JP7355471B2 - ヘモグロビン分析方法 - Google Patents

Description

本発明は、ヘモグロビンの分析方法に関する。

ヘモグロビン（Ｈｂ）は、酸素と結合するヘム（色素部分）と、ヘムを抱えるグロビンからなる色素タンパク質であり、全身の細胞への酸素の運搬に関わる。正常ヒトグロビンのポリペプチドには、α、β、γ、δ鎖という４種類のサブユニットがあり、これらが２本のα鎖と２本の非α鎖からなるテトラマーを構成する。正常ヒトＨｂにはＨｂＡ（α２β２）、ＨｂＡ２（α２δ２）及びＨｂＦ（α２γ２）の３種類が存在するが、その大部分はＨｂＡである。ＨｂＡには主にＨｂＡ０と糖化したＨｂＡ１ｃが含まれ、ＨｂＡ１ｃは糖尿病などのマーカーとして使用される。

グロビンサブユニットの立体構造の異常は異常Ｈｂ症を、一方、グロビンサブユニットの形成不全はサラセミアを引き起こし、いずれも貧血や、さらに重症例では溶血、発育不全、骨変形などをもたらす。異常Ｈｂ症は、一般にＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＥ、ＨｂＤなどの異常Ｈｂを検出することで診断される。サラセミアは、α鎖の形成不全によるαサラセミアとβ鎖の形成不全によるβサラセミアに大別され、一般にＨｂＡ２、ＨｂＦなどの高値を指標に診断される。

高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いてヘモグロビンを検出する方法がある。特許文献１には、リン酸１水素・２アルカリ金属塩（成分１）及びリン酸２水素・１アルカリ金属塩（成分２）を異なる比率で含む複数の溶離液を順次送液するグラジエント溶出を用いたＨＰＬＣにより、異常ＨｂであるＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＥ及びＨｂＤや、サラセミアマーカーＨｂＡ２及びＨｂＦを分離可能であることが記載されている。特許文献２には、ｐＨ８．１以上、浸透圧４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の溶離液を用いたカチオン交換クロマトグラフィーにより、ＨｂＡ０に加えて、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＳ、ＨｂＣ等の異常Ｈｂ、サラセミアマーカーなどを分離できることが記載されている。

特開２０１６－２７３２６号公報 国際公開公報第２０１９／２０３３０２号

従来のＨＰＬＣを用いるヘモグロビン分析方法では、ヘモグロビンの分離が不十分になる場合があった。本発明は、血液試料から、異常ヘモグロビンを含む各種ヘモグロビンを簡便に分離及び検出することができるヘモグロビン分析方法を提供する。

本発明者らは、イオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビン分析方法に用いる溶離液について種々検討した結果、亜鉛イオンを含有する溶離液を用いることで、各種ヘモグロビンの保持時間を制御できることを見出した。

したがって、本発明は、以下を提供する。
〔１〕イオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビン分析方法であって、亜鉛イオンを含有する溶離液を用いてヘモグロビンを分離することを含む、分析方法。
〔２〕前記ヘモグロビンがヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣからなる群より選択される少なくとも１種である、〔１〕記載の分析方法。
〔３〕前記亜鉛イオンを含有する溶離液が塩化亜鉛、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛、酢酸亜鉛、炭酸亜鉛、及びグルコン酸亜鉛からなる群より選択される少なくとも１種を含有する溶離液である、〔１〕又は〔２〕記載の分析方法。
〔４〕前記溶離液中の前記亜鉛イオンの濃度が０μＭより高く４．６０μＭ以下である、〔１〕～〔３〕のいずれか１項記載の分析方法。
〔５〕前記クロマトグラフィーが高速液体クロマトグラフィーである、〔１〕～〔４〕のいずれか１項記載の分析方法。
〔６〕イオン交換クロマトグラフィーにおけるヘモグロビンの保持時間の制御方法であって、亜鉛イオンを含有する溶離液を用いてヘモグロビンを分離することを含む、制御方法。
〔７〕前記ヘモグロビンがヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣからなる群より選択される少なくとも１種である、〔６〕記載の制御方法。
〔８〕亜鉛イオンを含有する、イオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビン分離用溶離液。
〔９〕前記亜鉛イオンを含有する溶離液が塩化亜鉛、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛、酢酸亜鉛、炭酸亜鉛、及びグルコン酸亜鉛からなる群より選択される少なくとも１種を含有する溶離液である、〔８〕記載の溶離液。
〔１０〕前記溶離液中の前記亜鉛イオンの濃度が０μＭより高く４．６０μＭ以下である、〔８〕又は〔９〕記載の溶離液。

