JP2014095638A - ヘモグロビンａ０分画の分離方法 - Google Patents

Abstract

【課題】カチオン交換クロマトグラフィーにより、短時間で再現性良くヘモグロビンＡ０分画を分離する方法を提供する。
【解決手段】カチオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ０分画の分離方法であって、下記溶離液Ａ及び溶離液Ｂの少なくとも二種類の溶離液と、カチオン交換基を有するカラム充填剤とを用い、測定系に生じる圧力値を９．８×１０^３Ｐａ以上１９．６×１０^５Ｐａ以下に設定するヘモグロビンＡ０分画の分離方法。
溶離液Ａ：ｐＨが４．０〜６．０であって、下記（１）、（２）、及び、（３）の全ての成分を含む溶離液
（１）カオトロピックイオン
（２）酸解離定数を３．５以上６．５未満の範囲に有し、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、及び、アミノ酸からなる群より選択される少なくとも一種である酸又はその塩
（３）酸解離定数を６．５以上９．５以下の範囲に有し、無機オキソ酸及びアミノ酸の少なくともいずれかである酸又はその塩
溶離液Ｂ：ｐＨが溶離液ＡのｐＨよりも０．５〜３．０高く、かつ、濃度が溶離液Ａの濃度よりも２０〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ小さく、溶離液Ａの送液後に送液する溶離液
【選択図】なし

Description

本発明は、カチオン交換クロマトグラフィーにより、短時間で再現性良くヘモグロビンＡ０分画を分離する方法に関する。

液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法は、他の測定方法と比較して精度が良く、短時間で測定できるため、特に糖尿病患者の安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定値（ヘモグロビンＡ１ｃ値）の管理に用いられている。この用途では、同時再現性試験時におけるヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値（％）が１．０％以下程度の精度が要求される。

安定型ヘモグロビンＡ１ｃの高精度測定のためには、安定型ヘモグロビンＡ１ｃと他のヘモグロビン類との良好な分離が必要である。高い分離性能を得るための一般的な手段は、カラム充填剤粒子の粒径を小さくし、より均一にすることである。例えば、特許文献１には、平均粒径値が３〜４μｍの微小な充填剤を用いて安定型ヘモグロビンＡ１ｃを測定する方法が開示されている。しかし、その結果、測定系にかかる圧力は５０×１０^５Ｐａ以上と大きくなる。そのため、使用する液体クロマトグラフは高い耐圧性能が必要になり、高価で複雑な構造になる。また、測定系に常時高圧がかかるため、長期間使用した場合の配管系の詰まりや劣化、カラム寿命の短縮等の弊害をもたらす。安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定のような多数の検体を測定する項目においては、カラム寿命はコストに直接影響を及ぼすため、短期間で測定精度が低下するカラムは実用上使用できない。従来の方法で高精度測定を行う場合は、特許文献１に示された圧力値と同等か、それ以上の圧力値が生じる。

高圧測定での問題を回避するために測定系に生じる圧力値を小さくする方法として、粒径値が大きいカラム充填剤を用いる方法がある。しかしこの方法では、カラム内の空隙率の増加によって分離性能が低下し、ヘモグロビンＡ１ｃ値の測定精度の低下、及び、カラム寿命の短縮という問題が生じる。また、測定時の流速を小さくする方法もある。しかしこの方法では、流量が不安定になり分離性能の低下によるヘモグロビンＡ１ｃ値の測定精度の低下、及び、測定時間の延長等の問題が生じる。

一方、安定型ヘモグロビンＡ１ｃをより精度よく分離するための溶離液に関する技術も開示されている。溶離液の変更は、充填剤の変更に比べて容易にできるため、クロマトグラフィーの改良手段として有益である。安定型ヘモグロビンＡ１ｃを測定する際の溶離液の成分は、通常の液体クロマトグラフィーに用いる緩衝液の成分が適宜用いられている。例えば、リン酸やホウ酸等の無機オキソ酸を含む緩衝液を用いる方法（特許文献２〜５）、有機酸やアミノ酸を含む緩衝液を用いる方法（特許文献６、７）等が開示されている。また、溶離液に界面活性剤を添加する方法（特許文献８、９）、カオトロピックイオンを添加する方法（特許文献２、４、１０）等、各種添加剤を付与することで分離性能の向上が図られている。

通常、糖尿病診断のための測定では、測定時間の短縮のため、ヘモグロビンＡ０分画は１本のピークとして溶出する。しかしヘモグロビンＡ０分画には、ヘモグロビンＡ２や異常ヘモグロビンが含まれる。ヘモグロビンＡ２の測定は、サラセミアの診断に用いられる。また、異常ヘモグロビンであるヘモグロビンＳやヘモグロビンＣの測定は、重篤な貧血等の遺伝子疾患の検出に用いられる。例えば、特許文献１１では、特定の複数の溶離液を用いることにより、ヘモグロビンＡ０分画に含まれるヘモグロビンＡ２、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを同時に測定できるとしている。

しかし、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、ヘモグロビンＡ２、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを短時間で同時に測定する場合は、安定型ヘモグロビンＡ１ｃのみを測定する場合に比べて、分離するピーク数が増えるため、各ピークを高精度に分離することが困難になる。また、安定型ヘモグロビンＡ１ｃと、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣの保持時間が大きく異なるため測定時間が延長する。
多くのピークを短時間で分離するためには、より高い分離性能が必要である。上記の溶離液に関する従来技術では、短時間測定で分離性能を高くすることが困難なため、結局小粒径のカラム充填剤を用いることになり、高圧下での測定における上記問題が生じる。特に、長期間測定を行った場合には、使用初期には良好であった測定再現性が低下する問題が生じる。
また、保持時間の大きく異なる成分を同時に測定する場合、特許文献１に開示されているような、測定時間の短縮化のために比較的保持時間が短い成分を濃度の低い溶離液で溶出させた後、濃度の高い溶離液に変更して、比較的保持時間が長い成分を溶出させることが行われている（濃度の正のグラジエント法）。しかし、このような従来の方法によりヘモグロビン類の測定を行う場合、長期間の測定で再現性が低下するという問題がある。

特開平５−００５７３０号公報 特開平３−１０２２５９号公報 特開平３−２５５３６０号公報 特開昭６３−７５５５８号公報 特開昭５８−２１００２４号公報 特開平５−６０７４２号公報 特開平１１−２９５２８６号公報 特開平５−５７３０号公報 特開平１０−１０１０８号公報 特開２０００−５５８９９号公報 特開２００１−１５９６２５号公報

本発明は、カチオン交換クロマトグラフィーにより、短時間で再現性良くヘモグロビンＡ０分画を分離し、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ及びヘモグロビンＡ０分画中のヘモグロビン類を同時に測定する方法を提供することを目的とする。

本発明は、カチオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ０分画の分離方法であって、下記溶離液Ａ及び溶離液Ｂの少なくとも二種類の溶離液と、カチオン交換基を有するカラム充填剤とを用い、測定系に生じる圧力値を９．８×１０^３Ｐａ以上１９．６×１０^５Ｐａ以下に設定するヘモグロビンＡ０分画の分離方法である。
溶離液Ａ：ｐＨが４．０〜６．０であって、下記（１）、（２）、及び、（３）の全ての成分を含む溶離液
（１）カオトロピックイオン
（２）酸解離定数を３．５以上６．５未満の範囲に有し、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、及び、アミノ酸からなる群より選択される少なくとも一種である酸又はその塩
（３）酸解離定数を６．５以上９．５以下の範囲に有し、無機オキソ酸及びアミノ酸の少なくともいずれかである酸又はその塩
溶離液Ｂ：ｐＨが溶離液ＡのｐＨよりも０．５〜３．０高く、かつ、濃度が溶離液Ａの濃度よりも２０〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ小さく、溶離液Ａの送液後に送液する溶離液
以下に本発明を詳述する。

本発明は、カチオン交換基を有するカラム充填剤を用いるカチオン交換クロマトグラフィーにおいて、特定の成分並びに特定のｐＨ及び濃度を有する少なくとも二種類の溶離液を特定の順序で送液する方法、即ち、従来の「濃度の正のグラジエント法」ではなく、「ｐＨの正のグラジエント及び濃度の負のグラジエントを併用する方法」を用いる。
本発明者は、このグラジエント法を用いた測定方法が、測定系に生じる圧力値を従来よりも低い特定の範囲に設定する場合にのみ、短時間の測定においてもヘモグロビンＡ０分画に含まれる成分の良好な再現性を示すことを見出した。
その結果、短時間で再現性良く安定型ヘモグロビンＡ１ｃと、通常ヘモグロビンＡ０分画に含まれるヘモグロビンＡ２、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣの少なくとも一種以上を同時に測定できること、並びにこの良好な再現性を長期間に亘って維持できることを見出し、本発明を完成させた。

本発明方法の分離対象とする「ヘモグロビンＡ０分画」とは、糖尿病診断のために一般に行われるカチオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ１ｃの測定において、ヘモグロビンＡ１ｃの後に溶出させるヘモグロビンＡ０分画を指す。即ち、健常人血液の場合、ヘモグロビンＡ１ａ、ヘモグロビンＡ１ｂ、ヘモグロビンＦ、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ及び安定型ヘモグロビンＡ１ｃを含むファーストフラクション以外の成分である。
本発明の方法により分離できるヘモグロビンＡ０分画中のヘモグロビンは、具体的には、ヘモグロビンＡ２、ヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＣの内の少なくとも一種のヘモグロビンを指す。

本発明に用いる溶離液Ａは、ｐＨが４．０〜６．０である。溶離液ＡのｐＨが４．０未満の場合、安定型ヘモグロビンＡ１ｃの溶出が遅くなり、測定時間が延長する。また、ヘモグロビン類が変性して分離性能が悪くなり、測定精度が低下する。溶離液ＡのｐＨが６．０を超える場合、カチオン交換反応が充分行われなくなり、分離性能が低下する。溶離液ＡのｐＨの好ましい下限は４．２、好ましい上限は５．８である。

