JP4391733B2 - ヘモグロビン類の測定方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘモグロビン類の測定方法に関し、より詳細には安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定を目的とした、陽イオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃと略す）は、すべてのヘモグロビンに対するその構成比率が、過去１〜２カ月間の平均的な血糖値（血液中のグルコース濃度）を反映しているため、糖尿病のスクリーニング検査や糖尿病患者の血糖管理状態を把握する検査項目として繁用されている。
【０００３】
ＨｂＡ１ｃは、血液中のグルコースとヘモグロビンＡ（以下、ＨｂＡと略す）とが反応して生成された糖化ヘモグロビン( 以下、ＧＨｂと略す) であり、可逆的に反応したものを不安定型ＨｂＡ１ｃ（unstable HbA1c）と呼び、不安定型ＨｂＡ１ｃを経て不可逆的に反応したものを安定型ＨｂＡ１ｃ(stable HbA1c)と呼んでいる。
【０００４】
普通、ヘモグロビンは２種類のサブユニット２つずつから構成される４量体のタンパク質である。ＨｂＡのサブユニットはα鎖とβ鎖であり、このβ鎖のＮ末端アミノ酸にグルコースが結合したものがＨｂＡ１ｃである。過去１〜２カ月間の平均的な血糖値を良く反映するのは安定型ＨｂＡ１ｃであり、臨床検査分野では、高精度に安定型ＨｂＡ１ｃ値（％）を得ることができる測定法の開発が望まれている。
【０００５】
従来、ＨｂＡ１ｃの主な測定法としては、血液検体を溶血希釈して調製した試料中のヘモグロビン類を、陽イオン交換法により、ヘモグロビン成分毎に異なるプラス荷電状態の違いを利用して分離する液体クロマトグラフィー（以下、ＬＣと略す）が用いられてきた。（例えば、日本国・特公平８−７１９８号公報等）。
【０００６】
陽イオン交換ＬＣにより、十分な時間を掛けて溶血試料中のヘモグロビン類を分離すると、通常はヘモグロビンＡ１ａ（以下、ＨｂＡ１ａと略す）及びヘモグロビンＡ１ｂ（以下、ＨｂＡ１ｂと略す）、ヘモグロビンＦ（以下、ＨｂＦと略す）、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ及びヘモグロビンＡ０（以下、ＨｂＡ０と略す）の順に溶離されてくる。ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ及びＨｂＡ１ｃはＨｂＡが糖化されたＧＨｂ、ＨｂＦはα鎖とγ鎖から成る胎児性ヘモグロビン、ＨｂＡ０はＨｂＡを主成分とする一群のヘモグロビン成分であって、ＨｂＡ１ｃより強くカラムに保持されたものである。
【０００７】
従来の技術では、安定型ＨｂＡ１ｃから不安定型ＨｂＡ１ｃを十分に分離することができないばかりでなく、時にアセチル化ヘモグロビン（以下、ＡＨｂと略す）やカルバミル化ヘモグロビン（以下、ＣＨｂと略す）等の「修飾ヘモグロビン」が安定型ＨｂＡ１ｃと重なって溶離してくるという問題があった。
【０００８】
すなわち、陽イオン交換ＬＣによる安定型ＨｂＡ１ｃ値（％）の測定を目的として、血液検体のヘモグロビン類を測定する際、安定型ＨｂＡ１ｃの測定値に影響を与えないように、安定型ＨｂＡ１ｃと溶出挙動が近似している不安定型ＨｂＡ１ｃやＡＨｂ及びＣＨｂピークを、安定型ＨｂＡ１ｃピークから分離することが困難であった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、高精度に安定型ＨｂＡ１ｃを測定するために、上述した従来技術の欠点を解消し、短時間でしかも分離能に優れたヘモグロビン類の測定方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
請求項１記載の発明（以下、 本発明という）は、陽イオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法において、カオトロピックイオンを含有し、かつ酸解離定数（ｐＫａ）が２．１５〜６．３９の範囲及び６．４０〜１０．５０の範囲にある緩衝剤を含む溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
【００１２】
請求項２記載の発明は、 請求項１に記載のヘモグロビン類の測定方法であって、測定目的のピークを分離するのに際し、ｐＨの異なる少なくとも２種以上の溶離液を用い、該ｐＨの異なる少なくとも２種以上の溶離液が、同一の緩衝剤を含むものであることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
【００１３】
請求項３記載の発明は、 請求項１または２に記載のヘモグロビン類の測定方法であって、ＨｂＡ０を溶出するために、カラムに流入する際のｐＨがヘモグロビンの等電点と等しいか、または等電点よりアルカリ側になる溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
【００１６】
請求項４記載の発明は、請求項３に記載のヘモグロビン類の測定方法であって、前記溶離液のｐＨが６．８以上であることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
【００１７】
請求項５記載の発明は、 請求項１〜４のいずれか１項に記載のヘモグロビン類の測定方法であって、ヘモグロビンＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン類の溶出に、ｐＨ４．０〜６．８の溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
【００１８】
請求項６記載の発明は、 請求項５に記載のヘモグロビン類の測定方法であって、ヘモグロビンＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン類の溶出に、少なくとも溶出力の異なる２種以上の溶離液を用い、 溶出力の弱い溶離液から順に送液することを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
【００１９】
請求項７記載の発明は、請求項１〜６のいずれか１項に記載のヘモグロビン類の測定方法であって、少なくとも溶出力の異なる３種の溶離液を用い、ＨｂＡ０を溶出するための溶離液を送液する前に、該ＨｂＡ０を溶出するための溶離液以外の溶離液を送液することを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
【００２０】
請求項８記載の発明は、 請求項１〜７のいずれか１項に記載のヘモグロビン類の測定方法であって、溶離液を勾配溶出法または段階溶出法によって送液し、その途中において溶離液の溶出力を低下させることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
【００３９】
以下、本発明の詳細を説明する。
本発明では、上記カオトロピックイオンを含有し、かつ酸解離定数（ｐＫａ）が、２．１５〜６．３９の範囲及び６．４０〜１０．５０の範囲にある緩衝剤を含有する溶離液が用いられる。
【００４０】
上記カオトロピックイオンとは、化合物が水溶液に溶解したときに解離により生じたイオンであり、水の構造を破壊し、疎水性物質と水が接触したときに起こる水のエントロピー減少を抑制するものである。
陰イオンのカオトロピックイオンとしては、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン、塩化物イオン、酢酸イオン等が挙げられる。また、陽イオンのカオトロピックイオンとしては、バリウムイオン、カルシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、グアニジンイオン等が挙げられる。
上記カオトロピックイオンの中でも、陰イオンとして、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン等を、陽イオンとして、バリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、グアニジンイオン等を用いるのが好ましい。さらに、より好ましくは、チオシアン酸イオン、過塩素酸イオン、硝酸イオン、グアニジンイオン等が用いられる。
上記溶離液中のカオトロピックイオンの濃度が、０．１ｍＭより低いとヘモグロビン類の測定において、分離効果が低下するおそれがあり、また、３０００ｍＭよりも高いと、ヘモグロビン類の分離効果はそれ以上向上しないので、０．１ｍＭ〜３０００ｍＭが好ましく、１ｍＭ〜１０００ｍＭがより好ましく、更に、１０ｍＭ〜５００ｍＭが好ましい。
また、カオトロピックイオンは複数種混合して用いても良い。
上記カオトロピックイオンは、測定試料と接触する液、例えば、溶血試薬、試料希釈液等に添加しても良い。
【００４１】
本発明において、上記緩衝剤としては、酸解離定数（ｐＫａ）が、２．１５〜６．３９及び６．４０〜１０．５０の範囲に存在するものが用いられる。すなわち、緩衝剤として、ｐＫａを、２．１５〜６．３９及び６．４０〜１０．５０の範囲に少なくとも一つずつもつ単一の物質を用いても良く、あるいは、２．１５〜６．３９の範囲に少なくとも一つのｐＫａをもつ物質と６．４０〜１０．５０の範囲に少なくとも一つのｐＫａをもつ物質とを組み合わせて緩衝剤として用いても良い。また、上記緩衝剤を複数組み合わせて用いても良い。
【００４２】
上記緩衝剤のｐＫａの範囲は、測定目的のピークを分離するのに適切な溶離液のｐＨ付近において、より優れた緩衝能を発揮できるように、２．６１〜６．３９及び６．４０〜１０．５０の範囲が好ましく、より好ましくは、２．８０〜６．３５及び６．８０〜１０．００の範囲である。さらに好ましくは、３．５０〜６．２５及び７．００〜９．５０の範囲である。
【００４３】
上記緩衝剤としては、例えば、リン酸、ホウ酸、炭酸等の無機物のほか、カルボン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン酸、アニリンまたはアニリン誘導体、アミノ酸、アミン類、イミダゾール類、アルコール類等の有機物が挙げられる。また、エチレンジアミン四酢酸、ピロリン酸、ピリジン、カコジル酸、グリセロールリン酸、２，４，６−コリジン、Ｎ−エチルモルホリン、モルホリン、４−アミノピリジン、アンモニア、エフェドリン、ヒドロキシプロリン、ペリジン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、グリシルグリシン等の有機物でも良い。
【００４４】
上記カルボン酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、安息香酸等が挙げられる。
【００４５】
上記ジカルボン酸としては、例えば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイン酸、フタル酸、フマル酸等が挙げられる。
【００４６】
上記カルボン酸誘導体としては、例えば、β，β’−ジメチルグルタル酸、バルビツール酸、５，５−ジエチルバルビツール酸、γ−アミノ酪酸、ピルビン酸、フランカルボン酸、ε−アミノカプロン酸等が挙げられる。
【００４７】
上記ヒドロキシカルボン酸としては、例えば、酒石酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸等が挙げられる。
【００４８】
上記アニリンまたはアニリン誘導体としては、例えば、アニリン、ジメチルアニリン等が挙げられる。
【００４９】
上記アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシン、α−アラニン、β−アラニン、ヒスチジン、セリン、ロイシン等が挙げられる。
【００５０】
上記アミン類としては、例えば、エチレンジアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジエタノールアミン等が挙げられる。上記イミダゾール類としては、例えば、イミダゾール、５（４）−ヒドロキシイミダゾール、５（４）−メチルイミダゾール、２，５（４）−ジメチルイミダゾール等が挙げられる。
【００５１】
上記アルコール類としては、例えば、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−エチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール等が挙げられる。
【００５２】