本発明によれば、イオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビン分析において、血液試料に含まれる主要なヘモグロビンであるＨｂＡ０や、ＨｂＳ、ＨｂＣ等の異常Ｈｂ、サラセミアマーカーなどの保持時間を制御することができる。本発明は、各種ヘモグロビンの分析に有用である。

金属化合物含有溶離液を用いたイオン交換クロマトグラフィーによるＨｂＳの分析結果。（Ａ）金属塩添加なしの溶離液を用いた場合の結果、（Ｂ）塩化亜鉛含有溶離液又は硫酸亜鉛含有溶離液を用いた場合の結果、（Ｃ）塩化マグネシウム含有溶離液又は硫酸マグネシウム含有溶離液を用いた場合の結果、（Ｄ）塩化カルシウム含有溶離液又は硫酸カルシウム含有溶離液を用いた場合の結果。 金属化合物含有溶離液を用いたイオン交換クロマトグラフィーによるＨｂＣの分析結果。（Ａ）金属塩添加なしの溶離液を用いた場合の結果、（Ｂ）塩化亜鉛含有溶離液又は硫酸亜鉛含有溶離液を用いた場合の結果、（Ｃ）塩化マグネシウム含有溶離液又は硫酸マグネシウム含有溶離液を用いた場合の結果、（Ｄ）塩化カルシウム含有溶離液又は硫酸カルシウム含有溶離液を用いた場合の結果。 塩化亜鉛含有溶離液を用いたイオン交換クロマトグラフィーによるＨｂＳの分析結果。（Ａ）亜鉛イオン濃度０μＭの場合の結果、（Ｂ）亜鉛イオン濃度０．１９μＭの場合の結果、（Ｃ）亜鉛イオン濃度０．３８μＭの場合の結果、（Ｄ）亜鉛イオン濃度０．７６μＭの場合の結果、（Ｅ）亜鉛イオン濃度１．５３μＭの場合の結果。 塩化亜鉛含有溶離液を用いたイオン交換クロマトグラフィーによるＨｂＣの分析結果。（Ａ）亜鉛イオン濃度０μＭの場合の結果、（Ｂ）亜鉛イオン濃度０．１９μＭの場合の結果、（Ｃ）亜鉛イオン濃度０．３８μＭの場合の結果、（Ｄ）亜鉛イオン濃度０．７６μＭの場合の結果、（Ｅ）亜鉛イオン濃度１．５３μＭの場合の結果。 溶離液に含まれる亜鉛イオン濃度とＨｂＳの保持時間の関係を示す図。 溶離液に含まれる亜鉛イオン濃度とＨｂＣの保持時間の関係を示す図。

本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。

本発明のヘモグロビン分析方法は、イオン交換クロマトグラフィーにより試料中のヘモグロビンを分離することを含む。当該本発明の方法に用いられる試料としては、通常のヘモグロビン分析に用いられるヘモグロビンを含む血液試料を用いることができる。例えば、ヒトから採取した血液を溶血又は希釈した血液試料を用いることができる。

好ましくは、本発明の方法で行われるイオン交換クロマトグラフィーは、カチオン交換カラムを用いた、カチオン交換クロマトグラフィーである。本発明の方法で用いられるカチオン交換カラムは、カチオン交換基を有する固定相が充填されたカラムであればよい。該カチオン交換基としては、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基などが挙げられ、このうちスルホン酸基が好ましい。

