JP2003014714A

JP2003014714A - ヘモグロビン類の測定方法

Info

Publication number: JP2003014714A
Application number: JP2001198865A
Authority: JP
Inventors: Yuji Setoguchi; 雄二瀬戸口
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 2001-06-29
Filing date: 2001-06-29
Publication date: 2003-01-15

Abstract

(57)【要約】【課題】特に安定型ヘモグロビンＡ１ｃを短時間で分
離し、その比率を高精度で測定することができるヘモグ
ロビン類の測定方法を提供する。【解決手段】カチオン交換液体クロマトグラフィーに
よるヘモグロビン類の測定方法において、血液検体を溶
血させる際に用いるｐＨが５．０〜１０．０の溶血試
薬、および、ヘモグロビンＡ０よりも前に溶出するヘモ
グロビン類を溶出させるための溶離液Ａとヘモグロビン
Ａ０を溶出させるための溶離液Ｂとの少なくとも２種類
の溶離液を用い、上記溶血試薬および／または上記溶離
液Ａにアジ化物イオンが含有され、かつ、上記溶離液Ａ
にカオトロピックイオンが含有され、上記溶離液Ｂのｐ
Ｈが溶離液ＡのｐＨより０．１〜８．０高く、かつ、上
記溶離液Ｂの塩濃度が溶離液Ａの塩濃度より１０〜１０
００ｍＭ高いことを特徴とするヘモグロビン類の測定方
法、ならびに、溶離液Ｂにカオトロピックイオンが含有
されることを特徴とする上記ヘモグロビン類の測定方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、カチオン交換液体
クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】ヘモグロビンＡ１ｃ（以下、「ＨｂＡ１
ｃ」と記す）は、血液中の糖が赤血球に入った後に、ヘ
モグロビンと不可逆的に結合して生成したものであり、
過去１〜２カ月間の血液中の平均的な血糖値（血液中の
グルコース濃度）を反映する。このため、ＨｂＡ１ｃ
は、糖尿病のスクリーニング検査や糖尿病患者の血糖管
理状態を把握する等の糖尿病診断の指標として広く利用
されている。

【０００３】ＨｂＡ１ｃは、血液中のグルコースとヘモ
グロビンＡ（以下、「ＨｂＡ」と記す）とが反応して生
成された糖化ヘモグロビン（以下、「ＧＨｂ」と記す）
であり、これが可逆的に反応したものを不安定型ＨｂＡ
１ｃと言い、不安定型ＨｂＡ１ｃを経て不可逆的に反応
したものを安定型ＨｂＡ１ｃと言う。そして、上記糖尿
病診断の指標としては、安定型ＨｂＡ１ｃを用いること
が好ましく、臨床検査分野においては、安定型ＨｂＡ１
ｃの比率を高精度で測定し得る方法の開発が強く望まれ
ている。

【０００４】従来、このＨｂＡ１ｃの測定方法として
は、一般に液体クロマトグラフィー法や免疫法が用いら
れている。

【０００５】液体クロマトグラフィー法によるＨｂＡ１
ｃの測定は、例えば、特公平８−７１９８号公報に開示
されているように、主としてカチオン交換液体クロマト
グラフィー法により行われている。溶血液試料をカチオ
ン交換液体クロマトグラフィーにより分離すると、通
常、ヘモグロビンＡ１ａ（以下、「ＨｂＡ１ａ」と記
す）およびヘモグロビンＡ１ｂ（以下、「ＨｂＡ１ｂ」
と記す）、ヘモグロビンＦ（以下、「ＨｂＦ」と記
す）、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃならびに
ヘモグロビンＡ０（以下、「ＨｂＡ０」と記す）などの
ピークが出現する。また、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂおよ
びＨｂＡ１ｃは、ＨｂＡが糖化されたＧＨｂであり、Ｈ
ｂＦは、α鎖とγ鎖とからなる胎児性ヘモグロビンであ
り、該ＨｂＦ値は、溶血性貧血の診断指標としても用い
られている。

【０００６】なお、糖尿病の診断の指標として使用され
ているＨｂＡ１ｃは、最近では、前述したように安定型
ＨｂＡ１ｃであり、この安定型ＨｂＡ１ｃは、全ヘモグ
ロビンピークの面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃピークの
面積の比率（％）として求められている。

【０００７】ところが、安定型ＨｂＡ１ｃピークと不安
定型ＨｂＡ１ｃピークとの分離は一般的に困難であるた
め、例えば、特開昭６３−２９８０６３号公報では、血
液中の少なくとも赤血球および／またはヘモグロビンを
含む試料を、リン酸縮合体および／またはリン酸縮合体
の塩を含む解離用媒質と接触させて、該赤血球および／
またはヘモグロビンに含まれる不安定型ＨｂＡ１ｃをヘ
モグロビンとグルコースとに解離させる工程、および、
該解離後の試料中のヘモグロビンをイオン交換クロマト
グラフィーで各ヘモグロビン成分に分離し、該試料中に
存在する安定型ＨｂＡ１ｃを測定する工程、を包含する
糖化ヘモグロビンの測定方法が開示されている。

【０００８】しかし、上記公報に開示されている測定方
法では、安定型ＨｂＡ１ｃの分離が不十分なため、測定
精度が悪いという問題点がある。

【０００９】また、液体クロマトグラフィー法によるヘ
モグロビン類の測定方法においては、アセチル化ヘモグ
ロビンやカルバミル化ヘモグロビンなどの修飾ヘモグロ
ビンの影響を受けると言われ、これら修飾ヘモグロビン
のピークも安定型ＨｂＡ１ｃのピーク付近に溶出するた
め、安定型ＨｂＡ１ｃを短時間で分離することが困難で
あるという問題点がある。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
従来の問題点に鑑み、特に安定型ＨｂＡ１ｃを短時間で
分離し、その比率を高精度で測定することができるヘモ
グロビン類の測定方法を提供することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】請求項１に記載の発明に
よるヘモグロビン類の測定方法は、カチオン交換液体ク
ロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法にお
いて、血液検体を溶血させる際に用いるｐＨが５．０〜
１０．０の溶血試薬、および、ヘモグロビンＡ０よりも
前に溶出するヘモグロビン類を溶出させるための溶離液
ＡとヘモグロビンＡ０を溶出させるための溶離液Ｂとの
少なくとも２種類の溶離液を用い、上記溶血試薬および
／または上記溶離液Ａにアジ化物イオンが含有され、か
つ、上記溶離液Ａにカオトロピックイオンが含有され、
上記溶離液ＢのｐＨが溶離液ＡのｐＨより０．１〜８．
０高く、かつ、上記溶離液Ｂの塩濃度が溶離液Ａの塩濃
度より１０〜１０００ｍＭ高いことを特徴とする。

【００１２】また、請求項２に記載の発明によるヘモグ
ロビン類の測定方法は、上記請求項１に記載のヘモグロ
ビン類の測定方法において、溶離液Ｂにカオトロピック
イオンが含有されることを特徴とする。

【００１３】本発明のヘモグロビン類の測定方法では、
血液検体を溶血させる際にｐＨが５〜１０の溶血試薬が
用いられる。

【００１４】本発明で用いられる溶血試薬は、赤血球よ
り低張な水溶液であれば良い。なお、ここで言う溶血と
は、赤血球膜が破れ、血色素などの内容物（例えば、ヘ
モグロビン類）が赤血球外に出ることを意味する。

【００１５】本発明においては、上記溶血試薬のｐＨが
５．０〜１０．０であることが必要であり、好ましくは
５．５〜９．５であり、より好ましくは６．０〜９．０
である。

