JP4571046B2 - ヘモグロビン類の測定方法 - Google Patents
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Description
本発明は、陽イオン交換液体クロマトグラフィーを用いたヘモグロビン類の測定方法に関し、特に安定型ヘモグロビンＡ１ｃを高精度で測定することが可能なヘモグロビン類の測定方法に関する。
ヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃともいう）は、ヘモグロビン全体に対する構成比率が、過去１〜２カ月間の平均的な血糖値（血液中のグルコース濃度）を反映しているため、糖尿病のスクリーニング検査や糖尿病患者の血糖管理状態を把握するための検査項目として広く利用されている。
ＨｂＡ１ｃは、血液中のグルコースとヘモグロビンＡ（以下、ＨｂＡともいう）とが反応して生成された糖化ヘモグロビン（以下、ＧＨｂともいう）であり、可逆的に反応したものは、不安定型ＨｂＡ１ｃ（ｕｎｓｔａｂｌｅ ＨｂＡ１ｃ）と呼ばれ、不安定型ＨｂＡ１ｃを経て不可逆的に反応したものは、安定型ＨｂＡ１ｃ（ｓｔａｂｌｅ ＨｂＡ１ｃ）と呼ばれている。
通常、ヘモグロビンは２種類のサブユニット２つずつから構成される４量体のタンパク質である。ＨｂＡのサブユニットはα鎖とβ鎖であり、このβ鎖のＮ末端アミノ酸にグルコースが結合したものがＨｂＡ１ｃである。このうち過去１〜２カ月間の平均的な血糖値を良く反映しているものは、安定型ＨｂＡ１ｃであり、臨床検査分野では、安定型ＨｂＡ１ｃ値（％）を高精度に得ることができる測定法の開発が望まれている。
従来、ＨｂＡ１ｃの主な測定法としては、例えば、特許文献１に開示されているように、血液検体を溶血希釈して調製した試料中のヘモグロビン類を、陽イオン交換法により、ヘモグロビン成分毎に異なるプラス荷電状態の違いを利用して分離する液体クロマトグラフィー（以下、ＬＣともいう）を用いた方法が行われてきた。
通常、陽イオン交換ＬＣを用い、充分な時間を掛けて溶血試料中のヘモグロビン類を分離すると、ヘモグロビンＡ１ａ（以下、ＨｂＡ１ａともいう）及びヘモグロビンＡ１ｂ（以下、ＨｂＡ１ｂともいう）、ヘモグロビンＦ（以下、ＨｂＦともいう）、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ及びヘモグロビンＡ０（以下、ＨｂＡ０ともいう）の順に溶離されてくる。ここで、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ及びＨｂＡ１ｃはＨｂＡが糖化されたＧＨｂであり、ＨｂＦはα鎖とγ鎖から成る胎児性ヘモグロビンであり、ＨｂＡ０はＨｂＡを主成分とする一群のヘモグロビン成分であって、ＨｂＡ１ｃより強くカラムに保持されたものである。
しかしながら、従来の陽イオン交換ＬＣを用いた方法では、安定型ＨｂＡ１ｃから不安定型ＨｂＡ１ｃを充分に分離することができないばかりでなく、アセチル化ヘモグロビン（以下、ＡＨｂともいう）やカルバミル化ヘモグロビン（以下、ＣＨｂともいう）等の「修飾ヘモグロビン」が安定型ＨｂＡ１ｃと重なって溶離してくるという問題があった。
即ち、陽イオン交換ＬＣによる安定型ＨｂＡ１ｃ値（％）の測定を目的として、血液検体のヘモグロビン類を測定する際、安定型ＨｂＡ１ｃの測定値に影響を与えないように、安定型ＨｂＡ１ｃと溶出挙動が近似している不安定型ＨｂＡ１ｃやＡＨｂ及びＣＨｂピークを、安定型ＨｂＡ１ｃピークから分離することが困難であった。
即ち、陽イオン交換ＬＣによる安定型ＨｂＡ１ｃ値（％）の測定を目的として、血液検体のヘモグロビン類を測定する際、安定型ＨｂＡ１ｃの測定値に影響を与えないように、安定型ＨｂＡ１ｃと溶出挙動が近似している不安定型ＨｂＡ１ｃやＡＨｂ及びＣＨｂピークを、安定型ＨｂＡ１ｃピークから分離することが困難であった。
これに対して、近年、ＣＨｂ、ＡＨｂ等の修飾Ｈｂの分離性能を向上させ、安定型Ａ１ｃを測定できる技術が開発されており、例えば、特許文献２には、陽イオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法であって、カオトロピックイオンを含有し、かつ、ｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び／又はこれらの塩を含む溶離液を用いることで安定型Ａ１ｃを分離する方法が開示されている。
しかしながら、このような方法では、高度に修飾されたアセチル化Ｈｂ、カルバミル化Ｈｂを充分に分離できないという欠点があった。
しかしながら、このような方法では、高度に修飾されたアセチル化Ｈｂ、カルバミル化Ｈｂを充分に分離できないという欠点があった。
また、特許文献３には、液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定において、尿素、界面活性剤等を含有する溶離液を用い、充填剤の平均粒子径、カラムサイズ、移動相の流速等を規定することにより、従来の方法と比較して、より安定型Ａ１ｃ分離性能を向上させる技術が開示されている。また、特許文献４には、陽イオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法において、カオトロピックイオンに加えて、尿素等を含有し、かつ、ｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ無機酸、有機酸及び／又はこれらの塩を含有する溶離液を用い、更に、ヘモグロビン類の分離に用いる３種類の溶離液のｐＨ・塩濃度を規定することで、より安定型Ａ１ｃ分離性能を向上させる技術が開示されている。
しかしながら、特許文献３及び４に記載されている方法では、高度に修飾されたアセチル化Ｈｂ、カルバミル化Ｈｂの分離性能は格段に向上するが、溶離液の安定性が著しく低下するという欠点があった。従って、安定型Ａ１ｃの分離性能が高く、安定型Ａ１ｃを高精度で測定することができ、かつ、測定の際に用いる溶離液の保存安定性が良好なヘモグロビン類の測定方法が求められていた。
特公平８−７１９８号公報
特開２０００−１１１５３９号公報
特開２０００−１７１４５４号公報
特開２００３−１０７０６９号公報
本発明は、上記現状に鑑み、陽イオン交換液体クロマトグラフィーを用いたヘモグロビン類の測定方法であって、特に安定型ヘモグロビンＡ１ｃを高精度で測定することが可能なヘモグロビン類の測定方法を提供することを目的とする。
本発明は、陽イオン交換液体クロマトグラフィーを用いたヘモグロビン類の測定方法であって、チオ尿素化合物の含有量が１〜３０００ｍＭであり、ｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を有する無機酸、有機酸及び／又はこれらの塩を含有する溶離液を用いるヘモグロビン類の測定方法である。
以下に本発明を詳述する。
以下に本発明を詳述する。
本発明のヘモグロビン類の測定方法では、溶離液として、チオ尿素化合物の含有量が１〜３０００ｍＭであり、ｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を有する無機酸、有機酸及び／又はこれらの塩を含有するものを用いる。
上記チオ尿素化合物とは、チオ尿素のほか、公知のチオ尿素構造類似体を含むものである。上記チオ尿素化合物としては、例えば、チオ尿素、Ｎ−メチルチオ尿素、Ｎ、Ｎ’−ジメチルチオ尿素、トリメチルチオ尿素、１，１，３，３−テトラメチル−２−チオ尿素、１，３−ジエチルチオ尿素、１−エチル−２−チオ尿素、１−アリル−３−（２−ヒドロキシエチル）−２−チオ尿素、アリルチオ尿素等が挙げられる。
上記溶離液中のチオ尿素化合物の含有量の下限は１ｍＭ、上限は３０００ｍＭである。１ｍＭ未満であると、修飾Ｈｂの分離性能が低下する。また、３０００ｍＭを超えると、ヘモグロビンが変性して正しいＡ１ｃ値が得られない。好ましい下限は５ｍＭ、好ましい上限は１０００ｍＭであり、より好ましい下限は１０ｍＭ、より好ましい上限は５００ｍＭである。
なお、上記チオ尿素化合物は、完全に溶離液に溶解する濃度で添加することが好ましい。
このため、上記チオ尿素化合物の溶解性を高めることを目的として、溶離液にメタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン等の水溶性有機溶媒を混合してもよい。
なお、上記チオ尿素化合物は、完全に溶離液に溶解する濃度で添加することが好ましい。
このため、上記チオ尿素化合物の溶解性を高めることを目的として、溶離液にメタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン等の水溶性有機溶媒を混合してもよい。
上記溶離液は、ｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を有する無機酸、有機酸又はこれらの塩を含有する。
上記無機酸としては、例えば、炭酸、リン酸等が挙げられる。上記有機酸としては、例えば、カルボン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン酸、アミノ酸、カコジル酸、ピロリン酸等が挙げられる。
上記無機酸としては、例えば、炭酸、リン酸等が挙げられる。上記有機酸としては、例えば、カルボン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン酸、アミノ酸、カコジル酸、ピロリン酸等が挙げられる。
上記カルボン酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸等が挙げられる。上記ジカルボン酸としては、例えば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸等が挙げられる。上記カルボン酸誘導体としては、例えば、β、β−ジメチルグルタル酸、バルビツール酸、アミノ酪酸等が挙げられる。上記ヒドロキシカルボン酸としては、例えば、クエン酸、酒石酸、乳酸等が挙げられる。上記アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、アスパラギン等が挙げられる。
