JP5248257B2 - イオン交換液体クロマトグラフィーを用いた蛋白質の分析方法、及び、ヘモグロビン類の分離、定量方法 - Google Patents

Description

本発明は、カラム温度を変えても溶出挙動が変わらないため、厳密なカラム温度の制御を必要とせずに、精度の高い分離、定量を行うことが可能なイオン交換液体クロマトグラフィーを用いた蛋白質の分析方法に関する。また、本発明は、該イオン交換液体クロマトグラフィーを用いた蛋白質の分析方法を用いたヘモグロビン類の分離、定量方法に関する。

イオン交換液体クロマトグラフィーは糖化ヘモグロビンの分析をはじめ、各種生体関連資料の定量および分離、精製に適した方法であり、多くの移動相が水を媒体としたものであるため、生物活性を失活させずに目的成分を分離できる等利点が多い。

液体クロマトグラフィーはカラム温度に依存して成分の溶出挙動が変化することが知られている。例えば、カラム充填剤と溶質成分間の電荷の違いを利用して分離を行うイオン交換クロマトグラフィーでは、カラム温度が上昇すると、移動相粘度が減少するとともに溶質成分の拡散が増すことでカラム充填剤と溶質成分との相互作用が弱まり、保持時間が短くなる。また、溶質成分の疎水性の違いを利用して分離を行う疎水性クロマトグラフィーや逆相クロマトグラフィーではカラム温度が上昇すると溶質成分とカラム充填剤間の疎水性相互作用が強まり、保持時間が長くなる。従って、液体クロマトグラフィーは適切なカラム温度に設定することで分離能を向上させることが可能な反面、カラム温度を精密に管理しなければ溶出挙動が変化してしまうという問題があった。

溶出挙動が変化する問題を解決する方法として、特許文献１、２にはカラムの精密な温度制御を行う方法が開示されている。近年の液体クロマトグラフィーのカラムオーブンは高い精度で温度制御が可能となり、測定の安定性向上に貢献しているが、その分複雑かつ高価となるといった問題があった。
実開平６−０１０８６１号公報 特開平８−２３３７９３号公報

本発明は、カラム温度を変えても溶出挙動が変わらないため、高価なカラムオーブンを必要とせずに、精度の高い分離、定量を行うことが可能なイオン交換液体クロマトグラフィーを用いた蛋白質の分析方法を提供することを目的とする。

本発明は、カラム温度を変えても溶出挙動が変わらないイオン交換液体クロマトグラフィーを用いた蛋白質の分析方法である。
以下に本発明を詳述する。

一般的に蛋白質はｐＨが低いほど疎水性が増すことが知られている。
移動相が低いｐＨ、高い塩濃度条件にある場合、多数のカウンターイオンが固定相のイオン交換基に吸着することでイオン交換作用が弱められるとともに、蛋白質の荷電を抑えて疎水性を高めることで固定相と蛋白質との疎水性相互作用を強める。このため、疎水性クロマトグラフィー又は逆相クロマトグラフィーと同様にカラム温度を上昇させることで保持が強まるといった溶出挙動の温度依存性を示すこととなる。即ち、移動相が低いｐＨ、高い塩濃度条件にある場合には、保持時間は蛋白質と固定相との疎水性相互作用によって決まる。疎水性相互作用が支配的である場合には、保持時間は温度が高いほど長くなる傾向にある。

一方、移動相が高いｐＨ、低い塩濃度条件にある場合、蛋白質を適度に荷電させつつ固定相のカウンターイオンとなる塩濃度を減らすことで固定相のイオン交換基と蛋白質とのイオン交換作用を強め、イオン交換クロマトグラフィーと同様にカラム温度を上昇させることで保持が弱まるといった溶出挙動の温度依存性を示すこととなる。即ち、移動相が高いｐＨ、低い塩濃度条件にある場合には、保持時間は蛋白質と固定相とのイオン交換作用によって決まる。イオン交換作用が支配的である場合には、保持時間は温度が高いほど短くなる傾向にある。

本発明者らは、イオン交換液体クロマトグラフィーにおいて、相反する溶出挙動の温度依存性を持つ疎水性相互作用の温度依存性とイオン交換作用の温度依存性とを利用することで、厳密なカラム温度の制御を必要とせずに、精度の高い分離、定量といった蛋白質の分析ができることを見出し、本発明を完成させるに至った。