該カチオン交換カラムの固定相としては、充填剤粒子、多孔質体等が挙げられ、充填剤粒子が好ましい。該充填剤粒子としては、無機系粒子、有機系粒子等が挙げられる。該無機系粒子としては、シリカ、ジルコニア等で構成される粒子が挙げられる。該有機系粒子としては、セルロース、ポリアミノ酸、キトサン等の天然高分子粒子や、ポリスチレン、ポリアクリル酸エステル等の合成高分子粒子が挙げられる。該カチオン交換基を有する固定相の好ましい例として、特開２０１１－０４７８５８号公報に開示されている、非架橋性の親水性アクリル系単量体とポリグリシジルエーテル類との混合物を重合して得られる架橋重合体粒子と、該架橋重合体粒子の表面に重合されたカチオン交換基を有するアクリル系単量体の層とを含む充填剤が挙げられる。

好ましくは、本発明の方法で行われるクロマトグラフィーは、液体クロマトグラフィーであり、より好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。本発明におけるイオン交換クロマトグラフィーは、公知の液体クロマトグラフィーシステム、すなわち、溶離液送液用のポンプ、サンプラ、検出器等を備えたシステムに接続したイオン交換カラムを用いて行うことができる。

本発明のヘモグロビン分析方法では、従来のイオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビン分析と同様に、試料中のヘモグロビンをイオン交換カラムに吸着させた後、該カラムに溶離液を流して該カラムからヘモグロビンを溶離させることにより、試料中のヘモグロビンを分離する。したがって、本発明のヘモグロビン分析方法で使用される溶離液は、イオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビン分離のために使用される溶離液である。より好ましくは、該溶離液は、カチオン交換クロマトグラフィーにおいて、カチオン交換カラムからのヘモグロビンの溶離のために使用される溶離液である。

本発明のヘモグロビン分析方法では、亜鉛イオンを含有する溶離液を用いる。亜鉛イオンを含有する溶離液は、イオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビン分析に用いられる公知の溶離液に亜鉛化合物を添加して作製することができる。
上記亜鉛化合物としては、特に限定されないが、水溶性の亜鉛化合物が好ましい。該水溶性の亜鉛化合物としては、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛、酢酸亜鉛、炭酸亜鉛、グルコン酸亜鉛などが挙げられ、このうち、塩化亜鉛又は硫酸亜鉛が好ましい。該亜鉛化合物は、単独で用いられてもよく、２種以上で併用されてもよい。該溶離液に含まれる亜鉛イオン濃度に依存してＨｂＡ０、ＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＥ、ＨｂＤなどのヘモグロビンの保持時間が延長されるので、該溶離液中の亜鉛イオン濃度は所望の保持時間に応じて適宜設定すればよい。該溶離液中の亜鉛イオン濃度としては、例えば、０μＭより高く、好ましくは０．０８μＭ以上、より好ましくは０．１５μＭ以上であり、一方、好ましくは４．６０μＭ以下、より好ましくは３．１０μＭ以下、さらに好ましくは２．３０μＭ以下、さらに好ましくは１．６０μＭ以下、さらに好ましくは１．５３μＭ以下である。該溶離液中の亜鉛イオン濃度が４．６０μＭを超えると、保持時間とのトレードオフで分離能が低下することがある。本発明で使用される該溶離液中の亜鉛イオン濃度は、好ましくは０μＭより高く４．６０μＭ以下であり、より好ましくは０．０８μＭ以上３．１０μＭ以下であり、さらに好ましくは０．０８μＭ以上２．３０μＭ以下であり、さらに好ましくは０．１５μＭ以上１．６０μＭ以下であり、さらに好ましくは０．１５μＭ以上１．５３μＭ以下である。なお、従来のヘモグロビン分析方法で用いられていた溶離液には、亜鉛イオンは含まれていない。

本発明で使用される該溶離液は、上記の亜鉛化合物に加えて、公知の緩衝剤を含有する。該溶離液に含まれ得る緩衝剤の例としては、有機酸、無機酸、グッド緩衝剤などが挙げられる。有機酸の例としては、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等、及びこれらの塩が挙げられ、無機酸の例としては、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸、過塩素酸等、及びこれらの塩が挙げられる。該溶離液に用いられる緩衝液は、これらの有機酸及び無機酸のいずれか１種又は２種以上を組み合わせて含有することができる。このうち、リン酸塩、コハク酸塩、及び過塩素酸塩のいずれか１種又は２種以上を含む緩衝液が好ましい。リン酸塩の例としては、ナトリウム塩及びカリウム塩などが挙げられ、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウムが好ましい。コハク酸塩の例としては、ナトリウム塩及びカリウム塩などが挙げられ、コハク酸一ナトリウム、コハク酸二ナトリウムが好ましい。過塩素酸塩の例としては、過塩素酸ナトリウムが挙げられる。これらのリン酸塩、コハク酸塩及び過塩素酸塩は、単独で用いられてもよく、２種以上で併用されてもよい。グッド緩衝剤の好ましい例としては、Ｂｉｃｉｎｅ（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン）、Ｔｒｉｃｉｎｅ（Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン）、及びＴＥＳ（Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノエタンスルホン酸）が挙げられ、このうち、ＴＥＳが好ましい。