上記無機酸、有機酸の塩としては、公知のものを用いることができ、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。
なお、上記無機酸、有機酸又はこれらの塩は、複数種混合して用いてもよく、無機酸と有機酸を混合して用いてもよい。
なお、上記無機酸、有機酸又はこれらの塩は、複数種混合して用いてもよく、無機酸と有機酸を混合して用いてもよい。
上記無機酸、有機酸及び／又はこれらの塩の溶離液中の含有量は、溶離液のｐＨを４．０〜６．８にする緩衝作用があれば特に限定されないが、好ましい下限が１ｍＭ、好ましい上限は１０００ｍＭである。また、より好ましい下限は１０ｍＭ、より好ましい上限は５００ｍＭである。
本発明において、上記無機酸、有機酸及び／又はこれらの塩は、溶離液のｐＨを４．０〜６．８にする緩衝能を有する。ｐＨが４未満であると、ヘモグロビン類が変性する可能性があり、ｐＨが６．８を超えると、ヘモグロビン類のプラス荷電が減少し、陽イオン交換基に保持されにくくなり、ヘモグロビン類の分離が悪くなる。好ましくは４．５〜５．８である。
上記溶離液は、Ａ１ｃピーク溶出を最適化することを目的として、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウム等の無機塩類を含有していてもよい。なお、これらの無機塩類の濃度は、特に限定されないが、好ましい下限が１ｍＭ、好ましい上限が１５００ｍＭである。
上記溶離液は、ｐＨ調節剤として、公知の酸、塩基を含有していてもよい。上記酸としては、例えば、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸等が挙げられ、上記塩基としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。これらの酸、塩基の含有量は、特に限定されないが、好ましい下限は０．００１ｍＭ、好ましい上限は５００ｍＭである。
上記溶離液は、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン等の水溶性有機溶媒を含有していてもよい。上記有機溶媒の濃度は、カオトロピックイオン、無機酸、有機酸、これらの塩等が析出しない程度で用いることが好ましく、好ましい上限は８０％（ｖ／ｖ）である。
また、上記溶離液は、アジ化ナトリウム、チモール等の防腐剤を含有していてもよく、ヘモグロビンの安定剤として、公知の安定剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤、グルタチオン、アジ化ナトリウム等の還元剤・酸化防止剤等を含有していてもよい。
本発明において用いる溶離液は、カオトロピックイオンを含有することが好ましい。上記カオトロピックイオンとは、化合物が水溶液に溶解したときに解離により生じたイオンであり、水の構造を破壊し、疎水性物質と水が接触したときに起こる水のエントロピー減少を抑制するものである。
上記カオトロピックイオンには、陰イオン及び陽イオンのカオトロピックイオンがあり、上記陰イオンのカオトロピックイオンとしては、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン、塩化物イオン、酢酸イオン等が挙げられ、陽イオンのカオトロピックイオンとしては、バリウムイオン、カルシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、グアニジンイオン等が挙げられる。
上記カオトロピックイオンの中でも、陰イオンのカオトロピックイオンとしては、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン等を用いることが好ましく、陽イオンのカオトロピックイオンとしては、バリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、グアニジンイオン等を用いることが好ましい。より好ましくは、チオシアン酸イオン、過塩素酸イオン、硝酸イオン、グアニジンイオン等が用いられる。
上記溶離液中のカオトロピックイオンの含有量の好ましい下限は０．１ｍＭ、好ましい上限は３０００ｍＭである。０．１ｍＭ未満であると、ヘモグロビン類の測定において、分離効果が低下するおそれがあり、３０００ｍＭを超えて添加しても、ヘモグロビン類の分離効果はそれ以上向上しない。より好ましい下限は１ｍＭ、より好ましい上限は１０００ｍＭであり、更に好ましい下限は１０ｍＭ、更に好ましい上限は５００ｍＭである。
本発明において、ヘモグロビン類の測定を行う場合は、ｐＨの異なる少なくとも２種類以上の溶離液を用いることが好ましい。その場合、測定目的のピークを分離するにあたって用いる溶離液は、同一の緩衝剤を含有するものを用いるのが好ましいが、溶離液を切り替える際の、検出器出力のベースライン変動が、測定値に悪影響を与えなければ、必ずしもこれに限定されない。なお、溶離液のｐＨは、例えば、ｐＨ調節剤の添加量によって調節することができる。
更に、ベースライン変動をより小さくするために、上記測定目的のピークを分離するにあたって用いる溶離液は、緩衝剤の濃度も同一であるものを用いるのがより好ましい。
更に、ベースライン変動をより小さくするために、上記測定目的のピークを分離するにあたって用いる溶離液は、緩衝剤の濃度も同一であるものを用いるのがより好ましい。
本発明において、上記溶離液を送液する方法としては特に限定されないが、ｐＨの異なる２種類以上の溶離液を用いる場合は、少なくとも溶出力の異なる３種の溶離液を用い、ＨｂＡ０を溶出するための溶離液を送液する前に、ＨｂＡ０より前に溶出されてくる各ヘモグロビン成分を分離することを目的として、該ＨｂＡ０を溶出するための溶離液以外の溶離液を送液する方法を行うことが好ましい。
なお、通常のヘモグロビン類の測定において、測定目的となるヘモグロビン類としては、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０等が挙げられるが、このうちＨｂＡ０より前に溶出されてくる各ヘモグロビン成分とは、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃのことをいう。
なお、通常のヘモグロビン類の測定において、測定目的となるヘモグロビン類としては、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０等が挙げられるが、このうちＨｂＡ０より前に溶出されてくる各ヘモグロビン成分とは、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃのことをいう。
上記方法において、ＨｂＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン類の溶出には、ｐＨ４．０〜６．８の溶離液を少なくとも２種類以上用いることが好ましい。４．０未満であると、ヘモグロビン類が変性する可能性があり、６．８を超えるとヘモグロビンのプラス電荷が減少し、陽イオン交換基に保持されにくくなり、分離能が低下するので４．０〜６．８が好ましく、４．５〜５．８がより好ましい。
また、塩濃度勾配法やｐＨ勾配法又はこの２つの組み合わせを行うことにより、安定型ＨｂＡ１ｃ等の測定対象ピークをシャープに溶出させることが可能になる。
また、塩濃度勾配法やｐＨ勾配法又はこの２つの組み合わせを行うことにより、安定型ＨｂＡ１ｃ等の測定対象ピークをシャープに溶出させることが可能になる。
また、安定型ＨｂＡ１ｃの測定に悪影響を与える可能性のあるＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等のヘモグロビン成分を含む血液検体を測定する場合は、ＨｂＡ０成分（ピーク）として主にＨｂＡを溶出させた後、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等を溶離させることが好ましい。これにより、ＨｂＡ０ピークからＨｂＡ以外のヘモグロビン成分を除けるため、より正確な安定型ＨｂＡ１ｃ（％）を算出できる。
なお、ＨｂＡ０を溶出するための溶離液を送液した後、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等を溶離するために使用する溶離液としては、より溶出力の強い溶離液を使用する必要がある。
なお、ＨｂＡ０を溶出するための溶離液を送液した後、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等を溶離するために使用する溶離液としては、より溶出力の強い溶離液を使用する必要がある。
また、本発明のヘモグロビン類の測定方法では、溶離液を勾配溶出法又は段階溶出法によって送液し、その途中において溶出力の低い溶離液を送液することが好ましい。
従来のヘモグロビン類の測定方法では、分離対象成分のピークをシャープにしたり、隣り合って溶出する２つ以上のピークの分離度を向上させたりするために、複数の溶離液を用いた勾配溶出法や段階溶出法が利用されていた。
上記勾配溶出法は「グラジエント溶出」と呼ばれる方法であり、例えば、複数台の送液ポンプを用い、溶出力が異なる複数の溶離液の送液比率を連続的に変化させることにより送液する方法である。これにより、図１に示すように、時間と共に溶出力が連続的に上昇するように溶出が行われる。
また、上記段階溶出法は「ステップワイズ溶出」と呼ばれる方法であり、例えば、１台の送液ポンプを、電磁弁等を介して複数の溶離液に連結し、電磁弁を切り替えることにより、溶出力の低い溶離液から、溶出力の高い溶離液に切り替えて送液する方法である。従って、図２に示すように、溶出力は段階的に上昇する。
