JP6004516B2 - ヘモグロビン類分離用カラム充填剤及びその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、ヘモグロビン類を短時間で高精度に測定することができるヘモグロビン類分離用カラム充填剤に関する。また、本発明は、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法に関する。

液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定は、安定型ヘモグロビンＡ１ｃを短時間で高精度に測定できるため、特に糖尿病患者のヘモグロビンＡ１ｃ値の管理に用いられている。この用途では、再現性試験におけるヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値（％）が１％以下程度の精度が要求される。

ヘモグロビンＡ１ｃの測定に用いられるカラム充填剤は、カチオン交換充填剤を用いるのが一般的である。例えば、特許文献１にはシリカ系基材にカチオン交換基を導入したカラム充填剤、特許文献２及び特許文献３にはカチオン交換基を有するアクリル系重合体のカラム充填剤が開示されている。しかし、いずれの技術においても、臨床検査の現場で使用するには測定時間が長く、測定時間を短縮すると分離性能が悪くなる。

特開昭６３−７５５５８号公報 特開平０３−１０２２５９号公報 特開平０３−２５５３６０号公報

本発明は、ヘモグロビン類を短時間で高精度に測定することができるヘモグロビン類分離用カラム充填剤及びその製造方法を提供することを目的とする。

本発明者は、ヘモグロビン類分離用カラム充填剤として、ハロゲン基及びカチオン交換基を有する架橋重合体粒子を用いることにより、液体クロマトグラフィーにおいて、ヘモグロビン類を短時間で高精度に測定することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。

本発明は、ハロゲン基及びカチオン交換基を有する架橋重合体粒子からなるヘモグロビン類分離用カラム充填剤であって、前記架橋重合体粒子は、ハロゲン基を有する単量体（ただし、クロロメチルスチレン及びハロゲン化ビニル類を除く）と架橋性単量体とを構造単位とし、更にカチオン交換基を有する重合体からなるヘモグロビン類分離用カラム充填剤である。
以下に本発明を詳述する。

本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤は、ハロゲン基及びカチオン交換基を有する架橋重合体粒子からなる。
架橋重合体粒子は架橋性単量体を重合して得られる架橋重合体粒子が好ましい。架橋性単量体としては、例えば、芳香族系架橋性単量体、炭化水素系架橋性単量体、ビニルエーテル系架橋性単量体、アクリル系架橋性単量体、その他の架橋性単量体等が挙げられる。なかでも、アクリル系架橋性単量体が好ましい。
なお、本明細書において「アクリル系」とは、アクリル基又はメタクリル基を有することを意味する。また、「（メタ）アクリル」とは、「アクリル又はメタクリル」を示し、「（メタ）アクリレート」とは、「アクリレート又はメタクリレート」を示す。

芳香族系架橋性単量体としては、例えば、ジビニルベンゼン、トリビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルエチルベンゼン、ジビニルナフタレン、ジビニルアントラセン等が挙げられる。

炭化水素系架橋性単量体としては、例えば、イソプレン、ブタジエン、ヒドロキシブタジエン、ジメチルブタジエン、ペンタジエン、ヘキサジエン、オクタジエン、ジシクロペンタジエン、トリシクロペンタジエン、シクロオクタジエン、ジビニルシクロブタン、ビニルシクロヘキセン等が挙げられる。

ビニルエーテル系架橋性単量体としては、例えば、ジビニルエーテル、エチレングリコールジビニルエーテル、トリエチレングリコールジビニルエーテル等のポリエチレングリコールジビニルエーテル、プロピレングリコールジビニルエーテル、ポリプロピレングリコールジビニルエーテル、ブタンジオールジビニルエーテル、ヘキサンジオールジビニルエーテル、オクタンジオールジビニルエーテル、ジメタノールシクロヘキサンジビニルエーテル、アリルビニルエーテル、プロペニルビニルエーテル等が挙げられる。

アクリル系架橋性単量体としては、例えば、ジ（メタ）アクリレート、トリ（メタ）アクリレート、テトラ（メタ）アクリレート等のアクリル系架橋性単量体が挙げられる。具体的には例えば、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート、分子内に二つ以上の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート、その他の架橋性（メタ）アクリレート等が挙げられる。

ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレートとしては、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレートとしては、例えば、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
アルキレングリコールジ（メタ）アクリレートとしては、例えば、ポリテトラメチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール−テトラメチレングリコール）−ジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールポリプロピレングリコールポリエチレングリコール−ジ（メタ）アクリレート、１，３−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサグリコールジ（メタ）アクリレート、１，９−ノナンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレートとしては、例えば、２−ヒドロキシ−１，３−ジ（メタ）アクリロキシプロパン、２−ヒドロキシ−１−（メタ）アクリロキシ−３−（メタ）アクリロキシプロパン、２−ヒドロキシ−３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル（メタ）アクリレート、グリセロールジ（メタ）アクリレート、グリセロールアクリレートメタクリレート、ウレタン（メタ）ジアクリレート、イソシアヌル酸ジ（メタ）アクリレート、イソシアヌル酸トリ（メタ）アクリレート、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−５−メチル−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１１−ジ（メタ）アクリロキシ−４，８−ジオキサウンデガン−２，６，１０−トリオール等が挙げられる。
分子内に二つ以上の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレートとしては、例えば、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタントリ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
その他の架橋性（メタ）アクリレートとしては、例えば、アリル（メタ）アクリレート、ビニル（メタ）アクリレート等が挙げられる。