本発明で使用される該溶離液における上述した緩衝剤の濃度及びｐＨは、亜鉛イオン及び後述する添加剤等の影響を考慮した上で、適宜設定すればよい。

上記溶離液は、１液で用いてもよく、ｐＨ及び／又は塩濃度グラジエント溶出のため２液以上で用いてもよい。好ましくは以下の溶離液Ａ（以下、Ａ液と称することがある）及び溶離液Ｂ（以下、Ｂ液と称することがある）を含む２液以上で用いる。２液以上を用いる場合、亜鉛イオンは、Ａ液、Ｂ液のいずれかに含有されていればよく、Ａ液及びＢ液の両方に亜鉛イオンが含有されていてもよい。

Ａ液
Ａ液に含まれ得る緩衝剤の例としては、有機酸、無機酸などが挙げられる。有機酸の例としては、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等、及びこれらの塩が挙げられ、無機酸の例としては、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸、過塩素酸等、及びこれらの塩が挙げられる。該Ａ液に用いられる緩衝液は、これらの有機酸及び無機酸のいずれか１種又は２種以上を組み合わせて含有することができる。このうち、リン酸塩、コハク酸塩、及び過塩素酸塩のいずれか１種又は２種以上を含む緩衝液が好ましい。リン酸塩の例としては、ナトリウム塩及びカリウム塩などが挙げられ、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウムが好ましい。コハク酸塩の例としては、ナトリウム塩及びカリウム塩などが挙げられ、コハク酸一ナトリウム、コハク酸二ナトリウムが好ましい。過塩素酸塩の例としては、過塩素酸ナトリウムが挙げられる。これらのリン酸塩、コハク酸塩及び過塩素酸塩は、単独で用いられてもよく、２種以上で併用されてもよい。該Ａ液における緩衝剤の濃度は、０．１ｍＭ以上４００ｍＭ以下であればよく、好ましくは１ｍＭ以上３００ｍＭ以下である。

該Ａ液のｐＨは、好ましくはｐＨ４．０以上、より好ましくはｐＨ５．０以上であり、好ましくはｐＨ６．８以下、より好ましくはｐＨ６．０以下である。該Ａ液のｐＨ範囲は、好ましくはｐＨ４．０～６．８であり、より好ましくはｐＨ５．０～６．０である。また、該Ａ液の浸透圧は、好ましくは１６０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上、より好ましくは１７０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上であり、好ましくは２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下、より好ましくは２２０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下である。該Ａ液の浸透圧の範囲は、好ましくは１６０～２４０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、より好ましくは１７０～２２０ｍＯｓｍ／ｋｇである。好ましい実施形態において、Ａ液は、ｐＨ４．０～６．８であり、かつ浸透圧が１６０～２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、より好ましくは１７０～２２０ｍＯｓｍ／ｋｇである。より好ましい実施形態において、Ａ液は、ｐＨ５．０～６．０であり、かつ浸透圧が１６０～２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、より好ましくは１７０～２２０ｍＯｓｍ／ｋｇである。本明細書における浸透圧の値は、凝固点降下法により測定された浸透圧の値をいう。浸透圧は、市販の浸透圧計、例えばオズモメーター３２５０（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）等を用いて測定することができる。また本明細書において、浸透圧の単位ｍＯｓｍ／ｋｇとは、ｍＯｓｍ／ｋｇＨ_２Ｏを意味し、これはｍＯｓｍ／Ｌ又はｍＯｓｍとも表記されることがある。