しかしながら、従来の勾配溶出法や段階溶出法では、溶出される各成分の性質が類似していたり、短時間で溶出することが要求されている場合、類似した性質の成分間でピークが重なり、分離度が低下するおそれがあった。
これに対して、勾配溶出法又は段階溶出法によって溶離液を送液するに際し、その途中、即ち、勾配溶出法又は段階溶出法により複数の溶離液を順に切り替えて送液していく途中において、溶出力が低い溶離液を送液することにより、分離対象のピーク又はピーク間の分離状態を良くすることができる。具体的には、段階溶出法の場合、溶出力の弱い溶離液から溶出力の強い溶離液に切り替えて送液した後、溶出力の弱い溶離液に切り替え、しばらくしてから溶出力の強い溶離液に切り替えて送液する方法等が挙げられる。
なお、本発明において、溶離液の溶出力を低下させる方法としては、例えば、溶離液の塩濃度を下げる方法やｐＨを下げる方法、又はこの２つを組み合わせる方法が挙げられる。
上述のように勾配溶出法又は段階溶出法によって送液し、その途中において溶離液の溶出力を低下させる方法により、ヘモグロビン類を分離する方法について具体的に説明する。
ヘモグロビン類の分離には、陽イオン交換充填剤が充填されたカラムを用い、溶離液を塩濃度２０〜１０００ｍＭ、ｐＨ４〜９の範囲で勾配溶出法又は段階溶出法によって送液させ、その途中において溶離液の塩濃度を５〜５００ｍＭ、ｐＨを０．１〜３の範囲で下げることによって溶離液の溶出力を低下させて分離を行う。
本発明の方法を段階溶出法によって行う場合の、装置の構成例を図３に示した。溶離液Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄは、各々溶出力の異なる（例えば、塩濃度、ｐＨ、極性等において異なる）ものであり、電磁弁１によって設定時間に各溶離液に切り替えられるように構成されている。溶離液は、送液ポンプ２により、試料注入部３から導入された試料とともにカラム４に導かれ、各成分が検出器５により検出される。各ピークの面積、高さ等はインテグレータ６により算出される。
本発明では、ヘモグロビン類の測定において、陽イオン交換液体クロマトグラフィーを用いる。
上記陽イオン交換液体クロマトグラフィーの充填剤は、少なくとも１種以上のカチオン交換基を有している粒子よりなるものであり、例えば、高分子粒子にカチオン交換基を導入することにより得ることができる。
上記陽イオン交換液体クロマトグラフィーの充填剤は、少なくとも１種以上のカチオン交換基を有している粒子よりなるものであり、例えば、高分子粒子にカチオン交換基を導入することにより得ることができる。
上記カチオン交換基としては、公知のものを用いることができ、例えば、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基等のカチオン交換基等が挙げられる。なお、上記カチオン交換基は、複数種導入してもよい。
充填剤として用いる粒子の直径の好ましい下限は０．５μｍ、好ましい上限は２０μｍであり、より好ましい下限は１μｍ、より好ましい上限は１０μｍである。
また、上記粒子の粒度分布を示す変動係数値（ＣＶ値）の好ましい上限は４０％、より好ましい上限は３０％である。なお、粒子径の標準偏差÷平均直径×１００から求めることができる。
また、上記粒子の粒度分布を示す変動係数値（ＣＶ値）の好ましい上限は４０％、より好ましい上限は３０％である。なお、粒子径の標準偏差÷平均直径×１００から求めることができる。
上記高分子粒子としては、例えば、シリカ、ジルコニア等の無機系粒子；セルロース、ポリアミノ酸、キトサン等の天然高分子粒子；ポリスチレン、ポリアクリル酸エステル等の合成高分子粒子等が挙げられる。
上記高分子粒子において、導入されるカチオン交換基以外の構成成分は、より親水性であることが好ましい。また耐圧性・耐膨潤性の点から架橋度の高いものが好ましい。
上記高分子粒子において、導入されるカチオン交換基以外の構成成分は、より親水性であることが好ましい。また耐圧性・耐膨潤性の点から架橋度の高いものが好ましい。
上記高分子粒子へのカチオン交換基の導入は、公知の方法により行うことができるが、例えば、高分子粒子を調製後、粒子が有する官能基（水酸基、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基等）に、化学反応でカチオン交換基を粒子に導入させる方法により行うことができる。
また、カチオン交換基を有する単量体を重合して高分子粒子を調製する方法によってもカチオン交換基を有する充填剤粒子を調製することができる。例えば、カチオン交換基含有単量体と架橋性単量体等とを混合し、重合開始剤の存在下に重合する方法等が挙げられる。
更に、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル等の重合性カチオン交換基含有エステルを架橋性単量体等と混合し、重合開始剤存在下で重合した後、得られた粒子を加水分解処理し、エステルをカチオン交換基に変換させる方法により、カチオン交換基を有する充填剤粒子を調製してもよい。
また、特公平８−７１９７号公報に記載のように、架橋重合体粒子を調製した後、カチオン交換基を有する単量体を添加して、重合体粒子の表面付近に、該単量体を重合させる方法により、カチオン交換基を有する充填剤粒子を調製してもよい。
また、特公平８−７１９７号公報に記載のように、架橋重合体粒子を調製した後、カチオン交換基を有する単量体を添加して、重合体粒子の表面付近に、該単量体を重合させる方法により、カチオン交換基を有する充填剤粒子を調製してもよい。
本発明では、上記充填剤をカラムに充填して使用する。
上記カラムの材質としては特に限定されず、例えば、公知のステンレス製、ガラス製、樹脂製等が挙げられる。
上記カラムのサイズとしては、内径０．１〜５０ｍｍ、長さ１〜３００ｍｍのものが好ましく、内径０．２〜３０ｍｍ、長さ５〜２００ｍｍのものがより好ましい。
上記カラムの材質としては特に限定されず、例えば、公知のステンレス製、ガラス製、樹脂製等が挙げられる。
上記カラムのサイズとしては、内径０．１〜５０ｍｍ、長さ１〜３００ｍｍのものが好ましく、内径０．２〜３０ｍｍ、長さ５〜２００ｍｍのものがより好ましい。
上記充填剤のカラムへの充填方法としては、特に限定されず、公知の方法を使用できるが、特にスラリー充填法が好ましい。具体的には、例えば、充填剤粒子を溶離液等の緩衝液に分散させたスラリーを送液ポンプ等により、充填剤をカラムに圧入する方法等が挙げられる。
本発明に使用される陽イオン交換液体クロマトグラフィー装置としては、公知のものを使用することができ、例えば、送液ポンプ、試料注入装置（サンプラ）、カラム、検出器等から構成される。また、カラム恒温槽や溶離液の脱気装置等の他の付属装置が適宜付加されてもよい。
本発明の測定方法における、他の測定条件は、使用する測定試料、カラム等の種類によって適宜選択できるが、溶離液の流速は、好ましくは０．０５〜５ｍＬ／分、より好ましくは０．２〜３ｍＬ／分である。ヘモグロビン類の検出は、４１５ｎｍの可視光が好ましいが、特にこれのみに限定されるわけではない。測定試料は、通常、界面活性剤等溶血活性を有する物質を含む溶液により溶血された溶血液を希釈したものを用いる。試料注入量は、血液検体の希釈倍率により異なるが、好ましくは０．１〜１００μＬ程度である。
本発明の別の態様は、陽イオン交換液体クロマトグラフィーを用いたヘモグロビン類の測定方法であって、チオ尿素化合物と、酸解離定数（ｐｋａ）が、２．１５〜６．３９及び６．４０〜１０．５０の範囲内である緩衝剤とを含有する溶離液を用いるヘモグロビン類の測定方法である。
別の態様の本発明では、上記溶離液は、酸解離定数（ｐＫａ）が、２．１５〜６．３９及び６．４０〜１０．５０の範囲内である緩衝剤を含有する。
上記ｐＫａが上記範囲外であると、溶離液のｐＨを、測定目的のピークを分離するのに適切な範囲とすることができず、結果として、ヘモグロビン類が変性したり、ヘモグロビン類の分離が困難となったりすることがある。
なお、上記緩衝剤としては、ｐＫａを２．１５〜６．３９及び６．４０〜１０．５０の範囲に少なくとも１つずつもつ単一の物質を用いてもよく、２．１５〜６．３９の範囲内に少なくとも１つのｐＫａをもつ物質と６．４０〜１０．５０の範囲内に少なくとも１つのｐＫａをもつ物質とを組み合わせて緩衝剤として用いてもよい。また、上記緩衝剤を複数組み合わせて用いてもよい。
上記ｐＫａが上記範囲外であると、溶離液のｐＨを、測定目的のピークを分離するのに適切な範囲とすることができず、結果として、ヘモグロビン類が変性したり、ヘモグロビン類の分離が困難となったりすることがある。
なお、上記緩衝剤としては、ｐＫａを２．１５〜６．３９及び６．４０〜１０．５０の範囲に少なくとも１つずつもつ単一の物質を用いてもよく、２．１５〜６．３９の範囲内に少なくとも１つのｐＫａをもつ物質と６．４０〜１０．５０の範囲内に少なくとも１つのｐＫａをもつ物質とを組み合わせて緩衝剤として用いてもよい。また、上記緩衝剤を複数組み合わせて用いてもよい。
上記緩衝剤のｐＫａの範囲は、測定目的のピークを分離するのに適切な溶離液のｐＨ付近において、より優れた緩衝能を発揮できるように、２．６１〜６．３９及び６．４０〜１０．５０の範囲内であることが好ましく、より好ましくは、２．８０〜６．３５及び６．８０〜１０．００の範囲内である。更に好ましくは、３．５０〜６．２５及び７．００〜９．５０の範囲内である。
上記緩衝剤としては、例えば、リン酸、ホウ酸、炭酸等の無機物のほか、カルボン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン酸、アニリン又はアニリン誘導体、アミノ酸、アミン類、イミダゾール類、アルコール類等の有機物が挙げられる。また、エチレンジアミン四酢酸、ピロリン酸、ピリジン、カコジル酸、グリセロールリン酸、２，４，６−コリジン、Ｎ−エチルモルホリン、モルホリン、４−アミノピリジン、アンモニア、エフェドリン、ヒドロキシプロリン、ペリジン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、グリシルグリシン等の有機物でもよい。
