CN115315626A - 血红蛋白分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种能够将HbA0组分高精度地分离的血红蛋白分析方法。一种血红蛋白分析方法，该方法包括通过使用了以小于25mM的浓度含有缓冲剂的洗脱液的离子交换色谱来洗脱包含血红蛋白A0的组分，该缓冲剂是磷酸盐或者两性离子缓冲剂，该洗脱液的pH在该缓冲剂的pKa的±0.1以内。

Description

血红蛋白分析方法

技术领域

本发明涉及一种血红蛋白的分析方法。

背景技术

在有机化学、生物化学、医学等领域中，样本中的成分的分析通常使用液相色谱。例如，在医学的领域中，血红蛋白(Hb)的分析利用液相色谱。正常人Hb的大部分为HbA，并且HbA主要包含HbA0和糖化的HbA1c。HbA1c是血中的糖与血红蛋白结合而成的糖化血红蛋白，用作糖尿病等的标志物。血中HbA1c浓度(％)、即血中全部Hb中的HbA1c的比例反映出过去1～2个月的血糖值的平均值，广泛用作糖尿病诊断的指标。

专利文献1和2中记载了通过阳离子交换色谱将HbA1c组分和HbA0组分分离的方法，该方法包括依次使用下述洗脱液A和洗脱液B，且将测定体系中产生的压力值设为9.8×10³Pa～19.6×10⁵Pa：

洗脱液A：pH为4.0～6.0，并且包含如下的成分的洗脱液：(1)离液离子、(2)在3.5以上且小于6.5的范围具有酸解离常数且选自一元羧酸、二元羧酸、三元羧酸以及氨基酸中的至少一种酸或其盐，以及(3)在6.5～9.5的范围具有酸解离常数且为无机含氧酸和氨基酸中的至少任一种的酸或者其盐，

洗脱液B：pH与洗脱液A相比高0.5～3.0，并且浓度与洗脱液A相比小20～200mmol/L或者pH为7.0～10.0的洗脱液。

专利文献3中记载了通过使用了pH8.1以上、渗透压40mOsm/kg以下的洗脱液的阳离子交换色谱，从血液试样中分离出包含异常血红蛋白和地中海贫血标志物的各种血红蛋白的方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2014－095637号公报

专利文献2：日本特开2014－095638号公报

专利文献3：国际公开公报第2019/203302号

发明内容

为了正确算出血红蛋白(Hb)A1c浓度，要求在液相色谱分析中将HbA1c和其它的Hb类、特别是HbA0分别高精度地分离。如果HbA0的分离精度降低，则不仅无法正确地计算HbA1c浓度，而且无法检测在HbA0的附近具有峰的HbA2、HbS、HbC等(这些作为表示Hb的形成异常的指标使用)。

然而，实际的色谱分析中，即使在使用相同的样本的相同测定条件下，也存在HbA0的洗脱时间、分离能力不同的情况。根据本发明人的研究推测该洗脱时间、分离能力的偏差是因色谱分析装置的构造上(例如部件尺寸、组装)的偏差、以及由动作的略微不同导致的洗脱液的送液条件的变动所产生的。本发明提供一种血红蛋白分析方法，该方法不受分析装置的构造上的偏差、以及由动作的不同带来的影响，能够高精度地将HbA0组分分离。

因此，本发明提供以下的技术方案。

〔1〕一种血红蛋白分析方法，该方法包括通过使用了以小于25mM的浓度含有缓冲剂的洗脱液的离子交换色谱来洗脱包含血红蛋白A0的组分，

该缓冲剂为两性离子缓冲剂，

该洗脱液的pH在该缓冲剂的pKa的±0.1以内。

〔2〕根据〔1〕所述的方法，其中，所述两性离子缓冲剂为TES。

〔3〕根据〔1〕或〔2〕所述的方法，其中，所述洗脱液的渗透压为60mOsm/kg以下。

〔4〕根据〔1〕～〔3〕中任一项所述的方法，其中，进一步包括在洗脱上述包含血红蛋白A0的组分之前使用洗脱液A洗脱包含血红蛋白A1c的组分，该洗脱液A为pH4.0～6.8的缓冲液。

〔5〕根据〔4〕所述的方法，其中，上述洗脱液A与上述以小于25mM的浓度含有缓冲剂的洗脱液之间的替换是通过阶式梯度进行的。

〔6〕根据〔1〕～〔5〕中任一项所述的方法，其中，进一步包括在上述以小于25mM的浓度含有缓冲剂的洗脱液之后，通入洗脱液B，该洗脱液B为pH6.0～10.0的缓冲液。

