の一部または全部を除去する事によっても、所望の多孔度の樹脂を得ることが出来る。
【００１３】
本発明で得られる多孔性架橋重合体粒子のＢＥＴ法で測定した乾燥状態での好ましい細孔物性としては、平均細孔半径として１０〜２０００オングストローム、好ましくは７５〜１５００オングストロームであり、細孔容積として０．２〜１．８ｍｌ／ｇ，好ましくは０．４〜１．２ｍｌ／ｇであり、細孔表面積として１〜１０００ｍ²／ｇ，好ましくは５〜５００ｍ²／ｇである。
【００１４】
このようにして得られた多孔性重合体粒子に陰イオン交換基を導入し、リポ蛋白質分離用樹脂とする。導入される陰イオン交換基としては、ジメチルアミノエチル基、ジエチルアミノエチル基をはじめとする各種アミノ基、各種４級アンモニウム基等が挙げられる。
多孔性重合体粒子に陰イオン交換基を導入する方法は、公知の方法に従って行われる。例えばマトリックスを構成するビニル単量体がエポキシ基を有する場合には、エポキシ基を水、グリセリン、又はエチレングリコール等により開環変性し、生成した水酸基に陰イオン交換基を導入する方法、或いは該エポキシ基に直接陰イオン交換基を結合させる方法等を挙げることが出来る。
また、導入される陰イオン交換基の量としては、乾燥樹脂重量１ｇあたり０．１〜１．５ミリ当量、好ましくは０．２〜１．２ミリ当量である。
【００１５】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実施例に限定されるものではない。
【００１６】
実施例１
粒子径１μｍ均一ポリスチレン種粒子の水懸濁液（９．５×１０^-2ｇ/ml）１．４ｍｌを、膨潤助剤であるフタル酸ジブチルエステル０．９５ｍｌ、重合開始剤としての過酸化ベンゾイル０．０８５ｇ，及びドデシル硫酸ナトリウム０．０４ｇを水１０ｍｌの中に分散させたマイクロエマルジョンと混合し、緩やかに室温で攪拌した。この第一段階目の膨潤は、光学顕微鏡による観察において加えたマイクロエマルジョン液滴が見られなくなるまで行った。
モノマーであるグリセリンジメタクリレート５．０ｇ，グリセリンモノメタクリレート５．０ｇ，グリシジルメタクリレート５．０ｇおよび多孔質化溶媒であるシクロヘキサノール３０ｍｌを、懸濁安定剤として４．８０ｇのポリビニルアルコール（重合度５００、ケン化度８６．５−８９mol％）を含む水２２５ｍｌの中に懸濁させた微分散液を、上記の一次膨潤後の懸濁液に加え、室温で一晩緩やかに攪拌した（二次膨潤）。
【００１７】
二次膨潤の終了した懸濁液は、アルゴン雰囲気下、水溶性重合抑制剤の存在下、７０℃で２４時間重合を行った。重合の終了した懸濁液を水２５０ｍｌ中にそそぎいれ、粒子の沈降後上澄み液を廃棄することで懸濁安定剤を除去した。さらに粒子をメタノールに再分散させ、粒子の沈降後に上澄み液を除く方法で洗浄した。この操作をメタノールでさらに一回、テトラヒドロフランで二回行った後、粒子をろ過し室温で乾燥させた。
イオン交換基の導入は、上記で得られた粒子５．７８ｇをジメチルホルムアミド５０ｍｌに分散させ、アルゴン雰囲気下にＮ，Ｎ−ジエチルエチレンジアミン１０ｍｌを加え、７０℃で６時間緩やかに攪拌しながら行った。反応終了後、懸濁液を水中にそそぎいれ、粒子の沈降後上澄み液を除去した。さらに粒子をメタノールに再分散させ、粒子の沈降後に上澄み液を除く方法で洗浄した。この操作をメタノールで一回、アセトンで二回行った後、粒子をろ過し、乾燥して粒状樹脂（分離剤）を得た。
