JP5041733B2 - ヘモグロビン類の測定方法 - Google Patents
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即ち、陽イオン交換液体クロマトグラフィーによる安定型HbA1c値(%)の測定を目的として、血液検体のヘモグロビン類を測定する際、安定型HbA1cの測定値に影響を与えないように、安定型HbA1cと溶出挙動が近似している不安定型HbA1cやアセチル化Hb及びカルバミル化Hbピークを、安定型HbA1cピークから分離することが困難であった。
しかしながら、このような方法では、高度に修飾されたアセチル化Hb、カルバミル化Hbを充分に分離できないという欠点があった。
以下に本発明を詳述する。
一方、本発明のように、溶離液の溶存酸素濃度を2.5mg/L以上とした場合は、脱酸素化が起こりにくく、デオキシヘモグロビンに対するオキシヘモグロビンの比率が非常に高くなるため、分離性能が向上するものと考えられる。
上記溶存酸素濃度の好ましい下限は3.5mg/L、好ましい上限は飽和溶存酸素濃度−0.5mg/L;より好ましい下限は4.5mg/L、より好ましい上限は飽和溶存酸素濃度−1.0mg/L;更に好ましい下限は5.5mg/L、更に好ましい上限は飽和溶存酸素濃度−1.5mg/Lである。
上記pKaが上記範囲外であると、溶離液のpHを、測定目的のピークを分離するのに適切な範囲とすることができず、結果として、ヘモグロビン類が変性したり、ヘモグロビン類の分離が困難となったりすることがある。
なお、上記緩衝剤としては、pKaを2.15〜6.39及び6.40〜10.50の範囲に少なくとも1つずつもつ単一の物質を用いてもよく、2.15〜6.39の範囲内に少なくとも1つのpKaをもつ物質と6.40〜10.50の範囲内に少なくとも1つのpKaをもつ物質とを組み合わせて緩衝剤として用いてもよい。また、上記緩衝剤を複数組み合わせて用いてもよい。
更に、ベースライン変動をより小さくするために、上記測定目的のピークを分離するにあたって用いる溶離液は、緩衝剤の濃度も同一であるものを用いるのがより好ましい。
なお、通常のヘモグロビン類の測定において、測定目的となるヘモグロビン類としては、HbA1a、HbA1b、HbF、不安定型HbA1c、安定型HbA1c、HbA0等が挙げられるが、このうちHbA0より前に溶出されてくる各ヘモグロビン成分とは、HbA1a、HbA1b、HbF、不安定型HbA1c、安定型HbA1cのことをいう。
なお、HbA0を溶出するための溶離液を送液した後、HbA2、HbS、HbC等を溶離するために使用する溶離液としては、より溶出力の強い溶離液を使用する必要がある。
また、上記粒子の粒度分布を示す変動係数値(CV値)の好ましい上限は40%、より好ましい上限は30%である。なお、上記変動係数値(CV値)は、粒子径の標準偏差÷平均直径×100から求めることができる。
上記高分子粒子において、導入されるカチオン交換基以外の構成成分は、より親水性であることが好ましい。また耐圧性・耐膨潤性の点から架橋度の高いものが好ましい。
また、特公平8−7197号公報に記載のように、架橋重合体粒子を調製した後、カチオン交換基を有する単量体を添加して、重合体粒子の表面付近に、該単量体を重合させる方法により、カチオン交換基を有する充填剤粒子を調製してもよい。
上記カラムのサイズとしては、内径0.1〜50mm、長さ1〜300mmのものが好ましく、内径0.2〜30mm、長さ5〜200mmのものがより好ましい。
本発明において用いられる脱気装置の一例を図31に示した。脱気装置20は、真空ポンプ21によって、真空化することが可能な真空チャンバー23の内部に気液分離膜22が導入された構成となっており、真空チャンバー23に進入した移動相(溶離液)は、気液分離膜22によって気体のみが脱気されるような構成となっている。
また、必要に応じて、生体試料成分の吸着を小さくするために、上記不織布の表面を少なくとも、セルロース系樹脂、フッ素系樹脂、スルホン系樹脂、ポリエチレン、エチレンのアルキル誘導体の重合体、アクリル系樹脂、ナイロン、炭化物セラミック、窒化物セラミック、珪化物セラミック、硼化物セラミック、表面がシリル化処理された二酸化珪素、ガラス及びチタンからなる群より選ばれる少なくとも1種からなるもの、又は、これらを複数組み合わせた素材で処理しても良い。
(1)充填剤の調製