その他の架橋性単量体としては、ジアリルフタレート等が挙げられる。これらの架橋性単量体は単独で用いてもよいし２種以上を併用してもよい。

架橋重合体粒子は、上記の架橋性単量体と非架橋性単量体の共重合体であってもよい（以下、架橋重合体粒子を構成する全単量体を合わせて架橋性単量体混合物ともいう）。非架橋性単量体としては、芳香族系非架橋性単量体、炭化水素系非架橋性単量体、ビニルエーテル系非架橋性単量体、アクリル系非架橋性単量体が挙げられる。なかでも、アクリル系非架橋性単量体が好ましい。

芳香族系非架橋性単量体としては、例えば、スチレン、メチルスチレン、メトキシスチレン、ｔｅｒｔ−ブトキシスチレン、アセトキシスチレン、ビニルトルエン、ビニルナフタリン、ビニルアントラセン等が挙げられる。

炭化水素系非架橋性単量体としては、例えば、エチレン、プロピレン、ブテン、メチルブテン、ジメチルブテン、イソブチレン、メチルブテン、トリメチルブテン、メチルペンテン、エチルペンテン、ジメチルペンテン、トリメチルペンテン、ヘキセン、ジメチルヘキセン、ヘプテン、メチルヘキセン、エチルヘキセン、オクテン、酢酸ビニル、ラウリン酸ビニル、サリチル酸ビニル等が挙げられる。

ビニルエーテル系非架橋性単量体としては、例えば、メチルビニルエーテル、エチルビニルエーテル、メトキシエチルビニルエーテル、プロピルビニルエーテル、イソプロピルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル、イソブチルビニルエーテル、シクロヘキシルビニルエーテル、フェニルビニルエーテル、オクチルビニルエーテル、エチルヘキシルエトキシビニルエーテル、ブチルジエトキシビニルエーテル、ヘキシルエトキシビニルエーテル等が挙げられる。

アクリル系非架橋性単量体としては、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、イソプロピル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、イソブチル（メタ）アクリレート、ｔｅｒｔ−ブチル（メタ）アクリレート、ヘキシル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、ベンジル（メタ）アクリレート、イソボルニル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート、エトキシエチル（メタ）アクリレート、アセトアセトキシエチル（メタ）アクリレート等が挙げられる。

非架橋性単量体としては、上記の非架橋性単量体の他に親水性基を有する非架橋性単量体も好ましい。親水性基としては、イオン交換性を有さない親水性基が好ましく、例えば、水酸基、グリコール基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、アルデヒド基等が挙げられる。なかでも、水酸基、グリコール基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基であり、より好ましくは、水酸基、グリコール基、エポキシ基、グリシジル基が好ましい。

これらの親水性基を有する非架橋性単量体としては、例えば、芳香族系非架橋性単量体、炭化水素系非架橋性単量体、ビニルエーテル系非架橋性単量体、アクリル系非架橋性単量体、その他の非架橋性単量体等が挙げられる。なかでも、アクリル系架橋性単量体が好ましい。

親水性基を有する芳香族系架橋性単量体としては、例えば、ヒドロキシスチレン、メチルヒドロキシスチレン、エポキシスチレン、アミノスチレン、Ｎ，Ｎ−ジメチルビニルベンジルアミン、シアノスチレン等が挙げられる。

親水性基を有する炭化水素系架橋性単量体としては、例えば、ヒドロキシブテン、ジヒドロキシブテン、ヒドロキシペンテン、ジヒドロキシペンテン、ヒドロキシヘキセン、ジヒドロキシヘキセン、アリルアミン等が挙げられる。

親水性基を有するビニルエーテル系非架橋性単量体としては、例えば、ヒドロキシエチルビニルエーテル、ヒドロキシブチルビニルエーテル、ヒドロキシヘキシルビニルエーテル、ヒドロキシメチルシクロヘキシルメチルビニルエーテル、エチレングリコールモノビニルエーテル、ジエチレングリコールモノビニルエーテル、トリエチレングリコールモノビニルエーテル、ポリエチレングリコールモノビニルエーテル、プロピレングリコールビニルエーテル、ポリプロピレングリコールビニルエーテル、メチルジプロピレングリコールビニルエーテル等が挙げられる。

親水性基を有するアクリル系非架橋性単量体としては、例えば、水酸基又はグリコール基を有する（メタ）アクリレート、エポキシ化（メタ）アクリレート、アミノ化（メタ）アクリレート、シアノ化（メタ）アクリレートが好ましい。

水酸基又はグリコール基を有する（メタ）アクリレートとしては、例えば、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート、その他の水酸基を有する（メタ）アクリレート等が挙げられる。
ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレートとしては、例えば、エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシトリ（ポリ）エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレートとしては、例えば、プロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレートやトリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレートやテトラプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート等のポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレートとしては、例えば、ポリ（エチレングリコール・プロピレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（エチレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、オクトキシポリエチレングリコールポリプロピレングリコール−モノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
その他の水酸基を有する（メタ）アクリレート類しては、例えば、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、ジヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ジヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート等が挙げられる。

エポキシ化（メタ）アクリレートとしては、例えば、グリシジル（メタ）アクリレート等が挙げられる。

アミノ化（メタ）アクリレートとしては、例えば、アミノメチルアクリレート、アミノエチル（メタ）アクリレート、アミノプロピル（メタ）アクリレート、アミノブチル（メタ）アクリレート、ジアミノエチル（メタ）アクリレート、ジアミノプロピル（メタ）アクリレート、Ｎ−メチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−エチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−プロピルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−ブチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノメチル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノイソプロピル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノブチル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノヘキシル（メタ）アクリレート、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジプロピルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジイソプロピルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジブチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−メチル−Ｎ−エチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−メチル−Ｎ−ブチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジプロピルアミノプロピル（メタ）アクリレート等が挙げられる。