本発明のイオン交換液体クロマトグラフィーを用いた蛋白質の分析方法は、固定相と蛋白質との疎水性相互作用とイオン交換作用とがつり合うことでカラム温度変化による保持の変化がなくなるｐＨ及び塩濃度条件となる移動相を導出し、上記移動相を用いて分離操作を行う工程を有する。
上記移動相を用いることで、厳密なカラム温度の制御を必要とせずとも保持時間及び測定値のばらつきが少なくなり、精度の高い分離、定量を行うことが可能となり、糖尿病診断に用いられる糖化ヘモグロビン測定装置等では複雑かつ高価なカラムオーブンを使用する必要がなくなるため、コストダウンが可能となる。

上記移動相に用いる溶離液は、イオン交換液体クロマトグラフィー用として用いられる緩衝液を用いた溶離液であれば特に限定されない。

上記緩衝液を調製する緩衝試薬は特に限定されず、例えば、クエン酸、酢酸、酒石酸、ホウ酸、リン酸等の酸、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、トリスヒドロキシメチルアミノメタン等の塩基、クエン酸ナトリウム、クエン酸リチウム、酢酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、四ホウ酸ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム、過塩素酸ナトリウム等の塩が挙げられる。

上記塩濃度は特に限定されないが、好ましい上限は５００ｍｍｏｌ／Ｌである。上記塩濃度が５００ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、塩が析出しシステムに悪影響を及ぼすことがある。上記塩濃度のより好ましい上限は２００ｍｍｏｌ／Ｌである。

上記ｐＨは特に限定されないが、好ましい下限は３、好ましい上限は９である。上記ｐＨがこの範囲外であると、蛋白質を大きく変性させ、測定の再現性が低下したり、カラム充填剤の劣化を早めたりすることがある。上記ｐＨのより好ましい下限は５、より好ましい上限は８である。

上記溶離液は、更に、ｐＨ調整剤、安定剤等の添加剤を含有してもよい。

本発明のイオン交換液体クロマトグラフィーを用いた蛋白質の分析方法で用いる固定相の充填剤粒子は、イオン交換液体クロマトグラフィー用として用いられる充填剤粒子であれば特に限定されず、無機系粒子や有機系粒子が挙げられる。上記無機系粒子は特に限定されず、例えば、シリカ、ジルコニア等が挙げられる。上記有機系粒子は特に限定されず、例えば、セルロース、ポリアミノ酸、キトサン等の天然高分子粒子や、ポリスチレン、ポリアクリル酸エステル等の合成高分子粒子等が挙げられる。なかでも、イオン交換基導入前の表面疎水性が高い粒子を用いることが望ましい。上記イオン交換基は陽イオン交換基であってもよいし、陰イオン交換基であってもよい。

上記陽イオン交換基は特に限定されず、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられる。上記陰イオン交換基は特に限定されず、例えば、３級もしくは４級アミノ基等が挙げられる。

本発明のイオン交換液体クロマトグラフィーを用いた蛋白質の分析方法において、目的とする蛋白質の等電点としては特に限定されないが、好ましい下限は３、好ましい上限は１１である。上記等電点が３未満もしくは１１を越えると、疎水性相互作用もしくはイオン交換作用のどちらかが強く反映されてしまいつり合いが取りにくくなることがある。上記等電点のより好ましい下限は５、より好ましい上限は１０である。

上記蛋白質としては特に限定されず、例えば、ヘモグロビン類（ヘモグロビンＡ１ｃ、ヘモグロビンＦ、ヘモグロビンＡ、ヘモグロビンＡ２、ヘモグロビンＥ、ヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＣ等）、アルブミン類、フィブリノーゲン、グロブリン類、インシュリン、ハプトグロビン等が挙げられる。