溶離液Ａはカオトロピックイオン（以下、成分（１）ともいう）を含有する。
カオトロピックイオンとしては、例えば、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン等の陰イオン性カオトロピックイオン類や、カルシウムイオン、リチウムイオン、カリウムイオン、グアニジウムイオン等の陽イオン性カオトロピックイオン類等が挙げられる。なかでも、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、グアニジウムイオンが好ましく、過塩素酸イオン、硝酸イオン、グアニジウムイオンがより好ましい。溶離液Ａは、二種類以上の成分（１）を含有してもよい。

溶離液Ａ中の成分（１）の濃度の好ましい下限は０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は４００ｍｍｏｌ／Ｌである。成分（１）の濃度が０．１ｍｍｏｌ／Ｌ未満の場合及び４００ｍｍｏｌ／Ｌを超える場合は、安定型ヘモグロビンＡ１ｃの分離性能が低下することがある。成分（１）の濃度のより好ましい下限は１ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は３００ｍｍｏｌ／Ｌである。

溶離液Ａは、酸解離定数（ｐＫａ値）を３．５以上６．５未満の範囲に有し、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、及び、アミノ酸からなる群より選択される少なくとも一種である酸又はその塩（以下、成分（２）ともいう）を含有する。
なお、本明細書において、「ｐＫａ値を３．５以上６．５未満の範囲に有し、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、及び、アミノ酸からなる群より選択される少なくとも一種である酸又はその塩」とは、「ｐＫａ値を３．５以上６．５未満の範囲に有し、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、及び、アミノ酸からなる群より選択される少なくとも一種である酸」又は「ｐＫａ値を３．５以上６．５未満の範囲に有し、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、及び、アミノ酸からなる群より選択される少なくとも一種である酸」の塩を意味する。

溶離液Ａが成分（２）を含まない場合、安定型ヘモグロビンＡ１ｃの分離性能が悪くなる。また、溶離液ＡのｐＨが変動しやすくなり、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値の測定再現性が低下する。成分（２）のｐＫａ値の範囲は、３．８以上６．５未満であることが好ましい。
なお、二つ以上のｐＫａ値を有する酸の場合、そのうちの少なくとも１つのｐＫａ値が３．５以上６．５未満であれば、この酸又はその塩は成分（２）のｐＫａ値の条件を満たすものとする。

成分（２）は、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、アミノ酸、又は、これらの塩が好ましい。これらの酸又は塩から生ずるカルボキシル基により安定型ヘモグロビンＡ１ｃの分離性能が向上する。
成分（２）のモノカルボン酸としては、例えば、乳酸、グリコール酸、ギ酸、酢酸等が挙げられる。
成分（２）のジカルボン酸としては、例えば、シュウ酸、オキサロ酢酸、マレイン酸、マロン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、フマル酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸、グルタル酸、アジピン酸等が挙げられる。
成分（２）のトリカルボン酸としては、例えば、クエン酸、イソクエン酸等が挙げられる。
成分（２）のアミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、β−アラニン、ヒスチジン、グルタミン酸等が挙げられる。
なかでも、ジカルボン酸又はその塩、トリカルボン酸又はその塩が好ましく、コハク酸又はその塩、クエン酸又はその塩がより好ましい。
溶離液Ａは、二種類以上の成分（２）を含有してもよい。

溶離液Ａ中の成分（２）の濃度の好ましい下限は０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は４００ｍｍｏｌ／Ｌである。成分（２）の濃度が０．１ｍｍｏｌ／Ｌ未満の場合、溶離液ＡのｐＨが変動しやすくなり、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値の測定再現性が低下することがある。成分（２）の濃度が４００ｍｍｏｌ／Ｌを超える場合、クロマトグラムのベースラインが不安定になることがある。成分（２）の濃度のより好ましい下限は１ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は３００ｍｍｏｌ／Ｌである。

溶離液Ａは、ｐＫａ値を６．５以上９．５以下の範囲に有し、無機オキソ酸及びアミノ酸の少なくともいずれかである酸又はその塩（以下、成分（３）ともいう）を含有する。
なお、本明細書において、「ｐＫａ値を６．５以上９．５以下の範囲に有し、無機オキソ酸及びアミノ酸の少なくともいずれかである酸又はその塩」とは、「ｐＫａ値を６．５以上９．５以下の範囲に有し、無機オキソ酸及びアミノ酸の少なくともいずれかである酸」又は「ｐＫａ値を６．５以上９．５以下の範囲に有し、無機オキソ酸及びアミノ酸の少なくともいずれかである酸」の塩を意味する。

溶離液Ａが成分（３）を含まない場合、安定型ヘモグロビンＡ１ｃの分離性能が悪くなる。成分（３）のｐＫａ値は、６．５以上９．２以下であることがより好ましい。
なお、二つ以上のｐＫａ値を有する酸の場合、そのうちの少なくとも１つのｐＫａ値が６．５以上９．５以下であれば、この酸又はその塩は成分（３）のｐＫａ値の条件を満たすものとする。

成分（３）は、無機オキソ酸、アミノ酸又はこれらの塩である。これらの酸又は塩から生じるオキソ酸イオン又はカルボキシル基により安定型ヘモグロビンＡ１ｃの分離性能が向上する。
成分（３）の無機オキソ酸としては、例えば、リン酸、ピロリン酸、ホウ酸等が挙げられる。
成分（３）のアミノ酸としては、例えば、アスパラギン、ヒスチジン、セリン、トリプトファン、チロシン、アルギニン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、システイン、グルタミン等が挙げられる。
なかでも、無機オキソ酸又はその塩が好ましく、リン酸又はその塩がより好ましい。溶離液Ａは、二種類以上の成分（３）を含有してもよい。

溶離液Ａ中の成分（３）の濃度の好ましい下限は０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は４００ｍｍｏｌ／Ｌである。成分（３）の濃度が０．１ｍｍｏｌ／Ｌ未満の場合、溶離液ＡのｐＨが変動しやすくなり、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値の測定再現性が低下することがある。成分（３）の濃度が４００ｍｍｏｌ／Ｌを超える場合、クロマトグラムのベースラインが不安定になることがある。成分（３）の濃度のより好ましい下限は１ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は３００ｍｍｏｌ／Ｌである。

表１に主要な酸のｐＫａ値を示した（ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ， ８７ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００７）。本明細書では、ｐＫａ値として、表１に示した値を採用する。なお、表１に示していない酸のｐＫａ値については、電位差滴定法、吸光度法、電気泳動法等の公知の方法によって測定される値を用いる。表１の「○」は成分（２）の条件又は成分（３）の条件を満たすもの、「×」は成分（２）の条件又は成分（３）の条件を満たさないものを示す。
また、溶離液Ａが成分（２）の条件及び成分（３）の条件の両方を満たす一種類以上の酸又はその塩を含有する場合は、当該溶離液Ａは成分（２）及び成分（３）の両方を含有することとする。

溶離液Ａの濃度の好ましい下限は２１ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は５００ｍｍｏｌ／Ｌである。溶離液Ａの濃度が２１ｍｍｏｌ／Ｌ未満である場合又は５００ｍｍｏｌ／Ｌを超える場合は、安定型ヘモグロビンＡ１ｃの分離性能が低下することがある。溶離液Ａの濃度のより好ましい下限は２５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は４００ｍｍｏｌ／Ｌである。
なお、本明細書における「溶離液の濃度」とは、各溶離液が含有する成分（成分（１）、成分（２）、成分（３）を含む）の合計の濃度を指す。

溶離液Ａは、上述した溶離液Ａの条件の範囲内で、組成や物性の異なる複数の溶離液Ａを用いてもよい。

溶離液Ａは、ヘモグロビンＡ０よりも早い保持時間を有するヘモグロビン類を溶出させるために用いることが好ましい。溶離液Ａが溶出させるヘモグロビン類には安定型ヘモグロビンＡ１ｃが含まれることが好ましい。

本発明の測定方法では、溶離液Ａの送液後に溶離液Ｂを送液する。
溶離液Ｂは、ｐＨが溶離液ＡのｐＨよりも０．５〜３．０高い溶離液である。溶離液ＢのｐＨが溶離液ＡのｐＨよりも０．５〜３．０高くない場合は、ヘモグロビンＡ０分画の分離精度が悪くなり、ヘモグロビンＡ２、ヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＣの測定精度が低下する。溶離液ＢのｐＨは、溶離液ＡのｐＨよりも０．８〜２．８高いことが好ましい。
また、溶離液ＢのｐＨは４．５〜９．０が好ましく、５．０〜８．６がより好ましい。

溶離液Ｂの濃度は、溶離液Ａの濃度よりも２０〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ小さい。溶離液Ｂの濃度が溶離液Ａの濃度より２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上小さくない場合又は２００ｍｍｏｌ／Ｌを越えて小さい場合、ヘモグロビンＡ０とヘモグロビンＡ２、又は、ヘモグロビンＡ０とヘモグロビンＳの分離精度が低下する。溶離液Ｂの濃度は、溶離液Ａの濃度よりも２５〜１８０ｍｍｏｌ／Ｌ小さいことが好ましい。
また、溶離液Ｂの濃度は、１〜３００ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、５〜２００ｍｍｏｌ／Ｌがより好ましい。
なお、複数の溶離液Ａを用いた場合は、溶離液Ｂの直前に送液する溶離液Ａに対して、溶離液ＢのｐＨ及び濃度が上記規定範囲内である必要がある。