シアノ化（メタ）アクリレートとしては、例えば、シアノ（メタ）アクリレート、メチルシアノ（メタ）アクリレート、エチルシアノ（メタ）アクリレート、イソプロピルシアノ（メタ）アクリレート、ブチルシアノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。

親水性基を有するその他の非架橋性単量体としては、例えば、（メタ）アクリルアミド、ジメチル（メタ）アクリルアミド、ｔｅｒｔ−ブチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシメチルアクリルアミド、Ｎ−アセトアミドアクリルアミド、Ｎ−メチロールアクリルアミド、クロトンアミド、マレインアミド、フマルアミド、メサコンアミド、シトラコンアミド、イタコンアミド等のアミド基を有する単量体、（メタ）アクリロニトリル、クロトンニトリル、マレインニトリル、フマロニトリル、メタコンニトリル、シトラコンニトリル、イタコンニトリル等のニトリル基を有する単量体、（メタ）アクロレイン等のアルデヒド基を有する単量体が挙げられる。

非架橋性単量体を添加する場合、非架橋性単量体の添加量の好ましい上限は、架橋性単量体混合物全量の７０重量％である。非架橋性単量体の添加量が７０重量％を超えると、耐圧性、耐膨潤性が低下し、正確な測定ができなくなることがある。非架橋性単量体の添加量のより好ましい上限は５０重量％、更に好ましい上限は３０重量％である。

本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を構成する架橋重合体粒子は、ハロゲン基を有する。この架橋重合体粒子が有するハロゲン基としては、フッ素基、塩素基、臭素基、ヨウ素基が挙げられる。なかでも、フッ素基及び塩素基が好ましく、塩素基がより好ましい。架橋重合体粒子は、種類の異なるハロゲン基を複数種有していてもよい。

本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を構成する架橋重合体粒子は、カチオン交換基を有する。この架橋重合体粒子が有するカチオン交換基としては、例えば、カルボキシ基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられる。なかでも、スルホン酸基が好ましい。
なお、本明細書において、「カチオン交換基」は、カチオン交換基に付随する構造は問わないため、カチオン交換基を末端に有する全ての官能基を含む。例えば、本明細書における「カルボキシ基」とは、カルボキシエチル基、カルボキシプロピル基等、カルボキシ基が結合する官能基類全てを含む。また、本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を構成する架橋重合体粒子は、種類の異なるカチオン交換基を複数種有していてもよい。

ハロゲン基及びカチオン交換基を有する架橋重合体粒子は、ハロゲン基を有する単量体と、カチオン交換基を有する単量体と、架橋性単量体とを重合して得られる架橋重合体粒子が好ましい。

ハロゲン基を有する単量体としては、例えば、ハロゲン基を有する芳香族系単量体、ハロゲン基を有する炭化水素系単量体、ハロゲン基を有するビニルエーテル系単量体、ハロゲン基を有するアクリル系単量体等が挙げられる。なかでも、ハロゲン基を有するアクリル系単量体が好ましい。

ハロゲン基を有する芳香族系単量体としては、例えば、ブロモスチレン、ブロモメチルスチレン、トリブロモメチルスチレン、クロロスチレン、ジクロロスチレン、クロロメチルスチレン、クロロエチルスチレン、フルオロスチレン、ジフルオロスチレン、トリフルオロメチルスチレン、トリフルオロメチルスチレン、ペンタフルオロスチレン、クロロメチルスチレン、パーフルオロオクチルエチレンオキシメチルスチレン等が挙げられる。

ハロゲン基を有する炭化水素系単量体としては、例えば、臭化ビニル、臭化アリル、ブロモプレン、塩化ビニル、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、ヘキサクロロロプロピレン、塩化ビニリデン、クロロトリフルオロエチレン、塩化アリル、クロロプレン、トリフルオロエチレン、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレン、フッ化ビニル、フッ化ビニリデン、トリフルオロ酢酸ビニル、フロロプレン等が挙げられる。

ハロゲン基を有するビニルエーテル系単量体としては、例えば、ブロモプロピルビニルエーテル、クロロエチルビニルエーテル、クロロエチルプロペニルエーテル、クロロブチルビニルエーテル、クロロフェニルビニルエーテル等が挙げられる。

ハロゲン基を有するアクリル系単量体としては、例えば、ブロモメチル（メタ）アクリレート、ブロモエチル（メタ）アクリレート、ジブロモプロピル（メタ）アクリレート、ブロモフェニル（メタ）アクリレート、ブロモシクロヘキシル（メタ）アクリレート、ブロモプロピオニルオキシエチル（メタ）アクリレート、ブロモイソブチリルオキシエチル（メタ）アクリレートクロロメチル（メタ）アクリレート、クロロエチル（メタ）アクリレート、クロロイソプロピル（メタ）アクリレート、クロロヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、クロロヒドロキシベンジルメチル（メタ）アクリレート、クロロブチル（メタ）アクリレート、クロロ−ｔ−ブチル（メタ）アクリレート、クロロフェニル（メタ）アクリレート、トリフルオロメチル（メタ）アクリレート、トリフルオロエチル（メタ）アクリレート、トリフルオロプロピル（メタ）アクリレート、テトラフルオロプロピル（メタ）アクリレート、ヘキサフルオロイソプロピル（メタ）アクリレート、パーフルオロブチルエチル（メタ）アクリレート、ペンタフルオロプロピル（メタ）アクリレート、ヘキサフルオロイソプロピル（メタ）アクリレート、フルオロブチル（メタ）アクリレート、ヘキサフルオロブチル（メタ）アクリレート、オクタフルオロペンチル（メタ）アクリレート、パーフルオロオクチルエチル（メタ）アクリレート、テトラヒドロパーフルオロデシル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
これらのハロゲン基を有する単量体は、単独で用いてもよいし２種以上を用いてもよい。