Ｂ液
Ｂ液に含まれ得る緩衝剤の例としては、有機酸、無機酸、グッド緩衝剤などが挙げられる。有機酸の例としては、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等、及びこれらの塩が挙げられ、無機酸の例としては、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸、過塩素酸等、及びこれらの塩が挙げられる。該Ｂ液に用いられる緩衝液は、これらの有機酸及び無機酸のいずれか１種又は２種以上を組み合わせて含有することができる。このうち、リン酸塩、コハク酸塩、及び過塩素酸塩のいずれか１種又は２種以上を含む緩衝液が好ましい。リン酸塩の例としては、ナトリウム塩及びカリウム塩などが挙げられ、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウムが好ましい。コハク酸塩の例としては、ナトリウム塩及びカリウム塩などが挙げられ、コハク酸一ナトリウム、コハク酸二ナトリウムが好ましい。過塩素酸塩の例としては、過塩素酸ナトリウムが挙げられる。これらのリン酸塩、コハク酸塩及び過塩素酸塩は、単独で用いられてもよく、２種以上で併用されてもよい。グッド緩衝剤の例としては、Ｂｉｃｉｎｅ（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン）、Ｔｒｉｃｉｎｅ（Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン）、及びＴＥＳ（Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノエタンスルホン酸）が挙げられ、このうち、ＴＥＳが好ましい。

該Ｂ液における該緩衝剤の濃度は、好ましくは２ｍＭ以上、より好ましくは２．５ｍＭ以上、さらに好ましくは５ｍＭ以上であり、好ましくは１７ｍＭ以下、より好ましくは１５ｍＭ以下、さらに好ましくは１２．５ｍＭ以下である。本発明で使用される該Ｂ液における該緩衝剤の濃度の範囲は、好ましくは２～１７ｍＭであり、より好ましくは２．５～１５ｍＭであり、さらに好ましくは５～１２．５ｍＭである。

該Ｂ液のｐＨは、好ましくはｐＨ８．１以上、より好ましくはｐＨ８．２以上、さらに好ましくはｐＨ８．３以上であり、好ましくはｐＨ１０．０以下、より好ましくはｐＨ９．０以下、さらに好ましくはｐＨ８．６以下である。該Ｂ液のｐＨ範囲は、好ましくはｐＨ８．１～１０．０であり、より好ましくはｐＨ８．２～９．０であり、さらに好ましくはｐＨ８．３～８．６である。また、該Ｂ液の浸透圧は、好ましくは１５ｍＯｓｍ／ｋｇ以上、より好ましくは１９ｍＯｓｍ／ｋｇ以上、さらに好ましくは２６ｍＯｓｍ／ｋｇ以上であり、好ましくは４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下、より好ましくは３７ｍＯｓｍ／ｋｇ以下、さらに好ましくは３６ｍＯｓｍ／ｋｇ以下である。該Ｂ液の浸透圧の範囲は、好ましくは１５～４０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、より好ましくは１９～３７ｍＯｓｍ／ｋｇであり、さらに好ましくは２６～３６ｍＯｓｍ／ｋｇである。好ましい実施形態において、Ｂ液は、ｐＨ８．１～１０．０であり、かつ浸透圧が１５～４０ｍＯｓｍ／ｋｇである。より好ましい実施形態において、Ｂ液は、ｐＨ８．２～９．０であり、かつ浸透圧が１９～３７ｍＯｓｍ／ｋｇである。さらに好ましい実施形態において、Ｂ液は、ｐＨ８．３～８．６であり、かつ浸透圧が２６～３６ｍＯｓｍ／ｋｇである。

本発明で使用される該溶離液は、上述した亜鉛イオンや緩衝剤以外に、溶媒、及び、ヘモグロビン変性剤、三価ヘム鉄への結合剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤などの添加剤を含有していてもよい。

好ましくは、本発明で使用される該溶離液は、ヘモグロビン変性剤を含有する。ヘモグロビン変性剤は、ヘモグロビンのヘム鉄を二価から三価に変化させ、メトヘモグロビンを生成することができる酸化剤であればよい。そのような酸化剤の例としては、亜硝酸塩、フェリシアン化カリウム、メチレンブルー、過酸化水素、アスコルビン酸、硫化水素などが挙げられる。このうち、亜硝酸塩が好ましく、亜硝酸ナトリウム又は亜硝酸カリウムがより好ましい。該溶離液における該ヘモグロビン変性剤の濃度は、好ましくは０．０５～１５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１．０～１０ｍｍｏｌ／Ｌである。