また、上記緩衝剤としては、２−（Ｎ−モリホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス−（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミドジ酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ）プロパン（Ｂｉｓｔｒｉｓｐｒｏｐａｎｅ）、Ｎ−（アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−（Ｎ−モルフォリン）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン（Ｔｒｉｓ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、グリシルグリシン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、グリシン、シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等の一般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれるものを組成する物質も使用できる。これらの物質のｐＫａを表１・２に示す（引用文献：堀尾武一・山下仁平 蛋白質・酵素の基礎実験法 南江堂 １９８５年）。
【００５３】
【表１】
【００５４】
【表２】
【００５５】
溶離液中の上記緩衝剤濃度は、緩衝作用がある範囲であれば良く、好ましくは１〜１０００ｍＭ、より好ましくは１０〜５００ｍＭである。また、上記緩衝剤は、単独でも複数混合して用いても良く、例えば、有機物と無機物を混合して用いても良い。
【００５６】
上記溶離液には、以下の物質を添加しても良い。
（１）無機塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウム等）を添加しても良い。これらの塩類の濃度は、特に限定されないが、好ましくは１〜１５００ｍＭである。
（２）ｐＨ調節剤として、公知の酸、塩基を加えても良い。酸としては、例えば、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸等が、塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。これらの酸、塩基の濃度は、特に限定されないが、好ましくは、０．００１〜５００ｍＭである。
（３）メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン等の水溶性有機溶媒を混合しても良い。これらの有機溶媒の濃度は、特に限定されないが、好ましくは０〜８０％（ｖ／ｖ）であり、カオトロピックイオン、無機酸、有機酸、これらの塩等が析出しない程度で用いるのが好ましい。
（４）アジ化ナトリウム、チモール等の防腐剤を添加しても良い。
（５）ヘモグロビンの安定剤として、公知の安定剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤、グルタチオン、アジ化ナトリウム等の還元剤・酸化防止剤等を添加しても良い。
【００５７】
本発明においては、ｐＨの異なる少なくとも２種類以上の上記溶離液を用いるのが好ましい。また、その場合、測定目的のピークを分離するにあたって用いる溶離液は、同一の緩衝剤を含むものを用いるのが好ましいが、溶離液を切り替える際の、（検出器出力の）ベースライン変動が、測定値に悪影響を与えなければ、その必要はない。
【００５８】
さらに、ベースライン変動をより小さくするために、上記測定目的のピークを分離するにあたって用いる溶離液は、緩衝剤の濃度も同一であるものを用いるのがより好ましい。なお、溶離液のｐＨは、例えば、前述のｐＨ調節剤の添加量により調節できる。
【００５９】
上記ｐＨの異なる２種類以上の溶離液を、勾配溶出法、あるいは段階溶出法によって送液しても良い。
【００６０】
上記測定目的のピークとは、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ、ＡＨｂ、ＣＨｂ、ＨｂＡ０、ＨｂＡ2 、ＨｂＳ、ＨｂＣ等が挙げられる。
【００６１】
ＨｂＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン類を分離するための溶離液のｐＨは、４．０未満であると、ヘモグロビン類が変性する可能性があり、６．８を超えるとヘモグロビンのプラス電荷が減少し、陽イオン交換基に保持されにくくなり、分離能が低下するので４．０〜６．８が好ましく、４．５〜５．８がより好ましい。
【００６３】
また、本発明においても、ＨｂＡ０の溶出に際し、すなわち、ＨｂＡ１ｃより強く充填剤に保持されたＨｂＡ等から成る「ＨｂＡ０成分」を溶出するためには、カラムに流入する際のｐＨをヘモグロビンの等電点よりアルカリ側になるように設定した溶離液を用いるのが好ましい。この条件を実現するには、ｐＨがヘモグロビンの等電点よりアルカリ側であるひとつの溶離液を送液する方法や、ｐＨの異なる２種以上の溶離液を用いる方法がある。
【００６４】
ヘモグロビンはｐＨが等電点より酸性側からアルカリ側になると、総荷電がプラスからマイナスに変わるため、充填剤の陽イオン交換基との「電気的反発力によってＨｂＡ０成分を溶出」させることができる。
【００６５】
なお、理化学辞典（第４版、１９８７年９月、岩波書店、久保亮五ら編集）、１１７８頁に記載されているように、ヘモグロビンの等電点はｐＨ６．８〜７．０である。そのため、ＨｂＡ０成分を溶出するために、カラムに流入する際の溶離液のｐＨを６．８以上にすることがより好ましい。
【００６６】
この条件を満たすため、測定に用いる溶離液の内、少なくともひとつの溶離液のｐＨが６．８以上であることが必要である。本溶離液のｐＨは望ましくは７．０〜１２．０であり、７．５〜１１．０がより好ましく、更には８．０〜９．５が好ましい。溶離液のｐＨが６．８未満になるとＨｂＡ０成分の溶出が不十分となる。溶離液のｐＨは、用いる充填剤の分解が起こらない範囲に設定すれば良い。
【００６７】
ＨｂＡ０成分の溶出に好適に用いられる、ｐＨが６．８以上で緩衝能をもつ溶離液としては、例えば、リン酸、ホウ酸、炭酸等の無機酸または、その塩；クエン酸等のヒドロキシカルボン酸、β、β−ジメチルグルタル酸等のカルボン酸誘導体、マレイン酸等のジカルボン酸、カコジル酸、等の有機酸または、その塩からなる緩衝液が挙げられる。その他、２−（Ｎ−モリホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス−（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓｔｒｉｓ）、Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、Ｂｉｓｔｒｉｓｐｒｏｐａｎｅ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、グリシルグリシン、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ等の一般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれるものも使用できる。また、ＢｒｉｔｔｏｎとＲｏｂｉｎｓｏｎの緩衝液；ＧＴＡ緩衝液も使用できる。また、イミダゾール等のイミダゾール類；エチレンジアミン、メチルアミン、エチルアミン、トリエチルアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等のアミン類；グリシン、β−アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン等のアミノ酸類；等の有機物も使用できる。
【００６８】
また、無機酸；有機酸；無機酸または有機酸の塩；有機物は、複数混合して用いても良く、また、有機酸、無機酸及び有機物を混合しても良い。
【００６９】
より効果的にＨｂＡ０成分を溶出するためには、上記溶離液にカオトロピックイオンを添加するのが好ましい。添加するカオトロピックイオンは前記と同様である。
【００７０】
添加するカオトロピックイオン濃度は、１〜３０００ｍＭで、好ましくは、１０〜１０００ｍＭ、更には、５０〜５００ｍＭが好ましい。
【００７１】
本発明においては、少なくとも溶出力の異なる３種の溶離液を用い、ＨｂＡ０を溶出するための溶離液を送液する前に、該ＨｂＡ０を溶出するための溶離液以外の溶離液を送液しても良い。
【００７２】
すなわち、ＨｂＡ０成分を溶出するための溶離液が（送液ポンプで）送液されてカラムに通液されるとＨｂＡ０成分が溶出されてくる。このＨｂＡ０成分を溶出するための溶離液を送液する前、すなわち、ＨｂＡ０より前に溶出されてくる各ヘモグロビン成分を分離するために、ＨｂＡ０成分を溶出する溶離液以外の溶離液を送液する。
【００７３】
ＨｂＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン類の溶出に、ｐＨ４．０〜６．８の溶離液を少なくとも２種類以上用い、塩濃度勾配法やｐＨ勾配法またはこの２つの組み合わせにより、安定型ＨｂＡ１ｃ等の測定対象ピークをシャープに溶出させることが可能になる。
【００７４】
本発明においては、ＨｂＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン類（ＨｂＡ１ａ及びｂ、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ）の溶出には、少なくとも２種類以上の溶離液を用い、かつ、溶出力の最も弱い溶離液を先に流すこともできる。
【００７５】
本発明に係るヘモグロビン類の測定方法では、好ましくは、溶離液を勾配溶出法または段階溶出法によって送液し、その途中において溶離液の溶出力を低下させることが望ましい。
【００７６】
従来のＬＣでは、分離対象成分のピークをシャープにしたり、隣り合って溶出する２つ以上のピークの分離度を向上させたりするために、複数の溶離液を用いた勾配溶出法や段階溶出法が利用されている。
【００７７】
勾配溶出法は「グラジエント溶出」と呼ばれている。すなわち、複数台の送液ポンプを用い、溶出力が異なる複数の溶離液の送液比率を連続的に変化させて送液する。それによって、図２０に示すように、時間と共に溶出力が連続的に上昇するように溶出が行われる。
【００７８】
また、段階溶出法は「ステップワイズ溶出」と称されている。この方法では、１台の送液ポンプを、電磁弁等を介して複数の溶離液に連結する。そして、電磁弁を切り換えることにより、溶出力の低い溶離液から、溶出力の高い溶離液に切り換えて送液する。従って、図２１に示すように、溶出力は段階的に上昇いていく。
【００７９】
しかしながら、溶出される各成分の性質が類似していたり、短時間で溶出することが要求されている場合、従来の勾配溶出法や段階溶出法では、類似した性質の成分間でピークが重なり、分離度が低下するおそれがあった。
【００８０】
これに対して、本発明では、勾配溶出法または段階溶出法によって溶離液を送液するに際し、その途中、すなわち勾配溶出法または段階溶出法により複数の溶離液を順に切り替えて送液していく途中において、分離対象のピークまたはピーク間の溶離タイミングを考慮して分離対象のピークまたはピーク間の分離状態が良くなるように、溶離液の溶出力を一旦低下させることもできる。具体的には、段階溶出法の場合、溶出力の弱い溶離液から溶出力の強い溶離液に切り替えて送液した後、溶出力の弱い溶離液に切り替え、しばらくしてから溶出力の強い溶離液に切り替えて送液する。
【００８１】
陽イオン交換ＬＣにおいて、溶離液の溶出力を低下させるには、溶離液の塩濃度を下げる方法やｐＨを下げる方法、またはこの２つを組み合わせる方法が挙げられる。
【００８２】
陰イオン交換ＬＣでは溶離液の塩濃度を下げる方法やｐＨを上げる方法、逆相クロマトグラフィーでは溶離液の有機溶媒の極性を上げる方法、順相クロマトグラフィーでは溶離液の有機溶媒の極性を下げる方法が挙げられる。
【００８３】
上記のように勾配溶出法または段階溶出法によって送液し、その途中において溶離液の溶出力を低下させる方法により、ヘモグロビンを分離する場合をより具体的に説明する。
【００８４】
ヘモグロビン類の分離には、陽イオン交換充填剤が充填されたカラムを用い、溶離液を塩濃度２０〜１０００ｍＭ、ｐＨ４〜９の範囲で勾配溶出法または段階溶出法によって送液させ、その途中において溶離液の塩濃度を５〜５００ｍＭ、ｐＨを０．１〜３の範囲で下げることによって溶離液の溶出力を低下させて分離を行う。