テトラエチレングリコールジメタクリレート(新中村化学社製)400g及び2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸150gの混合物に過酸化ベンゾイル(和光純薬社製)1.5gを溶解した。これを4重量%ポリビニルアルコール(日本合成化学社製)水溶液2500mLに分散させ、撹拌しながら窒素雰囲気下で75℃に昇温し、8時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒子径6μmの粒子を得た。
得られた粒子0.7gを、50mMリン酸緩衝液(pH5.8)30mLに分散し、5分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製の空カラム(内径4.6×30mm)を接続したパッカー(梅谷精機社製)に注入した。次いで、パッカーに送液ポンプ(サヌキ工業社製)を接続し、圧力30MPaで定圧充填した。
50mMリン酸緩衝液に、過塩素酸ナトリウムを60mM添加し、pHを5.3に調整して溶離液Aとした。また、80mMリン酸緩衝液に、過塩素酸ナトリウムを300mM添加し、pHを8.0に調整して溶離液Bとした。
健常人血をフッ化ナトリウム採血した全血検体から以下の試料を調製した。なお、溶血試薬として、0.1重量%ポリエチレングリコールモノ−4−オクチルフェニルエーテル(トリトンX−100)(東京化成社製)を含有するリン酸緩衝液溶液(pH7.0)を用いた。
(a)糖負荷血:全血検体に20g/Lのグルコース水溶液を添加し、37℃で3時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、90倍に希釈して試料aとした。
(b)カルバミル化Hb含有試料:全血検体15mLに、7.5g/Lのシアン酸ナトリウムの生理食塩水溶液1mLを添加し、37℃で2時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、90倍に希釈して試料bとした。
(c)アセチル化Hb含有試料:全血検体15mLに、7.5g/Lのアセトアルデヒドの生理食塩水溶液1mLを添加し、37℃で2時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、90倍に希釈して試料cとした。
得られたカラム、溶離液A、B及び試料a〜cを用いて、以下の条件でヘモグロビン類の測定を行った。また、健常人血をフッ化ナトリウム採血した全血検体を上記溶血試薬により溶血し、90倍に希釈した試料についても同様に測定した。なお、測定は、室温(25℃)で行った。また、溶離液は25℃に保温したものを用い、測定開始より0〜2分の間は溶離液Aを送液し、2〜3分の間は溶離液Bを送液し、3〜5分の間は溶離液Aを送液した。
測定条件:流速:2.0mL/分
検出波長:415nm
試料注入量:10μL
参考例1の(5)において、フッ素樹脂チューブとして表3に示す長さのものを用いた以外は、参考例1と同様にして、ヘモグロビン類の測定を行った。なお、フッ素樹脂チューブは、溶離液A用、溶離液B用を同じ長さとした。
参考例1、実施例2〜5及び比較例1〜3における溶存酸素濃度測定の結果を表3に示す。表3に示すように、フッ素樹脂チューブの長さと溶存酸素濃度の大きさはほぼ比例しており、フッ素樹脂チューブの長さが長いほど、溶存酸素濃度が大きいことが分かる。これは、フッ素樹脂チューブが酸素透過性を有することにより、溶離液の送液距離が長いほど、溶存酸素が多くなるためであると考えられる。
参考例1の方法を用いて、ヘモグロビン類を測定することにより、得られたクロマトグラムを図1〜4に示す。図1は試料a、図2は試料b、図3は試料c、図4は健常人血を測定した結果である。また、ピーク1は不安定型HbA1c、ピーク2は安定型HbA1c、ピーク3はHbA0、ピーク4はカルバミル化Hb、ピーク5はアセチル化Hbを示す。
図1では、ピーク1(不安定型HbA1c)及び2(安定型HbA1c)が良好に分離されている。また、図2ではピーク4(カルバミル化Hb)が、図3ではピーク5(アセチル化Hb)がピーク2(安定型HbA1c)から良好に分離されている。
また、実施例2〜5の方法を用いて、ヘモグロビン類を測定することにより得られたクロマトグラムを図5〜20に示す。図5〜8は実施例2の方法、図9〜12は実施例3の方法、図13〜16は実施例4の方法、図17〜20は実施例5の方法で測定することにより、得られたクロマトグラムである。また、図5、9、13、17は試料a;図6、10、14、18は試料b;図7、11、15、19は試料c;図8、12、16、20は健常人血を測定した結果である。図5〜20に示すように、実施例2〜5においても、良好に不安定型HbA1c、カルバミル化Hbピーク及びアセチル化Hbピークを安定型HbA1cピークから分離できたことがわかる。
