JP4404428B2 - ヘモグロビン類の測定方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法に関し、より詳細には、カチオン交換液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、液体クロマトグラフィー（以下、ＬＣという）を用いて試料を分離する場合、溶離液として、一定の溶出力のものを１種類用いる方法や、２種以上の溶離液を用いた勾配溶出法または段階溶出法により、各成分のピークを鋭くし、分離度を改善したり、測定時間を短縮する方法が行われている。
【０００３】
上記勾配溶出法（グラジエント溶離法）とは、溶離液の溶出力を弱いものからから強いものへと時間的に直線的に上昇させる方法（図１３）であり、送液ポンプを複数台用いて、溶出力の異なる液を送液し、その比率を連続的に変化させることにより、全体的な溶出力を変化させる方法である。
【０００４】
また、上記段階溶出法（ステップワイズ溶離法）とは、溶離液の溶出力を段階的に上昇させる方法（図１４）であり、送液ポンプ１台を用い、送液ポンプの上流側で電磁弁等により溶出力の異なる液を切り替え、段階的に溶出力を変化させる方法である。
【０００５】
これらの方法において、溶離液の溶出力を変化させるには、例えば、溶離液の極性、イオン強度、ｐＨなどが挙げられる。（以上の従来の技術については、日本分析化学会関東支部編、高速液体クロマトグラフィーハンドブック、３９〜４０頁、１１７〜１１９頁、１９８５年）。
【０００６】
しかしながら、各成分の性質が類似していたり、短時間で溶出することが要求されていたりする場合、勾配溶出法で勾配が大きすぎたり、段階溶出法で溶出力を上げすぎたりすると、類似した性質の成分間でピークが重なり、分離に悪影響を及ぼす恐れがある。
そこで、このような場合、ピークが重なるポイントで勾配を緩めたり、全くなくしたり、溶出力の上昇の程度を低くしたりしている。しかしながら、このような対策ではピークの鋭さがなくなったり、また、測定時間が延びたりするなど、勾配溶出法または段階溶出法の利点が発揮されない場合があった。
【０００７】
一方、上記液体クロマトグラフィーは、最近臨床検査分野で広く用いられており、特に、血液試料中に含まれている夾雑成分の中から測定対象成分を分離したり、性質の似た複数の成分を相互に分離分析したり、特定の成分を分取するために用いられている。
【０００８】
その中でも、糖化ヘモグロビン、特にヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）は糖尿病診断の指標として広く利用されている。ＨｂＡ１ｃとは血液中の糖が赤血球に入った後に、ヘモグロビンと不可逆的に結合して生成したものであり、過去１〜２カ月間の血液中の平均的な糖濃度を反映する。
【０００９】
液体クロマトグラフィー法によるＨｂＡ１ｃの測定は、主にカチオン交換液体クロマトグラフィー法により行われている（特公平８−７１９８号公報など）。溶血液試料をカチオン交換液体クロマトグラフィーにより分離すると、通常、ヘモグロビンＡ１ａ（以下、ＨｂＡ１ａという）及びヘモグロビンＡ１ｂ（以下、ＨｂＡ１ｂという）、ヘモグロビンＦ（以下、ＨｂＦという）、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ並びにヘモグロビンＡ０（以下、ＨｂＡ０という）などのピークが出現する。なお、糖尿病の診断の指標として使用されているＨｂＡ１ｃは、最近では、上記のうちの安定型ＨｂＡ１ｃであり、その割合は、全ヘモグロビンピークの面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃピークの面積の比率（％）として求められている。
【００１０】
しかしながら安定型ＨｂＡ１ｃピークと不安定型ＨｂＡ１ｃピークの分離が困難であるため、通常、精度良く安定型ＨｂＡ１ｃピークのみを測定することが困難であった。
【００１１】
また、時に、アセチル化ヘモグロビン（以下、ＡＨｂという）やカルバミル化ヘモグロビン（以下、ＣＨｂという）等の「修飾ヘモグロビン」が安定型ＨｂＡ１ｃと重なって溶離してくるという問題があった。