また好ましくは、本発明で使用される該溶離液は、三価ヘム鉄への結合剤を含有する。該三価ヘム鉄への結合剤は、該ヘモグロビン変性剤により生成されたメトヘモグロビンを安定化させて、その溶出挙動を安定化させる。該三価ヘム鉄への結合剤の例としては、アジ化物、シアン化物等が挙げられる。アジ化物の例としては、アジ化ナトリウム、ジフェニルリン酸アジド、４－ドデシルベンゼンスルフォニルアジド、４－アセチルアミノベンゼンスルフォニルアジド、アジ化カリウム、アジ化リチウム、アジ化鉄、アジ化水素、アジ化鉛、アジ化水銀、アジ化銅、アジ化銀等が挙げられる。シアン化物の例としては、シアン化カリウム、シアン化水素、シアン化ナトリウム、シアン化銀、シアン化水銀、シアン化銅、シアン化鉛、シアン化鉄、シアン化リチウム、シアン化アンモニウム等が挙げられる。好ましくは、該三価のヘム鉄への結合剤はアジ化物であり、より好ましくはアジ化ナトリウムである。該溶離液における該三価ヘム鉄への結合剤の濃度は、好ましくは０．０５～１５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．５～１０ｍｍｏｌ／Ｌである。

該ｐＨ調整剤としては、公知の酸及び塩基が挙げられ、酸の例としては、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸などが挙げられ、塩基の例としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウムなどが挙げられる。

該界面活性剤としては、公知の界面活性剤が挙げられ、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ、Ｔｗｅｅｎ２０等挙げられる。

該溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン等の水溶性有機溶媒が挙げられる。該溶媒の濃度は、塩等が析出しない程度であることが好ましく、例えば８０％（ｖ／ｖ）以下が好ましく、より好ましい範囲は０．１％（ｗ／ｗ）以上５０％（ｗ／ｗ）以下である。

好ましくは、本発明のヘモグロビン分析方法では、上記溶離液を用いたグラジエント溶離により、ヘモグロビンを分離する。好ましくは、本発明の方法では、Ａ液、Ｂ液の間でグラジエントをかける。

好ましくは、本発明の方法におけるグラジエント溶離では、まず、Ａ液１００％（Ｂ液０％）で通液し、次いでグラジエントをかけてＢ液の割合を増加させ、Ｂ液の割合を１００％まで上げる。グラジエントの大きさは、カラムの性能等に合わせて適宜調整すればよく、特に限定されない。グラジエントの一例は、Ａ：Ｂ＝１００：０ → Ｂの割合を５０～９８容量％（好ましくは７０～９５容量％）まで増加 → 段階的にＢの割合をさらに増加 → Ａ：Ｂ＝０：１００である。グラジエントの別の一例は、Ａ：Ｂ＝１００：０ → 溶離液が全体でｐＨ６．５～８．０、浸透圧２０～１００ｍＯｓｍ／ｋｇになるようＢの割合を増加 → 段階的にＢの割合をさらに増加 → Ａ：Ｂ＝０：１００である。必要に応じて、この後に再びＡ：Ｂ＝１００：０の通液時間を設けてもよい。

一実施形態において、本発明のヘモグロビン分析方法は、異常ヘモグロビンの検出に利用される。本発明の方法で検出される異常ヘモグロビンとしては、ＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＥ、ＨｂＤ、及びＨｂＯ－Ａｒａｂからなる群より選択される少なくとも１種が挙げられ、好ましくはＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＥ、及びＨｂＤからなる群から選択される少なくとも１種、より好ましくはＨｂＳ及びＨｂＣからなる群より選択される少なくとも１種である。本発明の方法は、亜鉛イオンを溶離液に含有せしめるという簡便な手法で上記に挙げた異常ヘモグロビンの保持時間を制御することで、該異常ヘモグロビンの分離検出に貢献することが可能である。

