CN103649745B - 血红蛋白类的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种血红蛋白类的测定方法，其能够在短时间内高精度地对血红蛋白类进行测定。另外，本发明的目的在于提供使用该血红蛋白类的测定方法的血红蛋白A1c的测定方法、血红蛋白A1c与血红蛋白F的同时测定方法、血红蛋白A1c与血红蛋白A2的同时测定方法、以及血红蛋白A1c与异常血红蛋白类的同时测定方法。本发明是一种借助液相色谱的血红蛋白类的测定方法，其中，填充阳离子交换性粒子作为柱填充剂，所述阳离子交换性粒子包含在交联聚合物粒子的表面含有阳离子交换基的聚合物，并且使用以1.0mL／分钟输送测定中所使用的洗脱液时的压力值为9.8×103Pa以上且29.4×105Pa以下的柱。

Description

血红蛋白类的测定方法
技术领域
本发明涉及使用液相色谱的血红蛋白类的测定方法。另外，本发明涉及使用该血红蛋白类的测定方法的血红蛋白A1c的测定方法、血红蛋白A1c与血红蛋白F的同时测定方法、血红蛋白A1c与血红蛋白A2的同时测定方法、以及血红蛋白A1c与异常血红蛋白类的同时测定方法。
背景技术
借助液相色谱的血红蛋白类的测定方法能够在短时间内进行测定，且精度比其他测定方法高，因此特别地被应用于糖尿病患者的血红蛋白A1c值的管理。
对于借助液相色谱的现有的血红蛋白类的测定方法，为了在短时间内进行测定，要以一定速度以上的流速输送洗脱液，或者为了维持高精度，要使用微小的填充剂粒子，因此测定体系中产生的压力值变高。
例如在专利文献1所公开的技术中，在洗脱液的流速为1.0mL／分钟的情况下，测定体系中产生的压力值为约5MPa。对于通常进行的血红蛋白类的测定中的测定体系中产生的压力值，与专利文献1中公开的技术同等或者为其以上。可见，现有技术中为了维持短的测定时间、高的精度，而不得不在高压条件下进行测定，因此使用高耐压性的装置。
但是，这种高压条件下的测定由于对流路的压力负载大，因此有时由于来自流路的连接部的微小的漏液、脉动电流而引起色谱图的变形，使测定精度下降。另外，高压的条件与低压条件下相比而言，由于在包含柱、过滤器类在内的流路内的非特异吸附的存在、使用多种洗脱液时的洗脱液的切换、环境温度的变化等而产生的对压力值的影响较大，因此有时使测定精度下降。这些现象有时即使在使用高耐压性的装置的情况下也会产生。
现有技术文献 
专利文献 专利文献1：日本特开平5-005730号公报
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供一种血红蛋白类的测定方法，其能够在短时间内高精度地对血红蛋白类进行测定。另外，本发明的目的在于提供使用该血红蛋白类的测定方法的血红蛋白A1c的测定方法、血红蛋白A1c与血红蛋白F的同时测定方法、血红蛋白A1c与血红蛋白A2的同时测定方法、以及血红蛋白A1c与异常血红蛋白类的同时测定方法。
用于解决课题的手段
本发明人发现，在血红蛋白类的测定方法中，在使用填充有具有特定结构的柱填充剂的情况下，通过选择显示出在一定条件下所示的特定范围的压力值的柱，从而使测定的重现性提高。另外发现，该压力值的范围是与现有的血红蛋白类的测定方法中所使用的柱的压力值不同的范围，且显著低于现有的柱的压力值。
本发明是一种借助液相色谱的血红蛋白类的测定方法，其中，填充阳离子交换性粒子作为柱填充剂，所述阳离子交换性粒子包含在交联聚合物粒子的表面含有阳离子交换基的聚合物，并且使用以1.0mL／分钟输送测定中所使用的洗脱液时的压力值为9.8×103Pa以上且29.4×105Pa以下的柱。
以下对本发明进行详述。
本发明的血红蛋白类的测定方法中使用的柱填充剂是一种阳离子交换性粒子，所述阳离子交换性粒子包含在交联聚合物粒子的表面含有阳离子交换基的聚合物。
交联聚合物粒子优选为将有机系的交联性单体或者以有机系的交联性单体为主要成分的单体类的混合物进行聚合而得到的粒子。其中，更优选为将交联性丙烯酸系单体或者以交联性丙烯酸系单体为主要成分的单体类的混合物进行聚合而得到的粒子。另外，交联聚合物粒子优选为实质上不具有离子交换性的粒子。
需要说明的是，在本说明书中，“丙烯酸系”是指具有丙烯酰基或甲 基丙烯酰基的情形。另外，在本说明书中，“(甲基)丙烯酸”是指“丙烯酸或甲基丙烯酸”，“(甲基)丙烯酸酯”是指“丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯”。
作为交联性丙烯酸系单体，可以列举例如：聚乙二醇二(甲基)丙烯酸酯类、聚丙二醇二(甲基)丙烯酸酯类、烷撑二醇二(甲基)丙烯酸酯类、羟基烷基二(甲基)丙烯酸酯类、分子内具有至少两个(甲基)丙烯酰基的烷醇烷(甲基)丙烯酸酯类等。
作为聚乙二醇二(甲基)丙烯酸酯类，可以列举例如：乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、二乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、四乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇二(甲基)丙烯酸酯等。 
作为聚丙二醇二(甲基)丙烯酸酯类，可以列举例如：丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、二丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、四丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、聚丙二醇二(甲基)丙烯酸酯等。 