【００８５】
本発明の方法を段階溶出法によって行う場合の、装置の構成例を図１７に示した。溶離液Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄは、各々溶出力の異なる（例えば、塩濃度、ｐＨ、極性等において異なる）ものであり、電磁弁１によって設定時間に各溶離液に切り替えられるように構成されている。溶離液は、送液ポンプ２により、試料注入部３から導入された試料とともにカラム４に導かれ、各成分が検出器５により検出される。各ピークの面積、高さ等はインテグレータ６により算出される。
【００８６】
安定型ＨｂＡ１ｃの測定に悪影響を与える可能性のあるＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等のヘモグロビン成分を含む血液検体を測定する場合、ＨｂＡ０成分（ピーク）として主にＨｂＡを溶出させ、それより後にＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等を溶離させる測定方法を設定することがある。これにより、ＨｂＡ０ピークからＨｂＡ以外のヘモグロビン成分を除けるため、より正確な安定型ＨｂＡ１ｃ（％）を算出できる。
【００８７】
ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等を溶離させる測定方法を設定する場合、前述した少なくとも溶出力の異なる３種の溶離液を用いる方法における「ＨｂＡ０を溶出するための溶離液」は、ＨｂＡを主成分とするＨｂＡ０ピークを溶出する溶離液を意味している。このとき、「ＨｂＡ０を溶出するための溶離液」の後に、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等を溶離するために、より溶出力の強い溶離液を送液することが必要となる。
【００８８】
本発明のヘモグロビン類の測定方法におけるカチオン交換液体クロマトグラフィーの充填剤は、少なくとも１種以上のカチオン交換基を有している粒子よりなるものであり、例えば、高分子粒子にカチオン交換基を導入することで得られる。
【００８９】
該カチオン交換基は、公知のものでよく特に制限はない。例えば、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基などのカチオン交換基等が挙げられる。また、このカチオン交換基は、複数種導入しても良い。
【００９０】
上記粒子の直径は、好ましくは０．５〜２０μｍ、より好ましくは１〜１０μｍである。
また、粒度分布は、変動係数値（ＣＶ値）（粒径の標準偏差÷平均直径×１００）として、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下である。
【００９１】
上記高分子粒子としては、例えば、シリカ、ジルコニアなどの無機系粒子；セルロース、ポリアミノ酸、キトサンなどの天然高分子粒子；ポリスチレン、ポリアクリル酸エステルなどの合成高分子粒子などが挙げられる。
上記高分子粒子は、導入されるイオン交換基以外の構成成分は、より親水性であることが好ましい。また耐圧性・耐膨潤性の点から架橋度の高いものが好ましい。
【００９２】
上記高分子粒子へのカチオン交換基の導入は、公知の方法により行うことができるが、例えば、高分子粒子を調製後、粒子が有する官能基（水酸基、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基など）に、化学反応でカチオン交換基を粒子に導入させる方法により行うことができる。
【００９３】
また、カチオン交換基を有する単量体を重合して高分子粒子を調製する方法によってもカチオン交換充填剤を調製できる。例えば、カチオン交換基含有単量体と架橋性単量体等とを混合し、重合開始剤の存在下に重合する方法などが挙げられる。
【００９４】
また、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチルなどの重合性カチオン交換基含有エステルを架橋性単量体などと混合し、重合開始剤存在下で重合した後、得られた粒子を加水分解処理し、エステルをカチオン交換基に変換させてもよい。
【００９５】
更に、特公平８−７１９７号公報に記載のように、架橋重合体粒子を調製した後、カチオン交換基を有する単量体を添加して、重合体粒子の表面付近に、該単量体を重合させても良い。
【００９６】
上記充填剤はカラムに充填されて液体クロマトグラフィー測定に用いられる。上記カラムは公知のステンレス製、ガラス製、樹脂製など、特に限定されない。カラムサイズとしては、内径０．１〜５０ｍｍ、長さ１〜３００ｍｍのものが好ましく、内径０．２〜３０ｍｍ、長さ５〜２００ｍｍのものがより好ましい。充填剤のカラムへの充填方法は、公知の任意の方法が使用できるがスラリー充填法がより好ましい。具体的には、例えば、充填剤粒子を溶離液などの緩衝液に分散させたスラリーを送液ポンプなどによりカラムに圧入することにより行う。
【００９７】
本発明に使用されるＬＣ装置は、公知のもので良く、例えば、送液ポンプ、試料注入装置（サンプラ）、カラム、検出器等から構成される。また、他の付属装置（カラム恒温槽や溶離液の脱気装置等）が適宜付加されても良い。
【００９８】
上記測定法における、他の測定条件としては、公知の条件で良く、溶離液の流速は、好ましくは０．０５〜５ｍＬ／分、より好ましくは０．２〜３ｍＬ／分である。ヘモグロビン類の検出は、４１５ｎｍの可視光が好ましいが、特にこれのみに限定されるわけではない。測定試料は、通常、界面活性剤等溶血活性を有する物質を含む溶液により溶血された溶血液を希釈したものを用いる。試料注入量は、血液検体の希釈倍率により異なるが、好ましくは０．１〜１００μＬ程度である。
【００９９】
【実施例】
以下に実施例、比較例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【０１００】
（実施例１）
充填剤の調製
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４００ｇ及び２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸１５０ｇの混合物に過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）１．５ｇを溶解した。これを４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍＬに分散させ、撹拌しながら窒素雰囲気下で７５℃に昇温し、８時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径６μｍの粒子を得た。
【０１０１】
充填剤のカラムへの充填
得られた粒子をカラムに以下のようにして充填した。粒子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）３０ｍＬに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製の空カラム（内径４．６×３０ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填した。
【０１０２】
ヘモグロビン類の測定
得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘモグロビン類の測定を行った。
なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りである。測定開始より０〜３分の間は溶離液Ａを送液し、３〜３．２分の間は溶離液Ｂを送液し、３．２〜５分の間は溶離液Ａを送液した。
流速：２．０ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μＬ
【０１０３】
（測定試料）
健常人血をフッ化ナトリウム採血した全血検体から以下の試料を調製した。なお、溶血試薬として、０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）（東京化成社製）を含有させたリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０）を用いた。
ａ）糖負荷血：全血検体に５００ｍｇ／ｄＬのグルコース水溶液を添加し、３７℃で３時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、１５０倍に希釈して試料ａとした。
ｂ）ＣＨｂ含有試料：全血検体１０ｍＬに、０．３重量％のシアン酸ナトリウムの生理食塩水溶液１ｍＬを添加し、３７℃で３時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、１５０倍に希釈して試料ｂとした。
ｃ）ＡＨｂ含有試料：全血検体１０ｍＬに、０．３重量％のアセトアルデヒドの生理食塩水溶液１ｍＬを添加し、３７℃で３時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、１５０倍に希釈して試料ｃとした。
【０１０４】
（測定結果）
上記測定条件により、試料を測定して得られたクロマトグラムを図１〜３に示す。図１は試料ａ、図２は試料ｂ、図３は試料ｃを測定した結果である。ピーク１はＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ、ピーク２はＨｂＦ、ピーク３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５はＨｂＡ０、ピーク６はＣＨｂ、ピーク７はＡＨｂを示す。
図１では、ピーク３および４が良好に分離されている。また、図２ではピーク６（ＣＨｂ）、図３ではピーク７（ＡＨｂ）がピーク４から良好に分離されている。
【０１０５】
（実施例２）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図１〜３と同様に良好であった。
なお、コハク酸のｐＫａは、表１に記載の通りである。
【０１０６】
（実施例３）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図１〜３と同様に良好であった。
なお、マレイン酸のｐＫａは、表１に記載の通りである。
【０１０７】
（実施例４）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図１〜３と同様に良好であった。
【０１０８】
（比較例１）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。
得られたクロマトグラムを図４〜６に示す。図４は試料ａ、図５は試料ｂ、図６は試料ｃを測定した結果である。図１〜３に比較して、測定時間が長いにもかかわらず、分離状態が悪いことが分かる。
【０１０９】
（実施例５）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。
測定開始より０〜３分の間は溶離液Ａを送液し、３〜３．２分の間は溶離液Ｂを送液し、３．２〜５分の間は溶離液Ａを送液した。
【０１１０】
（測定結果）
得られたクロマトグラムを図７〜９に示す。図７は試料ａ、図８は試料ｂ、図９は試料ｃを測定した結果である。ピーク１はＨｂＡ１ａ及びｂ、ピーク２はＨｂＦ、ピーク３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５はＨｂＡ０、ピーク６はＣＨｂ、ピーク７はＡＨｂを示す。
図７では、ピーク３および４が良好に分離されている。また、図８ではピーク６（ＣＨｂ）、図９ではピーク７（ＡＨｂ）がピーク４から良好に分離されている。
【０１１１】
（実施例６）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図７〜９と同様に良好であった。
【０１１２】
（実施例７）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図７〜９と同様に良好であった。
【０１１３】
（実施例８）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図７〜９と同様に良好であった。
【０１１４】
（比較例２）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。
得られたクロマトグラムを図１０〜１２に示す。図１０は試料ａ、図１１は試料ｂ、図１２は試料ｃを測定した結果である。図７〜９に比較して、測定時間が長いにもかかわらず、分離状態が悪いことが分かる。
【０１１５】