カラム温度変化による保持の変化がなくなるｐＨ及び塩濃度条件となる移動相を導出する手順を以下に示すが、本発明はこの手順に制限されない。

（１）まず、低いｐＨ、高い塩濃度条件にある疎水性相互作用が支配的となる移動相Ａと、高いｐＨ、低い塩濃度条件にあるイオン交換作用が支配的となる移動相Ｂとを調製し、これらの移動相を用いて、対象とする蛋白質の種々の温度における保持時間を測定する。
（２）次いで、得られた保持時間の対数値をとり、保持時間の対数値の温度依存性を直線近似する。得られた２つの直線の交点を求め、２つの直線について、交点の温度以外の任意の温度における保持時間の対数値と交点における保持時間の対数値との差を算出し、それらの比を求める。
（３）得られた比の逆比となるｐＨ及び塩濃度条件を算出し、このｐＨ及び塩濃度条件となる液を調製することで、疎水性相互作用とイオン交換作用とがつり合い、カラム温度変化による保持時間の変化が小さくなるｐＨ及び塩濃度条件となる移動相を調製することができる。

更に、上記（３）で得られた移動相のカラム温度変化と保持時間の関係を基に移動相条件を微修正することで、カラム温度変化による保持時間の変化がほぼなくなるｐＨ及び塩濃度条件となる移動相を調製することができる。上記移動相条件の微修正は、複数回行ってもよい。

本発明のイオン交換液体クロマトグラフィーを用いた蛋白質の分析方法を用いたヘモグロビン類の分離、定量方法もまた、本発明の１つである。

本発明によれば、カラム温度を変えても溶出挙動が変わらないため、厳密なカラム温度の制御を必要とせずに、精度の高い分離、定量を行うことが可能なイオン交換液体クロマトグラフィーを用いた蛋白質の分析方法を提供することができる。また、本発明によれば、該イオン交換液体クロマトグラフィーを用いた蛋白質の分析方法を用いたヘモグロビン類の分離、定量方法を提供することができる。

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されない。

（実施例１）
（１）保持時間の測定
グリコヘモグロビンコントロールレベル２（シスメックス社製）を２００μＬの注射用水で溶解した後、希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料とした。
イオン交換カラムとして陽イオン交換樹脂充填品、検出器としてＳＰＤ−Ｍ２０Ａ（島津製作所社製）、送液ポンプとしてＬＣ−２０ＡＤ（島津製作所社製）、デガッサーとしてＤＧＵ−２０Ａ５（島津製作所社製）、カラムオーブンとしてＣＴＯ−２０ＡＣ（島津製作所社製）、オートサンプラーとしてＳＩＬ−２０ＡＣ（島津製作所社製）を用い、流速を１．７ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長を４１５ｎｍ、試料注入量を１０μＬとして、０〜１．５分は移動相１（６０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．４））又は移動相２（４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（過塩素酸ナトリウムを含まない）（ｐＨ６．３））にて溶出し、１．５分を超え２．２分までは移動相３（０．８重量％トリトンＸ−１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））にて溶出してヘモグロビンＡ１ｃの測定を行った。

（２）移動相条件の導出
移動相１、２を用いたクロマトグラムを図１、２に、Ａ１ｃの保持時間と保持時間の対数値を表１に示した。また、移動相１及び２におけるＡ１ｃ保持時間の対数値をグラフ化したものを図３に示した。

図１、２より、移動相１では温度上昇につれてＡ１ｃの保持時間が遅延しており、逆に、移動相２では温度上昇につれてＡ１ｃの保持時間が早まっていることがわかる。これらの結果から、移動相１では疎水性相互作用、移動相２ではイオン交換作用が強く反映されていると考えられる。
図３において、移動相１で溶出したＡ１ｃと移動相２で溶出したＡ１ｃの保持時間の対数値の近似直線をとり、近似直線の交点の温度以外の任意の温度における保持時間の対数値と交点における保持時間の対数値との差の比はほぼ１：１であった。これより、カラム温度変化によるＡ１ｃの保持時間の変化がなくなる移動相のｐＨは５．８５、塩濃度は３０ｍｍｏｌ／Ｌであると考えられた。