〔7〕根据〔6〕所述的方法，其中，上述以小于25mM的浓度含有缓冲剂的洗脱液与上述洗脱液B的替换是通过阶式梯度进行的。

〔8〕根据〔1〕～〔7〕中任一项所述的方法，其中，上述离子交换色谱为阳离子交换色谱。

〔9〕根据〔1〕～〔8〕中任一项所述的方法，其中，上述色谱为高效液相色谱。

〔10〕一种离子交换色谱的血红蛋白A0分离用洗脱液，其中，以小于25mM的浓度含有缓冲剂，具有该缓冲剂的pKa的±0.1以内的pH，该缓冲剂为两性离子缓冲剂。

〔11〕根据〔10〕所述的洗脱液，其中，上述两性离子缓冲剂为TES。

〔12〕根据〔10〕或〔11〕所述的洗脱液，其中，渗透压为60mOsm/kg以下。

〔13〕根据〔10〕～〔12〕中任一项所述的洗脱液，其中，在离子交换色谱中，在洗脱液A之后使用，该洗脱液A为pH4.0～6.8的缓冲液。

〔14〕根据〔10〕～〔13〕中任一项所述的洗脱液，其中，在离子交换色谱中，在洗脱液B之前使用，该洗脱液B为pH6.0～10.0的缓冲液。

根据本发明，可以在不受分析装置的构造上的偏差、以及因动作的不同带来的影响的情况下，从试样中高精度地分离HbA0。本发明对各种血红蛋白种类的高灵敏度的检测和HbA1c浓度的正确的测定有用。

附图说明

图1是利用使用了各种洗脱液C的HPLC进行的HbA0分离。各图表示2台HPLC装置(装置A、B)中得到的色谱的整体图像(上)和A0峰的放大图像(下)。各图上的数值表示洗脱液C的TES浓度和pH。

图2是图1的后续。

具体实施方式

本发明涉及一种利用离子交换色谱进行的血红蛋白分析方法。作为用于本发明的血红蛋白分析方法(以下，也称为本发明的方法)的试样，可以使用通常的血红蛋白分析中使用的、包含血红蛋白的血液试样。例如，可以使用将从人体采取的血液进行溶血或稀释而得的血液试样。

优选地，利用本发明的方法进行的色谱为液相色谱，更优选为高效液相色谱(HPLC)。本发明的离子交换色谱可以使用与公知的液相色谱系统、即具备洗脱液送液用的泵、采样器、检测器等的系统连接的离子交换柱等进行。

优选地，本发明的方法中进行的离子交换色谱是使用了具有阳离子交换基团的固定相的阳离子交换色谱。优选地，填充有该具有阳离子交换基团的固定相的阳离子交换柱用于该阳离子交换色谱。作为该阳离子交换基团，可举出羧基、磷酸基、磺酸基等，其中优选为磺酸基。

作为该固定相，可举出填充剂粒子、多孔质体等，优选为填充剂粒子。作为该填充剂粒子，可举出无机系粒子、有机系粒子等。作为该无机系粒子，可举出由二氧化硅、氧化锆等构成的粒子。作为该有机系粒子，可举出纤维素、多氨基酸、壳聚糖等天然高分子粒子、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯等合成高分子粒子。作为该具有阳离子交换基团的固定相的优选的例子，可举出日本特开2011－047858号公报中公开的、包含将非交联性的亲水性丙烯酸系单体和聚缩水甘油醚类的混合物聚合而得到的交联聚合物粒子、以及在该交联聚合物粒子的表面聚合而得到的具有阳离子交换基团的丙烯酸系单体的层的填充剂。

在本发明的方法中，与以往的基于离子交换色谱的血红蛋白分析同样地，使试样中的血红蛋白吸附于固定相(例如离子交换柱)后，洗脱液流入该固定相，从该固定相中洗脱血红蛋白，从而将试样中的血红蛋白分离。因此，本发明的方法中使用的洗脱液是为了基于离子交换色谱的血红蛋白分离而使用的洗脱液。更优选地，该洗脱液是在阳离子交换色谱中为了从固定相洗脱血红蛋白而使用的洗脱液。