【００１６】溶血試薬のｐＨが５．０未満であると、ア
ジ化水素が発生しやすくなったり、ヘモグロビン類が変
性しやすくなり、逆に溶血試薬のｐＨが１０．０を超え
ると、溶血時にヘモグロビン類が変性し、高精度で測定
することができなくなる。

【００１７】本発明で用いられる溶血試薬には、本発明
の課題達成を阻害しない範囲で必要に応じて、例えばホ
ウ酸などの公知の各種不安定型ＨｂＡ１ｃ除去試薬が含
有されていても良い。これらの不安定型ＨｂＡ１ｃ除去
試薬は、単独で用いられても良いし、２種類以上が併用
されても良い。不安定型ＨｂＡ１ｃ除去処理を行う場合
には、上記除去試薬を添加した後、３０〜６０℃で加温
することが好ましい。また、室温で不安定型ＨｂＡ１ｃ
除去処理を行う場合には、処理時間を１０分〜５時間と
することが好ましい。

【００１８】また、本発明で用いられる溶血試薬には、
本発明の課題達成を阻害しない範囲で必要に応じて、例
えば、無機酸、有機酸、無機酸もしくは有機酸の塩、有
機物、一般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液と呼称される
ものを構成する物質などの緩衝剤が含有されていても良
い。これらの緩衝剤は、単独で用いられても良いし、２
種類以上が併用されても良い。

【００１９】上記無機酸としては、例えば、リン酸、ホ
ウ酸、炭酸等が挙げられる。これらの無機酸は、単独で
用いられても良いし、２種類以上が併用されても良い。

【００２０】上記有機酸や有機物としては、例えば、カ
ルボン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキ
シカルボン酸、アミノ酸、アミン類、イミダゾール類、
ピリジン、カコジル酸、トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン、グリシルグリシン、ビロリン酸等が挙げら
れる。これらの有機酸や有機物は、単独で用いられても
良いし、２種類以上が併用されても良い。

【００２１】カルボン酸としては、例えば、酢酸やプロ
ピオン酸等が挙げられる。ジカルボン酸としては、例え
ば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マ
レイン酸、フタル酸、フマル酸等が挙げられる。カルボ
ン酸誘導体としては、例えば、β，β−ジメチルグルタ
ル酸、バルビツール酸、アミノ酪酸等が挙げられる。ヒ
ドロキシカルボン酸としては、例えば、クエン酸、酒石
酸、乳酸等が挙げられる。アミノ酸としては、例えば、
アスパラギン酸、アスパラギン、グリシン等が挙げられ
る。アミン類としては、例えば、エチレンジアミン、ジ
エタノールアミン、トリエタノールアミン等が挙げられ
る。イミダゾール類としては、例えば、イミダゾール、
５（４）−メチルイミダゾール、２，５（４）−ジメチ
ルイミダゾール等が挙げられる。

【００２２】上記無機酸もしくは有機酸の塩としては、
公知のもので良く、例えば、ナトリウム塩やカリウム塩
等が挙げられる。これらの無機酸もしくは有機酸の塩
は、単独で用いられても良いし、２種類以上が併用され
ても良い。

【００２３】上記一般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液と
呼称されるものを構成する物質としては、例えば、２−
（Ｎ−モリホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−
２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホ
ン酸（ＨＥＰＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イ
ミノトリス−（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓｔｒ
ｉｓ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン（Ｔ
ｒｉｓ）、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、Ｂｉｓｔｒｉｓｐｒｏ
ｐａｎｅ、ＡＣＥＡ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥ
ＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、Ｃ
ＡＰＳ等が挙げられる。これらの物質は、単独で用いら
れても良いし、２種類以上が併用されても良い。

【００２４】溶血試薬中における上記緩衝剤の濃度は、
水に溶解された状態で緩衝作用を発現する範囲であれば
良く、特に限定されるものではないが、０．１〜１００
０ｍＭであることが好ましく、より好ましくは１〜５０
０ｍＭであり、さらに好ましくは２〜２００ｍＭであ
る。

【００２５】さらに、本発明で用いられる溶血試薬に
は、本発明の課題達成を阻害しない範囲で必要に応じ
て、後述する溶離液Ａに含有されていても良い添加剤、
例えば、無機塩類、ｐＨ調節剤、水溶性有機溶媒、ヘモ
グロビンの安定剤、アミン類、界面活性剤等の各種添加
剤の１種類もしくは２種類以上が含有されていても良
い。

【００２６】本発明のヘモグロビン類の測定方法では、
ＨｂＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン類を溶出させ
るための溶離液ＡとＨｂＡ０を溶出させるための溶離液
Ｂとの少なくとも２種類の溶離液が用いられる。

【００２７】本発明においては、前記溶血試薬および／
または上記溶離液Ａにアジ化物イオンが含有されてい
る。すなわち、アジ化物イオンは、溶血試薬および溶離
液Ａのいずれか一方に含有されていても良いし、双方に
含有されていても良い。

【００２８】また、本発明においては、上記溶離液Ａに
カオトロピックイオンが含有されている。

【００２９】上記溶離液Ａとしては、特定のｐＨおよび
塩濃度を有する１種類の溶離液Ａを用いても良いし、異
なるｐＨおよび／または塩濃度を有する２種類以上の溶
離液Ａを併用しても良い。

【００３０】上記アジ化物イオンの生成源としては、水
溶液中で解離してアジ化物イオンを生成するものであれ
ば良く、特に限定されるものではないが、例えば、公知
の各種アジ化物塩等が挙げられ、好適に用いられるが、
なかでもアジ化ナトリウムやアジ化バリウム等がより好
適に用いられる。これらのアジ化物イオンの生成源は、
単独で用いられても良いし、２種類以上が併用されても
良い。

【００３１】溶血試薬中および／または溶離液Ａ中にお
ける上記アジ化物イオンの生成源の濃度は、特に限定さ
れるものではないが、０．１５〜７６．９ｍＭ（０．０
０１〜０．５重量％）であることが好ましく、より好ま
しくは０．７７〜６１．５ｍＭ（０．００５〜０．４重
量％）である。アジ化物イオンの生成源の上記濃度が
０．１５ｍＭ（０．００１重量％）未満であると、Ｈｂ
Ｆの分離性が悪くなることがあり、逆にアジ化物イオン
の生成源の上記濃度が７６．９ｍＭ（０．５重量％）を
超えても、もはやＨｂＦの分離性はそれ以上向上しな
い。

【００３２】本発明におけるカオトロピックイオンと
は、水溶液に解離して生じたイオンにより、水の構造が
破壊され、疎水性物質と水とが接触したときに起こる、
水のエントロピー減少を抑制するものであり、例えば、
陰イオンや陽イオンが挙げられる。これらのカオトロピ
ックイオンは、単独で用いられても良いし、２種類以上
が併用されても良い。

【００３３】上記陰イオンとしては、例えば、トリブロ
モ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イ
オン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸
イオン、硝酸イオン、臭化物イオン、塩化物イオン、酢
酸イオン、尿素イオン等が挙げられ、好適に用いられ
る。これらの陰イオンは、単独で用いられても良いし、
２種類以上が併用されても良い。

【００３４】また、上記陽イオンとしては、例えば、バ
リウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオ
ン、リチウムイオン、セシウムイオン、カリウムイオ
ン、グアニジンイオン等が挙げられ、好適に用いられ
る。これらの陽イオンは、単独で用いられても良いし、
２種類以上が併用されても良い。

【００３５】上記カオトロピックイオンのなかでも、安
定型ＨｂＡ１ｃの測定精度をより向上させることができ
ることから、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イ
オン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸
イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオ
ン等の陰イオンや、バリウムイオン、カルシウムイオ
ン、マグネシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイ
オン、グアニジンイオン等の陽イオンがより好適に用い
られ、とりわけ、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢
酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩
素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、グアニ
ジンイオン等がさらに好適に用いられる。