作为烷撑二醇二(甲基)丙烯酸酯类，可以列举例如：聚四亚甲基二醇二(甲基)丙烯酸酯、聚(丙二醇-四亚甲基二醇)-二(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇聚丙二醇聚乙二醇-二(甲基)丙烯酸酯、1，3-丁二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，4-丁二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，6-己二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，9-壬二醇二(甲基)丙烯酸酯、新戊二醇二(甲基)丙烯酸酯等。
作为羟基烷基二(甲基)丙烯酸酯类，可以列举例如：2-羟基-1，3-二(甲基)丙烯酰氧基丙烷、2-羟基-1-(甲基)丙烯酰氧基-3-(甲基)丙烯酰氧基丙烷、2-羟基-3-(甲基)丙烯酰氧基丙基(甲基)丙烯酸酯、甘油二(甲基)丙烯酸酯、甘油丙烯酸酯甲基丙烯酸酯、氨基甲酸酯二(甲基)丙烯酸酯、异氰脲酸二(甲基)丙烯酸酯、异氰脲酸三(甲基)丙烯酸酯、1，10-二(甲基)丙烯酰氧基-4，7-二氧杂癸烷-2，9-二醇、1，10-二(甲基)丙烯酰氧基-5-甲基-4，7-二氧杂癸烷-2，9-二醇、1，11-二(甲基)丙烯酰氧基-4，8-二氧杂十一烷-2，6，10-三醇等。
作为分子内具有至少两个(甲基)丙烯酰基的烷醇烷(甲基)丙烯酸酯类，可以列举例如：三羟甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、四羟甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、二(三羟甲基丙烷)四(甲基)丙烯酸酯、四羟甲基甲烷三(甲基)丙烯酸酯、四羟甲基甲烷四(甲基)丙烯酸酯、三羟 甲基乙烷三(甲基)丙烯酸酯等。
这些交联性丙烯酸系单体可以单独使用，也可以组合使用两种以上。另外，这些交联性丙烯酸系单体优选为不具有离子交换基的结构。
作为构成交联聚合物粒子的单体，可以进一步使用非交联性单体。
非交联性单体优选为非交联性丙烯酸系单体。
非交联性丙烯酸系单体优选为亲水性的非交联性丙烯酸系单体，可以列举例如：(甲基)丙烯酸烷基酯类、具有羟基的非交联性丙烯酸系单体等。
作为(甲基)丙烯酸烷基酯类，可以列举例如：(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸2-乙基己酯等。 
作为具有羟基的非交联性丙烯酸系单体，可以列举例如：聚乙二醇单(甲基)丙烯酸酯类、聚丙二醇单(甲基)丙烯酸酯类、烷撑二醇单(二甲基)丙烯酸酯类、其他具有羟基的(甲基)丙烯酸酯类等。
作为聚乙二醇单(甲基)丙烯酸酯类，可以列举例如：乙二醇单(甲基)丙烯酸酯、二乙二醇单(甲基)丙烯酸酯、三乙二醇单(甲基)丙烯酸酯、四乙二醇单(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇单(甲基)丙烯酸酯、甲氧基三(聚)乙二醇单(甲基)丙烯酸酯、甲氧基聚乙二醇单(甲基)丙烯酸酯等。
作为聚丙二醇单(甲基)丙烯酸酯类，可以列举例如：丙二醇单(甲基)丙烯酸酯、二丙二醇单(甲基)丙烯酸酯、三丙二醇单(甲基)丙烯酸酯、四丙二醇单(甲基)丙烯酸酯、聚丙二醇单(甲基)丙烯酸酯等。 
作为烷撑二醇单(甲基)丙烯酸酯类，可以列举例如：聚(乙二醇-丙二醇)单(甲基)丙烯酸酯、聚(乙二醇四亚甲基二醇)单(甲基)丙烯酸酯、聚(丙二醇四亚甲基二醇)单(甲基)丙烯酸酯、辛氧基聚乙二醇聚丙二醇一单(甲基)丙烯酸酯等。
作为其他具有羟基的(甲基)丙烯酸酯类，可以列举例如：甘油单(甲基)丙烯酸酯、2-羟基乙基(甲基)丙烯酸酯、2-羟基丙基(甲基)丙烯酸酯、2，3-二羟基乙基(甲基)丙烯酸酯、2，3-二羟基丙基(甲基)丙烯酸酯等。
这些非交联性丙烯酸系单体可以单独使用，也可以组合使用两种以上。另外，这些非交联性丙烯酸系单体优选为不具有离子交换基的结构。
在使用非交联性单体作为构成交联聚合物粒子的单体的情况下，交联性单体与非交联性单体的混合物中的非交联性单体的含量的优选的上限为30重量％。在非交联性单体的含量超过30重量％的情况下，所得到的柱填充剂的耐压性及耐溶胀性下降，有时无法准确地进行血红蛋白类的测定。非交联性单体的含量的更优选的上限为20重量％、进一步优选的上限为10重量％。
作为将交联性单体、或者交联性单体与非交联性单体的混合物(以下也将两者合称为“交联性单体类”)进行聚合的方法，可以列举例如：在聚合引发剂的存在下的乳液聚合法、无皂聚合法(soap-free polymerization)、分散聚合法、悬浮聚合法、种子聚合法等公知的聚合法。其中，优选分散聚合法、悬浮聚合法、种子聚合法。
例如在悬浮聚合法的情况下，将聚合引发剂溶解于交联性单体类中并分散于适当的分散介质中，然后根据需要在氮气等不活泼气体气氛下边搅拌边加温，由此可以得到作为柱填充剂的适当的交联聚合物粒子。
作为交联性单体类的聚合中使用的聚合引发剂，可以使用水溶性或油溶性的公知的自由基聚合引发剂。可以列举例如：过硫酸钾、过硫酸钠、过硫酸铵等过硫酸盐，氢过氧化枯烯、过氧化苯甲酰、过氧化月桂酰、过氧化辛酰、邻氯过氧化苯甲酰、过氧化乙酰、叔丁基过氧化氢、过氧化乙酸叔丁酯、过氧化异丁酸叔丁酯、双(3，5，5-三甲基己酰)过氧化物、过氧化(2-乙基己酸)叔丁酯、二叔丁基过氧化物等有机过氧化物，2，2-偶氮二异丁腈、2，2-偶氮二(2，4-二甲基戊腈)、4，4-偶氮二(4-氰基戊酸)、2，2-偶氮二(2-甲基丁腈)、2，2-偶氮二(2，4-二甲基戊腈)、偶氮二环己烷甲腈等偶氮化合物。
关于聚合引发剂的使用量，相对于交联性单体类100重量份，优选的下限为0.05重量份、优选的上限为5重量份。在聚合引发剂的使用量小于0.05重量份的情况下，未反应的单体残留，有时对血红蛋白类的测定造成不良影响。另外，如果为了使未反应的单体聚合而进行长时间的聚合，则有时在聚合过程中发生凝聚而无法得到粒子。在聚合引发剂的使用 量超过5重量份的情况下，有时由于进行剧烈的聚合反应而产生凝聚物。