架橋性単量体１００重量部に対するハロゲン基を有する単量体の使用量の好ましい範囲は、１〜１００重量部である。１重量部未満の場合、ハロゲン基を導入した効果が得られ難い。１００重量部を超える場合、ハロゲン基に起因する疎水性により非特異吸着が増加してカラム寿命が短くなることがある。より好ましくは５〜７０重量部である。

カチオン交換基を有する単量体（以下、カチオン交換性単量体ともいう）としては、例えば、カチオン交換基を有する芳香族系単量体、カチオン交換基を有するアクリル系単量体、カチオン交換基を有するその他の単量体等が挙げられる。なかでも、カチオン交換基を有するアクリル系単量体が好ましい。

カチオン交換基を有する芳香族系単量体としては、例えば、ビニル安息香酸、スチレンスルホン酸等が挙げられる。

カチオン交換基を有するアクリル系単量体としては、例えば、（メタ）アクリル酸、カルボキシエチル（メタ）アクリレート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルサクシネート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルフタル酸、シアノ（メタ）アクリル酸、（（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（２−（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル）アシッドホスフェート、２−スルホエチル（メタ）アクリレート、３−スルホプロピル（メタ）アクリレート、２−（メタ）アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸等が挙げられる。

カチオン交換基を有するその他の単量体としては、マレイン酸、クロトン酸、フマル酸、メサコン酸、シトラコン酸、イタコン酸等が挙げられる。これらのカチオン交換性単量体は、単独で用いてもよいし２種以上を用いてもよい。また、ブロモ（メタ）アクリル酸、クロロ（メタ）アクリル酸等のハロゲン基及びカチオン交換基を有する単量体を用いてもよい。

架橋性単量体１００重量部に対するカチオン交換基を有する単量体の使用量の好ましい範囲は１０〜２００重量部である。１０重量部未満の場合、カチオン交換反応が充分に行われず分離性能が悪くなることがある。２００重量部を超える場合、充填剤の耐圧性が低下して分離性能が悪くなることがある。より好ましくは２０〜１５０重量部である。

ハロゲン基及びカチオン交換基を有する架橋重合体粒子は、ハロゲン基を有する架橋重合体粒子に、カチオン交換基を導入して得られる架橋重合体粒子が好ましい。このハロゲン基を有する架橋重合体粒子は、ハロゲン基を有する単量体と架橋性単量体とを重合して得られる重合体粒子であることが好ましい。

ハロゲン基を有する架橋重合体粒子にカチオン交換基を導入して得られる架橋重合体粒子は、ハロゲン基を有する架橋重合体粒子の存在下で、上記のカチオン交換性単量体を重合させて得られる重合体粒子が好ましい。

また、ハロゲン基を有する架橋重合体粒子にカチオン交換基を導入して得られる架橋重合体粒子としては、カチオン交換基に変換し得る官能基（以下、反応性基ともいう）及びハロゲン基を有する架橋重合体粒子が含有する反応性基にカチオン交換基を有する化合物（以下、カチオン交換性化合物ともいう）を反応させて得られる重合体粒子を用いることもできる。

反応性基及びハロゲン基を有する架橋重合体粒子は、架橋性単量体と、ハロゲン基を有する単量体と、親水性基を有する非架橋性単量体とを重合して得られる重合体粒子が好ましい。

反応性基及びハロゲン基を有する架橋重合体粒子が含有する反応性基としては、水酸基、グリコール基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、アルデヒド基等が挙げられる。なかでも、水酸基、グリコール基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基が好ましく、水酸基、グリコール基、エポキシ基、グリシジル基がより好ましい。

反応性基にカチオン交換性化合物を反応させて得られる、ハロゲン基及びカチオン交換基を有する架橋重合体粒子は、反応性基及びハロゲン基を有する架橋重合体粒子の分解や変性等を伴わない条件下で、反応性基及びハロゲン基を有する架橋重合体粒子にカチオン交換性化合物を公知の化学反応により反応させて得られる架橋重合体粒子が好ましい。

例えば、ハロゲン基及び反応性基として水酸基を含有する架橋重合体粒子と、ブロムエタンスルホン酸ナトリウム等のハロゲン化エタンスルホン酸類又はクロロ酢酸ナトリウム等のハロゲン化酢酸類等のカチオン交換性化合物を水酸化アルカリ水溶液中で反応させる方法により、該架橋重合体粒子にカチオン交換基を導入することができる。
ハロゲン基及び反応性基として水酸基を含有する架橋重合体粒子と、カチオン交換基を有するアルデヒド化合物を酸触媒下でアセタール反応を行う方法により、該架橋重合体粒子にカチオン交換基を導入することができる。
ハロゲン基及び反応性基として水酸基を含有する架橋重合体粒子と、トリカルバニル酸、ブタンテトラカルボン酸等の多官能カルボン酸化合物を、脱水反応によるエステル化反応を行う方法により、該架橋重合体粒子にカチオン交換基を導入することができる。
ハロゲン基及び反応性基として水酸基を含有する架橋重合体粒子と、１，３−プロパンスルトン、１，４−ブタンスルトン等のスルトン類を水酸化アルカリ水溶液中又は水酸化アルカリの有機溶媒中で反応させる方法により、該架橋重合体粒子にカチオン交換基を導入することができる。