上記カルボン酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、安息香酸等が挙げられる。
上記ジカルボン酸としては、例えば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイン酸、フタル酸、フマル酸等が挙げられる。
上記ジカルボン酸としては、例えば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイン酸、フタル酸、フマル酸等が挙げられる。
上記カルボン酸誘導体としては、例えば、β，β’−ジメチルグルタル酸、バルビツール酸、５，５−ジエチルバルビツール酸、γ−アミノ酪酸、ピルビン酸、フランカルボン酸、ε−アミノカプロン酸等が挙げられる。
上記ヒドロキシカルボン酸としては、例えば、酒石酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸等が挙げられる。上記アニリン又はアニリン誘導体としては、例えば、アニリン、ジメチルアニリン等が挙げられる。上記アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシン、α−アラニン、β−アラニン、ヒスチジン、セリン、ロイシン等が挙げられる。
上記アミン類としては、例えば、エチレンジアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジエタノールアミン等が挙げられる。上記イミダゾール類としては、例えば、イミダゾール、５（４）−ヒドロキシイミダゾール、５（４）−メチルイミダゾール、２，５（４）−ジメチルイミダゾール等が挙げられる。
上記アルコール類としては、例えば、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−エチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール等が挙げられる。
また、上記緩衝剤としては、２−（Ｎ−モリホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス−（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミドジ酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ）プロパン（Ｂｉｓｔｒｉｓｐｒｏｐａｎｅ）、Ｎ−（アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−（Ｎ−モルフォリン）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン（Ｔｒｉｓ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、グリシルグリシン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、グリシン、シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等の一般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれるものを組成する物質も使用できる。これらの物質のｐＫａを表１、２に示す。
上記溶離液中の緩衝剤の含有量は、緩衝作用がある範囲であればよく、好ましい下限は１ｍＭ、好ましい上限は１０００ｍＭである。より好ましい下限は１０ｍＭ、より好ましい上限は５００ｍＭである。また、上記緩衝剤は、単独でも複数混合して用いてもよく、例えば、有機物と無機物を混合して用いてもよい。
なお、別の態様の本発明において用いられるチオ尿素化合物、陽イオン交換液体クロマトグラフィー等については、本発明のヘモグロビン類の測定方法において用いられるものと同様であるため、本明細書ではその詳しい説明を省略する。
本発明によれば、陽イオン交換液体クロマトグラフィーを用いたヘモグロビン類の測定の際に用いる溶離液に、チオ尿素化合物を添加することにより、溶離液の保存安定性に優れるとともに、安定型ヘモグロビンＡ１ｃを高精度で測定することが可能なヘモグロビン類の測定方法を提供することができる。
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
（実施例１）
（１）充填剤の調製
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４００ｇ及び２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸１５０ｇの混合物に過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）１．５ｇを溶解した。これを４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍＬに分散させ、撹拌しながら窒素雰囲気下で７５℃に昇温し、８時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒子径６μｍの粒子を得た。
（１）充填剤の調製
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４００ｇ及び２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸１５０ｇの混合物に過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）１．５ｇを溶解した。これを４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍＬに分散させ、撹拌しながら窒素雰囲気下で７５℃に昇温し、８時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒子径６μｍの粒子を得た。
（２）充填剤のカラムへの充填
得られた粒子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）３０ｍＬに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製の空カラム（内径４．６×３０ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。次いで、パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ２で定圧充填した。
得られた粒子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）３０ｍＬに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製の空カラム（内径４．６×３０ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。次いで、パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ２で定圧充填した。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
ＮａＣｌを５０ｍＭ、チオ尿素を２５０ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．４）を調製し、溶離液Ａとした。また、ＮａＣｌを２００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．４）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
ＮａＣｌを５０ｍＭ、チオ尿素を２５０ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．４）を調製し、溶離液Ａとした。また、ＮａＣｌを２００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．４）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
（４）測定試料の調製
健常人血をフッ化ナトリウム採血した全血検体から以下の試料を調製した。なお、溶血試薬として、０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）（東京化成社製）を含有するリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０）を用いた。
（ａ）糖負荷血：全血検体に２０００ｍｇ／ｄＬのグルコース水溶液を添加し、３７℃で３時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、２００倍に希釈して試料ａとした。
（ｂ）ＡＨｂ含有試料：全血検体１５ｍＬに、０．７５ｇ／ｄｌのアセトアルデヒドの生理食塩水溶液１ｍＬを添加し、３７℃で２時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、２００倍に希釈して試料ｂとした。
（ｃ）ＣＨｂ含有試料：全血検体１５ｍＬに、０．７５ｇ／ｄｌのシアン酸ナトリウムの生理食塩水溶液１ｍＬを添加し、３７℃で２時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、２００倍に希釈して試料ｃとした。