另外，在交联性单体类的聚合时可以添加公知的添加剂等。作为这种添加剂，可以列举例如：用于在交联聚合物粒子中形成微孔的多孔化剂、用于控制聚合反应的各种链转移剂、用于使悬浮粒子稳定化的分散剂等。
本发明的血红蛋白类的测定方法中使用的柱填充剂是一种阳离子交换性粒子，所述阳离子交换性粒子包含在交联聚合物粒子的表面含有阳离子交换基的聚合物。
作为阳离子交换基，可以列举例如：羧基、磷酸基、磺酸基等。其中，优选磺酸基。含有阳离子交换基的聚合物可以具有多种不同的阳离子交换基。
需要说明的是，对于本说明书中的“阳离子交换基”而言，与阳离子交换基相伴的结构没有限制，因此包括在末端具有阳离子交换基的全部官能团。例如本说明书中的“羧基”包括羧基乙基、羧基丙基等。
对于含有阳离子交换基的聚合物，优选为使含有阳离子交换基的单体进行聚合而得到的聚合物、或者使含有能够转换为阳离子交换基的官能团的单体进行聚合并且使该官能团转换为阳离子交换基而得到的聚合物。其中，更优选使含有阳离子交换基的单体进行聚合而得到的聚合物。
含有阳离子交换基的单体(以下也称为阳离子交换性单体)，为含有聚合反应性的官能团及阳离子交换基的单体。
阳离子交换性单体优选为含有阳离子交换基的丙烯酸系单体类。
作为含有羧基的丙烯酸系单体，可以列举例如：(甲基)丙烯酸、2-(甲基)丙烯酰氧基乙基琥珀酸酯、2-(甲基)丙烯酰氧基乙基邻苯二甲酸酯等(甲基)丙烯酸衍生物类。
作为含有磷酸基的丙烯酸系单体，可以列举例如：((甲基)丙烯酰氧基乙基)酸性磷酸酯、(2-(甲基)丙烯酰氧基乙基)酸性磷酸酯、(3-(甲基)丙烯酰氧基丙基)酸性磷酸酯等(甲基)丙烯酸衍生物类等。
作为含有磺酸基的丙烯酸系单体，可以列举例如：2-(甲基)丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸、2-磺基乙基(甲基)丙烯酸酯、3-磺基丙基(甲基)丙烯酸酯等(甲基)丙烯酸衍生物类等。
这些阳离子交换性单体可以单独使用，也可以组合使用两种以上。
另外，除这些阳离子交换性单体以外，也可以使用其他非交联性的亲水性单体。作为非交联性的亲水性单体，优选上述具有羟基的非交联性丙烯酸系单体。可以列举例如：聚乙二醇单(甲基)丙烯酸酯类、聚丙二醇单(甲基)丙烯酸酯类、烷撑二醇单(甲基)丙烯酸酯类、其他具有羟基的(甲基)丙烯酸酯类等。
对于使这些阳离子交换性单体在交联聚合物粒子的表面进行聚合而得到的阳离子交换性粒子，优选为在交联聚合物粒子及聚合引发剂的存在下使阳离子交换性单体进行聚合而得到的粒子。其中，更优选为在在内部含有聚合引发剂的交联聚合物粒子的存在下使上述阳离子交换性单体进行聚合而得到的粒子。
关于在内部含有聚合引发剂的交联聚合物粒子，优选为将聚合引发剂溶解于能够使交联聚合物粒子溶胀并且能够将聚合引发剂溶解的有机溶剂中、并使交联聚合物粒子浸渗在该有机溶剂中而得到的粒子。
例如，作为使阳离子交换性单体在交联聚合物粒子的表面进行聚合而得到的阳离子交换性粒子，可以列举：使交联聚合物粒子的内部含有聚合引发剂后，将交联聚合物粒子分散到适当的分散介质中，在该分散介质中添加阳离子交换性单体并进行聚合而得到的粒子等。
关于阳离子交换性粒子，进一步优选为在制备交联聚合物粒子时的聚合反应中，在该聚合反应结束前、即聚合引发剂完全被消耗前，向反应体系中添加阳离子交换性单体来继续聚合反应而得到的粒子。该粒子是利用为了进行交联聚合物粒子的聚合反应而在最初添加的聚合引发剂，使阳离子交换性单体在交联聚合物粒子的表面高效地进行聚合而得到的粒子。
另外，作为阳离子交换性粒子，还优选为使含有能够转换为阳离子交换基的官能团的单体在交联聚合物粒子的表面进行聚合、进而使该官能团转换为阳离子交换基而得到的粒子。
能够转换为阳离子交换基的官能团(以下也称为反应性基团)优选为非离子性的亲水性基团。作为非离子性的亲水性基团，可以列举例如：羟基、二醇基、环氧基、缩水甘油基、伯胺基、仲氨基、氰基、醛基等。其中，优选羟基、环氧基、缩水甘油基、伯胺基、仲氨基，更优选羟基、环氧基、缩水甘油基。
对于含有这些反应性基团的单体(以下也称为反应性单体)，优选(甲基)丙烯酸酯类。 
作为(甲基)丙烯酸酯类，可以列举例如：聚乙二醇单(甲基)丙烯酸酯类、聚丙二醇(甲基)丙烯酸酯类、烷撑二醇单(甲基)丙烯酸酯类、环氧化或羟基化(甲基)丙烯酸酯类、氨基化(甲基)丙烯酸酯类、醛基化或氰基化(甲基)丙烯酸酯类等。
作为聚乙二醇单(甲基)丙烯酸酯类，可以列举例如：乙二醇单(甲基)丙烯酸酯、二乙二醇单(甲基)丙烯酸酯、三乙二醇单(甲基)丙烯酸酯、四乙二醇单(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇单(甲基)丙烯酸酯、甲氧基三(聚)乙二醇单(甲基)丙烯酸酯、甲氧基聚乙二醇单(甲基)丙烯酸酯等。
作为聚丙二醇(甲基)丙烯酸酯类，可以列举例如：丙二醇单(甲基)丙烯酸酯、二丙二醇单(甲基)丙烯酸酯、三丙二醇单(甲基)丙烯酸酯、四丙二醇单(甲基)丙烯酸酯、聚丙二醇单(甲基)丙烯酸酯等。 
作为烷撑二醇单(甲基)丙烯酸酯类，可以列举例如：聚(乙二醇-丙二醇)单(甲基)丙烯酸酯、聚(乙二醇-四亚甲基二醇)单(甲基)丙烯酸酯、聚(丙二醇-四亚甲基二醇)单(甲基)丙烯酸酯、辛氧基聚乙二醇聚丙二醇-单(甲基)丙烯酸酯等。
作为环氧化或羟基化(甲基)丙烯酸酯类，可以列举例如：缩水甘油基(甲基)丙烯酸酯、丙三醇单(甲基)丙烯酸酯、2-羟基乙基(甲基)丙烯酸酯、2-羟基丙基(甲基)丙烯酸酯、2，3-二羟基乙基(甲基)丙烯酸酯、2，3-二羟基丙基(甲基)丙烯酸酯等。
作为氨基化(甲基)丙烯酸酯类，可以列举例如：2-氨基乙基(甲基)丙烯酸酯、2，3-二氨基乙基(甲基)丙烯酸酯、2-氨基丙基(甲基)丙烯酸酯、2，3-二氨基丙基(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酰胺等。