（比較例３）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図１０〜１２と同様であった。
実施例５〜８及び比較例２、３のクロマトグラムにおいて、ＨｂＡ０のピーク幅及び分離能を比較した結果、実施例５〜８は、比較例２、３に比べて、ＨｂＡ０のピーク幅は、狭く、しかも、分離能も良かった。
【０１１６】
（実施例９）
充填剤の調製において２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸の代わりに、 メタクリル酸（和光純薬）を用い、 溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。
【０１１７】
（実施例１０）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例９と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。
【０１１８】
（実施例１１）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。
【０１１９】
（実施例１２）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。
【０１２０】
（比較例４）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例９と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。
【０１２１】
（比較例５）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。
【０１２２】
実施例９〜１２及び比較例４、５のクロマトグラムにおいて、ＨｂＡ０のピーク幅及び分離能を比較した結果、実施例９〜１２は、比較例４、５に比べて、ＨｂＡ０のピーク幅は、狭く、しかも、分離能も良かった。
また、実施例９〜１２及び比較例４、５において、試料を連続測定した場合のＨｂＡ１ｃの保持時間の変化を図１３に示した。 図１３より、実施例９〜１２では、比較例４、５に比べて保持時間の変化が少ないことが分かる。
【０１２３】
（実施例１３）
溶離液の数と組成およびその送液条件を以下のように変更した以外は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。
測定開始より０〜０．７分の間は溶離液Ａを送液し、０．７〜１．４分の間は溶離液Ｂを送液し、１．４〜１．５分の間は溶離液Ｃを送液し、１．５〜１．９分の間は溶離液Ａを送液した。
【０１２４】
（測定結果）
得られたクロマトグラムを図１４〜１６に示す。図１４は試料ａ、図１５は試料ｂ、図１６は試料ｃを測定した結果である。ピーク１はＨｂＡ１ａ及びｂ、ピーク２はＨｂＦ、ピーク３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５はＨｂＡ０、ピーク６はＣＨｂ、ピーク７はＡＨｂを示す。
図１４では、ピーク３および４が良好に分離されている。また、図１５ではピーク６（ＣＨｂ）、図１６ではピーク７（ＡＨｂ）がピーク４から良好に分離されている。
【０１２５】
（実施例１４）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１３と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図１４〜１６と同様に良好であった。
【０１２６】
（実施例１５）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１３と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図１４〜１６と同様に良好であった。
【０１２７】
（実施例１６）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１３と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図１４〜１６と同様に良好であった。
【０１２８】
（実施例１７）
図１７に示した装置を用いて、血液試料中のヘモグロビン類の測定を行った。カラムには陽イオン交換樹脂（ミクロネックスＡ１ｃ ＨＳ−IV、積水化学工業社製）を充填したものを用いた。溶離液Ａとして１７０ｍＭ、溶離液Ｂとして１９０ｍＭ、溶離液Ｃとして１５０ｍＭ、溶離液Ｄとして３３０ｍＭの、それぞれリン酸緩衝液で、溶離液Ａ〜ＣはｐＨ６のものを、溶離液ＤはｐＨ７．２のものを用いた。試料としては、実施例１で用いた全血検体を溶血試薬を用いて１００倍に溶血、希釈したものを用いた。２分間でＨｂＡ１ｃ（後述のピークＰ５）を各ヘモグロビン類のピークから分離するように溶離液を段階溶出法を用いて切り替えた。溶離液の切り替え条件および得られたクロマトグラムを図１８に示した。すなわち、溶離液は０〜３８秒は溶離液Ａを、３８〜５８秒は溶出力のより高い溶離液Ｂを、５８〜７８秒はより溶出力の低い溶離液Ｃを、７８〜１００秒は溶出力の最も高い溶離液Ｄを、１００〜１２０秒は溶離液Ａを再び送液した。ピークの検出には４１５ｎｍの吸収強度を用いた。
図１８のクロマトグラムにおいて、ピークＰ１〜Ｐ３は、ＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ類であり、ピークＰ４はＨｂＦであり、ピークＰ５はＨｂＡ１ｃであり、ピークＰ６はＨｂＡ０である。
【０１２９】
上記の方法では、溶離液Ａから溶離液Ｂへの切り替えにより溶出力を上昇させたことによりピークＰ６が早く溶出して、ＨｂＡ１ｃのピークであるピークＰ５の正確な検出を妨害するのを防ぐため、溶離液Ｂから溶出力のより低い溶離液Ｃへの切り替えを行っている。
【０１３０】
再現性を評価するために、この方法で同一試料について１０回繰り返し測定し、次式によりＨｂＡ１ｃ値を算出した。１０回の各測定値、その平均値およびＣＶ値（％）を表３に示した。
ＨｂＡ１ｃ値（％）＝ピークＰ５の面積÷（ピークＰ１の面積＋ピークＰ２の面積＋ピークＰ３の面積＋ピークＰ４の面積＋ピークＰ５の面積＋ピークＰ６の面積）×１００
【０１３１】
【表３】
【０１３２】
（比較例６）
実施例１７における溶離液Ｃを用いなかったこと、および溶離液Ｂの代わりに溶離液Ｂ１（１８０ｍＭ、ｐＨ６のリン酸緩衝液）を用いた他は、実施例１７に準じて実施例１７と同一の試料中のヘモグロビン類の測定を行った。溶離液の切り替え条件および得られたクロマトグラムを図１９に示した。すなわち、溶離液は０〜３８秒は溶離液Ａを、３８〜７８秒は溶離液Ｂ１を、７８〜１００秒は溶出力の最も高い溶離液Ｄを、１００〜１２０秒は溶離液Ａを再び送液した。溶離液Ａから溶離液Ｂよりも溶出力の低い溶離液Ｂ１へ切り替えたため、ピークＰ６の一部が早く溶出することはないが、ピークＰ５はシャープにならず、図１９に○で囲んだように、ピークＰ５にピークＰ４およびピークＰ６が一部重なっていることが分かる。
【０１３３】
再現性をみるために、この方法で同一試料について１０回繰り返し測定し、実施例１と同様にしてＨｂＡ１ｃ値を算出した。１０回の各測定値、その平均値およびＣＶ値（％）を表３に示した。
【０１３４】
【発明の効果】
本願発明に係る測定方法によれば、従来のヘモグロビン類の測定方法における問題点であったヘモグロビン類の分離性能が改善され、特に安定型ＨｂＡ１ｃを高い再現性で精密に分離できる。また、短時間で、ベースライン変動が少ないと共に、 カラム耐久性も向上されたヘモグロビン類の測定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例１の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図２】 実施例１の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｂ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図３】 実施例１の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｃ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図４】 比較例１の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図５】 比較例１の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｂ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図６】 比較例１の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｃ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図７】 実施例５の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図８】 実施例５の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｂ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図９】 実施例５の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｃ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図１０】 比較例２の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図１１】 比較例２の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｂ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図１２】 比較例２の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｃ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図１３】 実施例９〜１２及び比較例４、５において、試料を連続測定した場合のＨｂＡ１ｃの保持時間の変化を示した図である。
【図１４】 実施例１３の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図１５】 実施例１３の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｂ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図１６】 実施例１３の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｃ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図１７】 段階溶出法によって行う場合の、装置の構成例を示す図である。
【図１８】 実施例１７の溶離液の切り替え条件および得られたクロマトグラムを示す図である。
【図１９】 比較例６の溶離液の切り替え条件および得られたクロマトグラムを示す図である。
【図２０】 勾配溶出法を説明するための説明図である。
【図２１】 段階溶出法を説明するための説明図である。
【符号の説明】
１ ＨｂＡ１ａ及びｂのピーク
２ ＨｂＦのピーク
３ 不安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
４ 安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
５ ＨｂＡ０のピーク
６ ＣＨｂのピーク
７ ＡＨｂのピーク
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘモグロビン類の測定方法に関し、より詳細には安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定を目的とした、陽イオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃと略す）は、すべてのヘモグロビンに対するその構成比率が、過去１〜２カ月間の平均的な血糖値（血液中のグルコース濃度）を反映しているため、糖尿病のスクリーニング検査や糖尿病患者の血糖管理状態を把握する検査項目として繁用されている。