【００３６】溶離液Ａ中における上記カオトロピックイ
オンの濃度は、特に限定されるものではないが、０．１
〜３０００ｍＭであることが好ましく、より好ましくは
１〜１０００ｍＭであり、さらに好ましくは１０〜５０
０ｍＭである。カオトロピックイオンの上記濃度が０．
１ｍＭ未満であると、ヘモグロビン類の分離効果が低下
して、測定精度が悪くなることがあり、逆にカオトロピ
ックイオンの上記濃度が３０００ｍＭを超えても、もは
やヘモグロビン類の分離効果はそれ以上向上しないの
で、測定精度もそれ以上向上しない。

【００３７】本発明で用いられる溶離液Ａには、本発明
の課題達成を阻害しない範囲で必要に応じて、水に溶解
された状態で溶離液ＡのｐＨを４．０〜６．８にする緩
衝作用を発現する、例えば、無機酸、有機酸、無機酸も
しくは有機酸の塩等の緩衝剤が含有されていても良い。
これらの緩衝剤は、単独で用いられても良いし、２種類
以上が併用されても良い。

【００３８】上記無機酸としては、例えば、リン酸や炭
酸等が挙げられる。これらの無機酸は、単独で用いられ
ても良いし、２種類以上が併用されても良い。

【００３９】上記有機酸としては、例えば、カルボン
酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカル
ボン酸、カコジル酸、アミノ酸等が挙げられる。これら
の有機酸は、単独で用いられても良いし、２種類以上が
併用されても良い。

【００４０】カルボン酸としては、例えば、酢酸やプロ
ピオン酸等が挙げられる。ジカルボン酸としては、例え
ば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マ
レイン酸、フタル酸、フマル酸等が挙げられる。カルボ
ン酸誘導体としては、例えば、β，β−ジメチルグルタ
ル酸、バルビツール酸、アミノ酪酸等が挙げられる。ヒ
ドロキシカルボン酸としては、例えば、クエン酸、酒石
酸、乳酸等が挙げられる。アミノ酸としては、例えば、
アスパラギン酸やヒスチジン等が挙げられる。

【００４１】上記無機酸もしくは有機酸の塩としては、
公知のもので良く、例えば、ナトリウム塩やカリウム塩
等が挙げられる。これらの無機酸もしくは有機酸の塩
は、単独で用いられても良いし、２種類以上が併用され
ても良い。

【００４２】上記無機酸や有機酸等の緩衝剤として、酸
解離定数値（ｐＫａ値）が２．１５〜６．３９の範囲に
ある物質と、ｐＫａ値が６．４０〜１０．５０の範囲に
ある物質とを組み合わせて用いても良い。また、このよ
うに２種以上の物質を組み合わせて用いる代わりに、ｐ
Ｋａ値が２．１５〜６．３９の範囲と６．４０〜１０．
５０の範囲との両方にある単一の物質を用いても良い。
なお、ｐＫａ値のより好ましい範囲は、２．６１〜６．
３９および６．４０〜１０．５０であり、さらに好まし
い範囲は、２．８０〜６．３５および６．８０〜１０．
００であり、特に好ましい範囲は、３．５０〜６．２５
および７．００〜９．５０である。

【００４３】溶離液Ａ中における上記緩衝剤の濃度は、
水に溶解された状態で溶離液ＡのｐＨを４．０〜６．８
にする緩衝作用を発現する範囲であれば良く、特に限定
されるものではないが、１〜１０００ｍＭであることが
好ましく、より好ましくは１０〜５００ｍＭである。

【００４４】本発明で用いられる溶離液Ａは、特に限定
されるものではないが、ｐＨが４．０〜６．８であるこ
とが好ましく、より好ましくは４．５〜５．８である。
溶離液ＡのｐＨが４．０未満であると、ヘモグロビン類
が変性することがあり、逆に溶離液ＡのｐＨが６．８を
超えると、ヘモグロビン類のプラス電荷が減少して、カ
チオン交換基に保持されにくくなり、分離能力が悪くな
ることがある。

【００４５】本発明で用いられる溶離液Ａには、本発明
の課題達成を阻害しない範囲で必要に応じて、例えば、
無機塩類、ｐＨ調節剤、水溶性有機溶媒、ヘモグロビン
の安定剤、アミン類、界面活性剤等の各種添加剤の１種
類もしくは２種類以上が含有されていても良い。

【００４６】上記無機塩類としては、例えば、塩化ナト
リウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウ
ム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。これらの無機塩
類は、単独で用いられても良いし、２種類以上が併用さ
れても良い。また、溶離液Ａ中における上記無機塩類の
濃度は、特に限定されるものではないが、１〜１５００
ｍＭであることが好ましい。

【００４７】上記ｐＨ調節剤としては、公知の酸や塩基
が用いられて良く、例えば、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸
等の酸や、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化
リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸
化カルシウム等の塩基が挙げられる。これらのｐＨ調節
剤は、単独で用いられても良いし、２種類以上が併用さ
れても良い。また、溶離液Ａ中における上記ｐＨ調節剤
の濃度は、特に限定されるものではないが、０．００１
〜５００ｍＭであることが好ましい。

【００４８】上記水溶性有機溶媒としては、例えば、メ
タノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン等が
挙げられる。これらの水溶性有機溶媒は、単独で用いら
れても良いし、２種類以上が併用されても良い。また、
溶離液Ａ中における上記水溶性有機溶媒の濃度は、特に
限定されるものではないが、８０体積％以下であること
が好ましく、かつ、前記カオトロピックイオンや緩衝剤
等が析出しない濃度であることが好ましい。

【００４９】上記ヘモグロビンの安定剤としては、公知
の安定剤が用いられて良く、例えば、エチレンジアミン
四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤、グルタチオンな
どの還元剤、各種酸化防止剤等が挙げられる。これらの
ヘモグロビンの安定剤は、単独で用いられても良いし、
２種類以上が併用されても良い。

【００５０】上記アミン類としては、ヘモグロビンの非
特異的吸着を少なくし得るものであれば公知のアミン類
が用いられて良く、例えば、好ましくは分子量２０〜５
００の第１級アミン、第２級アミン、第３級アミン等が
挙げられる。これらのアミン類は、単独で用いられても
良いし、２種類以上が併用されても良い。

【００５１】上記界面活性剤としては、例えば、ノニオ
ン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界
面活性剤等が挙げられ、なかでもノニオン性界面活性剤
が好適に用いられる。これらの界面活性剤は、単独で用
いられても良いし、２種類以上が併用されても良い。ま
た、溶離液Ａ中における上記界面活性剤の濃度は、特に
限定されるものではないが、０．０１〜１０重量％であ
ることが好ましい。

【００５２】上記ノニオン性界面活性剤としては、例え
ば、ポリオキシエチレンエーテル類｛以下、ポリオキシ
エチレンをＰＯＥと記し、エチレンオキシド付加モル数
を（ｎ）と記す｝や、モノラウリン酸ソルビタン、モノ
パルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタ
ン、モノオレイン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノラウ
リン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノパルミチン酸ソル
ビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノステアリン酸ソルビタン、Ｐ
ＯＥ（ｎ）モノオレイン酸ソルビタン等が挙げられる。
また、上記ポリオキシエチレンエーテル類の具体例とし
ては、例えば、ＰＯＥ（７）デシルエーテル、ＰＯＥ
（ｎ）ドデシルエーテル、ＰＯＥ（１０）トリデシルエ
ーテル、ＰＯＥ（１１）テトラデシルエーテル、ＰＯＥ
（ｎ）セチルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）ステアリルエーテ
ル、ＰＯＥ（ｎ）オレイルエーテル、ＰＯＥ（１７）セ
チルステアリルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）オクチルフェニ
ルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）ノニルフェニルエーテル等が
挙げられる。これらのノニオン性界面活性剤は、単独で
用いられても良いし、２種類以上が併用されても良い。