作为醛基化或氰基化(甲基)丙烯酸酯类，可以列举例如：(甲基)丙烯醛、氰基(甲基)丙烯酸酯、乙基-2-丙烯酸酯等。 
这些反应性单体可以单独使用，也可以组合使用两种以上。
作为使这些反应性单体在交联聚合物粒子的表面进行聚合而得到的粒子，优选代替上述阳离子交换性单体而使反应性单体进行聚合而得到的 粒子。该粒子是在交联聚合物粒子及聚合引发剂的存在下使反应性单体进行聚合而得到的粒子。其中，更优选为在内部含有聚合引发剂的交联聚合物粒子的存在下使反应性单体进行聚合而得到的粒子。
作为将使反应性单体在交联聚合物粒子的表面进行聚合而得到的粒子的反应性基团转换为阳离子交换基而得到的粒子，优选为使具有阳离子交换基的化合物(以下也称为阳离子交换性化合物)与反应性基团进行反应而得到的粒子。
作为使反应性基团与阳离子性化合物进行反应而得到的粒子，可以列举：使用公知的化学反应使反应性基团与阳离子交换性化合物进行反应而得到的粒子。可以列举例如：使在表面具有作为反应性基团的羟基的交联聚合物粒子、与作为阳离子交换性化合物的溴乙烷磺酸钠等卤代乙烷磺酸类、氯乙酸钠等卤代乙酸类在氢氧化碱水溶液中进行反应而得到的、在交联聚合物粒子的表面具有磺酸基或羧基的阳离子交换性粒子。
另外可以列举：使在表面具有作为反应性基团的羟基的交联聚合物粒子、与作为阳离子交换性化合物的具有阳离子交换基的醛基化合物在酸催化剂下进行缩醛化反应而得到的、在交联聚合物粒子的表面具有阳离子交换基的阳离子交换性粒子。
另外可以列举：使在表面具有作为反应性基团的羟基的交联聚合物粒子、与作为阳离子交换性化合物的丙三羧酸、丁烷四甲酸等多官能羧酸化合物进行基于脱水反应的酯化而得到的、在交联聚合物粒子的表面具有羧基的阳离子交换性粒子。
另外可以列举：使在表面具有作为反应性基团的羟基的交联聚合物粒子、与作为阳离子交换性化合物的1，3-丙磺酸内酯、1，4-丁磺酸内酯等在氢氧化碱的水溶液中或有机溶剂溶液中进行反应而得到的、在交联聚合物粒子的表面具有磺酸基的阳离子交换性粒子。
作为使反应性基团与阳离子性化合物进行反应而得到的粒子，可以列举以下的1)、2)、3)等粒子。1)使在表面具有作为反应性基团的环氧基或缩水甘油基的交联聚合物粒子、与作为阳离子交换性化合物的硫酸钠、牛磺酸、乙醇酸等进行反应而得到的、在交联聚合物粒子的表面具有磺酸基或羧基的阳离子交换性粒子。2)对在表面具有作为反应性基团的 环氧基或缩水甘油基的交联聚合物粒子、与醚合三氟化硼及作为阳离子交换性化合物的亚硫酸钠进行加热处理而得到的、在交联聚合物粒子的表面具有磺酸基的阳离子交换性粒子。3)使在表面具有作为反应性基团的氨基的交联聚合物粒子、与表氯醇、三缩水甘油醚等环氧化合物在氢氧化碱的水溶液中或有机溶剂溶液中进行反应而发生环氧化后进行与上述的环氧基或缩水甘油基的情况相同的处理而得到的、在交联聚合物粒子的表面具有阳离子交换基的阳离子交换性粒子。
阳离子交换性粒子的体积平均粒径的优选的下限为5μm、优选的上限为30μm。在阳离子交换性粒子的体积平均粒径小于5μm的情况下，输送洗脱液时的压力值增大，难以得到本发明中规定的压力范围内的柱。在体积平均粒径超过30μm的情况下，柱内的孔隙率增大，测定试样等扩散，峰变得易于钝化，因此有时测定精度下降。阳离子交换性粒子的体积平均粒径的更优选的下限为6μm、更优选的上限为25μm。
对于填充了阳离子交换性粒子的柱，具有阳离子交换性粒子的体积平均粒径越小则柱的压力值越大，阳离子交换性粒子的体积平均粒径越大则柱的压力值越小的倾向。因此，在要使柱的压力值下降的情况下，则使阳离子交换性粒子的体积平均粒径增大，在要使柱的压力值上升的情况下，则使阳离子交换性粒子的体积平均粒径减小，由此能够进行微调整。
本发明的血红蛋白类的测定方法中使用的柱是填充了上述阳离子交换性粒子的柱，以1.0mL／分钟输送测定中所使用的洗脱液时的压力值为9.8×103Pa以上且29.4×105Pa以下。
以下，将以1.0mL／分钟输送测定中所使用的洗脱液时的柱的压力值称为“柱压力值”，将9.8×103Pa以上且29.4×105Pa以下的压力范围称为“柱的压力规定值”。另外，在本说明书中所说的压力值是在输送泵与柱之间设置压力计且以上述流速输送测定中所使用的洗脱液时压力计所示的值。
在使用柱压力值小于9.8×103Pa的柱情况下，测定体系中产生的压力值难以变得稳定，因此测定精度下降。另外，有时测定时间延长。在使用柱压力值超过29.4×105Pa的柱情况下，成为在高压下的测定，因此测定精度下降。对于本发明的血红蛋白类的测定方法中使用的柱，优选其柱 压力值为4.9×104Pa以上且24.5×105Pa以下的柱。
在本发明的血红蛋白类的测定方法中，作为填充上述阳离子交换性粒子作为柱填充剂的空柱，可以使用金属制、树脂制、玻璃制等的公知的原材料的空柱。另外，可以使用由收纳柱填充剂的柱主体、和含有玻璃料(frit)的终端部件构成的公知的结构的空柱。
本发明的血红蛋白类的测定方法中使用的柱主体的长度的优选的下限为3mm、优选的上限为70mm。在柱主体的长度小于3mm的情况下，填充剂与血红蛋白类的相互作用变得不充分，因此有时分离性能变差，测定精度下降。在柱主体的长度超过70mm的情况下，测定时间延长，另外，变得难以将柱压力值设定为柱的压力规定值。柱主体的长度的更优选的下限为5mm、更优选的上限为50mm。
存在柱主体的长度越短则柱的压力值越小，柱主体的长度越长则柱的压力值越大的倾向。因此，在要使柱的压力值下降的情况下，则缩短柱主体的长度，在要使柱的压力值上升的情况下，则延长柱主体的长度，由此能够进行微调整。
本发明的血红蛋白类的测定方法中使用的柱主体的内径的优选的下限为1mm、优选的上限为10mm。在柱主体的内径小于1mm的情况下，变得难以将柱压力值设定为柱的压力规定值，有时测定精度下降。在柱的内径超过10mm的情况下，有时试样在柱内扩散，因而测定精度下降。另外，测定时间延长。柱主体的更优选内径的下限为2mm、更优选的上限为4mm。