健常人血をフッ化ナトリウム採血した全血検体から以下の試料を調製した。なお、溶血試薬として、０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）（東京化成社製）を含有するリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０）を用いた。
（ａ）糖負荷血：全血検体に２０００ｍｇ／ｄＬのグルコース水溶液を添加し、３７℃で３時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、２００倍に希釈して試料ａとした。
（ｂ）ＡＨｂ含有試料：全血検体１５ｍＬに、０．７５ｇ／ｄｌのアセトアルデヒドの生理食塩水溶液１ｍＬを添加し、３７℃で２時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、２００倍に希釈して試料ｂとした。
（ｃ）ＣＨｂ含有試料：全血検体１５ｍＬに、０．７５ｇ／ｄｌのシアン酸ナトリウムの生理食塩水溶液１ｍＬを添加し、３７℃で２時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、２００倍に希釈して試料ｃとした。
（実施例２）
実施例１の（３）において、以下の操作を行った以外は、実施例１と同様にして、充填剤の調製、カラムへの充填、溶離液及び測定試料の調製を行った。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
ＮａＣｌを５０ｍＭ、チオ尿素を２５０ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸−１０ｍＭコハク酸緩衝液（ｐＨ５．４）を調製し、溶離液Ａとした。また、ＮａＣｌを２００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸−１０ｍＭコハク酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
実施例１の（３）において、以下の操作を行った以外は、実施例１と同様にして、充填剤の調製、カラムへの充填、溶離液及び測定試料の調製を行った。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
ＮａＣｌを５０ｍＭ、チオ尿素を２５０ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸−１０ｍＭコハク酸緩衝液（ｐＨ５．４）を調製し、溶離液Ａとした。また、ＮａＣｌを２００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸−１０ｍＭコハク酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
（比較例１）
実施例１の（３）において、以下の操作を行った以外は、実施例１と同様にして充填剤の調製、カラムへの充填、溶離液及び測定試料の調製を行った。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
ＮａＣｌを５０ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．４）を調製し、溶離液Ａとした。また、ＮａＣｌを２００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
実施例１の（３）において、以下の操作を行った以外は、実施例１と同様にして充填剤の調製、カラムへの充填、溶離液及び測定試料の調製を行った。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
ＮａＣｌを５０ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．４）を調製し、溶離液Ａとした。また、ＮａＣｌを２００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
（評価）
（１）ヘモグロビン類の測定
実施例１〜２、比較例１で得られたカラム、溶離液及び測定試料を用いて、以下の条件でヘモグロビン類の測定を行った。なお、溶離液は、測定開始より０〜２分の間は溶離液Ａを送液し、２〜２．２分の間は溶離液Ｂを送液し、２．２〜３分の間は溶離液Ａを送液した。
システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学工業社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
測定条件：流速：２．０ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μＬ
（１）ヘモグロビン類の測定
実施例１〜２、比較例１で得られたカラム、溶離液及び測定試料を用いて、以下の条件でヘモグロビン類の測定を行った。なお、溶離液は、測定開始より０〜２分の間は溶離液Ａを送液し、２〜２．２分の間は溶離液Ｂを送液し、２．２〜３分の間は溶離液Ａを送液した。
システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学工業社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
測定条件：流速：２．０ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μＬ
（測定結果）
実施例１で得られたカラム、溶離液及び測定試料を用いて、ヘモグロビン類を測定することにより、得られたクロマトグラムを図４〜６に示す。図４は試料ａ、図５は試料ｂ、図６は試料ｃを測定した結果である。また、ピーク１はＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ、ピーク２はＨｂＦ、ピーク３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５はＨｂＡ０、ピーク６はＡＨｂ、ピーク７はＣＨｂを示す。
図４では、ピーク３及び４が良好に分離されている。また、図５ではピーク６（ＡＨｂ）が、図６ではピーク７（ＣＨｂ）がピーク４から良好に分離されている。
また、実施例２で得られたカラム、溶離液及び測定試料を用いて、ヘモグロビン類を測定した場合も図４〜６と同様の結果であった。
従って、実施例１〜２では、良好にＣＨｂピーク及びＡＨｂピークをＡ１ｃピークから分離できることがわかる。
実施例１で得られたカラム、溶離液及び測定試料を用いて、ヘモグロビン類を測定することにより、得られたクロマトグラムを図４〜６に示す。図４は試料ａ、図５は試料ｂ、図６は試料ｃを測定した結果である。また、ピーク１はＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ、ピーク２はＨｂＦ、ピーク３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５はＨｂＡ０、ピーク６はＡＨｂ、ピーク７はＣＨｂを示す。
図４では、ピーク３及び４が良好に分離されている。また、図５ではピーク６（ＡＨｂ）が、図６ではピーク７（ＣＨｂ）がピーク４から良好に分離されている。
また、実施例２で得られたカラム、溶離液及び測定試料を用いて、ヘモグロビン類を測定した場合も図４〜６と同様の結果であった。
従って、実施例１〜２では、良好にＣＨｂピーク及びＡＨｂピークをＡ１ｃピークから分離できることがわかる。
これに対して、比較例１で得られたカラム、溶離液及び測定試料を用いて、ヘモグロビン類を測定することにより、得られたクロマトグラムを図７〜９に示す。図７は試料ａ、図８は試料ｂ、図９は試料ｃを測定した結果である。図７では、ピーク３及び４が良好に分離された。また、図８ではピーク６（ＡＨｂ）が、図９ではピーク７（ＣＨｂ）がピーク４から分離されていなかった。従って、チオ尿素を添加しない従来の方法では、糖負荷血検体では、良好な分離性能が得られたが、ＣＨｂピーク及びＡＨｂピークをＡ１ｃピークから良好に分離することが出来なかった。
（実施例３）
（１）充填剤の調製
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４００ｇ及び２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸１５０ｇの混合物に過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）１．５ｇを溶解した。これを４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍＬに分散させ、撹拌しながら窒素雰囲気下で７５℃に昇温し、８時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径６μｍの粒子を得た。
（１）充填剤の調製
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４００ｇ及び２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸１５０ｇの混合物に過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）１．５ｇを溶解した。これを４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍＬに分散させ、撹拌しながら窒素雰囲気下で７５℃に昇温し、８時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径６μｍの粒子を得た。
（２）充填剤のカラムへの充填