別の一実施形態において、本発明のヘモグロビン分析方法は、サラセミアマーカーの検出に利用される。本発明の方法で検出されるサラセミアマーカーとしては、ＨｂＡ２、ＨｂＦ、ＨｂＨ、ＨｂＢａｒｔ’、及びＨｂＣｏｎｓｔａｎｔ Ｓｐｒｉｎｇからなる群より選択される少なくとも１種が挙げられ、好ましくはＨｂＡ２である。本発明の方法は、亜鉛イオンを溶離液に含有せしめるという簡便な手法で上記に挙げたサラセミアマーカーの保持時間を制御することで、該サラセミアマーカーの分離検出に貢献することが可能である。

さらに別の一実施形態において、本発明は、イオン交換クロマトグラフィーにおけるヘモグロビンの保持時間の制御方法を提供する。本発明のヘモグロビンの保持時間の制御方法は、各種ヘモグロビンの分析に利用される。本発明の方法で保持時間が制御される標的ヘモグロビンとしては、ＨｂＡ０、上述した異常ヘモグロビン、及び上述したサラセミアマーカーからなる群より選択される少なくとも１種が挙げられ、好ましくはＨｂＡ０、ＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＥ、及びＨｂＤからなる群から選択される少なくとも１種、より好ましくはＨｂＳ及びＨｂＣからなる群より選択される少なくとも１種である。本発明の方法は、亜鉛イオンを溶離液に含有せしめるという簡便な手法で該標的ヘモグロビンの保持時間を制御することで標的以外のヘモグロビンや夾雑物の保持時間との差を拡大させ、該標的ヘモグロビンの分離検出に貢献することが可能である。

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

（参考例１：ヘモグロビン分離用カラムの調製）
非架橋性の親水性アクリル系単量体としてテトラエチレングリコールモノメタクリレート（日油社製）２００ｇ、及び、ポリグリシジルエーテル類としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（日油社製）２００ｇを混合した単量体混合物に、重合開始剤として過酸化ベンゾイル（ナカライテスク社製）１．０ｇを溶解した。得られた混合物を、４重量％のポリビニルアルコール（日本合成化学工業社製、「ゴーセノールＧＨ－２０」）水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１時間重合反応を行った。温度を３０℃に冷却した後、カチオン交換基を有するアクリル系単量体として２－メタクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸（東亜合成社製）１００ｇを反応系に添加し、再び８０℃に加温して１時間重合反応を行った。得られた架橋重合体粒子をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、スルホン酸基が導入された架橋重合体粒子を得た。得られたヘモグロビン分離用カラム充填剤を、内径４ｍｍ、長さ２０ｍｍのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビン分離用カチオン交換カラムを調製した。

（参考例２：検体の調製）
検体Ａ：ＡＦＳＣヘモコントロール（ヘレナ研究所社製、ＨｂＡ０、ＨｂＳ及びＨｂＣ含有）を０．１％トリトンＸ－１００含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で適宜希釈して検体を調製した。
検体Ｂ：ＨｂＳ含有検体（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｇｌｙｃｏｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ製、ＨｂＡ０及びＨｂＳ含有）を０．１％トリトンＸ－１００含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で適宜希釈して検体を調製した。
検体Ｃ：ＨｂＣ含有検体（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｇｌｙｃｏｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ製、ＨｂＡ０及びＨｂＣ含有）を０．１％トリトンＸ－１００含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で適宜希釈して検体を調製した。

（試験１）
参考例２で調製した検体Ａ及びＣについてヘモグロビン分析を行った。分析条件を以下に示す。
ＨＰＬＣ装置：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ２０Ａシリーズ（島津製作所社製）
検出器：ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ（島津製作所社製）
送液ポンプ：ＬＣ－２０ＡＤ（島津製作所社製）
脱気ユニット：ＤＧＵ－２０Ａ５Ｒ（島津製作所社製）
カラムオーブン：ＣＴＯ－２０ＡＣ（島津製作所社製）
オートサンプラー：ＳＩＬ－２０ＡＣ（島津製作所社製）
カラム：参考例１で作成したヘモグロビン分離用カチオン交換カラム
流速：１．１ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μＬ
溶離液
溶離液Ａ：表１のとおり
溶離液Ｂ：１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＴＥＳ、５ｍｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウム（ｐＨ８．４、浸透圧３１ｍＯｓｍ／ｋｇ）
グラジエント：表２のとおり
溶離液のｐＨ及び浸透圧は、ｐＨメーター：Ｆ－５２（堀場製作所製）、及びオズモメーター３２５０（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）にて測定した。