存在柱主体的内径越小则柱的压力值越大，柱主体的内径越大则柱的压力值越小的倾向。因此，在要使柱的压力值下降的情况下，则使柱主体的内径增大，在要使柱的压力值上升的情况下，则使柱主体的内径减小，由此能够进行微调整。
本发明的血红蛋白类的测定方法可以使用连接有上述柱的公知的液相色谱来进行。例如是具备用于导入测定试样的导入装置、用于输送洗脱液的泵、用于检测血红蛋白类的检测器等的液相色谱。本发明的血红蛋白类的测定方法中的液相色谱的构成的一例如图1所示。
对于本发明的血红蛋白类的测定方法所使用的洗脱液，优选使用含 有公知的氯化合物的缓冲液类、有机溶剂类，更优选使用缓冲液类。
作为缓冲液类，可以列举例如：有机酸、无机酸及它们的盐类、氨基酸类、Good缓冲液(Good′s buffer)等。
作为有机酸，可以列举例如：柠檬酸、琥珀酸、酒石酸、苹果酸、乙酸等。
作为无机酸，可以列举例如：盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、硼酸等。
作为氨基酸类，可以列举例如：甘氨酸、牛磺酸、精氨酸等。
另外，这些缓冲液类中可以适当添加通常添加的公知的成分，例如：表面活性剂、聚合物类、亲水性的低分子化合物、离液序列高的离子(chaotropic ions)类等。
进行血红蛋白类的测定时的缓冲液类的盐浓度的优选的下限为10mmol／L、优选的上限为1000mmol／L。在缓冲液类的盐浓度小于10mmol／L的情况下，离子交换反应无法充分进行，因此有时无法将血红蛋白类分离。如果缓冲液类的盐浓度超过1000mmol／L，则有时盐类析出，对系统造成不良影响。
在进行血红蛋白类的测定时，优选将测定体系中产生的压力值设定为9.8×103Pa以上且19.6×105Pa以下。以下，也将测定时的测定体系中产生的压力值称为“测定时的压力值”，将9.8×103Pa以上且19.6×105Pa以下的压力范围称为“测定时的压力规定值”。因此，在以流速1.0mL／分钟的流速进行测定的情况下，柱压力值与测定时的压力值一致。
在测定时的压力值小于9.8×103Pa的情况下，测定时的压力值难以变得稳定，测定精度下降。另外，有时测定时间延长。在测定时的压力值超过19.6×105Pa的情况下，成为在高压下的测定，因此测定精度下降。
测定时的压力值能够通过使洗脱液的输送速度等进行增减等来进行调整。
根据本发明的血红蛋白类的测定方法，可以对各种血红蛋白类进行测定。例如可以对正常人所具有的血红蛋白A0、血红蛋白A1c、血红蛋白F(胎儿性血红蛋白)、血红蛋白A2进行测定。另外，可以对通常被称为异常血红蛋白的血红蛋白类的一部分进行测定。作为异常血红蛋白类，可以列举例如：血红蛋白S、血红蛋白C、血红蛋白D、血红蛋白E等。
需要说明的是，在本说明书中，“可以对上述血红蛋白类进行测定”是指：与公知的血红蛋白类的测定方法同样地，可以以百分率表示相对于在色谱图中出现的全部峰面积的合计或一部分峰面积的合计而言的各血红蛋白的峰面积，从而示出其含有率的情形。
根据本发明的血红蛋白类的测定方法，可以对作为糖尿病的指标的血红蛋白A1c进行测定。使用本发明的血红蛋白类的测定方法的、借助液相色谱的血红蛋白A1c的测定方法也是本发明之一。
根据本发明的血红蛋白类的测定方法，也可以同时对血红蛋白A1c和其他血红蛋白类进行测定。在此所称的“同时”是指：能够在一次测定中将血红蛋白A1c和其他血红蛋白类的峰表现在色谱图上，从而示出测定对象的各血红蛋白类的含有率的情形。
例如，通过将血红蛋白F在血红蛋白A1c之前洗脱出来，可以同时对血红蛋白F和血红蛋白A1c进行测定。使用本发明的血红蛋白类的测定方法的、借助液相色谱的血红蛋白A1c与血红蛋白F的同时测定方法也是本发明之一。
另外，通过将血红蛋白A2在血红蛋白A1c之后洗脱出来，可以同时对血红蛋白A1c和血红蛋白A2进行测定。使用本发明的血红蛋白类的测定方法的、借助液相色谱的血红蛋白A1c与血红蛋白A2的同时测定方法也是本发明之一。
另外，通过将异常血红蛋白类在血红蛋白A1c的前后洗脱出来，可以同时对血红蛋白A1c与异常血红蛋白类进行测定。使用本发明的血红蛋白类的测定方法的、借助液相色谱的血红蛋白A1c与异常血红蛋白类的同时测定方法也是本发明之一。
发明效果
本发明是一种借助液相色谱的血红蛋白类的测定方法，其中，填充阳离子交换性粒子作为柱填充剂，所述阳离子交换性粒子包含在交联聚合物粒子的表面含有阳离子交换基的聚合物，并且使用以1.0mL／分钟输送测定中所使用的洗脱液时的压力值为9.8×103Pa以上且29.4×105Pa以下的柱。通过使用符合上述条件的柱，可以解决在现有的高压条件下的测定的缺点，进而可以在短时间内以高精度对血红蛋白类进行测定。另外，可 以同时对血红蛋白A1c与其他血红蛋白类进行测定。
附图说明
图1是本发明的血红蛋白类的测定方法中的液相色谱的构成的一例。
图2是使用实施例1的柱及测定条件进行正常人血液的血红蛋白A1c的测定时得到的色谱图。
图3是使用实施例1的柱及测定条件进行异常血红蛋白类的测定时得到的色谱图。
图4是使用实施例1的柱及测定条件进行血红蛋白A2的测定时得到的色谱图。
图5是使用比较例1的柱及测定条件进行正常人血液的血红蛋白A1c的测定时得到的色谱图。
图6是使用比较例2的柱及测定条件进行异常血红蛋白类的测定时得到的色谱图。
图7是使用比较例2的柱及测定条件进行血红蛋白A2的测定时得到的色谱图。
图8是示出使用实施例1及比较例4的柱的情况下的、测定时的压力值与同时重现性试验中的CV值的关系的图表。
图9是示出使用实施例1及比较例2的柱的情况下的、测定时的压力值与同时重现性试验中的CV值的关系的图表。
图10是示出使用实施例1及比较例3的柱的情况下的、测定时的压力值与同时重现性试验中的CV值的关系的图表。
图11是示出使用测定例1～7重复测定正常人血液的情况下的血红蛋白A1c值的推移的图表。
图12是示出使用测定例1～7重复测定正常人血液的情况下的同时重现性试验时的CV值的推移的图表。
具体实施方式