在本发明的方法中，作为用于从固定相洗脱HbA0的HbA0分离用洗脱液，使用含有低浓度的两性离子缓冲剂的缓冲液。作为两性离子缓冲剂的优选的例子，可举出Bicine(N,N-双(2-羟基乙基)甘氨酸)、Tricine(N-[三(羟基甲基)甲基]甘氨酸)和TES(N-三(羟基甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸)，其中，优选为TES。

该HbA0分离用洗脱液中的上述的缓冲剂的浓度优选为小于25mM，更优选为20mM以下，进一步优选为17.5mM以下，进一步优选为15mM以下，另一方面，优选为2mM以上，更优选为2.5mM以上，进一步优选为5mM以上，进一步优选为10mM以上。作为该HbA0分离用洗脱液中的该缓冲剂的浓度的范围的例子，可举出优选为2mM以上且小于25mM，更优选为2.5mM～20mM，进一步优选为5mM～17.5mM，进一步优选为10mM～15mM。

该HbA0分离用洗脱液的pH可以基于该洗脱液中包含的缓冲剂的pKa进行调整。该HbA0分离用洗脱液的pH可以优选为该缓冲剂的pKa的±0.1以内，更优选为该缓冲剂的pKa的±0.08以内，进一步优选为该缓冲剂的pKa的±0.05以内，进一步优选为该缓冲剂的pKa的±0.03以内。另外，在本说明书中，只要没有特别的记载，pH和pKa分别表示25℃下的pH和pKa的值。缓冲剂的pKa可以根据其组成计算，例如TES的25℃下的pKa为7.55(J.Phys.Chem.Ref.Data,Vol.31,No.2:231-370,2002)。

该HbA0分离用洗脱液可以进一步含有有机酸、无机酸或者其盐。作为该有机酸的例子，可举出柠檬酸、琥珀酸、酒石酸、苹果酸等，作为该无机酸的例子，可举出盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、硼酸、乙酸、高氯酸等。作为盐的例子，可举出钠盐、钾盐等。该HbA0分离用洗脱液可以将这些有机酸、无机酸或者其盐中的任意1种或2种以上组合含有。

该HbA0分离用洗脱液的渗透压优选为45mOsm/kg以下，更优选为40mOsm/kg以下，另一方面，优选为20mOsm/kg以上，更优选为25mOsm/kg以上。作为该HbA0分离用洗脱液的渗透压的范围的例子，可举出优选为20～45mOsm/kg，更优选为25～40mOsm/kg。应予说明，本说明书中的渗透压的值是指利用凝固点下降法测定的渗透压的值。渗透压可以使用市售的渗透压计、例如渗透压计3250(Advanced Instruments制)等测定。另外，在本说明书中，渗透压的单位mOsm/kg是指mOsm/kgH₂O，有时其表述为mOsm/L或者mOsm。

在本发明的方法中，通过使用了上述的HbA0分离用洗脱液的离子交换色谱，从试样中分离包含HbA0的组分。优选地，在本发明的方法中，与以往的基于离子交换色谱的血红蛋白分析同样地，在分离包含HbA0的组分之前，首先将包含血红蛋白A1c(HbA1c)的组分分离。

包含HbA1c的组分利用与上述的HbA0分离用洗脱液不同的洗脱液A进行洗脱。洗脱液A只要是含有缓冲剂的缓冲液即可。优选地，该缓冲剂是在pH4.0～6.8下具有缓冲能力的酸或者其盐。作为该酸的例子，可举出有机酸和无机酸。作为有机酸的例子，可举出柠檬酸、琥珀酸、酒石酸、苹果酸等及它们的盐，作为无机酸的例子，可举出盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、硼酸、乙酸、高氯酸等以及它们的盐。该洗脱液A中使用的缓冲液可以将这些有机酸、无机酸及其盐中的任意1种或2种以上组合含有。其中，优选为包含磷酸盐、琥珀酸盐、或者过高氯酸盐的缓冲液，更优选为琥珀酸盐缓冲液。作为磷酸盐的例子，可举出钠盐和钾盐等，优选为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠。作为琥珀酸盐的例子，可举出钠盐和钾盐等，优选为琥珀酸一钠、琥珀酸二钠。作为高氯酸盐的例子，可举出高氯酸钠。这些磷酸盐、琥珀酸盐和高氯酸盐可以单独使用，也可以并用2种以上。洗脱液A中的该缓冲剂的浓度可以为0.1mM～400mM，优选为1mM～300mM。