また、ハロゲン基、及び、反応性基として水酸基又はアミノ基を含有する架橋重合体粒子と、エピクロルヒドリンやトリグリシジルエーテル等のエポキシ化合物を水酸化アルカリ水溶液中又は水酸化アルカリの有機溶媒中で反応させてエポキシ化した後、硫酸ナトリウム、タウリン、グリコール酸等のカチオン交換性化合物を反応させる方法により、該架橋重合体粒子にカチオン交換基を導入することができる。
反応性基として水酸基又はアミノ基を含有する架橋重合体粒子と、三フッ化ホウ素エーテラートを反応させた後、亜硫酸ナトリウム水溶液中で加熱処理する方法により、架橋重合体粒子にカチオン交換基を導入することができる。

更に、ハロゲン基、及び、反応性基としてエポキシ基やグリシジル基を含有する架橋重合体粒子に上記のエポキシ化後の反応を行う方法により、該架橋重合体粒子にカチオン交換基を導入することができる。

本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤の平均粒子径の好ましい下限は０．１μｍ、好ましい上限は５０μｍである。平均粒子径が０．１μｍ未満であると、カラム圧力が増大して液体クロマトグラフに耐圧性付与のための特殊な部品等が必要となる。平均粒子径が５０μｍを超えると、カラム内の空隙率が増大して試料が拡散しやすくなり、ピークのブロード化等により測定精度が低下する。平均粒子径のより好ましい下限は０．５μｍ、より好ましい上限は３０μｍである。
なお、上記平均粒子径は、個数カウント方式粒度分布測定装置（パーティクルサイジングシステムズ社製、「アキュサイザー７８０」）等を用いて測定することができる。

本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤は、エンプティカラムに充填した後、送液用ポンプ、分離用カラム、検出器、試料導入機構等を備えた公知の構成の液体クロマトグラフに接続することにより、ヘモグロビン類を測定できる。

本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた液体クロマトグラフィーは、公知の塩化合物を含む緩衝液類や有機溶媒類を溶離液として用いることが好ましい。緩衝液の成分は、有機酸、無機酸、及び、これらの塩類、アミノ酸類、グッドの緩衝液等が挙げられる。
有機酸としては、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等が挙げられる。
無機酸としては、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等が挙げられる。
アミノ酸としては、例えば、グリシン、タウリン、アルギニン等が挙げられる。
また、溶離液には、一般に添加される物質、例えば、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物、カオトロピック化合物等を適宜添加してもよい。

ヘモグロビン類の測定を行う際の上記緩衝液の塩濃度の好ましい下限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は１０００ｍｍｏｌ／Ｌである。上記緩衝液の塩濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌ未満であると、充分なイオン交換反応が行なわれずヘモグロビン類を分離できないことがある。上記緩衝液の塩濃度が１０００ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、緩衝液中の塩が析出して液体クロマトグラフに悪影響を及ぼすことがある。

本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤により、安定型ヘモグロビンＡ１ｃを短時間で再現性良く測定できる。また、安定型ヘモグロビンＡ１ｃと同時に、健常人血に含まれる他のヘモグロビン類、例えば、ヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＦ（胎児性ヘモグロビン）、ヘモグロビンＡ２等を測定できる。更に安定型ヘモグロビンＡ１ｃと同時に、ヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＣ、ヘモグロビンＤ、ヘモグロビンＥ等の異常ヘモグロビン類を測定することができる。

本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を製造する方法であって、ハロゲン基を有する単量体と架橋性単量体とを水系分散媒に分散させて分散液を得る工程１、上記分散液を重合開始剤の存在下で加温してハロゲン基を有する架橋重合体粒子を得る工程２、及び、得られたハロゲン基を有する架橋重合体粒子の表面にカチオン交換基を導入する工程３を有するヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法もまた、本発明の１つである。

工程１は、ハロゲン基を有する単量体と架橋性単量体とを水系分散媒に分散させて分散液を得る工程である。ハロゲン基を有する単量体及び架橋性単量体を分散させる水系分散媒は、分散剤を溶解した水溶液であることが好ましい。

分散剤としては、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリデン等の水溶性高分子類やリン酸カルシウム等の無機塩類等の公知の分散媒が用いられる。
分散剤の濃度の好ましい下限は０．０１重量％、好ましい上限は２０重量％である。分散剤の濃度が０．０１重量％未満であると、単量体に対する分散効果が得られにくく、重合反応後に得られる重合体粒子が凝集することがある。分散剤の濃度が２０重量％を超えると、高濃度の分散剤により反応系の粘度が大きくなり、凝集塊が発生したり、得られる架橋重合体粒子の粒径が微小化し、測定時に圧力が高くなったりすることがある。分散剤の濃度のより好ましい下限は０．１重量％、より好ましい上限は１０重量％である。

工程１において、ハロゲン基を有する単量体と架橋性単量体とは、別個に添加してもよいし両者を混合してから添加してもよい。また、上記の非架橋性単量体を添加してもよい。

分散液には、公知の重合方法において用いられる各種の添加剤等を添加してもよい。添加剤としては、例えば、マクロポアを形成するための多孔質化剤、重合反応を制御するための連鎖移動剤、単量体の溶解度を調節するための有機化合物又は無機化合物等が挙げられる。

工程２は、工程１で得られた分散液を重合開始剤の存在下で加温してハロゲン基を有する架橋重合体粒子を得る工程である。

重合開始剤としては、水溶性又は油溶性の公知のラジカル重合開始剤を用いることができ、例えば、過硫酸塩、有機過酸化物、アゾ化合物等が挙げられる。
過硫酸塩としては、例えば、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウム等が挙げられる。
有機過酸化物としては、例えば、クメンハイドロパーオキサイド、ベンゾイルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド、オクタノイルパーオキサイド、ｏ−クロロベンゾイルパーオキサイド、アセチルパーオキサイド、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシアセテート、ｔ−ブチルパーオキシイソブチレート、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイド等が挙げられる。
アゾ化合物としては２，２−アゾビスイソブチロニトリル、２，２−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、４，４−アゾビス（４−シアノペンタン酸）、２，２−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、２，２−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル等が挙げられる。