（３）導出した移動相による分離
得られたｐＨ及び塩濃度条件となる移動相４（３０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．８５））を調製した。
グリコヘモグロビンコントロールレベル２（シスメックス社製）を２００μＬの注射用水で溶解した後、希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料とした。
イオン交換カラムとして陽イオン交換樹脂充填品、検出器としてＳＰＤ−Ｍ２０Ａ（島津製作所社製）、送液ポンプとしてＬＣ−２０ＡＤ（島津製作所社製）、デガッサーとしてＤＧＵ−２０Ａ５（島津製作所社製）、カラムオーブンとしてＣＴＯ−２０ＡＣ（島津製作所社製）、オートサンプラーとしてＳＩＬ−２０ＡＣ（島津製作所社製）を用い、流速を１．７ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長を４１５ｎｍ、試料注入量を１０μＬとして、０〜１．５分は移動相４にて溶出し、１．５分を超え２．２分までは移動相３（０．８重量％トリトンＸ−１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））にて溶出してヘモグロビンＡ１ｃの測定を行った。このクロマトグラムを図４に、Ａ１ｃの保持時間と保持時間の対数値を表２に示した。また、移動相１、２、及び、４におけるＡ１ｃ保持時間の対数値をグラフ化したものを図５に示した。

図５より、移動相４を用いた場合、移動相１、移動相２と比べて温度変化に対するＡ１ｃの保持時間が安定した。

（実施例２）
（１）保持時間の測定
ＡＦＳＣコントロール（ヘレナ研究所社製）を希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料とした。
イオン交換カラムとして陽イオン交換樹脂充填品、検出器としてＳＰＤ−Ｍ２０Ａ（島津製作所社製）、送液ポンプとしてＬＣ−２０ＡＤ（島津製作所社製）、デガッサーとしてＤＧＵ−２０Ａ５（島津製作所社製）、カラムオーブンとしてＣＴＯ−２０ＡＣ（島津製作所社製）、オートサンプラーとしてＳＩＬ−２０ＡＣ（島津製作所社製）を用い、流速を１．７ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長を４１５ｎｍ、試料注入量を１０μＬとして、０〜１．５分は移動相５（１７０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．４））又は移動相６（３０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２））にて溶出し、１．５分を超え２．２分までは移動相３（０．８重量％トリトンＸ−１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））にて溶出してヘモグロビンＣ（ＨｂＣ）の測定を行った。

（２）移動相条件の導出
移動相５、６を用いたクロマトグラムを図６、７に、ＨｂＣの保持時間と保持時間の対数値を表３に示した。また、移動相５及び６におけるＨｂＣ保持時間の対数値をグラフ化したものを図８に示した。

図６、７より、移動相５では温度上昇につれてＨｂＣの保持時間が遅延しており、逆に、移動相６では温度上昇につれてＨｂＣの保持時間が早まっていることがわかる。これらの結果から、移動相５では疎水性相互作用、移動相６ではイオン交換作用が強く反映されていると考えられる。
図８において、移動相５で溶出したＨｂＣと移動相６で溶出したＨｂＣの保持時間の対数値の近似直線をとり、近似直線の交点の温度以外の任意の温度における保持時間の対数値と交点における保持時間の対数値との差の比はほぼ２２：６７であった。これより、カラム温度変化による保持時間の変化がなくなる移動相のｐＨは６．７、塩濃度は６５ｍｍｏｌ／Ｌであると考えられた。

（３）導出した移動相による分離
得られたｐＨ及び塩濃度条件となる移動相７（６５ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．７））を調製した。
ＡＦＳＣコントロール（ヘレナ研究所社製）を希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料とした。
イオン交換カラムとして陽イオン交換樹脂充填品、検出器としてＳＰＤ−Ｍ２０Ａ（島津製作所社製）、送液ポンプとしてＬＣ−２０ＡＤ（島津製作所社製）、デガッサーとしてＤＧＵ−２０Ａ５（島津製作所社製）、カラムオーブンとしてＣＴＯ−２０ＡＣ（島津製作所社製）、オートサンプラーとしてＳＩＬ−２０ＡＣ（島津製作所社製）を用い、流速を１．７ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長を４１５ｎｍ、試料注入量を１０μＬとして、０〜１．５分は移動相７にて溶出し、１．５分を超え２．２分までは移動相３（０．８重量％トリトンＸ−１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））にて溶出してＨｂＣの測定を行った。このクロマトグラムを図９に、ＨｂＣの保持時間と保持時間の対数値を表４に示した。また、移動相５、６、及び、７におけるＨｂＣの保持時間の対数値をグラフ化したものを図１０に示した。