得られた粒子をカラムに以下のようにして充填した。粒子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）３０ｍＬに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製の空カラム（内径４．６×３０ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ２で定圧充填した。
得られた粒子をカラムに以下のようにして充填した。粒子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）３０ｍＬに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製の空カラム（内径４．６×３０ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ２で定圧充填した。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
過塩素酸Ｎａを５０ｍＭ、チオ尿素を２５０ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ａとした。また、過塩素酸Ｎａを２００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
過塩素酸Ｎａを５０ｍＭ、チオ尿素を２５０ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ａとした。また、過塩素酸Ｎａを２００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
（４）測定試料の調製
健常人血をフッ化ナトリウム採血した全血検体から以下の試料を調製した。なお、溶血試薬として、０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）（東京化成社製）を含有するリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０）を用いた。
（ａ）糖負荷血：全血検体に２０００ｍｇ／ｄＬのグルコース水溶液を添加し、３７℃で３時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、１００倍に希釈して試料ａとした。
（ｂ）ＡＨｂ含有試料：全血検体１５ｍＬに、０．７５ｇ／ｄｌのアセトアルデヒドの生理食塩水溶液１ｍＬを添加し、３７℃で２時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、１００倍に希釈して試料ｂとした。
（ｃ）ＣＨｂ含有試料：全血検体１５ｍＬに、０．７５ｇ／ｄｌのシアン酸ナトリウムの生理食塩水溶液１ｍＬを添加し、３７℃で２時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、１００倍に希釈して試料ｃとした。
健常人血をフッ化ナトリウム採血した全血検体から以下の試料を調製した。なお、溶血試薬として、０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）（東京化成社製）を含有するリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０）を用いた。
（ａ）糖負荷血：全血検体に２０００ｍｇ／ｄＬのグルコース水溶液を添加し、３７℃で３時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、１００倍に希釈して試料ａとした。
（ｂ）ＡＨｂ含有試料：全血検体１５ｍＬに、０．７５ｇ／ｄｌのアセトアルデヒドの生理食塩水溶液１ｍＬを添加し、３７℃で２時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、１００倍に希釈して試料ｂとした。
（ｃ）ＣＨｂ含有試料：全血検体１５ｍＬに、０．７５ｇ／ｄｌのシアン酸ナトリウムの生理食塩水溶液１ｍＬを添加し、３７℃で２時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、１００倍に希釈して試料ｃとした。
（実施例４）
実施例３の（３）において、以下の操作を行った以外は、実施例３と同様にして、充填剤の調製、カラムへの充填、溶離液及び測定試料の調製を行った。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
過塩素酸Ｎａを５０ｍＭ、Ｎ，Ｎ’−ジメチルチオ尿素を１５０ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ａとした。また、過塩素酸Ｎａを２００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
実施例３の（３）において、以下の操作を行った以外は、実施例３と同様にして、充填剤の調製、カラムへの充填、溶離液及び測定試料の調製を行った。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
過塩素酸Ｎａを５０ｍＭ、Ｎ，Ｎ’−ジメチルチオ尿素を１５０ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ａとした。また、過塩素酸Ｎａを２００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
（実施例５）
実施例３の（３）において、以下の操作を行った以外は、実施例３と同様にして、充填剤の調製、カラムへの充填、溶離液及び測定試料の調製を行った。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
過塩素酸Ｎａを５０ｍＭ、Ｎ−メチルチオ尿素を５０ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ａとした。また、過塩素酸Ｎａを２００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
実施例３の（３）において、以下の操作を行った以外は、実施例３と同様にして、充填剤の調製、カラムへの充填、溶離液及び測定試料の調製を行った。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
過塩素酸Ｎａを５０ｍＭ、Ｎ−メチルチオ尿素を５０ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ａとした。また、過塩素酸Ｎａを２００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
（実施例６）
実施例３の（３）において、以下の操作を行った以外は、実施例３と同様にして、充填剤の調製、カラムへの充填、溶離液及び測定試料の調製を行った。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
過塩素酸Ｎａを５０ｍＭ、１，３−ジエチルチオ尿素を１５０ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ａとした。また、過塩素酸Ｎａを２００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
実施例３の（３）において、以下の操作を行った以外は、実施例３と同様にして、充填剤の調製、カラムへの充填、溶離液及び測定試料の調製を行った。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
過塩素酸Ｎａを５０ｍＭ、１，３−ジエチルチオ尿素を１５０ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ａとした。また、過塩素酸Ｎａを２００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
（実施例７）
実施例３の（３）において、以下の操作を行った以外は、実施例３と同様にして、充填剤の調製、カラムへの充填、溶離液及び測定試料の調製を行った。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
過塩素酸Ｎａを５０ｍＭ、アリルチオ尿素を１５０ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ａとした。また、過塩素酸Ｎａを２００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
実施例３の（３）において、以下の操作を行った以外は、実施例３と同様にして、充填剤の調製、カラムへの充填、溶離液及び測定試料の調製を行った。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
過塩素酸Ｎａを５０ｍＭ、アリルチオ尿素を１５０ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ａとした。また、過塩素酸Ｎａを２００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
（実施例８）
実施例３の（３）において、以下の操作を行った以外は、実施例３と同様にして、充填剤の調製、カラムへの充填、溶離液及び測定試料の調製を行った。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
過塩素酸Ｎａを５０ｍＭ、トリメチルチオ尿素を１００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ａとした。また、過塩素酸Ｎａを５００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