架橋性単量体混合物の全量に対する重合開始剤の添加量の好ましい下限は０．０５重量％、好ましい上限は５重量％である。重合開始剤の添加量が０．０５重量％未満であると、重合反応が充分に進行しなかったり、重合反応に長時間を要したりすることがある。重合開始剤の添加量が５重量％を超えると、急激な反応の進行により凝集物が発生することがある。重合開始剤は架橋性単量体混合物に溶解させて用いることが好ましい。

工程２では、ハロゲン基を有する単量体と架橋性単量体とが分散した分散液を、重合開始剤の存在下で加温することにより重合反応を行う。加温する温度は、用いる重合開始剤に適した温度に設定することが好ましい。より好ましくは４０℃〜１５０℃、更に好ましくは５０〜１００℃である。また、加温する時間は０．３〜２４時間、より好ましくは０．５〜１２時間である。

工程３は、工程２の重合反応により得られたハロゲン基を有する架橋重合体粒子の表面にカチオン交換基を導入する工程である。カチオン交換基の導入は、ハロゲン基を有する架橋重合体粒子の存在下で上記のカチオン交換基を有する単量体を重合させる方法が好ましい。

ハロゲン基を有する架橋重合体粒子の存在下でカチオン交換基を有する単量体を重合させる方法は、ハロゲン基を有する架橋重合体粒子に重合開始剤を含有させた状態で、カチオン交換性単量体を重合させる方法が好ましい。ハロゲン基を有する架橋重合体粒子に重合開始剤を含有させる方法としては、架橋重合体粒子を膨潤させることができ、かつ、重合開始剤を溶解できる有機溶媒に重合開始剤を溶解し、更に、架橋重合体粒子をこの有機溶媒に含浸させる方法等が挙げられる。得られた重合開始剤を含有する架橋重合体粒子を適当な分散媒中に分散し、カチオン交換性単量体を添加して重合反応を行う。

また、ハロゲン基を有する架橋重合体粒子を調製する際の重合反応（工程２）において、この重合反応が完了する前、すなわち重合開始剤が完全に消費される前に、カチオン交換性単量体を反応系に添加し、ハロゲン基を有する架橋重合体粒子に含まれる重合開始剤を利用してカチオン交換性単量体を重合させることもできる。

また工程３のカチオン交換基の導入は、反応性基及びハロゲン基を有する架橋重合体粒子が有する反応性基に、カチオン交換基を有する化合物を反応させる方法を用いることもできる。またカチオン交換基を有する化合物を反応させる方法としては、上述した方法を用いることができる。

本発明の本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤は、ハロゲン基及びカチオン交換基を有する架橋重合体粒子からなる。従来用いられてきたカチオン交換基を有する架橋重合体粒子にハロゲン基を導入することで、ヘモグロビン類の分離性能が向上する。
また、本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法により、本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤が効率よく得ることができる。

実施例１のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いて安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。 比較例１のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いて安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。 実施例２のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いて安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。 比較例２のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いて安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。 実施例２のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いて異常ヘモグロビン類の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。 比較例２のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いて異常ヘモグロビン類の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。 実施例２のカラム充填剤を用いてヘモグロビンＡ２の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。 比較例２のカラム充填剤を用いてヘモグロビンＡ２の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。

（実施例１）
実施例１では、ハロゲン基を有する単量体、カチオン性単量体、及び、架橋性単量体を重合して、ハロゲン基及びカチオン交換基を有する架橋重合体粒子を調製した。
テトラエチレングリコールモノメタクリレート（架橋性単量体：日油社製）２００ｇ、トリフルオロエチルメタクリレート（ハロゲン基を有する単量体：共栄社化学社製）２０ｇ、及びメタクリル酸（カチオン交換性単量体：和光純薬工業社製）１００ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル（重合開始剤：ナカライテスク社製）１．０ｇを溶解した。得られた混合物を４重量％のポリビニルアルコール（分散剤：日本合成化学社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液２Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温して８時間重合反応を行なった。得られたハロゲン基及びカチオン交換基を有する架橋重合体粒子を洗浄して回収し、ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を得た。

（比較例１）
ハロゲン基を有する単量体を用いなかったこと以外は、実施例１と同様の操作により、ハロゲン基を有さずカチオン交換基を有するヘモグロビン類分離用カラム充填剤を得た。

（評価１）
評価１では、実施例１及び比較例１のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いて、ヒト健常人血液中の安定型ヘモグロビンＡ１ｃを測定しクロマトグラムを比較した。
実施例１及び比較例１の各ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を、内径４．６ｍｍ、長さ３０ｍｍのステンレス製エンプティカラム（巴製作所社製）に充填してヘモグロビン類分離用カラムを調製した。
得られたヘモグロビン類分離用カラムを、ＨＰＬＣシステム（島津製作所社製、「ＬＣ−２０Ａ」）に接続した。測定試料として、フッ化ナトリウム採血したヒト健常人血液を、０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）により２００倍に溶血希釈したものを用いた。
溶離液Ａとして１５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．１）、溶離液Ｂとして３２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）の２種の溶離液を用い、流速１．０ｍＬで送液して溶離液Ａから溶離液Ｂへのステップワイズグラジエント法により分離し、４１５ｎｍの吸光度を測定した。
実施例１のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた場合に得られたクロマトグラムを図１に示す。図１中、ピーク１が安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、ピーク２がヘモグロビンＡ０である。安定型ヘモグロビンＡ１ｃと他のヘモグロビン分画とが短時間内に良好に分離された。
比較例１のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた場合に得られたクロマトグラムを図２に示す。比較例１のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた場合、実施例１のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた場合より安定型ヘモグロビンＡ１ｃの分離性能が悪かった。