すなわち、カチオン交換ＬＣによる安定型ＨｂＡ１ｃ値の測定を目的として、血液検体のヘモグロビン類を測定する際、安定型ＨｂＡ１ｃの測定値に影響を与えないように、安定型ＨｂＡ１ｃと溶出挙動が近似している不安定型ＨｂＡ１ｃやＡＨｂ及びＣＨｂピークを、安定型ＨｂＡ１ｃピークから分離することが困難であった。
【００１２】
さらに、「異常ヘモグロビン」としてヘモグロビンＳ（以下、ＨｂＳという）ヘモグロビンＣ（以下、ＨｂＣという）が知られている。ＨｂＳはヘモグロビンＡ（以下、ＨｂＡという）のβ鎖のＮ末端から６番目のグルタミン酸がバリンに置換されたものであり、ＨｂＣは同じ部位がリジンに置換されたものである。これらＨｂＳ、ＨｂＣ、及び下記するＨｂＡ２は、ＨｂＡ０より後に順に溶出される。
そして、これらＨｂＳ、ＨｂＣを含む検体の安定型ＨｂＡ１ｃを測定するときには、これらのピーク面積を除いた他のヘモグロビン成分の合計ピーク面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃピーク面積の比率（％）を算出して求める必要がある。
【００１３】
また、ヘモグロビンＡ２（以下、ＨｂＡ２と略す）は、α鎖とδ鎖から成るヘモグロビンであり、ＨｂＦと共に地中海性貧血症（tha lassemia）においてその構成比率が正常者より高い。
そして、上記地中海性貧血症を同時に検査したい場合には、ＨｂＡ２をＨｂＡ０から分離できるような溶離条件を設定する。この場合は、全ヘモグロビンに対するＨｂＦとＨｂＡ２の構成比率が測定結果として算出される。
【００１４】
しかしながら、ＨｂＡ０とＨｂＳ、ＨｂＣ及びＨｂＡ２とのカラムに対する保持能力が近いため、これらのピークを完全に分離するためには、時間を要していただけでなく、精度良く測定することが困難であった。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記従来のヘモグロビン類の測定方法の問題点に鑑み、ヘモグロビン類の分離を短時間で、高分離能で行うことができ、さらに測定再現性の優れたヘモグロビン類の測定方法を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の本発明（以下、本発明１という）では、カチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法において、溶出力の異なる少なくとも２種の溶離液（溶離液Ａ及び溶離液Ｂ）を用い、溶離液ＡのｐＨが、溶離液ＢのｐＨより大きく、溶離液Ａの安定型ヘモグロビンＡ１ｃ溶出力が、溶離液Ｂの安定型ヘモグロビンＡ１ｃ溶出力よりも小さいことを特徴とするヘモグロビン類の測定方法を提供する。
また、請求項２記載の本発明（以下、本発明２という）では、上記溶離液Ａの浸透圧が、上記溶離液Ｂの浸透圧よりも小さいことを特徴とする請求項１記載のヘモグロビン類の測定方法を提供する。
また、請求項３記載の本発明（以下、本発明３という）では、アルカリ性水溶液添加に対する上記溶離液Ａの緩衝能が、上記溶離液Ｂのそれよりも小さいか、あるいは、それと等しいことを特徴とする請求項１または２記載のヘモグロビン類の測定方法を提供する。
また、請求項４記載の本発明（以下、本発明４という）では、ヘモグロビン類の測定中の溶離液送液工程において、少なくとも、上記溶離液Ａを送液した後上記溶離液Ｂを送液する工程、あるいは、上記溶離液Ｂを送液した後上記溶離液Ａを送液する工程が含まれることを特徴とする請求項１〜３いずれか一項に記載のヘモグロビン類の測定方法を提供する。
また、請求項５記載の本発明（以下、本発明５という）では、上記溶離液Ａ及び／又は溶離液Ｂにカオトロピックイオンが含有されており、かつ、ｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ有機酸、無機酸及び／又はこれらの塩が含有されていることを特徴とする請求項１〜４いずれか一項に記載のヘモグロビン類の測定方法を提供する。