【００５３】溶離液Ａ中および／または溶血試薬中に界
面活性剤を含有させることにより、溶血を効率的に行う
ことができるとともに、例えば高速液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）等で測定を行う場合に、溶血試薬の通
過する流路等を洗浄する効果も得られる。

【００５４】本発明のヘモグロビン類の測定方法では、
ＨｂＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン類を溶出させ
るための上述した溶離液ＡとＨｂＡ０を溶出させるため
の溶離液Ｂとの少なくとも２種類の溶離液が用いられ
る。

【００５５】一般に、カチオン交換液体クロマトグラフ
ィーで分離されるヘモグロビン類のうち、ＨｂＡ等から
なるＨｂＡ０は、ＨｂＡ１ｃより後に溶出し、カラム中
の充填剤に強く保持されるので、測定時間が長くなる傾
向にある。

【００５６】このため、ＨｂＡ０の溶出には、充填剤と
の相互作用を弱めるために、例えば、（１）溶離液のｐ
Ｈを高くする方法、（２）溶離液の塩濃度を高くする方
法、（３）溶離液のｐＨを高くし、さらに塩濃度を高く
する方法等が採られるが、なかでも、ＨｂＡ０の溶出、
分離をより短時間に良好に行うことができることから、
（３）溶離液のｐＨを高くし、さらに塩濃度を高くする
方法を採ることが好ましい。

【００５７】本発明で用いられるＨｂＡ０を溶出させる
ための溶離液Ｂは、そのｐＨが溶離液ＡのｐＨより０．
１〜８．０高いこと、すなわち、溶離液ＢのｐＨ−溶離
液ＡのｐＨが０．１〜８．０であることが必要であり、
好ましくは０．３〜７．０であり、より好ましくは０．
５〜６．０である。

【００５８】溶離液ＢのｐＨ−溶離液ＡのｐＨが０．１
未満であると、ＨｂＡ０の溶出、分離に時間がかかり、
逆に溶離液ＢのｐＨ−溶離液ＡのｐＨが８．０を超える
と、カラム中の充填剤の分解が起こり、ヘモグロビン類
の測定値に好ましくない影響を及ぼす欠点が生じる。

【００５９】また、本発明で用いられるＨｂＡ０を溶出
させるための溶離液Ｂは、その塩濃度が溶離液Ａの塩濃
度より１０〜１０００ｍＭ高いこと、すなわち、溶離液
Ｂの塩濃度−溶離液Ａの塩濃度が１０〜１０００ｍＭで
あることが必要であり、好ましくは３０〜８００ｍＭで
あり、より好ましくは５０〜６００ｍＭである。尚、こ
こで言う塩濃度とは、溶離液中の総陰イオン濃度を意味
する。

【００６０】溶離液Ｂの塩濃度−溶離液Ａの塩濃度が１
０ｍＭ未満であると、ＨｂＡ０の溶出、分離に時間がか
かり、逆に溶離液Ｂの塩濃度−溶離液Ａの塩濃度が１０
００ｍＭを超えると、カラムの圧力変動が大きくなる欠
点が生じる。

【００６１】本発明で用いられる溶離液Ｂには、カオト
ロピックイオンが含有されていることが好ましい。前記
溶離液Ａ中のみならず、溶離液Ｂ中にもカオトロピック
イオンを含有させることにより、ＨｂＡ０の溶出、分離
をより効果的に行うことができる。

【００６２】上記カオトロピックイオンとしては、前記
溶離液Ａに含有させるものと同様の各種陰イオンや各種
陽イオンが挙げられる。これらのカオトロピックイオン
は、単独で用いられても良いし、２種類以上が併用され
ても良い。

【００６３】溶離液Ｂ中におけるカオトロピックイオン
の濃度は、特に限定されるものではないが、１〜３００
０ｍＭであることが好ましく、より好ましくは１０〜１
０００ｍＭであり、さらに好ましくは５０〜５００ｍＭ
である。カオトロピックイオンの上記濃度が１ｍＭ未満
であると、ＨｂＡ０の溶出、分離効果が十分に向上しな
いことがあり、逆にカオトロピックイオンの上記濃度が
３０００ｍＭを超えても、もはやＨｂＡ０の溶出、分離
効果はそれ以上向上しないので、測定精度もそれ以上向
上しない。

【００６４】また、上記溶離液Ｂには、アジ化物イオン
が含有されていても良い。上記アジ化物イオンの生成源
としては、前記溶血試薬および／または前記溶離液Ａに
含有させるものと同様の各種アジ化物塩等が挙げられ
る。これらのアジ化物イオンの生成源は、単独で用いら
れても良いし、２種類以上が併用されても良い。

【００６５】本発明で用いられる溶離液Ｂには、本発明
の課題達成を阻害しない範囲で必要に応じて、例えば、
無機酸、有機酸、無機酸もしくは有機酸の塩、有機物、
一般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液と呼称されるものを
構成する物質などの緩衝剤が含有されていても良い。

【００６６】上記緩衝剤の具体例としては、例えば、リ
ン酸、ホウ酸、炭酸等の無機酸またはその塩；クエン酸
などのヒドロキシカルボン酸、β，β−ジメチルグルタ
ル酸などのカルボン酸誘導体、マレイン酸などのジカル
ボン酸、カコジル酸等の有機酸またはその塩；２−（Ｎ
−モリホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−２−
ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸
（ＨＥＰＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノ
トリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓｔｒｉ
ｓ）、Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、Ｂｉｓｔｒｉｓ
ｐｒｏｐａｎｅ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥ
Ｓ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃ
ｉｎｅ、グリシルグリシン、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ等の一
般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液と呼称されるものを構
成する物質；ＢｒｉｔｔｏｎとＲｏｂｉｎｓｏｎの緩衝
液；ＧＴＡ緩衝液；イミダゾール等のイミダゾール類；
エチレンジアミン、メチルアミン、エチルアミン、トリ
エチルアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールア
ミン等のアミン類；グリシン、β−アラニン、アスパラ
ギン酸、アスパラギン等のアミノ酸類等が挙げられる。
これらの緩衝剤は、単独で用いられても良いし、２種類
以上が併用されても良い。

【００６７】また、本発明で用いられる溶離液Ｂには、
本発明の課題達成を阻害しない範囲で必要に応じて、例
えば、無機塩類、ｐＨ調節剤、水溶性有機溶媒、ヘモグ
ロビンの安定剤、アミン類、界面活性剤等の各種添加剤
の１種類もしくは２種類以上が含有されていても良い。

【００６８】上記各種添加剤の具体例としては、前記溶
血試薬や前記溶離液Ａに含有させても良いものと同様の
ものがそれぞれ挙げられる。これらの各種添加剤は、単
独で用いられても良いし、２種類以上が併用されても良
い。

【００６９】本発明のヘモグロビン類の測定方法におい
ては、溶離液Ａおよび溶離液Ｂに加うるに、本発明の課
題達成を阻害しない範囲で必要に応じて、他の溶離液の
１種類もしくは２種類以上が併用されても良い。

【００７０】本発明のヘモグロビン類の測定方法におい
て、溶離液の送液方法としては、例えば、段階溶出法、
グラディエント溶出法、ステップアップグラディエント
溶出法等の公知の方法が挙げられ、いずれの方法が採ら
れても良い。