実施例３の（３）において、以下の操作を行った以外は、実施例３と同様にして、充填剤の調製、カラムへの充填、溶離液及び測定試料の調製を行った。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
過塩素酸Ｎａを５０ｍＭ、トリメチルチオ尿素を１００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ａとした。また、過塩素酸Ｎａを５００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
（実施例９）
実施例３の（３）において、以下の操作を行った以外は、実施例３と同様にして、充填剤の調製、カラムへの充填、溶離液及び測定試料の調製を行った。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
過塩素酸Ｎａを５０ｍＭ、１−アリル−３−（２−ヒドロキシエチル）−２−チオ尿素を１００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ａとした。また、過塩素酸Ｎａを２００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
実施例３の（３）において、以下の操作を行った以外は、実施例３と同様にして、充填剤の調製、カラムへの充填、溶離液及び測定試料の調製を行った。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
過塩素酸Ｎａを５０ｍＭ、１−アリル−３−（２−ヒドロキシエチル）−２−チオ尿素を１００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ａとした。また、過塩素酸Ｎａを２００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
（実施例１０）
実施例３の（３）において、以下の操作を行った以外は、実施例３と同様にして、充填剤の調製、カラムへの充填、溶離液及び測定試料の調製を行った。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
過塩素酸Ｎａを５０ｍＭ、コハク酸を１０ｍＭ、１，１，３，３−テトラメチル−２−チオ尿素を１００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ａとした。また、過塩素酸Ｎａを２００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
実施例３の（３）において、以下の操作を行った以外は、実施例３と同様にして、充填剤の調製、カラムへの充填、溶離液及び測定試料の調製を行った。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
過塩素酸Ｎａを５０ｍＭ、コハク酸を１０ｍＭ、１，１，３，３−テトラメチル−２−チオ尿素を１００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ａとした。また、過塩素酸Ｎａを２００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
（実施例１１）
実施例３の（３）において、以下の操作を行った以外は、実施例３と同様にして、充填剤の調製、カラムへの充填、溶離液及び測定試料の調製を行った。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
過塩素酸Ｎａを５０ｍＭ、コハク酸を１０ｍＭ、１−エチル−２−チオ尿素を５０ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ａとした。また、過塩素酸Ｎａを２００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
実施例３の（３）において、以下の操作を行った以外は、実施例３と同様にして、充填剤の調製、カラムへの充填、溶離液及び測定試料の調製を行った。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
過塩素酸Ｎａを５０ｍＭ、コハク酸を１０ｍＭ、１−エチル−２−チオ尿素を５０ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ａとした。また、過塩素酸Ｎａを２００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
（比較例２）
実施例３の（３）において、以下の操作を行った以外は、実施例３と同様にして、充填剤の調製、カラムへの充填、溶離液及び測定試料の調製を行った。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
コハク酸を２０ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ａとした。また、過塩素酸Ｎａを４００ｍＭ含有する２０ｍＭコハク酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
実施例３の（３）において、以下の操作を行った以外は、実施例３と同様にして、充填剤の調製、カラムへの充填、溶離液及び測定試料の調製を行った。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
コハク酸を２０ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ａとした。また、過塩素酸Ｎａを４００ｍＭ含有する２０ｍＭコハク酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
（比較例３）
実施例３の（３）において、以下の操作を行った以外は、実施例３と同様にして、充填剤の調製、カラムへの充填、溶離液及び測定試料の調製を行った。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
過塩素酸Ｎａを５０ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ａとした。また、過塩素酸Ｎａを２００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
実施例３の（３）において、以下の操作を行った以外は、実施例３と同様にして、充填剤の調製、カラムへの充填、溶離液及び測定試料の調製を行った。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
過塩素酸Ｎａを５０ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ａとした。また、過塩素酸Ｎａを２００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
（比較例４）
実施例３の（３）において、以下の操作を行った以外は、実施例３と同様にして、充填剤の調製、カラムへの充填、溶離液及び測定試料の調製を行った。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
過塩素酸Ｎａを５０ｍＭ、チオ尿素を０．５ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ａとした。また、過塩素酸Ｎａを２００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
実施例３の（３）において、以下の操作を行った以外は、実施例３と同様にして、充填剤の調製、カラムへの充填、溶離液及び測定試料の調製を行った。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
過塩素酸Ｎａを５０ｍＭ、チオ尿素を０．５ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ａとした。また、過塩素酸Ｎａを２００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
（比較例５）
実施例３の（３）において、以下の操作を行った以外は、実施例３と同様にして、充填剤の調製、カラムへの充填、溶離液及び測定試料の調製を行った。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
過塩素酸Ｎａを５０ｍＭ、チオ尿素を４０００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ａとした。また、過塩素酸Ｎａを２００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
実施例３の（３）において、以下の操作を行った以外は、実施例３と同様にして、充填剤の調製、カラムへの充填、溶離液及び測定試料の調製を行った。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
過塩素酸Ｎａを５０ｍＭ、チオ尿素を４０００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ａとした。また、過塩素酸Ｎａを２００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
（評価）
（２）ヘモグロビン類の測定
実施例３〜１１、比較例２〜５で得られたカラム、溶離液及び測定試料を用いて、以下の条件でヘモグロビン類の測定を行った。なお、溶離液は、測定開始より０〜１．５分の間は溶離液Ａを送液し、１．５〜１．７分の間は溶離液Ｂを送液し、１．７〜２．２分の間は溶離液Ａを送液した。
システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学工業社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
測定条件：流速：２．０ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μＬ
（２）ヘモグロビン類の測定
実施例３〜１１、比較例２〜５で得られたカラム、溶離液及び測定試料を用いて、以下の条件でヘモグロビン類の測定を行った。なお、溶離液は、測定開始より０〜１．５分の間は溶離液Ａを送液し、１．５〜１．７分の間は溶離液Ｂを送液し、１．７〜２．２分の間は溶離液Ａを送液した。
システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学工業社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
測定条件：流速：２．０ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μＬ
（測定結果）
実施例３で得られたカラム、溶離液及び測定試料を用いて、ヘモグロビン類を測定することにより、得られたクロマトグラムを図１０〜１２に示す。図１０は試料ａ、図１１は試料ｂ、図１２は試料ｃを測定した結果である。ピーク１はＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ、ピーク２はＨｂＦ、ピーク３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５はＨｂＡ０、ピーク６はＡＨｂ、ピーク７はＣＨｂを示す。
図１０では、ピーク３及び４が良好に分離されている。また、図１１ではピーク６（ＡＨｂ）、図１２ではピーク７（ＣＨｂ）がピーク４から良好に分離されている。
また、実施例３〜１１で得られたカラム、溶離液及び測定試料を用いて、ヘモグロビン類を測定した場合も図１０〜１２と同様の結果であった。
実施例３で得られたカラム、溶離液及び測定試料を用いて、ヘモグロビン類を測定することにより、得られたクロマトグラムを図１０〜１２に示す。図１０は試料ａ、図１１は試料ｂ、図１２は試料ｃを測定した結果である。ピーク１はＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ、ピーク２はＨｂＦ、ピーク３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５はＨｂＡ０、ピーク６はＡＨｂ、ピーク７はＣＨｂを示す。
図１０では、ピーク３及び４が良好に分離されている。また、図１１ではピーク６（ＡＨｂ）、図１２ではピーク７（ＣＨｂ）がピーク４から良好に分離されている。
また、実施例３〜１１で得られたカラム、溶離液及び測定試料を用いて、ヘモグロビン類を測定した場合も図１０〜１２と同様の結果であった。
これに対して、比較例２〜４で得られたカラム、溶離液及び測定試料を用いて、ヘモグロビン類を測定することにより、得られたクロマトグラムを図７〜９に示す。図７は試料ａ、図８は試料ｂ、図９は試料ｃを測定した結果である。図７では、ピーク３及び４が良好に分離された。また、図８ではピーク６（ＡＨｂ）が、図９ではピーク７（ＣＨｂ）がピーク４から分離されていなかった。従って、チオ尿素を添加しない従来の方法では、糖負荷血検体では、良好な分離性能が得られたが、ＣＨｂピーク及びＡＨｂピークをＡ１ｃピークから良好に分離することが出来なかった。また、比較例５では、修飾Ｈｂ分離性能は、実施例１〜２と同様であったが、高濃度のチオ尿素によりヘモグロビンが変性し、Ａ１ｃ値が低値化し、正確な値が得られなかった。
（評価）
（３）チオ尿素濃度と分離度との関係
実施例３で得られたカラム、溶離液及び測定試料を用いて、溶離液Ａのチオ尿素の濃度を変化させた場合について、（１）と同様のヘモグロビン類の測定を行い、ＣＨｂ分離性能を以下の基準で評価した。結果を表３に示す。
◎：ＣＨｂ分離性能が非常に優れる。
○：ＣＨｂ分離性能が優れる。
△：ＣＨｂ分離性能が劣る。
×：ＣＨｂ分離性能が非常に劣る。
（３）チオ尿素濃度と分離度との関係
実施例３で得られたカラム、溶離液及び測定試料を用いて、溶離液Ａのチオ尿素の濃度を変化させた場合について、（１）と同様のヘモグロビン類の測定を行い、ＣＨｂ分離性能を以下の基準で評価した。結果を表３に示す。
◎：ＣＨｂ分離性能が非常に優れる。
○：ＣＨｂ分離性能が優れる。
△：ＣＨｂ分離性能が劣る。
×：ＣＨｂ分離性能が非常に劣る。
（比較例６）
実施例３の（３）において、以下の操作を行った以外は、実施例３と同様にして、充填剤の調製、カラムへの充填、溶離液及び測定試料の調製を行った。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
過塩素酸Ｎａを５０ｍＭ、尿素を１５０ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ａとした。また、過塩素酸Ｎａを２００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
実施例３の（３）において、以下の操作を行った以外は、実施例３と同様にして、充填剤の調製、カラムへの充填、溶離液及び測定試料の調製を行った。
（３）溶離液Ａ、Ｂの調製
過塩素酸Ｎａを５０ｍＭ、尿素を１５０ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を調製し、溶離液Ａとした。また、過塩素酸Ｎａを２００ｍＭ含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製し、溶離液Ｂとした。なお、リン酸のｐＫａは表１に記載の通りとした。
（評価）
（４）溶離液の安定性評価
実施例３及び比較例６の溶離液を２つの４００ｍＬガラスバイアルに３８０ｍＬづつ分注し、１つを（Ａ）室温で２週間静置保存し、もう１つを（Ｂ）６０℃で２週間加温保存した。その後、各溶離液を室温に戻した後、評価（２）と同様の方法で、修飾Ｈｂ分離性能を評価した。
（４）溶離液の安定性評価
実施例３及び比較例６の溶離液を２つの４００ｍＬガラスバイアルに３８０ｍＬづつ分注し、１つを（Ａ）室温で２週間静置保存し、もう１つを（Ｂ）６０℃で２週間加温保存した。その後、各溶離液を室温に戻した後、評価（２）と同様の方法で、修飾Ｈｂ分離性能を評価した。
（評価結果）
その結果、実施例３で得られた溶離液を用いた場合は、（Ａ）室温で２週間静置保存した溶離液及び（Ｂ）６０℃で２週間加温保存した溶離液とも、図１０〜図１２と同様に、高度に修飾された修飾Ｈｂの分離性能は非常に良好であった。
これに対して、溶離液に尿素を添加した比較例６では、調製直後の修飾Ｈｂ分離性能は、実施例３と同様に良好であったが、（Ａ）室温で２週間静置保存した溶離液では、僅かにヘモグロビン類の分離は可能であったが、Ａ１ｃＲＴ（Ａ１ｃ保持時間）が調製直後より非常に早くなった。これは、尿素が酸性条件で分解したためと考えられた。
また、（Ｂ）６０℃で２週間加温保存した溶離液では、ヘモグロビン類の分離も全くできなかった。これは、尿素が酸性及び加温条件で分解したためと考えられた。
以上より、実施例３を得られた溶離液を用いることにより、高度に修飾された修飾Ｈｂでも、分離性能に優れ、安定型Ａ１ｃを高精度に分離測定でき、しかも、溶離液の保存安定性に優れたヘモグロビン類の測定方法を提供できることがわかる。
その結果、実施例３で得られた溶離液を用いた場合は、（Ａ）室温で２週間静置保存した溶離液及び（Ｂ）６０℃で２週間加温保存した溶離液とも、図１０〜図１２と同様に、高度に修飾された修飾Ｈｂの分離性能は非常に良好であった。
これに対して、溶離液に尿素を添加した比較例６では、調製直後の修飾Ｈｂ分離性能は、実施例３と同様に良好であったが、（Ａ）室温で２週間静置保存した溶離液では、僅かにヘモグロビン類の分離は可能であったが、Ａ１ｃＲＴ（Ａ１ｃ保持時間）が調製直後より非常に早くなった。これは、尿素が酸性条件で分解したためと考えられた。
また、（Ｂ）６０℃で２週間加温保存した溶離液では、ヘモグロビン類の分離も全くできなかった。これは、尿素が酸性及び加温条件で分解したためと考えられた。
以上より、実施例３を得られた溶離液を用いることにより、高度に修飾された修飾Ｈｂでも、分離性能に優れ、安定型Ａ１ｃを高精度に分離測定でき、しかも、溶離液の保存安定性に優れたヘモグロビン類の測定方法を提供できることがわかる。
本発明によれば、陽イオン交換液体クロマトグラフィーを用いたヘモグロビン類の測定方法に関し、特に安定型ヘモグロビンＡ１ｃを高精度で測定することが可能なヘモグロビン類の測定方法を提供することができる。
１ 電磁弁
２ 送液ポンプ
３ 試料注入部
４ カラム
５ 検出器
６ インテグレータ
２ 送液ポンプ
３ 試料注入部
４ カラム
５ 検出器
６ インテグレータ
Claims (3)
- 陽イオン交換液体クロマトグラフィーを用いたヘモグロビン類の測定方法であって、チオ尿素化合物の含有量が１〜３０００ｍＭであり、ｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を有する無機酸、有機酸及び／又はこれらの塩を含有する溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
- 陽イオン交換液体クロマトグラフィーを用いたヘモグロビン類の測定方法であって、チオ尿素化合物と、酸解離定数（ｐｋａ）が、２．１５〜６．３９及び６．４０〜１０．５０の範囲内である緩衝剤とを含有する溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
- 溶離液は、更にカオトロピックイオンを含有することを特徴とする請求項１又は２記載のヘモグロビン類の測定方法。
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