【０００３】
ＨｂＡ１ｃは、血液中のグルコースとヘモグロビンＡ（以下、ＨｂＡと略す）とが反応して生成された糖化ヘモグロビン( 以下、ＧＨｂと略す) であり、可逆的に反応したものを不安定型ＨｂＡ１ｃ（unstable HbA1c）と呼び、不安定型ＨｂＡ１ｃを経て不可逆的に反応したものを安定型ＨｂＡ１ｃ(stable HbA1c)と呼んでいる。
【０００４】
普通、ヘモグロビンは２種類のサブユニット２つずつから構成される４量体のタンパク質である。ＨｂＡのサブユニットはα鎖とβ鎖であり、このβ鎖のＮ末端アミノ酸にグルコースが結合したものがＨｂＡ１ｃである。過去１〜２カ月間の平均的な血糖値を良く反映するのは安定型ＨｂＡ１ｃであり、臨床検査分野では、高精度に安定型ＨｂＡ１ｃ値（％）を得ることができる測定法の開発が望まれている。
【０００５】
従来、ＨｂＡ１ｃの主な測定法としては、血液検体を溶血希釈して調製した試料中のヘモグロビン類を、陽イオン交換法により、ヘモグロビン成分毎に異なるプラス荷電状態の違いを利用して分離する液体クロマトグラフィー（以下、ＬＣと略す）が用いられてきた。（例えば、日本国・特公平８−７１９８号公報等）。
【０００６】
陽イオン交換ＬＣにより、十分な時間を掛けて溶血試料中のヘモグロビン類を分離すると、通常はヘモグロビンＡ１ａ（以下、ＨｂＡ１ａと略す）及びヘモグロビンＡ１ｂ（以下、ＨｂＡ１ｂと略す）、ヘモグロビンＦ（以下、ＨｂＦと略す）、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ及びヘモグロビンＡ０（以下、ＨｂＡ０と略す）の順に溶離されてくる。ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ及びＨｂＡ１ｃはＨｂＡが糖化されたＧＨｂ、ＨｂＦはα鎖とγ鎖から成る胎児性ヘモグロビン、ＨｂＡ０はＨｂＡを主成分とする一群のヘモグロビン成分であって、ＨｂＡ１ｃより強くカラムに保持されたものである。
【０００７】
従来の技術では、安定型ＨｂＡ１ｃから不安定型ＨｂＡ１ｃを十分に分離することができないばかりでなく、時にアセチル化ヘモグロビン（以下、ＡＨｂと略す）やカルバミル化ヘモグロビン（以下、ＣＨｂと略す）等の「修飾ヘモグロビン」が安定型ＨｂＡ１ｃと重なって溶離してくるという問題があった。
【０００８】
すなわち、陽イオン交換ＬＣによる安定型ＨｂＡ１ｃ値（％）の測定を目的として、血液検体のヘモグロビン類を測定する際、安定型ＨｂＡ１ｃの測定値に影響を与えないように、安定型ＨｂＡ１ｃと溶出挙動が近似している不安定型ＨｂＡ１ｃやＡＨｂ及びＣＨｂピークを、安定型ＨｂＡ１ｃピークから分離することが困難であった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、高精度に安定型ＨｂＡ１ｃを測定するために、上述した従来技術の欠点を解消し、短時間でしかも分離能に優れたヘモグロビン類の測定方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
請求項１記載の発明（以下、 本発明という）は、陽イオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法において、カオトロピックイオンを含有し、かつ酸解離定数（ｐＫａ）が２．１５〜６．３９の範囲及び６．４０〜１０．５０の範囲にある緩衝剤を含む溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
【００１２】
請求項２記載の発明は、 請求項１に記載のヘモグロビン類の測定方法であって、測定目的のピークを分離するのに際し、ｐＨの異なる少なくとも２種以上の溶離液を用い、該ｐＨの異なる少なくとも２種以上の溶離液が、同一の緩衝剤を含むものであることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
【００１３】
請求項３記載の発明は、 請求項１または２に記載のヘモグロビン類の測定方法であって、ＨｂＡ０を溶出するために、カラムに流入する際のｐＨがヘモグロビンの等電点と等しいか、または等電点よりアルカリ側になる溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
【００１６】
請求項４記載の発明は、請求項３に記載のヘモグロビン類の測定方法であって、前記溶離液のｐＨが６．８以上であることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
【００１７】
請求項５記載の発明は、 請求項１〜４のいずれか１項に記載のヘモグロビン類の測定方法であって、ヘモグロビンＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン類の溶出に、ｐＨ４．０〜６．８の溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
【００１８】
請求項６記載の発明は、 請求項５に記載のヘモグロビン類の測定方法であって、ヘモグロビンＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン類の溶出に、少なくとも溶出力の異なる２種以上の溶離液を用い、 溶出力の弱い溶離液から順に送液することを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
【００１９】
請求項７記載の発明は、請求項１〜６のいずれか１項に記載のヘモグロビン類の測定方法であって、少なくとも溶出力の異なる３種の溶離液を用い、ＨｂＡ０を溶出するための溶離液を送液する前に、該ＨｂＡ０を溶出するための溶離液以外の溶離液を送液することを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
【００２０】
請求項８記載の発明は、 請求項１〜７のいずれか１項に記載のヘモグロビン類の測定方法であって、溶離液を勾配溶出法または段階溶出法によって送液し、その途中において溶離液の溶出力を低下させることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
【００３９】
以下、本発明の詳細を説明する。
本発明では、上記カオトロピックイオンを含有し、かつ酸解離定数（ｐＫａ）が、２．１５〜６．３９の範囲及び６．４０〜１０．５０の範囲にある緩衝剤を含有する溶離液が用いられる。
【００４０】
上記カオトロピックイオンとは、化合物が水溶液に溶解したときに解離により生じたイオンであり、水の構造を破壊し、疎水性物質と水が接触したときに起こる水のエントロピー減少を抑制するものである。
陰イオンのカオトロピックイオンとしては、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン、塩化物イオン、酢酸イオン等が挙げられる。また、陽イオンのカオトロピックイオンとしては、バリウムイオン、カルシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、グアニジンイオン等が挙げられる。
上記カオトロピックイオンの中でも、陰イオンとして、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン等を、陽イオンとして、バリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、グアニジンイオン等を用いるのが好ましい。さらに、より好ましくは、チオシアン酸イオン、過塩素酸イオン、硝酸イオン、グアニジンイオン等が用いられる。
上記溶離液中のカオトロピックイオンの濃度が、０．１ｍＭより低いとヘモグロビン類の測定において、分離効果が低下するおそれがあり、また、３０００ｍＭよりも高いと、ヘモグロビン類の分離効果はそれ以上向上しないので、０．１ｍＭ〜３０００ｍＭが好ましく、１ｍＭ〜１０００ｍＭがより好ましく、更に、１０ｍＭ〜５００ｍＭが好ましい。
また、カオトロピックイオンは複数種混合して用いても良い。
上記カオトロピックイオンは、測定試料と接触する液、例えば、溶血試薬、試料希釈液等に添加しても良い。
【００４１】
本発明において、上記緩衝剤としては、酸解離定数（ｐＫａ）が、２．１５〜６．３９及び６．４０〜１０．５０の範囲に存在するものが用いられる。すなわち、緩衝剤として、ｐＫａを、２．１５〜６．３９及び６．４０〜１０．５０の範囲に少なくとも一つずつもつ単一の物質を用いても良く、あるいは、２．１５〜６．３９の範囲に少なくとも一つのｐＫａをもつ物質と６．４０〜１０．５０の範囲に少なくとも一つのｐＫａをもつ物質とを組み合わせて緩衝剤として用いても良い。また、上記緩衝剤を複数組み合わせて用いても良い。
【００４２】
上記緩衝剤のｐＫａの範囲は、測定目的のピークを分離するのに適切な溶離液のｐＨ付近において、より優れた緩衝能を発揮できるように、２．６１〜６．３９及び６．４０〜１０．５０の範囲が好ましく、より好ましくは、２．８０〜６．３５及び６．８０〜１０．００の範囲である。さらに好ましくは、３．５０〜６．２５及び７．００〜９．５０の範囲である。
【００４３】
上記緩衝剤としては、例えば、リン酸、ホウ酸、炭酸等の無機物のほか、カルボン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン酸、アニリンまたはアニリン誘導体、アミノ酸、アミン類、イミダゾール類、アルコール類等の有機物が挙げられる。また、エチレンジアミン四酢酸、ピロリン酸、ピリジン、カコジル酸、グリセロールリン酸、２，４，６−コリジン、Ｎ−エチルモルホリン、モルホリン、４−アミノピリジン、アンモニア、エフェドリン、ヒドロキシプロリン、ペリジン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、グリシルグリシン等の有機物でも良い。
【００４４】
上記カルボン酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、安息香酸等が挙げられる。
【００４５】
上記ジカルボン酸としては、例えば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイン酸、フタル酸、フマル酸等が挙げられる。
【００４６】
上記カルボン酸誘導体としては、例えば、β，β’−ジメチルグルタル酸、バルビツール酸、５，５−ジエチルバルビツール酸、γ−アミノ酪酸、ピルビン酸、フランカルボン酸、ε−アミノカプロン酸等が挙げられる。
【００４７】
上記ヒドロキシカルボン酸としては、例えば、酒石酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸等が挙げられる。
【００４８】
上記アニリンまたはアニリン誘導体としては、例えば、アニリン、ジメチルアニリン等が挙げられる。
【００４９】
上記アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシン、α−アラニン、β−アラニン、ヒスチジン、セリン、ロイシン等が挙げられる。
【００５０】
上記アミン類としては、例えば、エチレンジアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジエタノールアミン等が挙げられる。上記イミダゾール類としては、例えば、イミダゾール、５（４）−ヒドロキシイミダゾール、５（４）−メチルイミダゾール、２，５（４）−ジメチルイミダゾール等が挙げられる。
【００５１】
上記アルコール類としては、例えば、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−エチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール等が挙げられる。
【００５２】