また、請求項６記載の本発明（以下、本発明６という）では、上記溶離液Ａ及び溶離液Ｂとは溶出力が異なる溶離液Ｃを用い、該溶離液Ｃは、ヘモグロビンＡ０を溶出するために用い、カラムに流入する際のｐＨが、ヘモグロビン類の等電点と等しいか、または、等電点よりアルカリ側になるように設定されていることを特徴とする請求項１〜５いずれか一項に記載のヘモグロビン類の測定方法を提供する。
また、請求項７記載の本発明（以下、本発明７という）では、上記溶離液Ｃにカオトロピックイオンが含有されていることを特徴とする請求項６記載のヘモグロビン類の測定方法を提供する。
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明１は、溶出力の異なる少なくとも２種の溶離液（本明細書中では、溶離液Ａ及び溶離液Ｂという）を用い、溶離液ＡのｐＨが、溶離液ＢのｐＨより大きく、溶離液Ａの安定型ヘモグロビンＡ１ｃ溶出力が、溶離液Ｂの安定型ヘモグロビンＡ１ｃ溶出力よりも小さいことを特徴とする。
【００１８】
本発明でいう溶離液の安定型ヘモグロビンＡ１ｃ溶出力は、カチオン交換液体クロマトグラフィーによる測定において、同一ロットの安定型ヘモグロビンＡ１ｃ試料を、同一カラム、同一分析条件（溶離液を除いて分析に影響する全ての条件が同じ）で、溶出力を評価する溶離液のみを用い、安定型ヘモグロビンＡ１ｃの保持時間を測定して、これを比較することにより求めることができる。
すなわち、溶離液Ａと溶離液Ｂの場合で、安定型ＨｂＡ１ｃの保持時間を測定したとき、保持時間がそれぞれＴA 、ＴB であったとすると、ＴA ＞ＴB （つまり溶離液Ｂの場合より溶離液Ａの場合の方が安定型ＨｂＡ１ｃの溶出に時間がかかる）である場合、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ溶出力は、溶離液Ａのほうが溶離液Ｂよりも小さいということになる。
上記溶離液の溶出力を変える方法としては、ｐＨや塩濃度、イオン強度、溶液の極性を変える方法が挙げられる。
【００１９】
本発明において上記溶離液ＡのｐＨが、溶離液ＢのｐＨより大きいとは、市販のｐＨ測定装置（例えば、カスタニーＬＡＢ ｐＨメーター（Ｆ２３）、堀場製作所社製）で溶離液Ａ及び溶離液Ｂを測定した場合、溶離液ＡのｐＨが溶離液ＢのｐＨより大きいということである。
具体的には、液温２０℃の場合、溶離液ＡのｐＨは溶離液Ｂに比べて、０．００１〜３．０００大きいことが好ましく、さらに好ましくは、０．０１０〜２．５００大きく、またさらには、０．０２０〜２．０００大きいものが好ましい。
【００２０】
上記溶離液Ａ及びＢは、ヘモグロビン類測定中の溶離液送液工程において、上記ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、異常ヘモグロビン（ＨｂＳ、ＨｂＣ）、ＨｂＡ２、及び修飾ヘモグロビン（ＡＨｂ、ＣＨｂ）を最適に分離できるように送液する。
【００２１】
測定に用いられる溶離液としては、上記溶離液Ａ、Ｂ以外にも近接したピークを分離するために他の溶離液を用いても良い。また、測定終了後は、カラム洗浄液、または、溶離液Ａ、Ｂより溶出力の強い溶離液でカラム洗浄を行うことが好ましい。
【００２２】
本発明２は、溶離液Ａの浸透圧が、溶離液Ｂの浸透圧よりも小さいことを特徴とする。
上記溶離液Ａの浸透圧が、溶離液Ｂの浸透圧よりも小さいとは、市販の浸透圧測定装置（例えば、オズモスタット（OM-6020)、京都第一科学社製）において、溶離液Ａ、Ｂの浸透圧を測定した場合、溶離液Ｂの浸透圧より溶離液Ａの浸透圧が小さいということである。
具体的には、上記装置において溶離液を測定した場合、溶離液Ｂの浸透圧は、溶離液Ａに比べて２４．４５〜２４４５０ｈＰａ（上記OM-6020 で測定した場合は、１〜１０００ｍＯｓｍ、１ｍＯｓｍ＝２４．４５ｈＰａ）大きく、より好ましくは、４８．９０〜１２２２５ｈＰａ（２〜５００ｍＯｓｍ）大きく、更には、１２２．２５〜７３３５ｈＰａ（５〜３００ｍＯｓｍ）大きいのが好ましい。
上記溶離液の浸透圧を変える方法としては、溶離液に酸、アルカリ、塩等を添加する方法が挙げられる。
【００２３】
本発明３は、アルカリ性水溶液添加に対する溶離液Ａの緩衝能が、溶離液Ｂのそれよりも小さいか、あるいは、それと等しいことを特徴とする。
【００２４】