洗脱液A的pH优选为pH4.0以上，更优选为pH5.0以上，进一步优选为pH5.2以上，优选为pH6.8以下，更优选为pH6.0以下，进一步优选为pH5.8以下。洗脱液A的pH范围优选为pH4.0～6.8，更优选为pH5.0～6.0，进一步优选为pH5.2～5.8。另外，洗脱液A的渗透压优选为160mOsm/kg以上，更优选为180mOsm/kg以上，优选为240mOsm/kg以下，更优选为220mOsm/kg以下。洗脱液A的渗透压的范围优选为160～240mOsm/kg，更优选为180～220mOsm/kg。在优选的实施方式中，洗脱液A为pH5.0～6.0，并且渗透压为160～240mOsm/kg，更优选为180～220mOsm/kg。在更优选的实施方式中，洗脱液A为pH5.2～5.8，并且渗透压为160～240mOsm/kg，更优选为180～220mOsm/kg。

在本发明的方法中，可以接着上述的HbA0分离用洗脱液的通入，进一步通入洗脱液B。该洗脱液B是与上述的HbA0分离用洗脱液和洗脱液A组成不同的洗脱液。利用该洗脱液B，可以洗脱出比包含HbA0的组分晚洗脱的成分、例如包含HbA2、HbS、HbC等的组分。

洗脱液B只要是在以往的基于离子交换色谱的血红蛋白分析中以往用于HbA0、HbA2、HbS、HbC等的洗脱的洗脱液即可。例如，洗脱液B是缓冲液，作为用于该洗脱液B的缓冲液的例子，可以举出与关于洗脱液A例示的例子相同的例子，其中，优选为包含磷酸盐、琥珀酸盐、或者高氯酸盐的缓冲液，更优选为磷酸盐缓冲液。洗脱液B中的该缓冲剂的浓度可以为0.1mM～400mM，优选为1mM～300mM。洗脱液B的pH优选为pH6.0以上，更优选为pH7.0以上，进一步优选为pH7.5以上，优选为pH10.0以下，更优选为pH9.0以下，进一步优选为pH8.5以下。洗脱液B的pH范围优选为pH6.0～10.0，更优选为pH7.0～9.0，进一步优选为pH7.5～8.5。另外，洗脱液B的渗透压优选为150mOsm/kg以上，更优选为200mOsm/kg以上，进一步优选为250mOsm/kg以上，优选为500mOsm/kg以下，更优选为400mOsm/kg以下，进一步优选为350mOsm/kg以下。洗脱液B的渗透压的范围优选为150～500mOsm/kg，更优选为200～400mOsm/kg，进一步优选为250～350mOsm/kg。在优选的实施方式中，洗脱液B为pH6.0～10.0，并且渗透压为150～500mOsm/kg。在更优选的实施方式中，洗脱液B为pH7.0～9.0，并且渗透压为200～400mOsm/kg。在进一步优选的实施方式中，洗脱液B为pH7.5～8.5，并且渗透压为250～350mOsm/kg。

本发明中使用的洗脱液(上述的洗脱液A、B和HbA0分离用洗脱液)除了含有上述的缓冲剂以外，还可以含有溶剂和血红蛋白变性剂、与三价血红素铁的结合剂、pH调节剂、表面活性剂等添加剂。

优选地，本发明中使用的该洗脱液含有血红蛋白变性剂。血红蛋白变性剂只要是使血红蛋白的血红素铁从二价变化为三价，能够生成高铁血红蛋白的氧化剂即可。作为这样的氧化剂的例子，可举出亚硝酸盐、铁氰化钾、亚甲蓝、过氧化氢、抗坏血酸、硫化氢等。其中，优选为亚硝酸盐，更优选为亚硝酸钠或者亚硝酸钾。该洗脱液中的该血红蛋白变性剂的浓度优选为0.05～15mmol/L，更优选为1.0～10mmol/L。