実施例１及び２、並びに比較例１～５の溶離液を用いて得られた検体ＡにおけるＨｂＳピークのクロマトグラムを図１に、実施例１及び２、並びに比較例１～５の溶離液を用いて得られた検体ＣにおけるＨｂＣピークのクロマトグラムを図２に示す。各クロマトグラムは、横軸に保持時間を、縦軸にピーク強度を示し、ＨｂＳ又はＨｂＣのピーク付近を拡大したものである。溶離液ＡにＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＭｇＳＯ_４又はＣａＳＯ_４を含む場合（比較例２～５）には、ＨｂＳ及びＨｂＣの保持時間は、溶離液Ａに金属塩を添加しない場合（比較例１）と同等であった。これに対し、溶離液ＡにＺｎＣｌ_２又はＺｎＳＯ_４を含む場合（実施例１及び２）には、ＨｂＳ及びＨｂＣの保持時間は、比較例１に比して延長されていた。本結果より、亜鉛イオンを含む溶離液を用いることで、ＨｂＳ及びＨｂＣの保持時間を制御できることが示された。

（試験２）
参考例２で調製した検体Ｂ及びＣについてヘモグロビン分析を行った。溶離液Ａとして表３に記載の緩衝液を用いた以外は、試験１と同様の条件で試験した。

比較例１並びに実施例１及び３～５の溶離液を用いて得られた検体ＢにおけるＨｂＳのピークのクロマトグラムを図３に、比較例１並びに実施例１及び３～５の溶離液を用いて得られた検体ＣにおけるＨｂＣのピークのクロマトグラムを図４にそれぞれ示す。各クロマトグラムは、横軸に保持時間を、縦軸にピーク強度を示し、ＨｂＳ又はＨｂＣのピーク付近を拡大したものである。また、検体Ｂのクロマトグラムにおける溶離液Ａに含まれる亜鉛イオン濃度とＨｂＳの保持時間の関係を図５に、検体Ｃのクロマトグラムにおける溶離液Ａに含まれる亜鉛イオン濃度とＨｂＣの保持時間の関係を図６にそれぞれ示す。亜鉛イオン濃度依存的にＨｂＳ及びＨｂＣの保持時間が延長されることが明らかとなった。本結果より、亜鉛イオンを含む溶離液を用いることで、クロマトグラフィー分析におけるヘモグロビンの保持時間を濃度依存的に制御できることが示された。

Claims (10)

1. イオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビン分析方法であって、亜鉛イオンを含有する溶離液を用いてヘモグロビンを分離することを含む、分析方法。
2. 前記ヘモグロビンがヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１記載の分析方法。
3. 前記亜鉛イオンを含有する溶離液が塩化亜鉛、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛、酢酸亜鉛、炭酸亜鉛、及びグルコン酸亜鉛からなる群より選択される少なくとも１種を含有する溶離液である、請求項１又は２記載の分析方法。
4. 前記溶離液中の前記亜鉛イオンの濃度が０μＭより高く４．６０μＭ以下である、請求項１～３のいずれか１項記載の分析方法。
5. 前記クロマトグラフィーが高速液体クロマトグラフィーである、請求項１～４のいずれか１項記載の分析方法。
6. イオン交換クロマトグラフィーにおけるヘモグロビンの保持時間の制御方法であって、亜鉛イオンを含有する溶離液を用いてヘモグロビンを分離することを含む、制御方法。
7. 前記ヘモグロビンがヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項６記載の制御方法。
8. 亜鉛イオンを含有する、イオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビン分離用溶離液。
9. 前記亜鉛イオンを含有する溶離液が塩化亜鉛、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛、酢酸亜鉛、炭酸亜鉛、及びグルコン酸亜鉛からなる群より選択される少なくとも１種を含有する溶離液である、請求項８記載の溶離液。
10. 前記溶離液中の前記亜鉛イオンの濃度が０μＭより高く４．６０μＭ以下である、請求項８又は９記載の溶離液。