上記アルカリ性水溶液添加に対する溶離液Ａの緩衝能が、溶離液Ｂのそれよりも小さいとは、例えば、溶離液Ａ及びＢ各１００ｍｌに０．１モル／Ｌの水酸化ナトリウム１ｍｌを添加した時、溶離液ＡのｐＨ増加分（Ｘ）が、溶離液ＢのｐＨ増加分（Ｙ）と比べて同等以上であることを意味する。
本発明においては、緩衝能の差（Ｋ）を以下のように定義する。
緩衝能の差Ｋ＝（溶離液ＡのｐＨ増加分Ｘ）−（溶離液ＢのｐＨ増加分Ｙ） 上記、溶離液の緩衝能の差（Ｋ）は、液温２０℃において、０．００１〜３．０００であることが好ましく、さらに好ましくは、０．００２〜１．０００である。
【００２５】
上記溶離液には、通常、緩衝能を有する物質として、無機酸、有機酸またはこれらの塩が含まれる。
上記無機酸としては、例えば、炭酸、リン酸等が挙げられる。上記有機酸としては、例えば、カルボン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン酸、アミノ酸、カコジル酸、ピロリン酸等が挙げられる。
上記カルボン酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸等が挙げられる。上記ジカルボン酸としては、例えば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸等が挙げられる。上記カルボン酸誘導体としては、例えば、β、β−ジメチルグルタル酸、バルビツール酸、アミノ酪酸等が挙げられる。上記ヒドロキシカルボン酸としては、例えば、クエン酸、酒石酸、乳酸等が挙げられる。上記アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、アスパラギン等が挙げられる。
上記無機酸または有機酸の塩としては、公知のもので良く、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。
上記無機酸、有機酸またはこれらの塩は、複数種混合して用いても良く、無機酸と有機酸を混合して用いても良い。
上記無機酸、有機酸及び／またはこれらの塩の溶離液中の濃度、複数種用いる場合には複数種の合計の濃度は、溶離液のｐＨを４．０〜６．８にする緩衝作用があれば良く、１〜１０００ｍＭが好ましく、１０〜５００ｍＭが特に好ましい。
【００２６】
本発明４においては、ヘモグロビン類測定中の溶離液送液工程は、少なくとも、上記溶離液Ａを送液した後上記溶離液Ｂを送液する工程、あるいは、上記溶離液Ｂを送液した後上記溶離液Ａを送液する工程を含むものである。
【００２７】
すなわち、上記送液方法とは、溶離液Ａ、ＢをＡ−Ｂ、Ａ−Ｂ−Ａ、Ａ−Ｂ−Ａ−Ｂ、Ａ−Ｂ−Ａ−Ｂ−Ａ・・・、または、Ｂ−Ａ、Ｂ−Ａ−Ｂ、Ｂ−Ａ−Ｂ−Ａ、Ｂ−Ａ−Ｂ−Ａ−Ｂ・・・・のように交互に流すことで、交互に流す回数、Ａ及びＢの順番は、近接したピークを分離溶離するために適宜最適なものにすることが好ましい。
また、測定に用いる溶離液としては、上記Ａ、Ｂ以外の溶離液を組み合わせても良い。
【００２８】
上記溶離液は、例えば、溶出力のより弱い溶離液ＡによりＨｂＡ１ａからＨｂＦ付近まで溶離し、次に溶出力の強い溶離液Ｂに切り替えてＨｂＡ１ｃまでを溶離し、再び、溶離液Ａを流し、その後溶出力の最も強い溶離液に切り替えてＨｂＡ０以降に溶出するヘモグロビン成分を溶出させる。このように、ＨｂＡ１ｃ溶離後、溶離液Ａを再び流すことにより、ＨｂＡ１ｃピーク近傍に、妨害ピークが出現せず、ＨｂＡ１ｃを正確にしかも再現性良く分離溶離できる。
【００２９】
本発明５では、溶離液Ａ及び／又は溶離液Ｂには、カオトロピックイオン、かつ、ｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ有機酸、無機酸及び／又はこれらの塩が含有されていることを特徴とする。
【００３０】
上記カオトロピックイオンとは、化合物が水溶液に溶解したときに解離により生じたイオンであり、水の構造を破壊し、疎水性物質と水が接触したときに起こる水のエントロピー減少を抑制するものである。