以下示出实施例对本发明进一步地详细地进行说明，但本发明并不仅限定于这些实施例。
在实施例1～4中，制备包含在交联聚合物粒子的表面含有阳离子交 换基的聚合物的柱填充剂，制备符合本发明的“柱的压力规定值”的柱。另外，示出使用该柱填充剂在符合本发明的“测定时的压力规定值”的条件下进行测定的例子。
(实施例1)
在四乙二醇二甲基丙烯酸酯(新中村化学工业公司制)200g、二乙二醇二甲基丙烯酸酯(新中村化学工业公司制)50g、及四羟甲基甲烷三丙烯酸酯(新中村化学工业公司制)100g中溶解过氧化苯甲酰(NACALAI TESQUE，INC.制)1.0g。使所得到的混合物分散于5重量％的聚乙烯醇(日本合成化学工业公司制、“Gohsenol GH-20”)水溶液2L中，一边使用旋转桨在转速300rpm下进行搅拌，一边在氮气氛下加热至80℃而进行1小时聚合反应。1小时后，在反应体系中添加溶解有丙烯酰胺-叔丁基磺酸(东亚合成公司制)80g的水溶液200mL，进一步在80℃下进行1小时聚合反应，得到包含在交联聚合物粒子的表面含有阳离子交换基的聚合物的阳离子交换性粒子(柱填充剂)。
将所得到的柱填充剂进行洗涤后，利用粒度分布测定装置(Nicomp公司制、“AccuSizer780”)来测定粒径，结果，体积平均粒径为9.3μm。
将柱填充剂0.8g添加到50mmol／L磷酸缓冲液(pH6.0)30mL中，搅拌后，进行5分钟超声波处理，制备浆料。将全部浆料注入到连接有不锈钢制空柱(柱主体的内径4.6mm、长度35mm)类的柱填充用储料器(容量30mL、AS ONE Corporation制)中。将柱填充用储料器与输送泵(Science公司制、“PU-614GL”)连接，在20MPa的压力下进行填充，得到血红蛋白类测定用的柱。
将所得到的血红蛋白类测定用的柱(分离用柱7)与图1所示的构成的液相色谱1连接。在输送泵3与注射阀5之间连接压力计4(NAGANO KEIKI CO.，LTD.制、“数字压力计GC61”)来测定压力值。测定条件如下所示。以流速1.0mL／分钟输送洗脱液A时的柱压力值为1300×103Pa。
测定条件
·系统：LC-20A系统(岛津制作所公司制)
·洗脱液：洗脱液A：200mmol／L磷酸缓冲液(pH5.8)
洗脱液B：400mmol／L磷酸缓冲液(pH7.8)
·洗脱条件：0.0分钟～1.0分钟：洗脱液A100％
1.0分钟～1.1分钟：洗脱液B100％
1.1分钟～2.0分钟：洗脱液A100％
·流速：1.0mL／分钟
·检测波长：415nm
·试样注入量：10μL
使用上述的柱及测定条件，进行正常人血液中的血红蛋白A1c的测定。
测定试样使用的是：利用含有0.05％的TritonX-100(Sigma-Aldrich公司制)的磷酸缓冲液(pH6.8)将氟化钠采血而得的人体的正常人血液加以溶血稀释至200倍而得的试样。
在上述测定条件下进行测定，结果，所得到的色谱图如图2所示。图2中，峰21表示血红蛋白A1c、峰22表示血红蛋白A0、峰23表示血红蛋白F。血红蛋白A1c与其他血红蛋白类可以在短时间内良好地进行分离。另外，连续进行20次使用相同试样的测定，从而进行同时重现性试验。如表1所示，血红蛋白A1c值(HbA1c)与血红蛋白F值(HbF)的重现性良好。
[表1]
使用上述的柱及测定条件，对包含人工制备的修饰血红蛋白类的试样进行测定。
作为包含修饰血红蛋白类的试样，利用公知的方法制备含有不稳定的血红蛋白A1c的试样(试样L)、含有乙酰化血红蛋白的试样(试样A)、含有氨基甲酰化血红蛋白的试样(试样C)这3种。试样L通过如下方式制备：在正常人血液中添加葡萄糖使其达到2000mg／dL，并在37℃下加热3小时。试样A通过如下方式制备：在正常人血液中添加乙醛使其达到50mg／dL，并在37℃下加热2小时。试样C通过如下方式制备：在正常人血液中添加氰酸钠使其达到50mg／dL，并在37℃下加热2小时。
血红蛋白A1c与修饰血红蛋白类的分离性能通过如下方式进行评价：计算出从包含修饰血红蛋白类的试样(试样L、试样A、试样C)的血红蛋白A1c值中减去作为制备修饰血红蛋白时的原料所使用的正常人血液的血红蛋白A1c值所得到的值(Δ值)，从而进行比较。结果，如表1所示，Δ值均小于0.2％，对于包含修饰血红蛋白类的试样而言，均可以准确地对血红蛋白A1c进行测定。
使用上述的柱，对包含异常血红蛋白的血红蛋白S及血红蛋白C的试样(Helena Laboratories制、“AFSC Hemo Control”)进行测定。所得到的色谱图如图3所示。图3中，峰24表示血红蛋白S、峰25表示血红蛋白C。能够将作为异常血红蛋白类的血红蛋白S及血红蛋白C良好地进行分离。另外，如表1所示，同时重现性试验中的血红蛋白S及血红蛋白C的重现性也良好。
使用上述的柱，对包含血红蛋白A2的试样(Bio-Rad Laboratories，Inc.制、“A2Control Level2”)进行测定。所得到的色谱图如图4所示。图4的峰26表示血红蛋白A2。能够将血红蛋白A2良好地进行分离。另外，如表1所示，同时重现性试验中的血红蛋白A2的重现性也良好。
(实施例2～4)
使实施例1的聚合反应时的搅拌时的转速变小而进行聚合，制备出与实施例1的体积平均粒径不同的柱填充剂。通过与实施例1同样的方法，对体积平均粒径及柱压力值进行测定。聚合时的设定转速、体积平均粒径、所使用的柱的尺寸、柱压力值、测定时的流速、测定时的压力如表1所示。需要说明的是，以下的实施例及比较例中的这些条件及测定结果也均如表1所示。
使用所得到的柱，对实施例1中使用的正常人血液、含有异常血红蛋白的试样、含有血红蛋白A2的试样进行测定，结果，各自得到与图2、图3、图4同样的色谱图。
同时重现性试验的结果、及测定含有修饰血红蛋白类的试样时的Δ值如表1所示。均与使用实施例1的柱的情况同样地良好。
(实施例5、6)