溶離液Ｂは、ｐＨ及び濃度が異なること以外は、溶離液Ａと同様の成分を含む溶離液でもよい。また、溶離液Ａが含む成分（１）、成分（２）、及び、成分（３）のいずれか一種以上を含んでいてもよい。

溶離液Ｂは、上述した条件を満たす範囲内で、組成や物性の異なる複数の溶離液Ｂを用いてもよい。

溶離液Ｂは、ヘモグロビンＡ０分画、即ち、ヘモグロビンＡ０及びヘモグロビンＡ０よりも遅い保持時間を有するヘモグロビン類を溶出させるために用いることが好ましい。溶離液Ｂが溶出させるヘモグロビン類にはヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＡ２、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣが含まれることが好ましい。

本発明の測定方法において、溶離液の切り替え方法はステップワイズグラジエント法でもよいし、リニアグラジエント法でもよい。
ステップワイズグラジエント法では、安定型ヘモグロビンＡ１ｃを含む、ヘモグロビンＡ０よりも早い保持時間を有する成分を溶離液Ａで溶出した後、溶離液Ｂに切り替えて、ヘモグロビンＡ０分画、即ち、ヘモグロビンＡ０並びにヘモグロビンＡ２、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含むヘモグロビンＡ０よりも遅い保持時間を有する成分を溶出することが好ましい。
リニアグラジエント法では、溶離液Ａを主成分とする溶離液により安定型ヘモグロビンＡ１ｃを含む、ヘモグロビンＡ０よりも早い保持時間を有する成分を溶離液Ａで溶出した後、溶離液Ｂを主成分とする溶離液によりヘモグロビンＡ０分画、即ち、ヘモグロビンＡ０並びにヘモグロビンＡ２、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含むヘモグロビンＡ０よりも遅い保持時間を有する成分を溶出することが好ましい。少なくともヘモグロビンＡ０が溶出する段階において、カラム内が、測定開始初期の溶離液（ステップワイズグラジエント法の溶離液Ａに相当）よりも、ｐＨが０．５〜３．０高くかつ濃度が２０〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ小さい溶離液（ステップワイズグラジエント法の溶離液Ｂに相当）になっていることが好ましい。
また、連続測定を行う際には、溶離液Ｂを送液してヘモグロビン類を溶出した後、再び溶離液Ａを送液してカラム内を測定開始時の状態に戻すことが好ましい。

本発明の測定方法では、溶離液Ａ及び溶離液Ｂに加えて、溶離液Ｂの送液後に、ｐＨが７．０〜９．０の溶離液Ｃを送液することが好ましい。溶離液Ｃを用いることにより、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣをより短時間で測定できる。

溶離液ＣのｐＨが７．０未満の場合、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣの溶出が遅くなり、測定時間が延長する。溶離液ＣのｐＨが９．０を超える場合、ヘモグロビンが変性し、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣの分離性能が悪くなることがある。溶離液ＣのｐＨの好ましい下限は７．２、好ましい上限は８．８である。

溶離液Ｃは、ヘモグロビンＡ０よりも遅い保持時間を有するヘモグロビン類を溶出させるために用いることが好ましい。溶離液Ｃが溶出させるヘモグロビン類にはヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣが含まれることが好ましい。溶離液の切り替え方法は、上述した溶離液Ａ及び溶離液Ｂの場合と同様、ステップワイズグラジエント法でもよいし、リニアグラジエント法でもよい。また、連続測定を行う際には、溶離液Ｃを送液してヘモグロビン類を溶出した後、再び溶離液Ａを送液してカラム内を測定開始時の状態に戻すことが好ましい。

溶離液Ｃは、ｐＨが上述した範囲であること以外は、溶離液Ａ又は溶離液Ｂと同様の成分を含む溶離液でもよい。また、溶離液Ａが含む成分（１）、成分（２）、及び、成分（３）のいずれか一種以上を含んでいてもよい。更に、溶離液Ｃは、上述した条件を満たす範囲内で、組成や物性の異なる複数の溶離液Ｃを用いてもよい。

本発明の測定方法では、溶離液Ａ、溶離液Ｂ、及び、溶離液Ｃに加えて、溶離液Ｂの送液後、溶離液Ｃの送液前に、ｐＨが溶離液ＢのｐＨより０．５〜３．０低く、かつ、濃度が溶離液Ｂの濃度よりも２０〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ大きい溶離液Ｄを送液することが好ましい。溶離液Ｄを用いることにより、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣの分離性能が更に向上する。

溶離液ＤのｐＨが溶離液ＢのｐＨよりも０．５〜３．０低くない場合は、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣの分離性能が低下することがある。溶離液ＤのｐＨは、溶離液ＢのｐＨよりも０．８〜２．８低いことが好ましい。
また、溶離液ＤのｐＨは、４．０〜６．０が好ましく、４．２〜５．８がより好ましい。

溶離液Ｄの濃度が溶離液Ｂの濃度よりも２０〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ大きくない場合は、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣの分離精度が低下することがある。溶離液Ｄの濃度は、溶離液Ｂの濃度よりも２５〜１８０ｍｍｏｌ／Ｌ大きいことが好ましい。
溶離液Ｄの濃度は、２１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、２５〜４００ｍｍｏｌ／Ｌがより好ましい。
なお、複数の溶離液Ｂを用いた場合は、溶離液Ｄの直前に送液する溶離液Ｂに対して、溶離液ＤのｐＨ及び濃度が上記規定範囲内である必要がある。

溶離液Ｄは、ヘモグロビンＡ０よりも遅い保持時間を有するヘモグロビン類を溶出させるために用いることが好ましい。溶離液Ｄが溶出させるヘモグロビン類にはヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣが含まれることが好ましい。溶離液の切り替え方法は、上述した溶離液Ａ及び溶離液Ｂの場合と同様、ステップワイズグラジエント法でもよいし、リニアグラジエント法でもよい。

溶離液Ｄは、ｐＨ及び濃度が上述した条件を満たすこと以外は溶離液Ａ、溶離液Ｂ又は溶離液Ｃと同様の成分を含む溶離液でもよい。また、溶離液Ａが含む成分（１）、成分（２）、及び、成分（３）のいずれか一種以上を含んでいてもよい。更に、溶離液Ｄは、上述した条件を満たす範囲内で、組成や物性の異なる複数の溶離液Ｄを用いてもよい。

本発明の測定方法に用いる溶離液は、成分（１）〜（３）以外の無機酸又はその塩類、有機酸又はその塩類、酸性化合物、塩基性化合物、水溶性有機溶媒等の公知の溶離液組成物を含有してもよい。また、界面活性剤、親水性ポリマー類、親水性低分子化合物、防腐剤、安定化剤等の公知の添加剤成分を含有してもよい。

本発明の測定方法に用いるカラム充填剤は、カチオン交換基を有する。
カチオン交換基としては、例えば、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基等が挙げられる。なかでも、スルホン酸基が好ましい。
なお、本発明の測定方法でいうカチオン交換基には、該カチオン交換基に付随する構造は問わないため、カチオン交換基を末端に有する全ての官能基を含む。例えば、本発明の測定方法でいう「カルボキシル基」とは、カルボキシルエチル基、カルボキシルプロピル基等、カルボキシル基が結合する官能基類全てを含む。
また、上記架橋重合体粒子は、表面に複数種のカチオン交換基を有していてもよい。

上記カラム充填剤は、架橋重合体粒子の表面に、カチオン交換基含有重合体を有するカラム充填剤であることが好ましい。

架橋重合体粒子を構成する架橋重合体は、アクリル系重合体（アクリル系架橋重合体）であることが好ましい。
なお、本明細書において、「アクリル系架橋重合体」とは、アクリル基又はメタクリル基を有する架橋性単量体（以下、「アクリル系架橋性単量体」ともいう）の重合物を意味する。また、後述する「（メタ）アクリレート」とは、「アクリレート又はメタクリレート」を示し、「（メタ）アクリル酸」とは、「アクリル酸又はメタクリル酸」を示す。

アクリル系架橋性単量体としては、例えば、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類、分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類等が挙げられる。

ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、ポリテトラメチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール−テトラメチレングリコール）−ジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールポリプロピレングリコールポリエチレングリコール−ジ（メタ）アクリレート、１，３−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサグリコールジ（メタ）アクリレート、１，９−ノナンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、２−ヒドロキシ−１，３−ジ（メタ）アクリロキシプロパン、２−ヒドロキシ−１−（メタ）アクリロキシ−３−（メタ）アクリロキシプロパン、２−ヒドロキシ−３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル（メタ）アクリレート、グリセロールジ（メタ）アクリレート、グリセロールアクリレートメタクリレート、ウレタン（メタ）ジアクリレート、イソシアヌル酸ジ（メタ）アクリレート、イソシアヌル酸トリ（メタ）アクリレート、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−５−メチル−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１１−ジ（メタ）アクリロキシ−４，８−ジオキサウンデガン−２，６，１０−トリオール等が挙げられる。
分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類としては、例えば、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタントリ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
これらのアクリル系架橋性単量体は、単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

アクリル系架橋重合体の原料として、アクリル系架橋性単量体以外に、必要に応じて非架橋性単量体も原料として用いてもよい。
非架橋性単量体は、アクリル系単量体（以下、「アクリル系非架橋性単量体」ともいう）であることが好ましい。
アクリル系非架橋性単量体としては、例えば、（メタ）アクリル酸アルキル類、水酸基を有するアクリル系非架橋性単量体等が挙げられる。

（メタ）アクリル酸アルキル類としては、例えば、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸イソプロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル等が挙げられる。

水酸基を有するアクリル系非架橋性単量体としては、例えば、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、その他の水酸基を有する（メタ）アクリレート類等が挙げられる。

ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシトリ（ポリ）エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、プロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、ポリ（エチレングリコール・プロピレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（エチレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、オクトキシポリエチレングリコールポリプロピレングリコール−モノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
その他の水酸基を有する（メタ）アクリレート類としては、例えば、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルエチル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルプロピル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
これらのアクリル系非架橋性単量体は、単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

アクリル系非架橋性単量体を用いる場合、アクリル系非架橋性単量体の添加量は、アクリル系架橋性単量体量１００重量部に対して、１００重量部以下であることが好ましい。アクリル系非架橋性単量体の添加量が１００重量部を超えると、得られる架橋重合体粒子の架橋度が低下することにより耐圧性が小さくなり、膨潤や収縮が生じて分離精度が低下しやすくなる。

カチオン交換基含有重合体は、カチオン交換基含有単量体を重合して得られる重合体であることが好ましい。
カチオン交換基含有単量体は、アクリル系のカチオン交換基含有単量体であることが好ましい。

カルボキシル基を有するアクリル系のカチオン交換基含有単量体としては、例えば、（メタ）アクリル酸、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルサクシネート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルフタル酸等の（メタ）アクリル酸誘導体類や、クロトン酸、イタコン酸、シトラコン酸、メサコン酸、マレイン酸、フマル酸、及び、これらの誘導体等が挙げられる。
リン酸基を有するアクリル系のカチオン交換基含有単量体としては、例えば、（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（２−（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル）アシッドホスフェート及びこれらの誘導体等が挙げられる。
スルホン酸基を有するアクリル系のカチオン交換基含有単量体としては、例えば、２−（メタ）アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、２−スルホエチル（メタ）アクリレート、３−スルホプロピル（メタ）アクリル酸等の（メタ）アクリル酸誘導体類等、スチレンスルホン酸、アリルスルホン酸、（３−スルホプロピル）−イタコン酸、及び、これらの誘導体等が挙げられる。
これらのアクリル系のカチオン交換基含有単量体は、単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

また、カチオン交換基含有重合体は、カチオン交換基を有する化合物（以下、「カチオン交換性化合物」ともいう）と反応可能な官能基（以下、「反応性基」ともいう）を有する親水性重合体にカチオン交換性化合物を反応させて得られるものでもよい。

反応性基は、非イオン性の親水性基であることが好ましい。
非イオン性の親水性基としては、水酸基、グリコール基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基、シアノ基、アルデヒド基等が挙げられる。なかでも、水酸基、エポキシ基、グリシジル基、１級アミノ基、２級アミノ基が好ましく、水酸基、エポキシ基、グリシジル基がより好ましい。

反応性基を有する親水性重合体は、反応性基を有する単量体（以下、「反応性単量体」ともいう）の重合物であることが好ましい。
反応性単量体としては、（メタ）アクリル酸エステル類が好ましい。
（メタ）アクリル酸エステル類としては、例えば、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類や、ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート類や、アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類や、エポキシ化又はヒドロキシル化（メタ）アクリレート類や、アミノ化（メタ）アクリレート類や、アルデヒド化又はシアノ化（メタ）アクリレート類等が挙げられる。

ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシトリ（ポリ）エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート類としては、例えば、プロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、ポリ（エチレングリコール・プロピレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（エチレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、オクトキシポリエチレングリコールポリプロピレングリコール−モノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
エポキシ化又はヒドロキシル化（メタ）アクリレート類としては、例えば、グリシジル（メタ）アクリレート、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルエチル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルプロピル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
アミノ化（メタ）アクリレート類としては、例えば、２−アミノエチル（メタ）アクリレート、２、３−ジアミノエチル（メタ）アクリレート、２−アミノプロピル（メタ）アクリレート、２、３−ジアミノプロピル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。
アルデヒド化又はシアノ化（メタ）アクリレート類としては、例えば、（メタ）アクロレイン、シアノ（メタ）アクリレート、メチルシアノアクリレート、エチルシアノアクリレート、ブチルシアノアクリレート、（メタ）アクリロニトリル等が挙げられる。
これらの反応性単量体は、単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

カチオン交換性化合物としては、反応性基が水酸基の場合は、例えば、ブロムエタンスルホン酸ナトリウム等のハロゲン化エタンスルホン酸類や、クロロ酢酸ナトリウム等のハロゲン化酢酸類や、イオン交換基を有するアルデヒド化合物類や、トリカルバニル酸やブタンテトラカルボン酸等の多官能カルボン化合物類や、１，３−プロパンスルトン、１，４−ブタンスルトン等のスルトン化合物類等が挙げられる。また、反応性基がエポキシ基、グリシジル基、アミノ基の場合は、例えば、硫酸ナトリウム、タウリン、グリコール酸、亜硫酸ナトリウム等のイオン交換性化合物類が挙げられる。

本発明のヘモグロビンＡ０分画の分離方法に用いるカラム充填剤は、架橋重合体粒子の存在下でカチオン交換性単量体を重合させて得られる重合物であることが好ましい。または、架橋重合体粒子の存在下で反応性基を有する親水性単量体を重合させ、カチオン交換性化合物を反応させて得られる重合物であることが好ましい。

本発明のヘモグロビンＡ０分画の分離方法は、上記の溶離液及び上記のカラム充填剤を用いた上で、測定系に生じる圧力値を９．８×１０^３Ｐａ以上１９．６×１０^５Ｐａ以下となるように設定する。
なお、本明細書において「測定系に生じる圧力値（以下、単に「圧力値」ともいう）」とは、クロマトグラフィーの流路系において、カラムを含む、送液ポンプ以降の配管系流路全体により発生する圧力値を意味する。例えば、送液ポンプとカラムとの間に接続した圧力計により測定される値である。

圧力値が９．８×１０^３Ｐａ未満であると、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ並びにヘモグロビンＡ０分画、即ち、ヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＡ２、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣの測定値の精度が低下し、測定時間が延長する。また、圧力値が非常に小さいため、圧力値の制御が困難となる。圧力値が１９．６×１０^５Ｐａを超えると、測定精度及び測定安定性が低下する。

本発明のヘモグロビンＡ０分画の分離方法におけるカチオン交換クロマトグラフィーは、溶離液送液用のポンプ、検出器、試料導入装置等を備えた公知の液体クロマトグラフに、上述したカラム充填剤を充填したカラムを接続し、かつ、測定系に生じる圧力値を上述した設定範囲にすることにより行うことができる。

本発明は、糖尿病診断の指標となる安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、サラセミア診断の指標となるヘモグロビンＡ２、遺伝子疾患の診断の指標となるヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＣを短時間で高精度に測定する。
また、本発明は、安定型ヘモグロビンＡ１ｃとともに、健常人血に含まれるヘモグロビン類、例えば、ヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＦ（胎児性ヘモグロビン）を短時間内に高精度に測定できる。なかでも、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ及びヘモグロビンＡ２の同時測定、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣの同時測定、並びに安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、ヘモグロビンＡ２、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣの同時測定に好適に用いられる。

本発明によれば、カチオン交換クロマトグラフィーにより、短時間で再現性良くヘモグロビンＡ０分画を分離し、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ及びヘモグロビンＡ０分画中のヘモグロビン類を同時に、長期間に亘って再現性に良く測定できる。

実施例１の測定を行った際に得られたクロマトグラムである。 比較例１の測定を行った際に得られたクロマトグラムである。 比較例２の測定を行った際に得られたクロマトグラムである。 比較例９の測定を行った際に得られたクロマトグラムである。 実施例１２の測定を行った際に得られたクロマトグラムである。 実施例１４の測定を行った際に得られたクロマトグラムである。 実施例１６の測定を行った際に得られたクロマトグラムである。 ＨｂＳ値のＣＶ値とΔｐＨとの関係を示すグラフである。 ＨｂＣ値のＣＶ値とΔｐＨとの関係を示すグラフである。 ＨｂＳ値のＣＶ値とΔ濃度との関係を示すグラフである。 ＨｂＣ値のＣＶ値とΔ濃度との関係を示すグラフである。 実施例２及び比較例２の測定条件による、測定回数とヘモグロビンＡ１ｃ値との関係を示すグラフである。 実施例８及び比較例９の測定条件による、測定回数とヘモグロビンＳ値との関係を示すグラフである。 実施例１７の測定条件による、設定圧力値と同時再現性試験時のヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値との関係を示すグラフである。 実施例１７の測定条件による、設定圧力値と同時再現性試験時のヘモグロビンＳ値のＣＶ値との関係を示すグラフである。 実施例１７の測定条件による、設定圧力値と同時再現性試験時のヘモグロビンＡ２値のＣＶ値との関係を示すグラフである。 測定例１〜６における測定回数とヘモグロビンＡ１ｃ値との関係を示すグラフである。 測定例１〜６における測定回数とヘモグロビンＳ値との関係を示すグラフである。 測定例１〜６における測定回数とヘモグロビンＡ２値との関係を示すグラフである。

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されない。

（製造例１）
製造例１では、カチオン交換基を有する架橋重合体粒子であるカラム充填剤を調製した。
トリエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体、新中村化学工業社製）１７０ｇ、テトラメチロールメタントリアクリレート（架橋性単量体、新中村化学工業社製）８０ｇ、及び、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（カチオン交換基含有単量体、東亞合成社製）１５０ｇの単量体混合物に、過酸化ベンゾイル（重合開始剤、キシダ化学社製）１．０ｇを混合して溶解し、５重量％のポリビニルアルコール（分散剤、日本合成化学社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液２０００ｍＬに分散させた。
反応系を３００ｒｐｍで撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温して１０時間重合反応を行い、カチオン交換基を有する架橋重合体粒子であるカラム充填剤を得た。
得られたカラム充填剤の平均粒径値を、粒度分布測定装置（ＰＳＳ社製、「アキュサイザーＳ７８８／ＳＩＳ」）により測定したところ、６．７μｍであった。