また、上記緩衝剤としては、２−（Ｎ−モリホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス−（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミドジ酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ）プロパン（Ｂｉｓｔｒｉｓｐｒｏｐａｎｅ）、Ｎ−（アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−（Ｎ−モルフォリン）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン（Ｔｒｉｓ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、グリシルグリシン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、グリシン、シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等の一般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれるものを組成する物質も使用できる。これらの物質のｐＫａを表１・２に示す（引用文献：堀尾武一・山下仁平 蛋白質・酵素の基礎実験法 南江堂 １９８５年）。
【００５３】
【表１】
【表２】
溶離液中の上記緩衝剤濃度は、緩衝作用がある範囲であれば良く、好ましくは１〜１０００ｍＭ、より好ましくは１０〜５００ｍＭである。また、上記緩衝剤は、単独でも複数混合して用いても良く、例えば、有機物と無機物を混合して用いても良い。
【００５６】
上記溶離液には、以下の物質を添加しても良い。
（１）無機塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウム等）を添加しても良い。これらの塩類の濃度は、特に限定されないが、好ましくは１〜１５００ｍＭである。
（２）ｐＨ調節剤として、公知の酸、塩基を加えても良い。酸としては、例えば、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸等が、塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。これらの酸、塩基の濃度は、特に限定されないが、好ましくは、０．００１〜５００ｍＭである。
（３）メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン等の水溶性有機溶媒を混合しても良い。これらの有機溶媒の濃度は、特に限定されないが、好ましくは０〜８０％（ｖ／ｖ）であり、カオトロピックイオン、無機酸、有機酸、これらの塩等が析出しない程度で用いるのが好ましい。
（４）アジ化ナトリウム、チモール等の防腐剤を添加しても良い。
（５）ヘモグロビンの安定剤として、公知の安定剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤、グルタチオン、アジ化ナトリウム等の還元剤・酸化防止剤等を添加しても良い。
【００５７】
本発明においては、ｐＨの異なる少なくとも２種類以上の上記溶離液を用いるのが好ましい。また、その場合、測定目的のピークを分離するにあたって用いる溶離液は、同一の緩衝剤を含むものを用いるのが好ましいが、溶離液を切り替える際の、（検出器出力の）ベースライン変動が、測定値に悪影響を与えなければ、その必要はない。
【００５８】
さらに、ベースライン変動をより小さくするために、上記測定目的のピークを分離するにあたって用いる溶離液は、緩衝剤の濃度も同一であるものを用いるのがより好ましい。なお、溶離液のｐＨは、例えば、前述のｐＨ調節剤の添加量により調節できる。
【００５９】
上記ｐＨの異なる２種類以上の溶離液を、勾配溶出法、あるいは段階溶出法によって送液しても良い。
【００６０】
上記測定目的のピークとは、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ、ＡＨｂ、ＣＨｂ、ＨｂＡ０、ＨｂＡ2 、ＨｂＳ、ＨｂＣ等が挙げられる。
【００６１】
ＨｂＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン類を分離するための溶離液のｐＨは、４．０未満であると、ヘモグロビン類が変性する可能性があり、６．８を超えるとヘモグロビンのプラス電荷が減少し、陽イオン交換基に保持されにくくなり、分離能が低下するので４．０〜６．８が好ましく、４．５〜５．８がより好ましい。
【００６３】
また、本発明においても、ＨｂＡ０の溶出に際し、すなわち、ＨｂＡ１ｃより強く充填剤に保持されたＨｂＡ等から成る「ＨｂＡ０成分」を溶出するためには、カラムに流入する際のｐＨをヘモグロビンの等電点よりアルカリ側になるように設定した溶離液を用いるのが好ましい。この条件を実現するには、ｐＨがヘモグロビンの等電点よりアルカリ側であるひとつの溶離液を送液する方法や、ｐＨの異なる２種以上の溶離液を用いる方法がある。
【００６４】
ヘモグロビンはｐＨが等電点より酸性側からアルカリ側になると、総荷電がプラスからマイナスに変わるため、充填剤の陽イオン交換基との「電気的反発力によってＨｂＡ０成分を溶出」させることができる。
【００６５】
なお、理化学辞典（第４版、１９８７年９月、岩波書店、久保亮五ら編集）、１１７８頁に記載されているように、ヘモグロビンの等電点はｐＨ６．８〜７．０である。そのため、ＨｂＡ０成分を溶出するために、カラムに流入する際の溶離液のｐＨを６．８以上にすることがより好ましい。
【００６６】
この条件を満たすため、測定に用いる溶離液の内、少なくともひとつの溶離液のｐＨが６．８以上であることが必要である。本溶離液のｐＨは望ましくは７．０〜１２．０であり、７．５〜１１．０がより好ましく、更には８．０〜９．５が好ましい。溶離液のｐＨが６．８未満になるとＨｂＡ０成分の溶出が不十分となる。溶離液のｐＨは、用いる充填剤の分解が起こらない範囲に設定すれば良い。
【００６７】
ＨｂＡ０成分の溶出に好適に用いられる、ｐＨが６．８以上で緩衝能をもつ溶離液としては、例えば、リン酸、ホウ酸、炭酸等の無機酸または、その塩；クエン酸等のヒドロキシカルボン酸、β、β−ジメチルグルタル酸等のカルボン酸誘導体、マレイン酸等のジカルボン酸、カコジル酸、等の有機酸または、その塩からなる緩衝液が挙げられる。その他、２−（Ｎ−モリホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス−（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓｔｒｉｓ）、Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、Ｂｉｓｔｒｉｓｐｒｏｐａｎｅ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、グリシルグリシン、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ等の一般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれるものも使用できる。また、ＢｒｉｔｔｏｎとＲｏｂｉｎｓｏｎの緩衝液；ＧＴＡ緩衝液も使用できる。また、イミダゾール等のイミダゾール類；エチレンジアミン、メチルアミン、エチルアミン、トリエチルアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等のアミン類；グリシン、β−アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン等のアミノ酸類；等の有機物も使用できる。
【００６８】
また、無機酸；有機酸；無機酸または有機酸の塩；有機物は、複数混合して用いても良く、また、有機酸、無機酸及び有機物を混合しても良い。
【００６９】
より効果的にＨｂＡ０成分を溶出するためには、上記溶離液にカオトロピックイオンを添加するのが好ましい。添加するカオトロピックイオンは前記と同様である。
【００７０】
添加するカオトロピックイオン濃度は、１〜３０００ｍＭで、好ましくは、１０〜１０００ｍＭ、更には、５０〜５００ｍＭが好ましい。
【００７１】
本発明においては、少なくとも溶出力の異なる３種の溶離液を用い、ＨｂＡ０を溶出するための溶離液を送液する前に、該ＨｂＡ０を溶出するための溶離液以外の溶離液を送液しても良い。
【００７２】
すなわち、ＨｂＡ０成分を溶出するための溶離液が（送液ポンプで）送液されてカラムに通液されるとＨｂＡ０成分が溶出されてくる。このＨｂＡ０成分を溶出するための溶離液を送液する前、すなわち、ＨｂＡ０より前に溶出されてくる各ヘモグロビン成分を分離するために、ＨｂＡ０成分を溶出する溶離液以外の溶離液を送液する。
【００７３】
ＨｂＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン類の溶出に、ｐＨ４．０〜６．８の溶離液を少なくとも２種類以上用い、塩濃度勾配法やｐＨ勾配法またはこの２つの組み合わせにより、安定型ＨｂＡ１ｃ等の測定対象ピークをシャープに溶出させることが可能になる。
【００７４】
本発明においては、ＨｂＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン類（ＨｂＡ１ａ及びｂ、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ）の溶出には、少なくとも２種類以上の溶離液を用い、かつ、溶出力の最も弱い溶離液を先に流すこともできる。
【００７５】
本発明に係るヘモグロビン類の測定方法では、好ましくは、溶離液を勾配溶出法または段階溶出法によって送液し、その途中において溶離液の溶出力を低下させることが望ましい。
【００７６】
従来のＬＣでは、分離対象成分のピークをシャープにしたり、隣り合って溶出する２つ以上のピークの分離度を向上させたりするために、複数の溶離液を用いた勾配溶出法や段階溶出法が利用されている。
【００７７】
勾配溶出法は「グラジエント溶出」と呼ばれている。すなわち、複数台の送液ポンプを用い、溶出力が異なる複数の溶離液の送液比率を連続的に変化させて送液する。それによって、図２０に示すように、時間と共に溶出力が連続的に上昇するように溶出が行われる。
【００７８】
また、段階溶出法は「ステップワイズ溶出」と称されている。この方法では、１台の送液ポンプを、電磁弁等を介して複数の溶離液に連結する。そして、電磁弁を切り換えることにより、溶出力の低い溶離液から、溶出力の高い溶離液に切り換えて送液する。従って、図２１に示すように、溶出力は段階的に上昇いていく。
【００７９】
しかしながら、溶出される各成分の性質が類似していたり、短時間で溶出することが要求されている場合、従来の勾配溶出法や段階溶出法では、類似した性質の成分間でピークが重なり、分離度が低下するおそれがあった。
【００８０】
これに対して、本発明では、勾配溶出法または段階溶出法によって溶離液を送液するに際し、その途中、すなわち勾配溶出法または段階溶出法により複数の溶離液を順に切り替えて送液していく途中において、分離対象のピークまたはピーク間の溶離タイミングを考慮して分離対象のピークまたはピーク間の分離状態が良くなるように、溶離液の溶出力を一旦低下させることもできる。具体的には、段階溶出法の場合、溶出力の弱い溶離液から溶出力の強い溶離液に切り替えて送液した後、溶出力の弱い溶離液に切り替え、しばらくしてから溶出力の強い溶離液に切り替えて送液する。
【００８１】
陽イオン交換ＬＣにおいて、溶離液の溶出力を低下させるには、溶離液の塩濃度を下げる方法やｐＨを下げる方法、またはこの２つを組み合わせる方法が挙げられる。
【００８２】
陰イオン交換ＬＣでは溶離液の塩濃度を下げる方法やｐＨを上げる方法、逆相クロマトグラフィーでは溶離液の有機溶媒の極性を上げる方法、順相クロマトグラフィーでは溶離液の有機溶媒の極性を下げる方法が挙げられる。
【００８３】
上記のように勾配溶出法または段階溶出法によって送液し、その途中において溶離液の溶出力を低下させる方法により、ヘモグロビンを分離する場合をより具体的に説明する。
【００８４】
ヘモグロビン類の分離には、陽イオン交換充填剤が充填されたカラムを用い、溶離液を塩濃度２０〜１０００ｍＭ、ｐＨ４〜９の範囲で勾配溶出法または段階溶出法によって送液させ、その途中において溶離液の塩濃度を５〜５００ｍＭ、ｐＨを０．１〜３の範囲で下げることによって溶離液の溶出力を低下させて分離を行う。
【００８５】
本発明の方法を段階溶出法によって行う場合の、装置の構成例を図１７に示した。溶離液Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄは、各々溶出力の異なる（例えば、塩濃度、ｐＨ、極性等において異なる）ものであり、電磁弁１によって設定時間に各溶離液に切り替えられるように構成されている。溶離液は、送液ポンプ２により、試料注入部３から導入された試料とともにカラム４に導かれ、各成分が検出器５により検出される。各ピークの面積、高さ等はインテグレータ６により算出される。
【００８６】