この分離剤の元素分析の結果は、Ｃ＝５４．２２％、Ｈ＝７．８９％、Ｎ＝２．２３％であった。元素分析の結果に基づく計算により、イオン交換容量は０．８ｍｅｑ／ｇ−重合体であった。
【００１８】
実施例２
多孔質化溶媒としてシクロヘキサノールの代わりにトルエンを用いた他は、実施例１と同様にして粒状樹脂（分離剤）を得た。元素分析の結果は、Ｃ＝５４．２７％、Ｈ＝７．６４％、Ｎ＝１．８５％であった。元素分析の結果より計算すると、イオン交換容量は０．７ｍｅｑ／ｇ−重合体であった。
【００１９】
試験例１
実施例１及び２で得られた粒状樹脂を用い、ＩＣＲマウス血清を試料としてリポ蛋白質の分離を行った。
試験方法
図１に示すシステムに従い、試料を注入した分離カラムに溶離液を流してリポ蛋白質を分離し、これに酵素溶液を加え加熱反応させた後、検出器で検出する。
【００２０】
カラム：粒状樹脂を湿式法によって内径４．６ｍｍ，長さ１５０ｍｍのステンレススチール製カラムに充填して用いた。
溶離液：下記２種の緩衝液を用い、溶離液Ｂを図２に従って溶離液Ａに加えたものを４５分間流した。
Ａ：２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液＋１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ｐＨ７．０）
Ｂ：（溶離液Ａ）＋０．５Ｍ塩化ナトリウム
酵素試薬：コレステロールＣテストワコー（和光純薬（株）製）
流速：ポンプ１、２；０．５ｍｌ／ｍｉｎ．ポンプ３；０．３ｍｌ／ｍｉｎ．
カラム温度：２５℃
検出：５０５ｎｍ
試料：ＩＣＲマウス血清２５μｌ
結果実施例１及び実施例２の粒状樹脂を用いた場合のクロマトグラムを夫々図３及び図４に示した。
【００２１】
【発明の効果】
本発明の樹脂を用いることにより、血漿や血清中のコレステロール等のリポ蛋白質を極めて精度良く分離することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】試験例１におけるリポ蛋白質分離試験法のシステムを示す概略図
【図２】試験例１における溶離液中のグラジエントを示す図
【図３】実施例１の樹脂によるリポ蛋白質の分離結果を示すクロマトグラム
【図４】実施例２の樹脂によるリポ蛋白質の分離結果を示すクロマトグラム

Claims

水不溶性、親水性のマトリックスに陰イオン交換基が導入された陰イオン交換体からなり、該マトリックスが、平均細孔半径１０〜２０００オングストローム、細孔容積０．２〜１．８ｍｌ／ｇ、細孔表面積１〜１０００ｍ ^２／ｇの水不溶性、親水性多孔性重合体粒子であることよりなり、且つ該イオン交換体の陰イオン交換容量が乾燥樹脂１ｇ当たり０．１〜１．５ミリ当量であることよりなるリポ蛋白質分離用樹脂。
水不溶性、親水性のマトリックスが、モノビニル単量体から誘導される単位を重量分率で０〜８０％、架橋性ポリビニル単量体から誘導される単位を重量分率で２０〜１００％含有し、モノビニル単量体単位または架橋性ポリビニル単量体単位の少なくとも一方は親水性基を有している請求項１記載のリポ蛋白質分離用樹脂。
有機重合体粒子にモノビニル単量体０〜８０重量％を含有する架橋性ポリビニル単量体、ラジカル重合開始剤及び多孔質化溶媒を含浸させた後、該粒子を水性媒体に懸濁し、該懸濁液を昇温して重合した後、陰イオン交換基を導入してなる請求項１又は２に記載のリポ蛋白質分離用樹脂。
陰イオン交換基は、置換アミノ基である請求項１乃至３のいずれかに記載のリポ蛋白質分離用樹脂。