（製造例２）
製造例２では、架橋重合体の表面でカチオン交換基含有単量体を重合し、カチオン交換基を有する架橋重合体粒子であるカラム充填剤を調製した。

（１）架橋重合体粒子の調製
ジエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体、新中村化学工業社製）２０ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体、新中村化学工業社製）１５０ｇ、及び、テトラメチロールメタントリアクリレート（架橋性単量体、新中村化学工業社製）８０ｇの単量体混合物に、過酸化ベンゾイル（重合開始剤、キシダ化学社製）１．０ｇを混合して溶解し、５重量％のポリビニルアルコール（分散剤、日本合成化学社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液２０００ｍＬに分散させた。反応系を３５０ｒｐｍで撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温して１．２時間重合反応を行い、架橋重合体粒子を得た。

（２）カチオン交換基含有重合体の調製
上記「（１）架橋重合体粒子の調製」の反応系に２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸２２０ｇを溶解したイオン交換水２００ｍＬを添加した後、８０℃で２時間重合反応を行い、表面にカチオン交換基含有重合体を有する架橋重合体粒子であるカラム充填剤を得た。
得られたカラム充填剤の平均粒径値を、製造例１と同様の方法で測定したところ、６．７μｍであった。

（製造例３）
製造例３では、架橋重合体の表面に反応性基を有する親水性重合体を調製して、カチオン交換性化合物を反応させることにより、表面にカチオン交換基含有重合体を有する架橋重合体粒子であるカラム充填剤を調製した。
上記製造例２の「（１）架橋重合体粒子の調製」の反応系に２，３−ジヒドロキシルプロピルメタクリレート（反応性単量体、日油社製）１５０ｇを添加した後、８０℃で２．５時間重合反応を行い、架橋重合体の表面に反応性基含有親水性重合体を有する重合物を得た。この重合物１０ｇを、１，３−プロパンスルトン１０ｇを溶解した２％水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬ中に添加して６０℃で撹拌し、表面にカチオン交換基含有重合体を有する架橋重合体粒子であるカラム充填剤を得た。
得られたカラム充填剤の平均粒径値を、製造例１と同様の方法で測定したところ、６．６μｍであった

（製造例４）
製造例４では、カチオン交換基を有さない架橋重合体粒子であるカラム充填剤を調製した。
ジエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体、新中村化学工業社製）２０ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体、新中村化学工業社製）１５０ｇ、及び、テトラメチロールメタントリアクリレート（架橋性単量体、新中村化学工業社製）８０ｇの単量体混合物に、過酸化ベンゾイル（重合開始剤、キシダ化学社製）１．０ｇを混合して溶解し、５重量％のポリビニルアルコール（分散剤、日本合成化学社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液２０００ｍＬに分散させた。反応系を３００ｒｐｍで撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温して８時間重合反応を行い、カチオン交換基を有さない架橋重合体粒子であるカラム充填剤を得た。
得られたカラム充填剤の平均粒径値を、製造例１と同様の方法で測定したところ、６．８μｍであった。

（実施例１）
実施例１では、製造例１で得られたカラム充填剤を充填したカラムを用いて、ヒト血液試料中の安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）、ヘモグロビンＡ２（ＨｂＡ２）、ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）及びヘモグロビン（ＨｂＣ）を測定した。

（１）カラム充填剤の充填
製造例１で得られたカラム充填剤０．８ｇを、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０ｍＬに分散して撹拌しスラリー化した。５分間超音波処理した後、スラリー全量を、ステンレス製エンプティカラム（４．６φ×３５ｍｍ）を接続したパッカー（アズワン社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（ＧＬサイエンス社製、「ＰＵ−６１４」）を接続し、圧力２０ＭＰａで送液して定圧充填した。

（２）測定試料の調製
ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ２、ＨｂＳ及びＨｂＣを含むヒト血液をフッ化ナトリウム採血し、０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）により１００倍に溶血希釈した。

（３）測定条件
測定条件を表２に示す。流速は１．８ｍＬ／分に設定し、測定系の圧力値は１５．６×１０^５Ｐａに設定した。なお、圧力値は以下の方法により測定した。カラムを液体クロマトグラフに接続し、送液ポンプとカラムとの間にデジタル圧力計（長野計器社製、「ＧＣ６１」）を接続し、溶離液Ａを送液した時の圧力表示値を読み取った。
溶離液Ａは、成分（１）として５５ｍｍｏｌ／Ｌの過塩素酸ナトリウムを含み、成分（２）として１５ｍｍｏｌ／Ｌのコハク酸（ｐＫａ値４．２及び５．６）を含み、成分（３）として１１０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム（リン酸のｐＫａ値２．２、７．２、１２．３）を含む（溶離液Ａの濃度は１８０ｍｍｏｌ／Ｌ）。溶離液ＡのｐＨは５．３に調整した。
また、溶離液Ｂとして１３０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０）を用いた。溶離液Ａと溶離液ＢのｐＨの差（溶離液ＢのｐＨ−溶離液ＡのｐＨ：以下、ΔｐＨともいう）は＋１．７、溶離液Ａと溶離液Ｂの濃度の差（溶離液Ｂの濃度−溶離液Ａの濃度：以下、Δ濃度ともいう）は−１１０ｍｍｏｌ／Ｌだった。
溶離液Ａを２０秒間送液後、溶離液Ｂを１００秒間送液するステップワイズグラジエント法により溶出した。ヘモグロビン類を溶出後、４０秒間再び溶離液Ａを送液してカラム内を初期状態に戻した。

（４）測定結果
得られたクロマトグラムを図１に示す。ヘモグロビンＦ（ピーク１）、ＨｂＡ１ｃ（ピーク２）、ヘモグロビンＡ０（ＨｂＡ０：ピーク３）、ＨｂＳ（ピーク４）及びＨｂＣ（ピーク５）が良好に分離できた。

（実施例２）
実施例２では、製造例２で得られたカラム充填剤を充填したカラムを用いて、ヒト血液試料中のＨｂＡ１ｃ、ＨｂＳ及びＨｂＣを測定した。
製造例２で得られたカラム充填剤を、実施例１と同様にしてステンレス製エンプティカラムに充填し、実施例１と同様の方法でヒト血液試料を測定した。カラム充填剤、溶離液Ａ及び溶離液Ｂの成分、並びに、設定圧力値を表３に示す。得られたクロマトグラムは図１と同様、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＳ及びＨｂＣを良好に分離できた。

（実施例３）
実施例３では、製造例３のカラム充填剤を充填したカラムを用いて、ヒト血液試料中のＨｂＡ１ｃ、ＨｂＳ及びＨｂＣを測定した。
製造例３で得られたカラム充填剤を、実施例１と同様にしてステンレス製エンプティカラムに充填し、実施例１と同様の方法でヒト血液試料を測定した。カラム充填剤、溶離液Ａ及び溶離液Ｂの成分、並びに、設定圧力値を表３に示す。
得られたクロマトグラムは図１と同様、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＳ及びＨｂＣを良好に分離できた。

（比較例１）
比較例１では、製造例４で得られたカラム充填剤を充填したカラムを用いて、ヒト血液試料中のＨｂＡ１ｃ、ＨｂＳ及びＨｂＣを測定した。
製造例４で得られたカラム充填剤を、実施例１と同様にしてステンレス製エンプティカラムに充填し、実施例１と同様の方法でヒト血液試料を測定した。カラム充填剤、溶離液Ａ及び溶離液Ｂの成分、並びに、設定圧力値を表３に示す。
得られたクロマトグラムを図２に示す。ヘモグロビン類は分離されず一度に溶出された（ピーク６）。カチオン交換基を有しないカラム充填剤（製造例４）を用いた場合は、本発明で規定する溶離液Ａ及び溶離液Ｂを用い、本発明で規定する設定圧力値の範囲内で測定を行っても、ヘモグロビン類は分離できなかった。

（実施例４〜７）
実施例４〜７及び比較例２〜８では、実施例２のカラム充填剤（製造例２）及び溶離液Ｂを用い、溶離液Ａを変更した場合を示す。
まず、実施例４〜７では、実施例２の溶離液Ａに含まれる成分を、本発明の規定範囲内において変更して実施例２と同様の測定を行った。カラム充填剤の種類、溶離液Ａ及び溶離液Ｂの成分、並びに、設定圧力値を表４に示す。
実施例４及び実施例５は溶離液Ａの成分（１）の種類を変更した場合、実施例６は溶離液Ａの成分（２）の種類を変更した場合、実施例７は溶離液Ａの成分（３）の種類を変更した場合を示す。
得られたクロマトグラムはいずれも図１と同様、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＳ及びＨｂＣを良好に分離できた。

（比較例２〜８）
比較例２〜８では、実施例２の溶離液Ａに含まれる成分を本発明の規定範囲外の成分に変更して実施例２と同様の測定を行った。カラム充填剤の種類、溶離液Ａ及び溶離液Ｂの成分、並びに、設定圧力値を表５に示す。
比較例２は、溶離液Ａとして、成分（１）を含まない溶離液を用いた例を示す。
比較例３は、溶離液Ａとして、成分（２）を含まない溶離液を用いた例を示す。
比較例４は、溶離液Ａとして、成分（２）に代えて、ｐＫａ値は成分（２）の規定範囲内だが、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、及び、アミノ酸以外の酸を含む溶離液を用いた例を示す。
比較例５は、溶離液Ａとして、成分（２）に代えて、ｐＫａ値が成分（２）の規定範囲外の酸を含む溶離液を用いた例を示す。
比較例６は、溶離液Ａとして、成分（３）を含まない溶離液を用いた例を示す。
比較例７は、溶離液Ａとして、成分（３）に代えて、ｐＫａ値は成分（３）の規定範囲内だが、無機オキソ酸及びアミノ酸以外の酸を含む溶離液を用いた例を示す。なお、表５中、「ＨＥＰＥＳ」は、「２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸」を示す。
比較例８は、溶離液Ａとして、成分（３）に代えて、ｐＫａ値が成分（３）の規定範囲外の酸を含む溶離液を用いた例を示す。