（実施例３）
移動相７の結果を基に移動相条件を微修正し、カラム温度変化によるＨｂＣの保持時間の変化がなくなる移動相のｐＨは６．２、塩濃度は１１０ｍｍｏｌ／Ｌであると考えられた。このｐＨ及び塩濃度条件となる移動相８（１１０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．２））を調製した。
ＡＦＳＣコントロール（ヘレナ研究所社製）を希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料とした。
イオン交換カラムとして陽イオン交換樹脂充填品、検出器としてＳＰＤ−Ｍ２０Ａ（島津製作所社製）、送液ポンプとしてＬＣ−２０ＡＤ（島津製作所社製）、デガッサーとしてＤＧＵ−２０Ａ５（島津製作所社製）、カラムオーブンとしてＣＴＯ−２０ＡＣ（島津製作所社製）、オートサンプラーとしてＳＩＬ−２０ＡＣ（島津製作所社製）を用い、流速を１．７ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長を４１５ｎｍ、試料注入量を１０μＬとして、０〜１．５分は移動相８にて溶出し、１．５分を超え２．２分までは移動相３（０．８重量％トリトンＸ−１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））にて溶出してＨｂＣの測定を行った。このクロマトグラムを図１１に、ＨｂＣの保持時間と保持時間の対数値を表５に示した。また、移動相５、６、７、及び、８におけるＨｂＣの保持時間の対数値をグラフ化したものを図１２に示した。

図１１より、移動相条件を微修正した移動相８を用いた場合、移動相７と比べてカラム温度変化に対するＨｂＣの保持時間が安定した。

本発明による、イオン交換作用の温度依存性と疎水性相互作用の温度依存性の特性がつり合う条件組成となる移動相を用いることで、温度変化によって溶出挙動が変わらないイオン交換液体クロマトグラフィーの分析を行うことができた。

本発明によれば、カラム温度を変えても溶出挙動が変わらないため、厳密なカラム温度の制御を必要とせずに、精度の高い分離、定量を行うことが可能なイオン交換液体クロマトグラフィーを用いた蛋白質の分析方法を提供することができる。また、本発明によれば、該イオン交換液体クロマトグラフィーを用いた蛋白質の分析方法を用いたヘモグロビン類の分離、定量方法を提供することができる。

移動相１を用いたクロマトグラムを示した図である。 移動相２を用いたクロマトグラムを示した図である。 移動相１及び２におけるＡ１ｃ保持時間の対数値をグラフ化した図である。 移動相４を用いたクロマトグラムを示した図である。 移動相１、２、及び、４におけるＡ１ｃ保持時間の対数値をグラフ化した図である。 移動相５を用いたクロマトグラムを示した図である。 移動相６を用いたクロマトグラムを示した図である。 移動相５及び６におけるＨｂＣ保持時間の対数値をグラフ化した図である。 移動相７を用いたクロマトグラムを示した図である。 移動相５、６、及び、７におけるＨｂＣ保持時間の対数値をグラフ化した図である。 移動相８を用いたクロマトグラムを示した図である。 移動相５、６、７、及び、８におけるＨｂＣ保持時間の対数値をグラフ化した図である。

Claims (4)

1. カラム温度を変えても溶出挙動が変わらないイオン交換液体クロマトグラフィーを用いた蛋白質の分析方法であって、
   固定相と目的とする蛋白質との疎水性相互作用と、固定相と目的とする蛋白質とのイオン交換作用とがつり合うことでカラム温度変化による目的とする蛋白質の保持時間の変化がなくなるｐＨ及び塩濃度条件となる移動相を導出し、前記移動相を用いて分離操作を行う工程を有することを特徴とするイオン交換液体クロマトグラフィーを用いた蛋白質の分析方法。
2. カラム温度が１５〜４５℃の範囲にあり、この温度範囲内における目的成分の保持時間が各温度における保持時間の平均から５％以内であることを特徴とする請求項１記載のイオン交換液体クロマトグラフィーを用いた蛋白質の分析方法。
3. 目的とする蛋白質が等電点３〜１１の範囲にある蛋白質であることを特徴とする請求項１又は２記載のイオン交換液体クロマトグラフィーを用いた蛋白質の分析方法。
4. 請求項１、２又は３記載のイオン交換液体クロマトグラフィーを用いた蛋白質の分析方法を用いたヘモグロビン類の分離、定量方法。

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