优选地，本发明中使用的该洗脱液含有与三价血红素铁的结合剂。该与三价血红素铁的结合剂使利用该血红蛋白变性剂生成的高铁血红蛋白稳定化，并使其洗脱动作稳定化。作为该与三价血红素铁的结合剂的例子，可举出叠氮化物、氰化物等。作为叠氮化物的例子，可举出叠氮化钠、叠氮化磷酸二苯酯、4－十二烷基苯磺酰叠氮、4－乙酰基氨基苯磺酰叠氮、叠氮化钾、叠氮化锂、叠氮化铁、叠氮化氢、叠氮化铅、叠氮化汞、叠氮化铜、叠氮化银等。作为氰化物的例子，可举出氰化钾、氰化氢、氰化钠、氰化银、氰化汞、氰化铜、氰化铅、氰化铁、氰化锂、氰化铵等。优选地，该与三价的血红素铁的结合剂是叠氮化物，更优选为叠氮化钠。该洗脱液中的该与三价血红素铁的结合剂的浓度优选为0.05～15mmol/L，更优选为0.5～10mmol/L。

作为该pH调节剂，可举出公知的酸和碱，作为酸的例子，可举出盐酸、磷酸、硝酸、硫酸等，作为碱的例子，可举出氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化镁、氢氧化钡、氢氧化钙等。

作为该溶剂，可举出甲醇、乙醇、乙腈、丙酮等的水溶性有机溶剂。该溶剂的浓度优选为不析出盐等的程度，例如优选为80％(v/v)以下，更优选的范围为0.1％(w/w)～50％(w/w)。

优选地，在本发明的方法中，一边替换上述的洗脱液A、B以及HbA0分离用洗脱液，一边洗脱包含各种血红蛋白的组分。优选地，本发明的方法中，通过按照洗脱液A→HbA0分离用洗脱液的顺序替换洗脱液，从而进行梯度洗脱。更优选地，在本发明的方法中，通过按照洗脱液A→HbA0分离用洗脱液→洗脱液B的顺序替换洗脱液来进行梯度洗脱。

优选地，本发明的方法中的梯度洗脱中，首先，通入洗脱液A(以下，称为A液，或者仅称为A)100％，洗脱包含HbA1c的组分。接着，对洗脱液赋予梯度，增加HbA0分离用洗脱液(以下，称为C液，或者仅称为C)的比例，将C液的比例上升至100％。通过C液，洗脱包含HbA0的组分。从A液向C液的梯度是以成为A：C＝100：0→0：100的方式进行。从A液向C液的梯度可以是阶式梯度也可以是线性梯度，另外，可以中途阶段性地使阶式梯度的混合比、线性梯度的梯度发生变化。优选地，从A液向C液的梯度是阶式的。

优选地，接着，替换C液和洗脱液B(以下，称为B液，或者仅称为B)。优选地，从C液向B液的梯度以成为C：B＝100：0→0：100的方式进行。从C液向B液的梯度可以是阶式梯度，也可以是线性梯度，另外，可以中途阶段性地使阶式梯度的混合比、线性梯度的梯度发生变化。通过B液，可以洗脱出比HbA0晚洗脱的Hb组分(例如，包含HbA2、HbS、HbC等的组分)。

根据需要，接着B液，可以再次通入A液。可以设置A：B＝100：0的通液时间。从B液向A液的梯度可以是阶式梯度也，也可以是线性梯度，优选为阶式。

在本发明的方法中，接着洗脱液A，通过通入上述的HbA0分离用洗脱液，从而能够将HbA0组分高精度地分离。因此，根据本发明的方法，在不受分析装置的构造上的偏差、因动作的不同带来的影响的情况下，能够通过色谱分析明确地检测HbA0的峰，甚至能够实现各种血红蛋白种类的高灵敏度的检测、以及HbA1c浓度的正确的测定。

实施例

以下，通过实施例详细地说明本发明，本发明并不限于以下的实施例。

(参考例1：血红蛋白分离用柱的制备)

在将作为非交联性的亲水性丙烯酸系单体的四乙二醇单甲基丙烯酸酯(日油社制)200g、作为聚缩水甘油醚类的聚乙二醇二缩水甘油醚(日油社制)200g混合而成的单体混合物中，溶解作为聚合引发剂的过氧化苯甲酰(Nacalai tesque公司制)1.0g。使得到的混合物分散于4重量％的聚乙烯醇(日本合成化学工业社制，“GOHSENOL GH－20”)水溶液5L，一边搅拌，一边在氮气氛下加热到80℃，进行1小时聚合反应。将温度冷却至30℃后，将作为具有阳离子交换基团的丙烯酸系单体的2－甲基丙烯酰胺－2－甲基丙烷磺酸(东亚合成社制)100g添加到反应体系中，再次加热到80℃，进行1小时聚合反应。通过利用离子交换水和丙酮对得到的交联聚合物粒子进行清洗，从而得到导入了磺酸基的交联聚合物粒子。将得到的血红蛋白分离用柱填充剂填充到内径4mm、长度20mm的不锈钢制柱中，制备了血红蛋白分离用阳离子交换柱。