在实施例5、6中，制备出包含在交联聚合物粒子的表面含有阳离子交换基的聚合物、且符合本发明的“柱的压力规定值”的柱。但是，示出在不符合本发明的“测定时的压力规定值”的条件下进行血红蛋白类的测定的例子。
使实施例1的聚合反应时的搅拌时的转速变大而进行聚合，制备体积平均粒径不同的阳离子交换性粒子。通过与实施例1同样的方法，对体积平均粒径及柱压力值进行测定。聚合时的设定转速、体积平均粒径及柱压力值如表1所示。
使用所得到的柱，对实施例1中使用的正常人血液、含有异常血红蛋白的试样、含有血红蛋白A2的试样进行测定，结果，各自得到与图2、图3、图4同样的色谱图。
同时重现性试验的结果、及测定含有修饰血红蛋白类的试样时的Δ值如表1所示。均示出了在实用上没有问题的水平的良好的数值，CV值及Δ值也比使用实施例1～4的柱的情况稍微增大。
(实施例7)
在实施例7中示出：使用实施例5的柱填充剂、并且以符合本发明的“测定时的压力规定值”的方式变更条件而进行测定的例子。
将实施例5的柱填充剂填充于比实施例1中使用的柱子短的不锈钢制空柱(柱主体的内径4.6mm、长度25mm)中。柱压力值的测定结果如表1所示。柱压力值符合本发明的“柱的压力规定值”及“测定时的压力规定值”。
同时重现性试验的结果、及测定含有修饰血红蛋白类的试样时的Δ值如表1所示。任一值均比实施例5有所提高，与实施例1～4的结果是同等的。
(实施例8)
在实施例8中示出：使用实施例6的柱填充剂、并且以符合本发明的“测定时的压力规定值”的方式变更条件而进行测定的例子。
将实施例6的柱填充剂填充于比实施例1中使用的柱子短的不锈钢制空柱(柱主体的内径4.6mm、长度25mm)中。柱压力值的测定结果如表1所示。柱压力值符合本发明的“柱的压力规定值”。另外，将实施例1的测定条件中的洗脱液的流速从1.0mL／分钟变更为0.8mL／分钟，进行测定。测定时的压力值的测定结果如表1所示。测定时的压力值符合本发明的“测定时的压力规定值”。
同时重现性试验的结果、及测定含有修饰血红蛋白类的试样时的Δ值如表1所示。任一值均有所提高，与实施例1～4的结果是同等的。
从实施例7及8可以确认出，通过使用符合本发明的“柱的压力规定值”的柱填充剂，从而可以得到良好的重现性，另外，通过在符合本发明的”测定时的压力规定值”的条件下进行测定，从而可以提高重现性。
(比较例1)
在比较例1中示出：使实施例1的聚合反应时的搅拌时的转速变小而进行聚合，制备出不符合本发明的“柱的压力规定值”的柱来测定血红蛋白类的例子。
通过与实施例1同样的方法，对体积平均粒径及柱压力值进行测定。聚合时的设定转速、体积平均粒径及柱压力值如表1所示。
使用所得到的柱，对实施例1中使用的正常人血液、含有异常血红蛋白的试样、含有血红蛋白A2的试样进行测定。对正常人血液进行测定，结果，所得到的色谱图如图5所示。比较图2和图5可知，在使用比较例1中得到的柱的情况下，血红蛋白A1c及其他血红蛋白类的分离性能差。另外，异常血红蛋白类、血红蛋白A2完全无法进行分离。
同时重现性试验的结果、及测定含有修饰血红蛋白类的试样时的Δ值如表1所示。均比使用实施例1的柱的情况差。
(比较例2)
在比较例2中示出：使实施例1的聚合反应时的搅拌时的转速变大而进行聚合，制备出不符合本发明的“柱的压力规定值”的柱，使用该柱 来测定血红蛋白类的例子。
使用所得到的柱，通过与实施例1同样的方法，对体积平均粒径及柱压力值进行测定。聚合时的设定转速、体积平均粒径及柱压力值如表1所示。
使用所得到的柱，对实施例1中使用的正常人血液进行测定，结果，得到与图5同样的色谱图。另外，对实施例1中使用的含有异常血红蛋白的试样、含有血红蛋白A2的试样进行测定，结果，所得到的色谱图各自如图6、图7所示。在使用比较例2中得到的柱的情况下，血红蛋白A1c及其他血红蛋白类的分离性能差。
同时重现性试验的结果及测定含有修饰血红蛋白类的试样时的Δ值如表1所示。均比使用实施例1的柱的情况差。
(比较例3)
在比较例3中示出：通过变更实施例1的聚合反应时的搅拌时的转速以外的条件来制备出不符合本发明的“柱的压力规定值”的柱，从而测定血红蛋白类的例子。
将实施例1的聚合时使用的丙烯酰胺-叔丁基磺酸由80g增加至160g，其他条件与实施例1同样，得到柱填充剂。通过与实施例1同样的方法，对体积平均粒径及柱压力值进行测定。聚合时的设定转速、体积平均粒径及柱压力值如表1所示。
对实施例1中使用的正常人血液、含有异常血红蛋白的试样、含有血红蛋白A2的试样进行测定，结果，所得到的色谱图分别与图5、图6、图7同样，血红蛋白A1c及其他血红蛋白类的分离性能差。
同时重现性试验的结果、及测定含有修饰血红蛋白类的试样时的Δ值如表1所示。均比使用实施例1的柱的情况差。
(比较例4)
在比较例4中示出：制备出虽然不包含在交联聚合物粒子的表面含有阳离子交换基的聚合物、但符合本发明的“柱的压力规定值”的柱，在符合本发明的“测定时的压力规定值”的条件下进行测定的例子。
在三乙二醇二甲基丙烯酸酯200g、二乙二醇二甲基丙烯酸酯50g、四羟甲基甲烷三丙烯酸酯100g及丙烯酰胺-叔丁基磺酸(东亚合成公司制) 80g中溶解过氧化苯甲酰(NACALAI TESQUE，INC.制)1.0g。使所得到的混合物分散于5重量％的聚乙烯醇(日本合成化学工业公司制、“Gohsenol GH-20”)水溶液2L中，以边使用旋转桨在转速300rpm下进行搅拌，一边在氮气气氛下加热至80℃而进行10小时聚合反应。得到不包含在交联聚合物粒子的表面含有阳离子交换基的聚合物的阳离子交换性粒子(柱填充剂)。
通过与实施例1同样的方法，对体积平均粒径及柱压力值进行测定。所得到的结果如表1所示。
对实施例1中使用的正常人血液、含有异常血红蛋白的试样、含有血红蛋白A2的试样进行测定。对正常人血液进行测定，结果，所得到的色谱图与图5同样，血红蛋白A1c及其他血红蛋白类的分离性能差。另外，异常血红蛋白类、血红蛋白A2完全无法进行分离。
同时重现性试验的结果及测定含有修饰血红蛋白类的试样时的Δ值如表1所示。均比使用实施例1的柱的情况差。
(评价)