【００７１】本発明のヘモグロビン類の測定方法で用い
られる充填剤は、少なくとも１種類のカチオン交換基を
有している粒子よりなるものであり、例えば、高分子粒
子に少なくとも１種類のカチオン交換基を導入すること
により得られる。

【００７２】上記粒子としては、例えば、シリカ、ジル
コニアなどの無機系粒子；セルロース、ポリアミノ酸、
キトサンなどの天然高分子粒子；ポリスチレン、ポリア
クリル酸エステルなどの合成高分子粒子；公知の非多孔
性粒子等が挙げられる。これらの粒子は、単独で用いら
れても良いし、２種類以上が併用されても良い。

【００７３】上記粒子の平均粒子径は、特に限定される
ものではないが、０．５〜２０μｍであることが好まし
く、より好ましくは１〜１０μｍである。また、上記粒
子の粒度分布は、特に限定されるものではないが、変動
係数値｛ＣＶ値（１００×粒子径の標準偏差／平均粒子
径）｝で４０％以下であることが好ましく、より好まし
くは３０％以下である。

【００７４】また、上記粒子は、導入されるカチオン交
換基以外の構成成分がより親水性であることが好まし
い。さらに、上記粒子として高分子粒子を用いる場合、
高分子粒子は、より良好な耐圧性や耐膨潤性を得るため
に、架橋度の高いものであることが好ましい。

【００７５】上記粒子に導入されるカチオン交換基とし
ては、例えば、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸
基などの公知の各種カチオン交換基が挙げられる。これ
らのカチオン交換基は、単独で導入されても良いし、２
種類以上が導入されても良い。

【００７６】粒子へのカチオン交換基の導入方法として
は、例えば、粒子を調製した後、粒子が有する官能基
（水酸基、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基等）
に化学反応でカチオン交換基を導入することにより、カ
チオン交換基が導入された粒子を得る方法、例えばカチ
オン交換基含有単量体を架橋性単量体などと混合し、重
合開始剤の存在下で重合させるように、カチオン交換基
含有単量体を重合させることにより、カチオン交換基が
導入された高分子粒子を得る方法、例えば（メタ）アク
リル酸メチルや（メタ）アクリル酸エチルなどのカチオ
ン交換基含有重合性エステルを架橋性単量体などと混合
し、重合開始剤の存在下で重合させた後、得られた高分
子粒子を加水分解処理して、エステルをカチオン交換基
に変換させることにより、カチオン交換基が導入された
高分子粒子を得る方法、例えば特公平８−７１９７号公
報に記載されているように、架橋高分子粒子を調製した
後、カチオン交換基含有単量体を添加して、架橋高分子
粒子の表面部分でカチオン交換基含有単量体を重合させ
ることにより、カチオン交換基が導入された高分子粒子
を得る方法等が挙げられ、いずれの方法が採られても良
い。

【００７７】上記充填剤（カチオン交換基が導入された
粒子もしくは高分子粒子）は、カラムに充填されて、液
体クロマトグラフィー測定に用いられる。

【００７８】上記カラムのサイズは、特に限定されるも
のではないが、内径が０．１〜５０ｍｍ、長さが１〜３
００ｍｍであるものが好ましく、より好ましくは、内径
が０．２〜３０ｍｍ、長さが５〜２００ｍｍのものであ
る。カラムの内径が０．１ｍｍ未満であるか、長さが１
ｍｍ未満であると、作業性や分離能力が悪くなることが
あり、逆にカラムの内径が５０ｍｍを超えるか、長さが
２００ｍｍを超えると、充填剤の必要量が多くなるのみ
ならず、分離能力が悪くなることがある。

【００７９】充填剤のカラムへの充填方法としては、公
知の任意の充填方法が採られて良いが、なかでもスラリ
ー充填法を採ることが好ましい。具体的には、例えば、
先ず粒子状の充填剤を溶離液Ａや溶離液Ｂなどに分散さ
せたスラリーを調製し、このスラリーを送液ポンプなど
でカラム中に圧入することにより、充填剤をカラムへ充
填すれば良い。

【００８０】上記カラムの素材としては、例えば、ステ
ンレスなどの金属、ガラス、ポリエーテルエーテルケト
ン（ＰＥＥＫ）などの合成樹脂等の公知の各種素材が挙
げられる。これらのカラムの素材は、単独で用いられて
も良いし、２種類以上が併用されても良い。また、充填
剤とカラム本体が接する部位を不活性（イナート）な素
材で被覆しても良く、そのイナートな素材としては、例
えば、ＰＥＥＫ、ポリエチレン、テフロン（登録商
標）、チタン化合物、珪素化合物、シリコン膜等が挙げ
られる。これらのイナートな素材は、単独で用いられて
も良いし、２種類以上が併用されても良い。

【００８１】本発明で用いられるカラムフィルターおよ
び／またはプレフィルターとしては、イナートな素材か
らなるフィルター、または、フィルターの表面がイナー
トな素材で被覆されているフィルターを用いることが好
ましい。上記イナートな素材としては、例えば、セルロ
ースエステル、セルロースアセテート、セルローストリ
アセテート、セルロース、セルロースナイトレート、ポ
リテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフロライ
ド、ポリスルフォン、ポリエチレン、ＰＥＥＫ、ポリエ
ーテルスルホン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリフッ
化ビニリデン、ガラス素材、アクリル共重合体、酸化物
セラミック、炭化物セラミック、窒化物セラミック、珪
化物セラミック、硼化物セラミック、チタン等が挙げら
れる。これらのイナートな素材は、単独で用いられても
良いし、２種類以上が併用されても良い。

【００８２】また、例えばステンレスなどのイナートで
ない素材を用いる場合には、例えば、上記イナートな素
材で被覆する方法、シリコーン処理などのイナート化処
理を施す方法、例えば牛血清アルブミン、ゼラチン、カ
ゼイン、グロブリン、ヘモグロビンなどのブロッキング
試薬によりブロッキングする方法等を採ることが好まし
い。

【００８３】本発明のヘモグロビン類の測定方法に使用
される液体クロマトグラフィー装置は、公知のもので良
く、例えば、送液ポンプ、試料注入装置（サンプラ）、
カラム、検出器などから構成される。また、上記液体ク
ロマトグラフィー装置には、例えば、カラム恒温槽や溶
離液の脱気装置などの他の付属装置が備えられていても
良い。

【００８４】ヘモグロビン類を測定する際のカラム温度
は、特に限定されるものではないが、安定型ＨｂＡ１ｃ
の溶出や分離を良くするために、２５〜６０℃であるこ
とが好ましく、より好ましくは３５〜５５℃である。

【００８５】また、ヘモグロビン類を測定する際のカラ
ム圧力は、特に限定されるものではないが、カラムや装
置の耐久性を良くするために、９．８×１０⁴〜３．９
×１０⁶Ｐａ（１〜４０ｋｇｆ／ｃｍ²）であることが
好ましく、より好ましくは２．０×１０⁵〜３．４×１
０⁶Ｐａ（２〜３５ｋｇｆ／ｃｍ²）である。

【００８６】本発明のヘモグロビン類の測定方法におけ
る他の測定条件は、公知の条件で良く、例えば、溶離液
Ａや溶離液Ｂの流速は、特に限定されるものではない
が、０．０５〜５ｍｌ／分であることが好ましく、より
好ましくは０．２〜３ｍｌ／分である。また、ヘモグロ
ビン類の検出は、波長４１５ｎｍの可視光を用いて行う
方法が好ましいが、特に上記方法に限定されるものでは
ない。さらに、測定用試料としては、前記溶血試薬によ
り溶血された試料を用いる。上記測定用試料の液体クロ
マトグラフィー装置への注入量は、希釈倍率によっても
異なるが、一般的には０．１〜１００μｌ程度であるこ
とが好ましい。