比較例２により得られたクロマトグラムを図３に示す。ＨｂＡ１ｃの分離性能は、実施例１（図１）に比べて悪かった。比較例３〜８により得られたクロマトグラムも図３と同様であった。
以上の実施例４〜７及び比較例２〜８の結果から、本発明の規定範囲内の溶離液Ａを用いることにより、ＨｂＡ１ｃを良好に分離できることがわかった。また、本発明の規定範囲外の溶離液Ａを用いた場合、溶離液Ｂ及び設定圧力値が本発明の規定範囲内であっても、ＨｂＡ１ｃの分離が悪いことがわかった。

（実施例８〜１１）
実施例８〜１１並びに比較例９〜１５では、実施例２のカラム充填剤（製造例２）及び溶離液Ａを用い、溶離液Ｂを変更した場合を示す。
まず、実施例８〜１１では、実施例２における溶離液ＢのｐＨ及び濃度の条件を、本発明の規定範囲内において変更し、実施例２と同様の測定を行った。カラム充填剤の種類、溶離液Ａ及び溶離液Ｂの成分、並びに、設定圧力値を表６に示す。
得られたクロマトグラムはいずれも図１と同様、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＳ及びＨｂＣを良好に分離できた。

（比較例９及び比較例１０）
比較例９及び比較例１０では、実施例２における溶離液ＢのｐＨ及び濃度の条件を、本発明の規定範囲外において、ＨｂＳ及びＨｂＣの保持時間が実施例１と同様になるように条件を変更し、実施例２と同様の測定を行った。カラム充填剤の種類、溶離液Ａ及び溶離液Ｂの成分、並びに、設定圧力値を表７に示す。
比較例９は、溶離液Ｂとして、ｐＨが溶離液Ａと同等で、濃度が溶離液Ａよりも大きい溶離液を用いた例を示す（濃度勾配のみによる溶出法）。
比較例１０は、溶離液Ｂとして、ｐＨが溶離液Ａよりも高く、濃度が溶離液Ａと同等の溶離液を用いた例を示す（ｐＨ勾配のみによる溶出法）。
比較例９により得られたクロマトグラムを図４に示す。ＨｂＡ１ｃは実施例１と同様に分離できたが、ＨｂＡ０、ＨｂＳ及びＨｂＣの分離性能は悪くなった。比較例１０のクロマトグラムも図４と同様であった。

（比較例１１〜１５）
比較例１１〜１５では、実施例２における溶離液ＢのｐＨ及び濃度の条件を、本発明の規定範囲外において変更し、実施例２と同様の測定を行った。カラム充填剤の種類、溶離液Ａ及び溶離液Ｂの成分、並びに、設定圧力値を表７に示す。
比較例１１は、溶離液Ｂとして、ｐＨが溶離液Ａより０．４高く（規定範囲外）、濃度が溶離液Ａよりも小さい溶離液を用いた例を示す。
比較例１２は、溶離液Ｂとして、ｐＨが溶離液Ａより３．２高く（規定範囲外）、濃度が溶離液Ａよりも小さい溶離液を用いた例を示す。
比較例１３は、溶離液Ｂとして、ｐＨが溶離液Ａよりも高く、濃度が溶離液Ａより１０ｍＭ小さい（規定範囲外）溶離液を用いた例を示す。
比較例１４は、溶離液Ｂとして、ｐＨが溶離液Ａよりも高く、濃度が溶離液Ａより２２０ｍＭ小さい（規定範囲外）溶離液を用いた例を示す。
比較例１５は、溶離液Ｂとして、ｐＨが溶離液Ａよりも３．２高く（規定範囲外）、濃度が溶離液Ａより２２０ｍＭ小さい（規定範囲外）溶離液を用いた例を示す。
得られたクロマトグラムはいずれも図４と同様、ＨｂＡ０、ＨｂＳ及びＨｂＣの分離性能は悪かった。

（実施例１２）
実施例１２〜１７では、実施例２のカラム充填剤（製造例２）及び溶離液Ａを用い、溶離液Ｂを変更した場合、溶離液Ｃを用いた場合、溶離液Ｃ及び溶離液Ｄを用いた場合を示す。
実施例１２では、実施例２のカラム充填剤（製造例２）及び溶離液Ａを用い、溶離液Ｂを変更した場合を示す。
実施例２における溶離液ＢのｐＨ及び濃度の条件を、本発明の規定範囲内において変更し、実施例２と同様の測定を行った。カラム充填剤の種類、溶離液Ａ、溶離液Ｂの成分、並びに、設定圧力値を表８に示す。
得られたクロマトグラムを図５に示す。短時間でＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ２（ピーク７）、ＨｂＳ及びＨｂＣを良好に分離できた。

（実施例１３）
実施例１３では、実施例２のカラム充填剤（製造例２）及び溶離液Ａを用い、溶離液Ｂを二種類（溶離液Ｂ１及び溶離液Ｂ２）用いた場合を示す。
実施例２における溶離液Ｂを二種類の溶離液Ｂ（溶離液Ｂ１及び溶離液Ｂ２）を用いることに変更し、かつ、溶離液Ｂ１及び溶離液Ｂ２のｐＨ及び濃度の条件を、ともに本発明の規定範囲内の条件にして実施例２と同様の測定を行った。カラム充填剤の種類、溶離液Ａ、溶離液Ｂ１及び溶離液Ｂ２の成分、並びに、設定圧力値を表８に示す。
得られたクロマトグラムは図５と同様であり、短時間でＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ２、ＨｂＳ及びＨｂＣを良好に分離できた。

（実施例１４及び実施例１５）
実施例１４及び実施例１５では、実施例１３のカラム充填剤（製造例２）、溶離液Ａ、溶離液Ｂ１及び溶離液Ｂ２を用いた上で、更に溶離液Ｃを用いた場合を示す。
実施例１３における溶離液Ａ及び二種類の溶離液Ｂ（溶離液Ｂ１及び溶離液Ｂ２）を用い、更に本発明の規定範囲内の溶離液Ｃを溶離液Ｂ２の後に送液して、実施例２と同様の測定を行った。
カラム充填剤の種類、溶離液Ａ、溶離液Ｂ１、溶離液Ｂ２及び溶離液Ｃの成分、並びに、設定圧力値を表８に示す。
溶離液Ａを２０秒送液後、溶離液Ｂ１を３０秒、溶離液Ｂ２を３５秒、溶離液Ｃを５秒、溶離液Ａを２０秒送液するステップワイズグラジエント法により溶出した。
実施例１４により得られたクロマトグラムを図６に示す。ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ２、ＨｂＳ及びＨｂＣを、実施例１２及び実施例１３よりも短時間で良好に分離できた。実施例１５により得られたクロマトグラムも図６と同様であった。

（実施例１６）
実施例１６では、実施例２のカラム充填剤（製造例２）、溶離液Ａ、溶離液Ｂを用いた上で、更に溶離液Ｃ及び溶離液Ｄを用いた場合を示す。
実施例２における溶離液Ａ及び溶離液Ｂを用い、更に本発明の規定範囲内の溶離液Ｄを溶離液Ｂの後に送液し、更に本発明の規定範囲内の溶離液Ｃを溶離液Ｄの後に送液して、実施例２と同様の測定を行った。
カラム充填剤の種類、溶離液Ａ、溶離液Ｂ、溶離液Ｃ及び溶離液Ｄの成分、並びに、設定圧力値を表８に示す。
実施例１６により得られたクロマトグラムを図７に示す。ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ２、ＨｂＳ及びＨｂＣを良好に分離できた。実施例１２及び実施例１３と同程度の分離性能が、実施例１５と同程度の測定時間で得られた。

（実施例１７）
実施例１７では、実施例１３のカラム充填剤（製造例２）、溶離液Ａ、溶離液Ｂ１、溶離液Ｂ２を用いた上で、更に溶離液Ｃ及び溶離液Ｄを用いた場合を示す。
実施例１３における溶離液Ａ、溶離液Ｂ１及び溶離液Ｂ２を用い、更に本発明の規定範囲内の溶離液Ｄを溶離液Ｂ２の後に送液し、更に本発明の規定範囲内の溶離液Ｃを溶離液Ｄの後に送液して、実施例１３と同様の測定を行った。
カラム充填剤の種類、溶離液Ａ、溶離液Ｂ１、溶離液Ｂ２、溶離液Ｃ及び溶離液Ｄの成分、並びに、設定圧力値を表８に示す。
得られたクロマトグラムは図７と同様であり、短時間でＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ２、ＨｂＳ及びＨｂＣを良好に分離できた。