安定型ＨｂＡ１ｃの測定に悪影響を与える可能性のあるＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等のヘモグロビン成分を含む血液検体を測定する場合、ＨｂＡ０成分（ピーク）として主にＨｂＡを溶出させ、それより後にＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等を溶離させる測定方法を設定することがある。これにより、ＨｂＡ０ピークからＨｂＡ以外のヘモグロビン成分を除けるため、より正確な安定型ＨｂＡ１ｃ（％）を算出できる。
【００８７】
ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等を溶離させる測定方法を設定する場合、前述した少なくとも溶出力の異なる３種の溶離液を用いる方法における「ＨｂＡ０を溶出するための溶離液」は、ＨｂＡを主成分とするＨｂＡ０ピークを溶出する溶離液を意味している。このとき、「ＨｂＡ０を溶出するための溶離液」の後に、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等を溶離するために、より溶出力の強い溶離液を送液することが必要となる。
【００８８】
本発明のヘモグロビン類の測定方法におけるカチオン交換液体クロマトグラフィーの充填剤は、少なくとも１種以上のカチオン交換基を有している粒子よりなるものであり、例えば、高分子粒子にカチオン交換基を導入することで得られる。
【００８９】
該カチオン交換基は、公知のものでよく特に制限はない。例えば、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基などのカチオン交換基等が挙げられる。また、このカチオン交換基は、複数種導入しても良い。
【００９０】
上記粒子の直径は、好ましくは０．５〜２０μｍ、より好ましくは１〜１０μｍである。
また、粒度分布は、変動係数値（ＣＶ値）（粒径の標準偏差÷平均直径×１００）として、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下である。
【００９１】
上記高分子粒子としては、例えば、シリカ、ジルコニアなどの無機系粒子；セルロース、ポリアミノ酸、キトサンなどの天然高分子粒子；ポリスチレン、ポリアクリル酸エステルなどの合成高分子粒子などが挙げられる。
上記高分子粒子は、導入されるイオン交換基以外の構成成分は、より親水性であることが好ましい。また耐圧性・耐膨潤性の点から架橋度の高いものが好ましい。
【００９２】
上記高分子粒子へのカチオン交換基の導入は、公知の方法により行うことができるが、例えば、高分子粒子を調製後、粒子が有する官能基（水酸基、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基など）に、化学反応でカチオン交換基を粒子に導入させる方法により行うことができる。
【００９３】
また、カチオン交換基を有する単量体を重合して高分子粒子を調製する方法によってもカチオン交換充填剤を調製できる。例えば、カチオン交換基含有単量体と架橋性単量体等とを混合し、重合開始剤の存在下に重合する方法などが挙げられる。
【００９４】
また、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチルなどの重合性カチオン交換基含有エステルを架橋性単量体などと混合し、重合開始剤存在下で重合した後、得られた粒子を加水分解処理し、エステルをカチオン交換基に変換させてもよい。
【００９５】
更に、特公平８−７１９７号公報に記載のように、架橋重合体粒子を調製した後、カチオン交換基を有する単量体を添加して、重合体粒子の表面付近に、該単量体を重合させても良い。
【００９６】
上記充填剤はカラムに充填されて液体クロマトグラフィー測定に用いられる。上記カラムは公知のステンレス製、ガラス製、樹脂製など、特に限定されない。カラムサイズとしては、内径０．１〜５０ｍｍ、長さ１〜３００ｍｍのものが好ましく、内径０．２〜３０ｍｍ、長さ５〜２００ｍｍのものがより好ましい。充填剤のカラムへの充填方法は、公知の任意の方法が使用できるがスラリー充填法がより好ましい。具体的には、例えば、充填剤粒子を溶離液などの緩衝液に分散させたスラリーを送液ポンプなどによりカラムに圧入することにより行う。
【００９７】
本発明に使用されるＬＣ装置は、公知のもので良く、例えば、送液ポンプ、試料注入装置（サンプラ）、カラム、検出器等から構成される。また、他の付属装置（カラム恒温槽や溶離液の脱気装置等）が適宜付加されても良い。
【００９８】
上記測定法における、他の測定条件としては、公知の条件で良く、溶離液の流速は、好ましくは０．０５〜５ｍＬ／分、より好ましくは０．２〜３ｍＬ／分である。ヘモグロビン類の検出は、４１５ｎｍの可視光が好ましいが、特にこれのみに限定されるわけではない。測定試料は、通常、界面活性剤等溶血活性を有する物質を含む溶液により溶血された溶血液を希釈したものを用いる。試料注入量は、血液検体の希釈倍率により異なるが、好ましくは０．１〜１００μＬ程度である。
【００９９】
【実施例】
以下に実施例、比較例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【０１００】
（実施例１）
充填剤の調製
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４００ｇ及び２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸１５０ｇの混合物に過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）１．５ｇを溶解した。これを４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍＬに分散させ、撹拌しながら窒素雰囲気下で７５℃に昇温し、８時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径６μｍの粒子を得た。
【０１０１】
充填剤のカラムへの充填
得られた粒子をカラムに以下のようにして充填した。粒子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）３０ｍＬに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製の空カラム（内径４．６×３０ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填した。
【０１０２】
ヘモグロビン類の測定
得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘモグロビン類の測定を行った。
流速：２．０ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μＬ
【０１０３】
（測定試料）
健常人血をフッ化ナトリウム採血した全血検体から以下の試料を調製した。なお、溶血試薬として、０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）（東京化成社製）を含有させたリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０）を用いた。
ａ）糖負荷血：全血検体に５００ｍｇ／ｄＬのグルコース水溶液を添加し、３７℃で３時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、１５０倍に希釈して試料ａとした。
ｂ）ＣＨｂ含有試料：全血検体１０ｍＬに、０．３重量％のシアン酸ナトリウムの生理食塩水溶液１ｍＬを添加し、３７℃で３時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、１５０倍に希釈して試料ｂとした。
ｃ）ＡＨｂ含有試料：全血検体１０ｍＬに、０．３重量％のアセトアルデヒドの生理食塩水溶液１ｍＬを添加し、３７℃で３時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、１５０倍に希釈して試料ｃとした。
【０１０４】
（測定結果）
上記測定条件により、試料を測定して得られたクロマトグラムを図１〜３に示す。図１は試料ａ、図２は試料ｂ、図３は試料ｃを測定した結果である。ピーク１はＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ、ピーク２はＨｂＦ、ピーク３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５はＨｂＡ０、ピーク６はＣＨｂ、ピーク７はＡＨｂを示す。
図１では、ピーク３および４が良好に分離されている。また、図２ではピーク６（ＣＨｂ）、図３ではピーク７（ＡＨｂ）がピーク４から良好に分離されている。
【０１０５】
（実施例２）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図１〜３と同様に良好であった。
【０１０６】
（実施例３）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図１〜３と同様に良好であった。
【０１０７】
（実施例４）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図１〜３と同様に良好であった。
（比較例１）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。
【０１０９】
（実施例５）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。
【０１１０】
（測定結果）
得られたクロマトグラムを図７〜９に示す。図７は試料ａ、図８は試料ｂ、図９は試料ｃを測定した結果である。ピーク１はＨｂＡ１ａ及びｂ、ピーク２はＨｂＦ、ピーク３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５はＨｂＡ０、ピーク６はＣＨｂ、ピーク７はＡＨｂを示す。
図７では、ピーク３および４が良好に分離されている。また、図８ではピーク６（ＣＨｂ）、図９ではピーク７（ＡＨｂ）がピーク４から良好に分離されている。
【０１１１】
（実施例６）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図７〜９と同様に良好であった。
（実施例７）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図７〜９と同様に良好であった。
（実施例８）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図７〜９と同様に良好であった。
（比較例２）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。
【０１１５】
（比較例３）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図１０〜１２と同様であった。
【０１１６】
（実施例９）
充填剤の調製において２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸の代わりに、 メタクリル酸（和光純薬）を用い、 溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。
（実施例１０）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例９と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。
（実施例１１）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。
（実施例１２）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。
（比較例４）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例９と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。
（比較例５）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。
実施例９〜１２及び比較例４、５のクロマトグラムにおいて、ＨｂＡ０のピーク幅及び分離能を比較した結果、実施例９〜１２は、比較例４、５に比べて、ＨｂＡ０のピーク幅は、狭く、しかも、分離能も良かった。