【００８７】溶離液の送液方法を段階溶出法として測定
を行う場合の装置の構成例を図１に示す。溶離液Ａ、溶
離液Ｂ、溶離液Ｃおよび溶離液Ｄは、それぞれ溶出力が
異なる、すなわち、ｐＨおよび／または塩濃度が異なる
溶離液であり、電磁弁１によって設定時間ごとに各溶離
液に切り替えられるように構成されている。各溶離液
は、送液ポンプ２により、試料注入部３から導入された
測定用試料とともにカラム４に導かれ、各成分が検出器
５により検出される。各ピーク面積、高さ等はインテグ
レータ６により算出される。

【００８８】

【発明の実施の形態】本発明をさらに詳しく説明するた
め以下に実施例を挙げるが、本発明はこれら実施例のみ
に限定されるものではない。

【００８９】（実施例１）１．充填剤の調製テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化
学社製）４５０ｇおよび２−ヒドロキシ−１，３−ジメ
タクリロキシプロパン（和光純薬工業社製）５０ｇの混
合物に過酸化ベンゾイル（和光純薬工業社製）２ｇを溶
解した。これをポリビニルアルコール（日本合成化学社
製）の４重量％水溶液２５００ｍｌに分散させ、撹拌し
ながら窒素雰囲気下で８０℃に昇温し、１．５時間重合
反応を行った。次いで、重合反応系を３５℃に冷却した
後、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン
酸（東京化成社製）の５０重量％水溶液４００ｇおよび
メタノール４００ｍｌを添加し、１時間攪拌しながら再
び８０℃に昇温し、１．３時間重合反応を行った。重合
反応終了後、洗浄、乾燥、分級の工程を経て、平均粒子
径が６．５μｍの粒子状の充填剤を調製した。

【００９０】２．充填剤のカラムへの充填上記で得られた充填剤を以下のようにしてカラムに充填
した。充填剤０．７ｇを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
５．８）３０ｍｌに分散し、５分間超音波処理した後、
均一に撹拌混合した。次いで、その全量をステンレス製
の空カラム（内径４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍ）を接続し
たパッカー（梅谷精機社製）に注入した。上記パッカー
に送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力約３×
１０⁷Ｐａ（３００ｋｇｆ／ｃｍ²）の定圧で充填剤を
カラムへ充填した。

【００９１】３．ヘモグロビン類の測定上記で得られたカラムを用いて以下の測定条件でヘモグ
ロビン類の測定を行った。〔測定条件〕１）システム（１）送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）（２）オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学工業
社製）（３）検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）２）溶離液（１）溶離液Ａ：４５ｍＭの過塩素酸および４．６ｍＭ
（０．０３重量％）のアジ化ナトリウムを含有する５０
ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）（２）溶離液Ｂ：２００ｍＭの過塩素酸および４．６ｍ
Ｍ（０．０３重量％）のアジ化ナトリウムを含有する５
０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．４）３）測定開始より０〜３分の間は上記溶離液Ａを流し、
３〜３．２分の間は上記溶離液Ｂを流し、３．２〜５分
の間は上記溶離液Ａを流した。４）流速：２．０ｍｌ／分５）検出波長：４１５ｎｍ６）測定用試料注入量：１０μｌ

【００９２】４．測定用試料（ａ）の調製ＨｂＦ高値患者血を採血し、抗血液凝固剤としてフッ化
ナトリウムを１０ｍｇ／ｍｌ（血液）となるように添加
した。これに、１５０倍量の溶血試薬｛界面活性剤とし
てポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニル
エーテル（商品名「トリトンＸ−１００」、東京化成社
製）０．１重量％を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）｝を添加し、溶血して、測定用試料（ａ）を調製し
た。

【００９３】５．測定結果上記測定条件により、測定用試料（ａ）のヘモグロビン
類を測定して得られたクロマトグラムを図２に示した。
ピーク７はＨｂＡ１ａおよびＨｂＡ１ｂ、ピーク８はＨ
ｂＦ、ピーク９は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク１０は安
定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク１１はＨｂＡ０をそれぞれ表
す。図２から明らかなように、ピーク８、ピーク９およ
びピーク１０が良好に分離されていることが分かる。

【００９４】（実施例２）溶離液および溶血試薬を以下
に示す組成としたこと以外は、実施例１の場合とと同様
にして、測定用試料（ａ）のヘモグロビン類を測定し
た。得られたクロマトグラムは図２と同様であり、各ピ
ーク間の分離は良好であった。溶離液Ａ：５０ｍＭの過塩素酸を含有する、２５ｍＭコ
ハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）溶離液Ｂ：２５０ｍＭの過塩素酸を含有する、２０ｍＭ
コハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶血試薬：０．１重量％の界面活性剤「トリトンＸ−１
００」および９．２ｍＭ（０．０６重量％）のアジ化ナ
トリウムを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）

【００９５】（実施例３）溶離液および溶血試薬を以下
に示す組成としたこと以外は、実施例１の場合とと同様
にして、測定用試料（ａ）のヘモグロビン類を測定し
た。得られたクロマトグラムは図２と同様であり、各ピ
ーク間の分離は良好であった。溶離液Ａ：４８ｍＭの過塩素酸および９．２ｍＭ（０．
０６重量％）のアジ化ナトリウムを含有する、２５ｍＭ
コハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）溶離液Ｂ：２５０ｍＭの過塩素酸および９．２ｍＭ
（０．０６重量％）のアジ化ナトリウムを含有する、２
０ｍＭコハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶血試薬：０．１重量％の界面活性剤「トリトンＸ−１
００」および１２．３ｍＭ（０．０８重量％）のアジ化
ナトリウムを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）

【００９６】（実施例４）実施例１の場合と同様にし
て、平均粒子径が３．０μｍの充填剤を調製した。次い
で、実施例１の場合と同様にして、ステンレス製の空カ
ラム（内径１．５ｍｍ、長さ５０ｍｍ）へ上記で得られ
た充填剤を充填した。

【００９７】上記で得られたカラムを用い、測定条件を
以下に示す条件としたこと以外は、実施例１の場合と同
様にして、測定用試料（ａ）のヘモグロビン類を測定し
た。得られたクロマトグラムは図２と同様であり、各ピ
ーク間の分離は良好であり、かつ、ヘモグロビン類のピ
ークがシャープになった。〔測定条件〕１）システム（１）送液ポンプ：イナートポンプ２００１、ＮＡＮＯ
ＳＰＡＣＥＳＩ−１（資生堂社製）（２）オートサンプラ：２００３（資生堂社製）（３）検出器：ＵＶ−ＶＩＳ検出器２００２（資生堂社
製）２）溶離液（１）溶離液Ａ：４８ｍＭの過塩素酸および９．２ｍＭ
（０．０６重量％）のアジ化ナトリウムを含有する、２
５ｍＭコハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）（２）溶離液Ｂ：２５０ｍＭの過塩素酸および９．２ｍ
Ｍ（０．０６重量％）のアジ化ナトリウムを含有する、
２０ｍＭコハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．
４）３）溶血試薬０．１重量％の界面活性剤「トリトンＸ−１００」およ
び１２．３ｍＭ（０．０８重量％）のアジ化ナトリウム
を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４）流速：０．２５ｍｌ／分５）検出波長：４１５ｎｍ６）測定用試料注入量：３μｌ

【００９８】（比較例１）溶離液および溶血試薬を以下
に示す組成としたこと以外は、実施例１の場合とと同様
にして、測定用試料（ａ）のヘモグロビン類を測定し
た。得られたクロマトグラムを図３に示す。図３から明
らかなように、図２と比較して、ピーク８、ピーク９お
よびピーク１０の分離が悪かった。溶離液Ａ：２００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）溶離液Ｂ：３３０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）溶血試薬：０．１重量％の界面活性剤「トリトンＸ−１
００」を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）