（評価）
実施例及び比較例の測定条件を用いて以下の評価を行った。

（評価１）ＨｂＡ１ｃの同時再現性試験
実施例１〜１７（表３、表４、表６、表８）並びに比較例２〜８（表５）の測定条件を用いて、ＨｂＡ１ｃの同時再現性試験を実施した。
実施例１「（２）測定試料の調製」で得られたヒト血液試料を、２０回連続測定して得られたＨｂＡ１ｃ値のＣＶ値（以下、「同時再現性試験により得られたＣＶ値」を単に「ＣＶ値」ともいう）を表９に示す。
本発明の規定範囲内の溶離液Ａを用いた実施例１〜７では、ＨｂＡ１ｃ値のＣＶ値はいずれも１．０％以下と良好であった。
カラム充填剤の異なる実施例１〜３では、特に製造例２及び製造例３のカラム充填剤を用いた場合にＨｂＡ１ｃ値のＣＶ値が良好であり、その中でも製造例２で得られたカラム充填剤を用いた実施例２において良好であった。
また、溶離液Ａの成分を本発明の規定範囲内で変更した実施例４〜７、溶離液Ｂを本発明の規定範囲内で変更した実施例８〜１３、溶離液Ｃ並びに溶離液Ｃ及び溶離液Ｄを用いた実施例１４〜１７においても、ＨｂＡ１ｃ値のＣＶ値はいずれも良好であった（表９）。
本発明の規定範囲外の溶離液Ａを用いた比較例２〜８では、ＨｂＡ１ｃ値のＣＶ値はいずれも３．０％以上と悪く、糖尿病患者のＨｂＡ１ｃ値の精度管理を行えるレベルではなかった。

（評価２）修飾ヘモグロビン類の測定
実施例１〜１７及び比較例２〜８の測定条件を用いて、人為的に調製した修飾ヘモグロビン類を多く含む試料の測定を行った。修飾ヘモグロビン類を含む試料として、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ含有試料（試料Ｌ）、アセチル化ヘモグロビン含有試料（試料Ａ）、カルバミル化ヘモグロビン含有試料（試料Ｃ）の３種類を、以下の方法により調製した。
試料Ｌは、健常人血に、グルコースを２５００ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で３時間加温することにより調製した。試料Ａは、健常人血に、アセトアルデヒドを６０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。試料Ｃは、健常人血に、シアン酸ナトリウムを６０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。
分離性能は、修飾ヘモグロビン類を含む試料のＨｂＡ１ｃ値から、修飾ヘモグロビン類を含む試料の調製に用いた健常人血試料（非修飾品）のＨｂＡ１ｃ値を差し引いた値（Δ値）を算出して比較することにより評価した。結果を表９に示す。
本発明の規定範囲内の溶離液Ａを用いた実施例１〜７では、Δ値はいずれも０．１５以下と良好であった。また、実施例８〜１７においてもΔ値はいずれも良好であった。特に溶離液Ｄを用いた実施例１６及び１７において良好であった。本発明の規定範囲外の溶離液Ａを用いた比較例２〜８では、Δ値はいずれも０．４以上と悪く、ＨｂＡ１ｃ値が修飾ヘモグロビン類の影響を受けた（表９）。

（評価３）ＨｂＳ及びＨｂＣの同時再現性試験
実施例１〜１７及び比較例９〜１５（表７）の測定条件を用いて、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＳ及びＨｂＣを同時測定した場合の同時再現性試験を実施した。
実施例１「（２）測定試料の調製」で得られたヒト血液試料を２０回連続測定して得られたＨｂＳ値及びＨｂＣ値のＣＶ値を表９に示す。
本発明の規定範囲内の溶離液Ｂを用いた実施例１〜１７では、ＨｂＳ値及びＨｂＣ値の各ＣＶ値はいずれも１．４％以下と良好であった。本発明の規定範囲外の溶離液Ｂを用いた比較例９〜１５では、ＨｂＳ値及びＨｂＣ値の各ＣＶ値はいずれも２．５％以上と悪かった（表９）。
ＨｂＳ値のＣＶ値とΔｐＨとの関係を図８、ＨｂＣ値のＣＶ値とΔｐＨとの関係を図９に示す。ΔｐＨが本発明の規定範囲内（０．５〜３．０）の溶離液Ｂを用いた実施例１〜１７では、ＨｂＳ値及びＨｂＣ値のＣＶ値はいずれも１．５％以下と良好であった。一方ΔｐＨが本発明の規定範囲外の比較例ではＣＶ値が悪かった。なお図８及び図９における比較例１３及び比較例１４は本発明の規定範囲内のΔｐＨだがＣＶ値が悪い。これは比較例１３及び比較例１４のΔ濃度が本発明の規定範囲外のためである。
同様にＨｂＳ値のＣＶ値とΔ濃度との関係を図１０、ＨｂＣ値のＣＶ値とΔ濃度との関係を図１１に示す。Δ濃度が本発明の規定範囲内（−２００〜−２０ｍｍｏｌ／Ｌ）の溶離液Ｂを用いた実施例１〜１７では、ＨｂＳ値及びＨｂＣ値のＣＶ値はいずれも１．５％以下と良好であった。一方、Δ濃度が本発明の規定範囲外の比較例ではＣＶ値が悪かった。なお、図１０及び図１１における比較例１１及び比較例１２は本発明の規定範囲内のΔ濃度だがＣＶ値が悪い。これは比較例１１及び比較例１２のΔｐＨが本発明の規定範囲外のためである。
以上から、溶離液ＢのΔｐＨとΔ濃度が共に本発明の規定範囲内の場合のみ、ＨｂＡ１ｃ値、ＨｂＳ値及びＨｂＣ値のＣＶ値が良好となることがわかった。

（評価４）ＨｂＡ２の同時再現性試験
実施例１２〜１７の測定条件を用いて、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ２、ＨｂＳ及びＨｂＣを同時測定した場合の同時再現性試験を実施した。
実施例１「（２）測定試料の調製」で得られたヒト血液試料を２０回連続測定して得られたＨｂＡ２値のＣＶ値を表９に示す。
本発明の規定範囲内の溶離液Ｂを用いた実施例１２〜１７では、ＨｂＡ２値のＣＶ値はいずれも１．０％以下と良好であった。特に溶離液Ｂを二種類用いた実施例１３〜１５、１７において良好であった（表９）。
なお、本発明の規定範囲外の溶離液Ｂを用いた比較例では、いずれもＨｂＡ２ピークを分離することができなかった。

（評価５）測定安定性の評価
実施例及び比較例の測定条件を用いて、実施例１「（２）測定試料の調製」で得られたヒト血液試料を４０００回繰り返し測定し、ＨｂＡ１ｃ値、ＨｂＡ２値、ＨｂＳ値、ＨｂＣ値の推移を確認した。
まず、実施例２及び比較例２の測定条件を用いてＨｂＡ１ｃ値の推移を確認した。測定回数とＨｂＡ１ｃ値の関係を図１２に示す。
本発明の規定範囲内の溶離液Ａを用いた実施例２では、４０００回の測定においてもＨｂＡ１ｃ値は測定初期からほとんど変動せず安定であった。一方、本発明の規定範囲外の溶離液Ａを用いた比較例２では約１６００回の測定でＨｂＡ１ｃ値が低下した。
同様の評価を他の実施例及び比較例の測定条件を用いて行った。ＨｂＡ１ｃ値が初期の測定値から０．３％以上低下した時の測定回数を表９に示す。なお、表９において、４０００回の測定時にＨｂＡ１ｃ値が低下しなかった場合は「４０００」と表記した。
本発明の規定範囲内の溶離液Ａを用いた場合（実施例１〜実施例１７）は、測定回数３５００回以上においてもＨｂＡ１ｃ値が安定していた。特に製造例２のカラム充填剤を用いた実施例２、４〜１７において良好であった（表９）。
本発明の規定範囲外の溶離液Ａを用いた場合（比較例２〜８）は、測定回数１６００回以下で測定値が低下した。

次に、実施例８及び比較例９の測定条件を用いて、ＨｂＳ値の推移を確認した。測定回数とＨｂＳ値の関係を図１３に示す。
本発明の規定範囲内の溶離液Ｂを用いた実施例８では、ＨｂＳ値は約３５００回の測定まで安定であった。一方、本発明の規定範囲外の溶離液Ｂを用いた比較例９では約１５００回の測定でＨｂＳ値が低下した。
同様の評価を他の実施例及び比較例の測定条件を用い、ＨｂＳ値及びＨｂＣ値の推移を確認した。ＨｂＳ値が初期の測定値から０．３％以上低下した測定回数、及び、ＨｂＣ値が初期の測定値から０．３％以上低下した測定回数を表９に示す。なお、表９において、４０００回の測定時にＨｂＳ値、ＨｂＣ値が低下しなかった場合は、それぞれ「４０００」と表記した。
本発明の規定範囲内の溶離液Ｂを用いた場合（実施例１〜実施例１７）は、測定回数３０００回以上においてもＨｂＳ値及びＨｂＣ値が安定していた。特に本発明の規定範囲内の溶離液Ｂを二種類用いた場合（実施例１３〜１５及び実施例１７）及び溶離液Ｄを用いた場合（実施例１６、１７）において良好な安定性を示した（表９）。
本発明の規定範囲外の溶離液Ｂを用いた場合（比較例９〜比較例１５）は、測定回数１５００回以下で測定値が低下した。

実施例１２〜１７の測定条件を用いてＨｂＡ２値の推移を確認した。ＨｂＡ２値が初期の測定値から０．３％以上低下した測定回数を表９に示す。なお、表９において、４０００回の測定時にＨｂＡ２値が低下しなかった場合は「４０００」と表記した。
本発明の規定範囲内の溶離液Ｂを用いた実施例１２〜１７は、測定回数３８００回以上においても、ＨｂＡ２値が安定していた（表９）。

以上の評価１〜５により、本発明の規定範囲内のカラム充填剤、溶離液Ａ、溶離液Ｂ、及び、設定圧力値を用いた場合は、ＨｂＡ１ｃ値、ＨｂＡ２値、ＨｂＳ値及びＨｂＣ値の測定再現性及び測定安定性が良好であることがわかった。特に本発明の規定のカラム充填剤を用いること、本発明の規定範囲内の二種類の溶離液Ｂを用いること、又は本発明の規定範囲内の溶離液Ｄを用いることにより、ＨｂＡ１ｃ値、ＨｂＡ２値、ＨｂＳ値及びＨｂＣ値の測定再現性及び測定安定性が良好となることがわかった。