（評価２）
評価２では、評価１に用いたヒト健常人血液の代わりに、人為的に調製した修飾ヘモグロビン類を含む試料を測定し、安定型ヘモグロビンＡ１ｃの分離性能を比較した。
修飾ヘモグロビン類を含む試料としては、レイバイルヘモグロビンＡ１ｃ含有試料（試料Ｌ）、アセチル化ヘモグロビン含有試料（試料Ａ）、カルバミル化ヘモグロビン含有試料（試料Ｃ）の３種類を、公知の方法により調製した。
試料Ｌは、ヒト健常人血液にグルコースを２０００ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で３時間加温することにより調製した。試料Ａは、ヒト健常人血液にアセトアルデヒドを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。試料Ｃは、ヒト健常人血液にシアン酸ナトリウムを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。
修飾ヘモグロビン類を含む試料（試料Ｌ、試料Ａ、試料Ｃ）と、修飾ヘモグロビン類を含む試料の調製に用いたヒト健常人血液（非修飾品）とを、実施例１及び比較例１で調製したヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いて測定した。分離性能は、修飾ヘモグロビン類を含む試料のヘモグロビンＡ１ｃ値から非修飾品のヘモグロビンＡ１ｃ値を差し引いた値（Δ値）を算出して比較することにより評価した。測定結果を表１に示す。

表１に示した実施例１のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた場合のΔ値は０．３％以下であり、修飾ヘモグロビン類が含まれる試料においても、正確に安定型ヘモグロビンＡ１ｃが測定できた。比較例１のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた場合では、修飾ヘモグロビンの存在によりヘモグロビンＡ１ｃ値が大きく変動した。
評価１及び評価２の結果から、実施例１のヘモグロビン類分離用カラム充填剤はハロゲン基を有することにより分離性能が向上したことが確認できた。

（実施例２）
実施例２では、ハロゲン基を有する単量体及び架橋性単量体を重合して得られたハロゲン基を有する架橋重合体に、カチオン交換性単量体を重合して、ハロゲン基及びカチオン交換基を有する架橋重合体粒子を調製した。
トリエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体：新中村化学工業社製）２００ｇ、クロロヒドロキシプロピルメタクリレート（ハロゲン基を有する単量体：東京化成工業社製）２０ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．０ｇを溶解した。得られた混合物を４重量％のポリビニルアルコール水溶液２Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温して１時間重合反応を行なった。２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東亞合成社製）１３０ｇを反応系に添加して更に８０℃で１時間重合を行った。得られたハロゲン基及びカチオン交換基を有する架橋重合体粒子を洗浄して回収し、ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を得た。

（比較例２）
ハロゲン基を有する単量体を用いなかったこと以外は、実施例２と同様の操作により、ハロゲン基を有さずカチオン交換基を有するヘモグロビン類分離用カラム充填剤を得た。

（実施例３）
実施例３では、ハロゲン基を有する単量体及び架橋性単量体を重合して得られたハロゲン基を有する架橋重合体に、カチオン交換性化合物を反応させて、ハロゲン基及びカチオン交換基を有する架橋重合体粒子を調製した。
トリエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体：新中村化学工業社製）２００ｇ、クロロヒドロキシプロピルメタクリレート（ハロゲン基を有する単量体：東京化成工業社製）２０ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．０ｇを溶解した。得られた混合物を４重量％のポリビニルアルコール水溶液２Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温して８時間重合反応を行なった。得られた重合体を洗浄して回収した。
得られたハロゲン基を有する架橋重合体粒子５０ｇを、１０重量％の水酸化ナトリウム水溶液１００ｍＬに分散させ、４０ｇのエピクロルヒドリンを添加して室温で５時間反応させた。得られたエポキシ化架橋重合体粒子４０ｇを２０重量％の硫酸ナトリウム水溶液に分散させて８０℃で２０時間反応させた。得られたハロゲン基及びカチオン交換基を有する架橋重合体粒子を洗浄して回収し、ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を得た。

（比較例３）
ハロゲン基を有する単量体を用いなかったこと以外は、実施例３と同様の操作により、ハロゲン基を有さずカチオン交換基を有するヘモグロビン類分離用カラム充填剤を得た。

（評価３）
評価３では、実施例２、実施例３、比較例２、及び、比較例３のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いて、ヒト健常人血液中の安定型ヘモグロビンＡ１ｃを測定しクロマトグラムを比較した。
実施例２、実施例３、比較例２、及び、比較例３の各ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を、内径４．６ｍｍ、長さ３０ｍｍのステンレス製エンプティカラム（巴製作所社製）に充填してヘモグロビン類分離用カラムを調製した。
得られたヘモグロビン類分離用カラム、及び、溶離液Ｃとして２２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）、溶離液Ｄとして３７０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）の２種の溶離液を用い、上記評価１と同様の方法によりヒト健常人血液を測定した。
実施例２のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた場合に得られたクロマトグラムを図３に示す。安定型ヘモグロビンＡ１ｃと他のヘモグロビン分画とが短時間内に良好に分離された。実施例３のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた場合も、図３と同様のクロマトグラムが得られた。
比較例２のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた場合に得られたクロマトグラムを図４に示す。比較例２のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた場合、実施例２、実施例３のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた場合よりも安定型ヘモグロビンＡ１ｃの分離性能が悪かった。比較例３のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた場合も、図４と同様のクロマトグラムが得られた。