【００９９】（比較例２）溶離液および溶血試薬を以下
に示す組成としたこと以外は、実施例１の場合とと同様
にして、測定用試料（ａ）のヘモグロビン類を測定し
た。得られたクロマトグラムを図４に示す。図４から明
らかなように、図２と比較して、ピーク８およびピーク
９の分離が悪かった。溶離液Ａ：４５ｍＭの過塩素酸を含有する５０ｍＭのリ
ン酸緩衝液（ｐＨ５．３）溶離液Ｂ：２００ｍＭの過塩素酸を含有する５０ｍＭの
リン酸緩衝液（ｐＨ８．４）溶血試薬：０．１重量％の界面活性剤「トリトンＸ−１
００」を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）

【０１００】（比較例３）溶離液および溶血試薬を以下
に示す組成としたこと以外は、実施例１の場合とと同様
にして、測定用試料（ａ）のヘモグロビン類を測定し
た。得られたクロマトグラムは図３と同様であり、図２
と比較して、ピーク８、ピーク９およびピーク１０の分
離が悪かった。溶離液Ａ：４．６ｍＭ（０．０３重量％）のアジ化ナト
リウムを含有する２００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．
３）溶離液Ｂ：４．６ｍＭ（０．０３重量％）のアジ化ナト
リウムを含有する３３０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）溶血試薬：０．１重量％の界面活性剤「トリトンＸ−１
００」を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）

【０１０１】実施例１〜実施例４、および、比較例１〜
比較例３における測定用試料（ａ）の測定結果（ＨｂＦ
およびＨｂＡ１ｃの測定精度）を表１に示した。

【０１０２】

【表１】

【０１０３】表１から明らかなように、実施例１〜実施
例４におけるＨｂＦ測定値は、２．００〜２．０１％で
あり、ＣＶ値は、０．００〜０．７６％であり、また、
ＨｂＡ１ｃ測定値は、７．０３〜７．０４％であり、Ｃ
Ｖ値は、０．００〜０．０８％であり、測定精度（ＣＶ
値）が非常に優れていた。これに対し、比較例１〜比較
例３におけるＨｂＦ測定値は、順に２．８９％、２．７
４％、２．９７％であり、ＣＶ値は、順に１６．１０
％、１４．３５％、９．３０％であり、実施例と比較し
て、測定精度が非常に悪かった。また、ＨｂＡ１ｃ測定
値については、比較例２は、比較例１および比較例３と
比較すると、良好な測定精度であったが、実施例と比較
すると、比較例１〜比較例３のいずれも測定精度が悪か
った。

【０１０４】（実施例５〜実施例１０）ならびに（比較
例４および比較例５）溶離液および溶血試薬を以下に示す組成とし、測定条件
を以下に示す条件とし、測定用試料を以下に示す測定用
試料（ｂ）としたこと以外は実施例１の場合と同様にし
て、ヘモグロビン類の測定を行った。溶離液Ａ：３０ｍＭのトリクロロ酢酸および９．２ｍＭ
（０．０６重量％）のアジ化ナトリウムを含有する、２
５ｍＭコハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）溶離液Ｂ：１５０ｍＭのトリクロロ酢酸および９．２ｍ
Ｍ（０．０６重量％）のアジ化ナトリウムを含有する、
２０ｍＭコハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．
４）測定開始より０〜３分の間は上記溶離液Ａを流し、３〜
３．２分の間は上記溶離液Ｂを流し、３．２〜５分の間
は上記溶離液Ａを流した。溶血試薬：０．１重量％の界面活性剤「トリトンＸ−１
００」を含有するリン酸緩衝液、但し、溶血試薬のｐＨ
は次のように調節した。実施例５：ｐＨ５．０、実施例
６：ｐＨ６．０、実施例７：ｐＨ７．０、実施例８：ｐ
Ｈ８．０、実施例９：ｐＨ９．０、実施例１０：ｐＨ１
０．０、比較例４：ｐＨ４．５、比較例５：ｐＨ１０．
５流速：２．０ｍｌ／分検出波長：４１５ｎｍ試料注入量：１０μｌ測定用試料：安定型ＨｂＡ１ｃ値が８．１％の患者血を
採血し、抗血液凝固剤としてフッ化ナトリウムを１０ｍ
ｇ／ｍｌ（血液）となるように添加した。これを上記の
ようにｐＨ調節した各溶血試薬により１５０倍に希釈し
たものを測定用試料（ｂ）とした。

【０１０５】上記測定用試料（ｂ）の安定型ＨｂＡ１ｃ
値をｎ＝５で測定し、その平均値を図５に示した。図５
から明らかなように、溶血試薬のｐＨを５〜１０（実施
例５〜実施例１０）に調節した場合、ヘモグロビンの分
離パターンに影響がなく、安定型ＨｂＡ１ｃ値を精度良
く測定できた。これに対し、溶血試薬のｐＨを４．５
（比較例４）あるいは１０．５（比較例５）に調節した
場合、ヘモグロビンの分離パターンが悪化し、安定型Ｈ
ｂＡ１ｃ値を正確に測定できなかった。

【０１０６】（実施例１１）溶離液および溶血試薬を以
下に示す組成とし、測定条件を以下に示す条件とし、測
定用試料を以下に示す測定用試料（ｃ）としたこと以外
は実施例１の場合と同様にして、ヘモグロビン類の測定
を行った。溶離液Ａ：４５ｍＭの過塩素酸および９．２ｍＭ（０．
０６重量％）のアジ化ナトリウムを含有する、５０ｍＭ
のリン酸緩衝液（ｐＨ５．４）溶離液Ｂ：２００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）測定開始より０〜３分の間は上記溶離液Ａを流し、３〜
３．２分の間は上記溶離液Ｂを流し、３．２〜４分の間
は上記溶離液Ａを流した。溶血試薬：０．１重量％の界面活性剤「トリトンＸ−１
００」を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）流速：２．０ｍｌ／分検出波長：４１５ｎｍ試料注入量：１０μｌ測定用試料：安定型ＨｂＡ１ｃ値が８．１％で、ＨｂＦ
値が高値の患者血を採血し、抗血液凝固剤としてフッ化
ナトリウムを１０ｍｇ／ｍｌ（血液）となるように添加
した。これを上記のように調製した溶血試薬により１５
０倍に希釈したものを測定用試料（ｃ）とした。

【０１０７】上記測定用試料（ｃ）のヘモグロビン類を
連続的に測定し、安定型ＨｂＡ１ｃ値の変動を調べた。

【０１０８】（実施例１２）溶離液Ｂを以下に示す組成
としたこと以外は実施例１１の場合と同様にして、ヘモ
グロビン類の測定を行った。溶離液Ｂ：２００ｍＭのリ
ン酸緩衝液（ｐＨ８．５）

【０１０９】（実施例１３）溶離液Ｂを以下に示す組成
としたこと以外は実施例１１の場合と同様にして、ヘモ
グロビン類の測定を行った。溶離液Ｂ：２００ｍＭのリ
ン酸緩衝液（ｐＨ１２．０）

【０１１０】（実施例１４）溶離液Ｂを以下に示す組成
としたこと以外は実施例１１の場合と同様にして、ヘモ
グロビン類の測定を行った。溶離液Ｂ：３００ｍＭの過塩素酸を含有する、２５ｍＭ
コハク酸−３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）

【０１１１】（実施例１５）溶離液Ｂを以下に示す組成
としたこと以外は実施例１１の場合と同様にして、ヘモ
グロビン類の測定を行った。溶離液Ｂ：２００ｍＭの過塩素酸を含有する、２５ｍＭ
コハク酸−３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）