（製造例５）
製造例５及び製造例６では、本発明に規定する設定圧力値の検討を行うため、製造例２と同様の組成及び同様の方法によるが、平均粒子径が異なるカラム充填剤を調製した。
まず製造例５では、製造例２より平均粒子径が小さいカラム充填剤を調製した。

（１）架橋重合体粒子の調製
ジエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体、新中村化学工業社製）２０ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体、新中村化学工業社製）１５０ｇ、及び、テトラメチロールメタントリアクリレート（架橋性単量体、新中村化学工業社製）８０ｇの単量体混合物に、過酸化ベンゾイル（重合開始剤、キシダ化学社製）１．０ｇを混合して溶解し、５重量％のポリビニルアルコール（分散剤、日本合成化学社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液２０００ｍＬに分散させた。反応系を４００ｒｐｍで撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温して１．２時間重合反応を行い、架橋重合体粒子を得た。

（２）カチオン交換基含有重合体の調製
上記「（１）架橋重合体粒子の調製」の反応系に２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸２００ｇを溶解したイオン交換水２００ｍＬを添加した後、８０℃で２時間重合反応を行い、表面にスルホン酸基含有重合体を有する架橋重合体粒子であるカラム充填剤を得た。
得られたカラム充填剤の平均粒径値を、製造例１と同様の方法で測定したところ、４．２μｍであった。

（製造例６）
製造例６では、製造例２よりも平均粒子径が大きいカラム充填剤を調製した。
製造例５「（１）架橋重合体粒子の調製」の反応系の撹拌速度を４００ｒｐｍから２５０ｒｐｍに変更した以外は製造例５と同様に操作してカラム充填剤を得た。
得られたカラム充填剤の平均粒径値を、製造例１と同様の方法で測定したところ、９．５μｍであった。

（評価６）設定圧力値の同時再現性への影響評価
設定圧力値を変更した場合の同時再現性を確認した。
設定圧力値は、平均粒径値が異なるカラム充填剤を用いること、及び、測定時の流速を変更することにより行った。
平均粒径値が異なるカラム充填剤は、製造例２、製造例５及び製造例６で得られた各カラム充填剤を用いた。各カラム充填剤を、実施例１「（１）カラム充填剤の充填」と同様にしてステンレス製エンプティカラムに充填して得られたカラムを用いた。また、測定時の流速は、０．１〜３．３ｍＬ／分の間で変更した。
同時再現性試験は、実施例１７の溶離液Ａ、溶離液Ｂ、溶離液Ｃ及び溶離液Ｄを用い、評価１の方法に準じて行った。
同時再現性試験時の設定圧力値と、ＨｂＡ１ｃ値のＣＶ値との関係を図１４に示す。ＣＶ値は、本発明で規定する設定圧力値の範囲（９．８×１０^３〜１９．６×１０^５Ｐａ）において良好であった。
同時再現性試験時の設定圧力値と、ＨｂＳ値のＣＶ値との関係を図１５に示す。ＣＶ値は、本発明で規定する設定圧力値の範囲において良好であった。
同時再現性試験時の設定圧力値と、ＨｂＡ２値のＣＶ値との関係を図１６に示す。ＣＶ値は、本発明で規定する設定圧力値の範囲において良好であった。
図１４〜１６において、本発明の規定範囲外の設定圧力値の場合は、本発明の規定範囲内のカラム充填剤及び溶離液を用いた場合でも再現性が低下した。
設定圧力値とＣＶ値の関係は、実施例１〜１６の溶離液を用いた場合でも同様であった。

（評価７）設定圧力値の測定安定性への影響評価
設定圧力値を変更した場合の測定安定性を確認した。
設定圧力値は評価４と同様の方法で変更した。また、測定安定性試験は、製造例２、５、又は６で得られたカラム充填剤及び実施例１４の溶離液を用い、評価５の方法に準じて行った。各測定例の測定条件を表１０に示す
測定例１〜６における測定回数とＨｂＡ１ｃ値との関係を図１７に示す。設定圧力値が本発明の規定範囲内の場合（測定例１〜４）、約４０００回の測定まで安定していた。一方設定圧力値が本発明の規定範囲外の場合、測定例５では約５００回で、測定例６では約１５００回でＨｂＡ１ｃ値が低下した。
測定例１〜６における測定回数とＨｂＳ値との関係を図１８に示す。設定圧力値が本発明の規定範囲内の場合（測定例１〜４）、約４０００回の測定まで安定していた。一方設定圧力値が本発明の規定範囲外の場合、測定例５では約５００回で、測定例６では約１５００回でＨｂＳ値が低下した。
測定例１〜６における測定回数とＨｂＡ２値との関係を図１９に示す。設定圧力値が本発明の規定範囲内の場合（測定例１〜４）、約４０００回の測定まで安定していた。一方設定圧力値が本発明の規定範囲外の場合、測定例５では約１０００回で、測定例６では約１８００回でＨｂＡ２値が低下した。
これらの挙動は、他の製造例で得られたカラム充填剤を用いた場合でも同様であった。また、他の実施例の溶離液を用いた場合でも同様であった。
上記評価４及び評価５の結果から、本発明に規定する設定圧力値の範囲外で測定を行った場合は、本発明に規定するカラム充填剤及び溶離液を用いた場合でも、再現性や安定性が悪くなることを確認できた。
上記評価６及び評価７の挙動、即ち、設定圧力値による同時再現性及び測定安定性への影響は、カラム充填剤の平均粒径値を変更した場合でも、測定時の溶離液の流速を変更した場合でも同様であった。従って、これらの挙動は、充填剤の平均粒径値や流速の影響ではなく、設定圧力値の影響である。

以上から、カチオン交換基を有するカラム充填剤を用いること、本発明で規定する溶離液を用いること、及び本発明で規定する設定圧力値を用いること、の全ての条件を満たす場合のみにおいてヘモグロビンＡ０分画が分離でき、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ２、ＨｂＳ及びＨｂＣの高精度測定が行えることを確認した。また、溶離液Ａ及び溶離液Ｂに加えて、本発明に規定する溶離液Ｃ及び溶離液Ｄを用いることにより、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＳ及びＨｂＣの同時測定、並びにＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ２、ＨｂＳ及びＨｂＣの同時測定が、より短時間で高精度に測定できた。

本発明によれば、カチオン交換クロマトグラフィーにより、短時間で再現性良く、長期間に渡ってヘモグロビンＡ０分画を分離でき、ＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡ２、並びにＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ２、ＨｂＳ及びＨｂＣを同時に測定できる。

１ ヘモグロビンＦ
２ ヘモグロビンＡ１ｃ
３ ヘモグロビンＡ０
４ ヘモグロビンＳ
５ ヘモグロビンＣ
６ 全ヘモグロビン
７ ヘモグロビンＡ２

Claims (10)

1. カチオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ０分画の分離方法であって、
   下記溶離液Ａ及び溶離液Ｂの少なくとも二種類の溶離液と、
   カチオン交換基を有するカラム充填剤とを用い、
   測定系に生じる圧力値を９．８×１０^３Ｐａ以上１９．６×１０^５Ｐａ以下に設定する
   ことを特徴とするヘモグロビンＡ０分画の分離方法。
   溶離液Ａ：ｐＨが４．０〜６．０であって、下記（１）、（２）、及び、（３）の全ての成分を含む溶離液
   （１）カオトロピックイオン
   （２）酸解離定数を３．５以上６．５未満の範囲に有し、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、及び、アミノ酸からなる群より選択される少なくとも一種である酸又はその塩
   （３）酸解離定数を６．５以上９．５以下の範囲に有し、無機オキソ酸及びアミノ酸の少なくともいずれかである酸又はその塩
   溶離液Ｂ：ｐＨが溶離液ＡのｐＨよりも０．５〜３．０高く、かつ、濃度が溶離液Ａの濃度よりも２０〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ小さく、溶離液Ａの送液後に送液する溶離液
2. 溶離液Ｂの送液後に、ｐＨが７．０〜９．０の溶離液Ｃを送液することを特徴とする請求項１記載のヘモグロビンＡ０分画の分離方法。
3. 溶離液Ｂの送液後、溶離液Ｃの送液前に、ｐＨが溶離液ＢのｐＨより０．５〜３．０低く、かつ、濃度が溶離液Ｂの濃度よりも２０〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ大きい溶離液Ｄを送液することを特徴とする請求項２記載のヘモグロビンＡ０分画の分離方法。
4. 溶離液Ａが含む成分（２）が、ジカルボン酸又はその塩、或いは、トリカルボン酸又はその塩であることを特徴とする請求項１、２又は３記載のヘモグロビンＡ０分画の分離方法。
5. 溶離液Ａが含む成分（３）が、無機オキソ酸又はその塩であることを特徴とする請求項１、２、３又は４記載のヘモグロビンＡ０分画の分離方法。
6. カチオン交換基を有するカラム充填剤は、架橋重合体粒子の表面に、カチオン交換基含有重合体を有するカラム充填剤であることを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載のヘモグロビンＡ０分画の分離方法。
7. 架橋重合体粒子を構成する架橋重合体、及び、カチオン交換基含有重合体は、アクリル系重合体であることを特徴とする請求項６記載のヘモグロビンＡ０分画の分離方法。
8. 請求項１、２、３、４、５、６又は７のヘモグロビンＡ０分画の分離方法を用いた、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ及びヘモグロビンＡ２の同時測定法。
9. 請求項１、２、３、４、５、６又は７のヘモグロビンＡ０分画の分離方法を用いた、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣの同時測定法。
10. 請求項１、２、３、４、５、６又は７のヘモグロビンＡ０分画の分離方法を用いた、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、ヘモグロビンＡ２、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣの同時測定法。
    

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