また、実施例９〜１２及び比較例４、５において、試料を連続測定した場合のＨｂＡ１ｃの保持時間の変化を図１３に示した。 図１３より、実施例９〜１２では、比較例４、５に比べて保持時間の変化が少ないことが分かる。
【０１２３】
（実施例１３）
溶離液の数と組成およびその送液条件を以下のように変更した以外は、実施例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。
【０１２４】
（測定結果）
得られたクロマトグラムを図１４〜１６に示す。図１４は試料ａ、図１５は試料ｂ、図１６は試料ｃを測定した結果である。ピーク１はＨｂＡ１ａ及びｂ、ピーク２はＨｂＦ、ピーク３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５はＨｂＡ０、ピーク６はＣＨｂ、ピーク７はＡＨｂを示す。
図１４では、ピーク３および４が良好に分離されている。また、図１５ではピーク６（ＣＨｂ）、図１６ではピーク７（ＡＨｂ）がピーク４から良好に分離されている。
【０１２５】
（実施例１４）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１３と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図１４〜１６と同様に良好であった。
（実施例１５）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１３と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図１４〜１６と同様に良好であった。
（実施例１６）
溶離液を以下の組成としたことの他は、実施例１３と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図１４〜１６と同様に良好であった。
（実施例１７）
図１７に示した装置を用いて、血液試料中のヘモグロビン類の測定を行った。カラムには陽イオン交換樹脂（ミクロネックスＡ１ｃ ＨＳ−IV、積水化学工業社製）を充填したものを用いた。溶離液Ａとして１７０ｍＭ、溶離液Ｂとして１９０ｍＭ、溶離液Ｃとして１５０ｍＭ、溶離液Ｄとして３３０ｍＭの、それぞれリン酸緩衝液で、溶離液Ａ〜ＣはｐＨ６のものを、溶離液ＤはｐＨ７．２のものを用いた。試料としては、実施例１で用いた全血検体を溶血試薬を用いて１００倍に溶血、希釈したものを用いた。２分間でＨｂＡ１ｃ（後述のピークＰ５）を各ヘモグロビン類のピークから分離するように溶離液を段階溶出法を用いて切り替えた。溶離液の切り替え条件および得られたクロマトグラムを図１８に示した。すなわち、溶離液は０〜３８秒は溶離液Ａを、３８〜５８秒は溶出力のより高い溶離液Ｂを、５８〜７８秒はより溶出力の低い溶離液Ｃを、７８〜１００秒は溶出力の最も高い溶離液Ｄを、１００〜１２０秒は溶離液Ａを再び送液した。ピークの検出には４１５ｎｍの吸収強度を用いた。
図１８のクロマトグラムにおいて、ピークＰ１〜Ｐ３は、ＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ類であり、ピークＰ４はＨｂＦであり、ピークＰ５はＨｂＡ１ｃであり、ピークＰ６はＨｂＡ０である。
【０１２９】
上記の方法では、溶離液Ａから溶離液Ｂへの切り替えにより溶出力を上昇させたことによりピークＰ６が早く溶出して、ＨｂＡ１ｃのピークであるピークＰ５の正確な検出を妨害するのを防ぐため、溶離液Ｂから溶出力のより低い溶離液Ｃへの切り替えを行っている。
【０１３０】
再現性を評価するために、この方法で同一試料について１０回繰り返し測定し、次式によりＨｂＡ１ｃ値を算出した。１０回の各測定値、その平均値およびＣＶ値（％）を表３に示した。
ＨｂＡ１ｃ値（％）＝ピークＰ５の面積÷（ピークＰ１の面積＋ピークＰ２の面積＋ピークＰ３の面積＋ピークＰ４の面積＋ピークＰ５の面積＋ピークＰ６の面積）×１００
【０１３１】
【表３】
（比較例６）
実施例１７における溶離液Ｃを用いなかったこと、および溶離液Ｂの代わりに溶離液Ｂ１（１８０ｍＭ、ｐＨ６のリン酸緩衝液）を用いた他は、実施例１７に準じて実施例１７と同一の試料中のヘモグロビン類の測定を行った。溶離液の切り替え条件および得られたクロマトグラムを図１９に示した。すなわち、溶離液は０〜３８秒は溶離液Ａを、３８〜７８秒は溶離液Ｂ１を、７８〜１００秒は溶出力の最も高い溶離液Ｄを、１００〜１２０秒は溶離液Ａを再び送液した。溶離液Ａから溶離液Ｂよりも溶出力の低い溶離液Ｂ１へ切り替えたため、ピークＰ６の一部が早く溶出することはないが、ピークＰ５はシャープにならず、図１９に○で囲んだように、ピークＰ５にピークＰ４およびピークＰ６が一部重なっていることが分かる。
【０１３３】
再現性をみるために、この方法で同一試料について１０回繰り返し測定し、実施例１と同様にしてＨｂＡ１ｃ値を算出した。１０回の各測定値、その平均値およびＣＶ値（％）を表３に示した。
【０１３４】
【発明の効果】
本願発明に係る測定方法によれば、従来のヘモグロビン類の測定方法における問題点であったヘモグロビン類の分離性能が改善され、特に安定型ＨｂＡ１ｃを高い再現性で精密に分離できる。また、短時間で、ベースライン変動が少ないと共に、 カラム耐久性も向上されたヘモグロビン類の測定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例１の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図２】 実施例１の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｂ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図３】 実施例１の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｃ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図４】 比較例１の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図５】 比較例１の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｂ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図６】 比較例１の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｃ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図７】 実施例５の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図８】 実施例５の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｂ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図９】 実施例５の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｃ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図１０】 比較例２の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図１１】 比較例２の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｂ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図１２】 比較例２の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｃ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図１３】 実施例９〜１２及び比較例４、５において、試料を連続測定した場合のＨｂＡ１ｃの保持時間の変化を示した図である。
【図１４】 実施例１３の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図１５】 実施例１３の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｂ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図１６】 実施例１３の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｃ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図１７】 段階溶出法によって行う場合の、装置の構成例を示す図である。
【図１８】 実施例１７の溶離液の切り替え条件および得られたクロマトグラムを示す図である。
【図１９】 比較例６の溶離液の切り替え条件および得られたクロマトグラムを示す図である。
【図２０】 勾配溶出法を説明するための説明図である。
【図２１】 段階溶出法を説明するための説明図である。
【符号の説明】
１ ＨｂＡ１ａ及びｂのピーク
２ ＨｂＦのピーク
３ 不安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
４ 安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
５ ＨｂＡ０のピーク
６ ＣＨｂのピーク
７ ＡＨｂのピーク
Claims (8)
- 陽イオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法において、チオシアン酸イオン、過塩素酸イオン、硝酸イオン又はグアニジンイオンであるカオトロピックイオンを含有し、かつ酸解離定数（ｐＫａ）が２．１５〜６．３９の範囲及び６．４０〜１０．５０の範囲にある緩衝剤を含む溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
- 請求項１に記載のヘモグロビン類の測定方法であって、測定目的のピークを分離するのに際し、ｐＨの異なる少なくとも２種以上の溶離液を用い、該ｐＨの異なる少なくとも２種以上の溶離液が、同一の緩衝剤を含むものであることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
- 請求項１または２に記載のヘモグロビン類の測定方法であって、ＨｂＡ０を溶出するために、カラムに流入する際のｐＨがヘモグロビンの等電点と等しいか、または等電点よりアルカリ側になる溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
- 請求項３に記載のヘモグロビン類の測定方法であって、前記溶離液のｐＨが６．８以上であることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載のヘモグロビン類の測定方法であって、ヘモグロビンＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン類の溶出に、ｐＨ４．０〜６．８の溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
- 請求項５に記載のヘモグロビン類の測定方法であって、ヘモグロビンＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン類の溶出に、少なくとも溶出力の異なる２種以上の溶離液を用い、 溶出力の弱い溶離液から順に送液することを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載のヘモグロビン類の測定方法であって、少なくとも溶出力の異なる３種の溶離液を用い、ＨｂＡ０を溶出するための溶離液を送液する前に、該ＨｂＡ０を溶出するための溶離液以外の溶離液を送液することを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
- 請求項１〜７のいずれか１項に記載のヘモグロビン類の測定方法であって、溶離液を勾配溶出法または段階溶出法によって送液し、その途中において溶離液の溶出力を低下させることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
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