従って、溶存酸素が少ない場合は、糖負荷血検体では、良好な分離性能が得られたが、カルバミル化Hbピーク及びアセチル化Hbピークを安定型HbA1cピークから良好に分離することが出来なかったことがわかる。
○:各修飾ヘモグロビンピークと安定型HbA1cピークとが良好に分離されている。
△:各修飾ヘモグロビンピークと安定型HbA1cピークとの分離が不完全である。
×:各修飾ヘモグロビンピークと安定型HbA1cピークとの分離が不良である。
通常、同一人の血液検体を分離性能が良好な測定方法で測定した場合は、修飾ヘモグロビン等の有無に関わらず、安定型HbA1c値は一定の数値を示す。従って、乖離値は、安定型HbA1cの分離性能を示す目安となり、乖離値が大きいほど、安定型HbA1cの分離性能が悪いと言うことができる。
参考例1の(5)において、測定温度を4℃とし、溶離液は4℃で保温したものを用いるとともに、脱気装置の電源を入れず使用しなかった以外は、参考例1と同様にして、ヘモグロビン類の測定を行った。
測定温度を20℃として、溶離液は20℃で保温したものを用いた以外は、参考例6と同様にしてヘモグロビン類の測定を行った。
測定温度を40℃として、溶離液は40℃で保温したものを用いた以外は、参考例6と同様にしてヘモグロビン類の測定を行った。
参考例6、実施例7〜8の方法を用いて、ヘモグロビン類を測定することにより、得られたクロマトグラムは、図17〜20と同様のものであった。また、修飾ヘモグロビンの分離性能及び乖離値を表3に示した。これらの結果から、参考例6、実施例7〜8の方法を用いた場合、良好に不安定型HbA1c、カルバミル化Hbピーク及びアセチル化Hbピークを安定型HbA1cピークから分離できることがわかる。
下記の操作を行った以外は、参考例1と同様にしてヘモグロビン類の測定を行った。
50mMリン酸緩衝液に、過塩素酸ナトリウムを60mM添加し、pHを5.3に調整したものを溶離液C、40mMリン酸緩衝液(pH7.5)を溶離液D、20mMリン酸緩衝液に、過塩素酸ナトリウムを90mM添加し、pHを5.3に調整したものを溶離液E、及び、50mMリン酸緩衝液に、過塩素酸ナトリウムを300mM添加し、pHを8.5に調整したものを溶離液Fとした。
AFSCコントロール(ヘレナ社製)を溶血試薬により溶血し、67倍に希釈して試料dとした。なお、溶血試薬としては、0.1重量%ポリエチレングリコールモノ−4−オクチルフェニルエーテル(トリトンX−100)(東京化成社製)を含有するリン酸緩衝液溶液(pH7.0)を用いた。
得られたカラム、溶離液C〜F及び試料dを用いて、以下の条件でヘモグロビン類の測定を行った。なお、測定は、室温(25℃)で行った。また、溶離液は25℃に保温したものを用い、測定開始より0〜1.7分の間は溶離液Cを送液し、1.7〜3.0分の間は溶離液Dを送液し、3.0〜3.5分の間は溶離液Eを送液し、3.5〜3.6分の間は溶離液Fを送液し、3.6〜4.0分の間は溶離液Cを送液した。
測定条件:流速:2.0mL/分
検出波長:415nm
試料注入量:10μL
参考例9の(5)において、フッ素樹脂チューブとして表3に示す長さのものを用いた以外は、参考例9と同様にして、ヘモグロビン類の測定を行った。なお、フッ素樹脂チューブは、溶離液C用、溶離液D用、溶離液E用、溶離液F用を全て同じ長さとした。実施例10及び比較例4における溶存酸素濃度測定の結果を表3に示す。
参考例9の方法を用いて、ヘモグロビン類を測定することにより、得られたクロマトグラムを図25に示す。図25は試料dを測定した結果である。また、ピーク11はHbA1a及びHbA1b、ピーク12はHbF、ピーク13は不安定型HbA1c、ピーク14はHbA0(主にHbA)、ピーク15はHbA2、ピーク16はHbS、ピーク17はHbCを示す。
図25では、ピーク11〜17が良好に分離されている。また、実施例10の方法を用いて、ヘモグロビン類を測定した場合も図25と同様の結果であった。
2 送液ポンプ
3 試料注入部
4 カラム
5 検出器
6 インテグレータ
Claims (1)
- 陽イオン交換液体クロマトグラフィーを用いて、アセチル化ヘモグロビン、カルバミル化ヘモグロビン、不安定型ヘモグロビンA1c、安定型ヘモグロビンA1c、ヘモグロビンA0、ヘモグロビンA2、ヘモグロビンS及びヘモグロビンCからなる群より選択される少なくとも1種を測定するヘモグロビン類の測定方法であって、溶存酸素濃度が3.7〜8.7mg/Lの溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
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