（評価４）
評価４では、評価３に用いたヒト健常人血液の代わりに修飾ヘモグロビン類を含む試料を用い、評価２と同様の方法により安定型ヘモグロビンＡ１ｃの分離性能を比較した。
測定結果を表１に示す。表１に示した実施例２及び実施例３のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた場合のΔ値は０．２％以下であり、修飾ヘモグロビン類が含まれる試料においても、正確に安定型ヘモグロビンＡ１ｃが測定できた。比較例２及び比較例３のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた場合では、修飾ヘモグロビンの存在によりヘモグロビンＡ１ｃ値が大きく変動した。
評価３及び評価４の結果から、実施例２及び実施例３のヘモグロビン類分離用カラム充填剤はハロゲン基を有することにより分離性能が向上したことが確認できた。

（評価５）
評価５では、実施例２及び比較例２のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いて、異常ヘモグロビンを含む試料を測定した。
実施例２及び比較例２の各ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を、内径４．６ｍｍ、長さ３０ｍｍのステンレス製エンプティカラム（巴製作所社製）に充填してヘモグロビン類分離用カラムを調製した。
異常ヘモグロビンとしてヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含む試料（ヘレナ研究所社製、「ＡＦＳＣヘモコントロール」）を用いて測定を行った。
実施例２のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた場合に得られたクロマトグラムを図５に示す。図５中、ピーク１は安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、ピーク２はヘモグロビンＡ０、ピーク３はヘモグロビンＦ（胎児性Ｈｂ）、ピーク４はヘモグロビンＳ、ピーク５はヘモグロビンＣを示す。実施例２のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた場合、異常ヘモグロビンのヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを良好に分離することができ、安定型ヘモグロビンＡ１ｃとの同時測定が可能であった。
比較例２のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた場合に得られたクロマトグラムを図６に示す。比較例２のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた場合、異常ヘモグロビン類のヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを分離することはできなかった。

（評価６）
評価６では、実施例２及び比較例２のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いて、ヘモグロビンＡ２を含む試料を測定した。
実施例２及び比較例２の各ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を、内径４．６ｍｍ、長さ３０ｍｍのステンレス製エンプティカラム（巴製作所社製）に充填してヘモグロビン類分離用カラムを調製した。
ヘモグロビンＡ２を含む試料として、Ａ２コントロール（レベル２）（バイオラッド社製）を用いて測定を行った。
実施例２のカラム充填剤を用いた場合に得られたクロマトグラムを図７に示す。図７中、ピーク１は安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、ピーク２はヘモグロビンＡ０、ピーク３はヘモグロビンＦ（胎児性Ｈｂ）、ピーク６はヘモグロビンＡ２を示す。実施例２のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた場合、ヘモグロビンＡ２を良好に分離することができた。
比較例２のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた場合に得られたクロマトグラムを図８に示す。比較例２のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた場合、ヘモグロビンＡ２を分離することはできなかった。

（評価７）
評価７では、実施例２及び比較例２のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いて、同時再現性試験を実施した。
実施例２及び比較例２の各ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を、内径４．６ｍｍ、長さ３０ｍｍのステンレス製エンプティカラム（巴製作所社製）に充填してヘモグロビン類分離用カラムを調製した。
得られたカラムを用い、ヒト健常人血液試料及び上記評価５で用いた異常ヘモグロビンを含む試料を２０回連続して測定し、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値の再現性を比較した。
測定結果を表２に示す。
実施例２のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた場合は、いずれのヘモグロビン成分においても良好な再現性を示した。
比較例２のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた場合は、臨床検査に使用できる再現性は得られなかった。

本発明によれば、ヘモグロビン類を短時間で高精度に測定することができるヘモグロビン類分離用カラム充填剤を提供することができる。また、本発明によれば、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法を提供することができる。

１ 安定型ヘモグロビンＡ１ｃ
２ ヘモグロビンＡ０
３ ヘモグロビンＦ（胎児性Ｈｂ）
４ ヘモグロビンＳ
５ ヘモグロビンＣ
６ ヘモグロビンＡ２

Claims (5)

1. ハロゲン基及びカチオン交換基を有する架橋重合体粒子からなるヘモグロビン類分離用カラム充填剤であって、
   前記架橋重合体粒子は、ハロゲン基を有する単量体（ただし、クロロメチルスチレン及びハロゲン化ビニル類を除く）と架橋性単量体とを構造単位とし、更にカチオン交換基を有する重合体からなる
   ことを特徴とするヘモグロビン類分離用カラム充填剤。
2. ハロゲン基を有する単量体は、ハロゲン基を有するビニルエーテル系単量体又はハロゲン基を有するアクリル系単量体であることを特徴とする請求項１記載のヘモグロビン類分離用カラム充填剤。
3. ハロゲン基を有する単量体は、ハロゲン基を有するアクリル系単量体であることを特徴とする請求項１又は２記載のヘモグロビン類分離用カラム充填剤。
4. 請求項１、２又は３記載のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を製造する方法であって、
   ハロゲン基を有する単量体（ただし、クロロメチルスチレン及びハロゲン化ビニル類を除く）と、カチオン交換基を有する単量体と、架橋性単量体とを重合する工程を有することを特徴とするヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法。
5. 請求項１、２又は３記載のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を製造する方法であって、
   ハロゲン基を有する単量体（ただし、クロロメチルスチレン及びハロゲン化ビニル類を除く）と架橋性単量体とを重合してハロゲン基を有する架橋重合体を得る工程と、
   該ハロゲン基を有する架橋重合体に、カチオン交換基を導入する工程とを有することを特徴とするヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法。

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