使用实施例及比较例的柱填充剂或柱来进行性能评价。
(1)柱填充剂的结构对重现性的影响
在该评价(1)中，使用实施例1及比较例4的柱填充剂，使测定时的压力值进行变化，考察对实施例1中进行的同时重现性试验中的CV值的影响。测定时的压力值的变更通过如下方式进行：将柱填充剂填充至柱主体的长度为35mm和15mm的2种空柱中，并使流速变更为0.5mL／分钟～2.5mL/分钟。
测定时的压力值和CV值的关系如图8所示。在使用包含在交联聚合物粒子的表面含有阳离子交换基的聚合物的柱填充剂(实施例1中得到的柱填充剂)，并使用符合柱的规定压力值的柱的情况下，得到了良好的重现性。另外，在符合测定时的规定压力值的条件下，重现性提高。
在使用不包含在交联聚合物粒子的表面含有阳离子交换基的聚合物的柱填充剂(比较例4中得到的柱填充剂)的情况下，即使为符合柱的规定压力值的条件，重现性也不好。另外，没有观察到测定时的规定压力值的影响。
(2)是否符合柱压力规定值对重现性的影响1
在该评价(2)中，使用比较例2的柱填充剂，通过与上述评价(1)同样的方法对测定时的压力值、与实施例1中进行的同时重现性试验中的CV值的关系进行考察。
所得到的测定时的压力值与CV值的关系如图9所示。比较例2的柱填充剂是包含在交联聚合物粒子的表面含有阳离子交换基的聚合物的柱填充剂，但不符合本发明的“柱的规定压力值”。此时，重现性不良，即使在符合测定时的规定压力值的条件下进行测定，重现性也没有提高。
(3)是否符合柱压力规定值对重现性的影响2
在该评价(3)中，使用比较例3的柱填充剂，通过与上述评价(1)同样的方法对测定时的压力值、与实施例1中进行的同时重现性试验中的CV值的关系进行考察。
所得到的测定时的压力值与CV值的关系如图10所示。比较例3的柱填充剂是包含在交联聚合物粒子的表面含有阳离子交换基的聚合物的阳离子交换性粒子，但是不符合本发明的“柱的规定压力值”。此时，重现性不良，即使在符合测定时的规定压力值的条件下进行测定，重现性也没有提高。
根据上述的评价(1)～(3)可知，为了得到良好的重现性，需要使用包含在交联聚合物粒子的表面含有阳离子交换基的聚合物的柱填充剂，以及需要使用符合本发明的柱的规定压力值的柱。另外，通过在测定时的规定压力值下进行测定，从而使重现性进一步提高。
(4)重复测定的影响
使用实施例1、实施例5、比较例2、比较例3、及比较例4的柱填充剂，对同一正常人血液试样进行多次重复测定来考察血红蛋白A1c值的推移。另外，在每200次的测定中，实施实施例1中进行的同时重现性试验，确认其CV值的推移。
使用各柱填充剂制备测定例1～7。各测定例的条件如表2所示。表2的“是否符合本发明的条件”一栏中，符合该条件的条件用“○”表示、不符合该条件的条件用“×”表示。例如测定例1是包含在交联聚合物粒子的表面含有阳离子交换基的聚合物的柱填充剂，因此柱填充剂的结构符 合条件(○)。另外，输送流速1.0mL／分钟的洗脱液的情况下的压力值为1300×103Pa，因此符合柱的规定压力值(○)。另外，测定时的压力值为1300×103Pa，因此符合测定时的压力规定值(○)。
[表2]
图11示出：在这些测定例中进行重复测定而得到的血红蛋白A1c值的推移。测定例1及测定例2的血红蛋白A1c值在3000次的测定后仍稳定。在测定例3中，在2500次的测定以后稍微下降。另外，同时重现性 试验时的CV值在进行了3000次测定时也均稳定。
在测定例4～7中，在1500次的测定以前大幅下降。另外，图12所示的同时重现性时的CV值的推移也显示出同样的倾向。可以确认出，对于本发明的柱子而言，不仅测定开始时的CV值良好，而且可以在多次测定期间维持其精度。
产业上的可利用性
根据本发明，可以提供能够在短时间内高精度地对血红蛋白类进行测定的方法。另外，根据本发明，可以提供血红蛋白A1c的测定方法、血红蛋白A1c与血红蛋白F的同时测定方法、血红蛋白A1c与血红蛋白A2的同时测定方法、及血红蛋白A1c与异常血红蛋白类的同时测定方法。
符号说明
1、液相色谱 
2、洗脱液切换阀
3、输送泵
4、压力计
5、注射阀
6、预过滤器 
7、分离用柱 
8、检测器
9、洗脱液
10、自动取样器 
11、废液容器 
21、血红蛋白A1c
22、血红蛋白A0
23、血红蛋白F(胎儿性Hb)
24、血红蛋白S
25、血红蛋白C
26、血红蛋白A2

Claims (8)

1.一种借助液相色谱的血红蛋白类的测定方法，其中，
填充阳离子交换性粒子作为柱填充剂，所述阳离子交换性粒子包含在交联聚合物粒子的表面含有阳离子交换基的聚合物，并且
使用以1.0mL／分钟输送测定中所使用的洗脱液时的压力值为9.8×103Pa以上且29.4×105Pa以下的柱。
2.如权利要求1所述的血红蛋白类的测定方法，其中，
含有阳离子交换基的聚合物是使含有阳离子交换基的单体在交联聚合物粒子的表面进行聚合而得到的。
3.如权利要求1所述的血红蛋白类的测定方法，其中，
含有阳离子交换基的聚合物是使含有能够转换为阳离子交换基的官能团的单体在交联聚合物粒子的表面进行聚合而得到的。
4.如权利要求1、2或3中任一项所述的血红蛋白类的测定方法，其中，将测定体系中产生的压力值设定为9.8×103Pa以上且19.6×105Pa以下。
5.一种借助液相色谱的血红蛋白A1c的测定方法，其使用权利要求1、2、3或4中任一项所述的血红蛋白类的测定方法。
6.一种借助液相色谱的血红蛋白A1c与血红蛋白F的同时测定方法，其使用权利要求1、2、3或4中任一项所述的血红蛋白类的测定方法。
7.一种借助液相色谱的血红蛋白A1c与血红蛋白A2的同时测定方法，其使用权利要求1、2、3或4中任一项所述的血红蛋白类的测定方法。
8.一种借助液相色谱的血红蛋白A1c与异常血红蛋白类的同时测定方法，其使用权利要求1、2、3或4中任一项所述的血红蛋白类的测定方法。
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