(参考例2：试样的制备)

将糖化血红蛋白质控液(SYSMEX公司制)利用含有0.1％Triton X－100的磷酸缓冲液(pH7.00)适当地溶解稀释来制备试样。

(试验1)

对于参考例2中制备的试样，利用HPLC进行血红蛋白分析。准备2台同型的HPLC装置(装置A、B)，使用各试样，在下述条件下进行分析。

＜分析条件＞

HPLC装置：Prominence20A系列(岛津制作所社制)

检测器：SPD－M20A(岛津制作所社制)

送液泵：LC－20AD(岛津制作所社制)

脱气单元：DGU－20A5R(岛津制作所社制)

柱式烘箱：CTO－20AC(岛津制作所社制)

自动进样器：SIL－20AC(岛津制作所社制)

柱：参考例1中制成的血红蛋白分离用阳离子交换柱

流速：2.1mL/min

检测波长：415nm

试样注入量：5μL

洗脱液

洗脱液A：含有40mmol/L琥珀酸钠、55mmol/L高氯酸钠、1mmol/L叠氮化钠的缓冲液(pH5.3，渗透压200mOsm/kg)

洗脱液B：含有45mmol/L磷酸钠、100mmol/L高氯酸钠、9mmol/L叠氮化钠的缓冲液(pH7.6，渗透压300mOsm/kg)

洗脱液C：表1记载的处方

梯度：阶式梯度(0～21秒：洗脱液A→超过21秒至39秒：洗脱液C→超过39秒至47秒：洗脱液B→超过47秒至90秒：洗脱液A)

洗脱液的pH(25℃)和渗透压利用pH计：F－52(堀场制作所制)，以及渗透压计3250(Advanced Instruments制)进行测定。

[表1]

将试样的分析结果示于图1～2。另外，表2中表示使用了各洗脱液C的情况下的HbA0峰的洗脱时间(顶峰时间)和半值全宽。在使用TES浓度小于25mM且pH与TES的pKa之差为0.1以内的洗脱液C的情况下，在任一机型中，利用色谱均可得到HbA0的明确的峰，另外，因机型导致的峰的上升时间、顶峰时间之差、以及峰宽度之差变小。

[表2]

Claims (14)

1.一种血红蛋白分析方法，该方法包括通过使用了以小于25mM的浓度含有缓冲剂的洗脱液的离子交换色谱来洗脱包含血红蛋白A0的组分，

该缓冲剂为两性离子缓冲剂，

该洗脱液的pH在该缓冲剂的pKa的±0.1以内。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述两性离子缓冲剂为TES。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述洗脱液的渗透压为60mOsm/kg以下。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，进一步包括在洗脱所述包含血红蛋白A0的组分之前使用洗脱液A洗脱包含血红蛋白A1c的组分，该洗脱液A为pH4.0～6.8的缓冲液。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述洗脱液A与所述以小于25mM的浓度含有缓冲剂的洗脱液之间的替换是通过阶式梯度进行的。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，进一步包括在所述以小于25mM的浓度含有缓冲剂的洗脱液之后，通入洗脱液B，该洗脱液B为pH6.0～10.0的缓冲液。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述以小于25mM的浓度含有缓冲剂的洗脱液与所述洗脱液B之间的替换是通过阶式梯度进行的。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，所述离子交换色谱为阳离子交换色谱。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，所述色谱为高效液相色谱。

10.一种离子交换色谱中的血红蛋白A0分离用洗脱液，其中，以小于25mM的浓度含有缓冲剂，并具有该缓冲剂的pKa的±0.1以内的pH，该缓冲剂为两性离子缓冲剂。

11.根据权利要求10所述的洗脱液，其中，所述两性离子缓冲剂为TES。

12.根据权利要求10或11所述的洗脱液，其中，渗透压为60mOsm/kg以下。

13.根据权利要求10～12中任一项所述的洗脱液，其中，在离子交换色谱中，在洗脱液A之后使用，该洗脱液A为pH4.0～6.8的缓冲液。

14.根据权利要求10～13中任一项所述的洗脱液，其中，在离子交换色谱中，在洗脱液B之前使用，该洗脱液B为pH6.0～10.0的缓冲液。

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