【０１１２】（実施例１６）溶離液Ｂを以下に示す組成
としたこと以外は実施例１１の場合と同様にして、ヘモ
グロビン類の測定を行った。溶離液Ｂ：１００ｍＭの過塩素酸を含有する、２５ｍＭ
コハク酸−３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ１２．０）

【０１１３】（実施例１７）測定用試料（ｃ）を１００
試料連続的に測定する毎に、以下に示すカラム洗浄液
Ｉ、カラム洗浄液ＩＩおよびカラム洗浄シークエンスで
カラムの洗浄を行ったこと以外は実施例１１の場合と同
様にして、ヘモグロビン類の測定を行った。カラム洗浄液Ｉ：４５ｍＭの過塩素酸および９．２ｍＭ
（０．０６重量％）のアジ化ナトリウムを含有する、２
５ｍＭコハク酸−３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）カラム洗浄液ＩＩ：２００ｍＭの過塩素酸を含有する、
２５ｍＭコハク酸−３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．
５）カラム洗浄シークエンス：上記洗浄液ＩＩを１分間流し
た後、上記洗浄液Ｉを３分間流す

【０１１４】（比較例６）溶離液を以下に示す組成とし
たこと以外は実施例１１の場合と同様にして、ヘモグロ
ビン類の測定を行った。溶離液Ａ：４５ｍＭの過塩素酸を含有する５０ｍＭのリ
ン酸緩衝液（ｐＨ５．４）溶離液Ｂ：２００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．４）

【０１１５】（比較例７）溶離液を以下に示す組成とし
たこと以外は実施例１１の場合と同様にして、ヘモグロ
ビン類の測定を行った。溶離液Ａ：４５ｍＭの過塩素酸を含有する、２０ｍＭリ
ン酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．４）溶離液Ｂ：２００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．４）

【０１１６】実施例１１の測定で得られたクロマトグラ
ムを図６に示した。また、比較例６の測定で得られたク
ロマトグラムを図７に示した。なお、実施例１２〜実施
例１７の測定で得られたクロマトグラムは図６とほぼ同
様であり、比較例７の測定で得られたクロマトグラムは
図７とほぼ同様であった。図６から明らかなように、実
施例１１〜実施例１７の測定では、実施例１の場合と同
様に、ＨｂＦ、安定型ＨｂＡ１ｃおよびＨｂＡ０が良好
に分離できるとともに、実施例１の場合と比較して、よ
り短時間で測定することができた。これに対し、図７か
ら明らかなように、比較例６および比較例７の測定で
は、ピーク８およびピーク９間の分離が悪く、しかもＨ
ｂＡ０のピークが広がり、そのためにＨｂＡ０の溶出時
間が長くなり、結果として、実施例１１〜実施例１７の
場合と比較して、測定時間が長くなってしまった。

【０１１７】また、実施例１１〜実施例１７、ならび
に、比較例６および比較例７の条件により１５００試料
を連続的に測定した際の耐久性評価結果を図８に示し
た。図８から明らかなように、比較例６および比較例７
の測定では、２００試料を連続的に測定するまでに、安
定型ＨｂＡ１ｃ値が８．１％より次第に高くなった。こ
の原因は、カラムが劣化し、保持が弱くなったためであ
る。これに対し、実施例１１〜実施例１３の測定では、
ＨｂＡ０溶出液（溶離液Ｂ）のｐＨおよび塩濃度を溶離
液ＡのｐＨおよび塩濃度より高くしているために、１０
００試料を連続的に測定した後でも、安定型ＨｂＡ１ｃ
値は、初期値とほとんど変動しなかった。また、カオト
ロピックイオンを添加した実施例１４〜実施例１６の測
定では、１５００試料を連続的に測定した後でも、安定
型ＨｂＡ１ｃ値は、初期値とほとんど変動しなかった。
さらに、連続的な測定の間に定期的にカラム洗浄を行っ
た実施例１７の測定では、１５００試料を連続的に測定
した後も、安定型ＨｂＡ１ｃ値は、８．１％を維持して
おり、全く変化がなかった。

【０１１８】

【発明の効果】以上述べたように、本発明のヘモグロビ
ン類の測定方法によれば、カチオン交換液体クロマトグ
ラフィーによるヘモグロビン類の測定方法において、血
液検体を溶血させる際に用いるｐＨが５．０〜１０．０
の溶血試薬、および、ヘモグロビンＡ０よりも前に溶出
するヘモグロビン類を溶出させるための溶離液Ａとヘモ
グロビンＡ０を溶出させるための溶離液Ｂとの少なくと
も２種類の溶離液を用い、上記溶血試薬および／または
上記溶離液Ａにアジ化物イオンが含有され、かつ、上記
溶離液Ａにカオトロピックイオンが含有され、上記溶離
液Ｂの塩濃度が溶離液Ａの塩濃度より１０〜１０００ｍ
Ｍ高く、かつ、上記溶離液ＢのｐＨが溶離液ＡのｐＨよ
り０．１〜８．０高い構成とされているので、ヘモグロ
ビン類、特に安定型ＨｂＡ１ｃを短時間で分離し、高精
度に測定することができる。

【０１１９】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明で用いられるカチオン交換液体クロマト
グラフィー装置の一例を示す図である。

【図２】実施例１の測定条件により、測定用試料（ａ）
のヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマト
グラムを示す図である。

【図３】比較例１の測定条件により、測定用試料（ａ）
のヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマト
グラムを示す図である。

【図４】比較例２の測定条件により、測定用試料（ａ）
のヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマト
グラムを示す図である。

【図５】実施例５〜実施例１０、ならびに、比較例４お
よび比較例５の測定条件により、測定用試料（ｂ）のＨ
ｂＡ１ｃ値を求めた結果を示す図である。

【図６】実施例１１の測定条件により、測定用試料
（ｃ）のヘモグロビン類の測定を行った際に得られたク
ロマトグラムを示す図である。

【図７】比較例６の測定条件により、測定用試料（ｃ）
のヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマト
グラムを示す図である。

【図８】実施例１１〜実施例１７、ならびに、比較例６
および比較例７の測定条件により、測定用試料（ｃ）の
安定型ＨｂＡ１ｃ値を連続的に測定した際のＨｂＡ１ｃ
値の変動を示す図である。

【符号の説明】

Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ溶離液１電磁弁２送液ポンプ３試料注入部４カラム５検出器６インテグレータ７ＨｂＡ１ａおよびＨｂＡ１ｂのピー
ク８ＨｂＦのピーク９不安定型ＨｂＡ１ｃのピーク１０安定型ＨｂＡ１ｃのピーク１１ＨｂＡ０のピーク

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】カチオン交換液体クロマトグラフィーに
よるヘモグロビン類の測定方法において、血液検体を溶
血させる際に用いるｐＨが５．０〜１０．０の溶血試
薬、および、ヘモグロビンＡ０よりも前に溶出するヘモ
グロビン類を溶出させるための溶離液Ａとヘモグロビン
Ａ０を溶出させるための溶離液Ｂとの少なくとも２種類
の溶離液を用い、上記溶血試薬および／または上記溶離
液Ａにアジ化物イオンが含有され、かつ、上記溶離液Ａ
にカオトロピックイオンが含有され、上記溶離液Ｂのｐ
Ｈが溶離液ＡのｐＨより０．１〜８．０高く、かつ、上
記溶離液Ｂの塩濃度が溶離液Ａの塩濃度より１０〜１０
００ｍＭ高いことを特徴とするヘモグロビン類の測定方
法。
【請求項２】溶離液Ｂにカオトロピックイオンが含有
されることを特徴とする請求項１に記載のヘモグロビン
類の測定方法。