陰イオンのカオトロピックイオンとしては、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン、塩化物イオン、酢酸イオン等が挙げられる。また、陽イオンのカオトロピックイオンとしては、バリウムイオン、カルシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、グアニジンイオン等が挙げられる。
これらのカオトロピックイオンの中で第５の発明に用いられるものは、陰イオンとして、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン等を、陽イオンとして、バリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、グアニジンイオン等を用いるのが好ましい。さらに、より好ましくは、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、ヨウ化物イオン、チオシアン酸イオン、過塩素酸イオン、硝酸イオン、グアニジンイオン等が用いられる。
上記溶離液中のカオトロピックイオンの濃度が、０．１ｍＭより低いとヘモグロビン類の測定において、分離効果が低下するおそれがあり、また、３０００ｍＭよりも高いと、ヘモグロビン類の分離効果はそれ以上向上しないので、０．１ｍＭ〜３０００ｍＭが好ましく、１ｍＭ〜１０００ｍＭがより好ましく、更に、１０ｍＭ〜５００ｍＭが好ましい。
また、カオトロピックイオンは複数種混合して用いても良い。
上記カオトロピックイオンは、測定試料と接触する液、例えば、溶血試薬、試料希釈液等に添加しても良い。
【００３１】
また、上記溶離液のｐＨは、４．０〜６．８であることが好ましく、さらに好ましくは４．５〜５．８である。溶離液のｐＨが４未満であると、ヘモグロビン類が変性する可能性があり、ｐＨが６．８を超えると、ヘモグロビン類のプラス荷電が減少し、陽イオン交換基に保持されにくくなり、ヘモグロビン類の分離が悪くなる。
【００３２】
尚、上記溶離液のｐＨは、例えば、後述のｐＨ調節剤の添加量により調節できる。
上記ｐＨの異なる２種類以上の溶離液を、勾配溶出法、あるいは段階溶出法によって送液しても良い。
【００３３】
本発明６では、上記溶離液Ａ及び溶離液Ｂとは溶出力が異なる溶離液Ｃを用い、該溶離液ＣはＨｂＡ０を溶出するために用い、カラムに流入する際のｐＨが、ヘモグロビン類の等電点と等しいか、または、等電点よりアルカリ側になるように設定されているものを用いる。また上記溶離液Ｃは、ＨｂＡ０以外の成分の溶出、例えば、ＨｂＳやＨｂＣの溶出に用いることもでき、また、測定終了時におけるカラム洗浄液としても用いることができる。
【００３４】
本発明６において、ＨｂＡ０の溶出に際し、すなわち、ＨｂＡ１ｃより強く充填剤に保持されたＨｂＡ等から成る「ＨｂＡ０成分」を溶出するためには、カラムに流入する際のｐＨをヘモグロビンの等電点よりアルカリ側になるように設定した溶離液を用いるのが好ましい。この条件を実現するには、ｐＨがヘモグロビンの等電点よりアルカリ側であるひとつの溶離液を送液する方法や、ｐＨの異なる２種以上の溶離液を用いる方法がある。
ヘモグロビンはｐＨが等電点より酸性側からアルカリ側になると、総荷電がプラスからマイナスに変わるため、充填剤の陽イオン交換基との「電気的反発力によってＨｂＡ０成分を溶出」させることができる。
なお、理化学辞典（第４版、１９８７年９月、岩波書店、久保亮五ら編集）、１１７８頁に記載されているように、ヘモグロビンの等電点はｐＨ６．８〜７．０である。そのため、ＨｂＡ０成分を溶出するために、カラムに流入する際の溶離液のｐＨを６．８以上にすることがより好ましい。
この条件を満たすため、測定に用いる溶離液の内、少なくともひとつの溶離液のｐＨが６．８以上であることが必要である。本溶離液のｐＨは望ましくは７．０〜１２．０であり、７．５〜１１．０がより好ましく、更には８．０〜９．５が好ましい。溶離液のｐＨが６．８未満になるとＨｂＡ０成分の溶出が不十分となる。溶離液のｐＨは、用いる充填剤の分解が起こらない範囲に設定すれば良い。
ＨｂＡ０成分の溶出に好適に用いられるｐＨが６．８以上で緩衝能をもつ溶離液としては、例えば、リン酸、ホウ酸、炭酸等の無機酸または、その塩；クエン酸等のヒドロキシカルボン酸、β、β−ジメチルグルタル酸等のカルボン酸誘導体、マレイン酸等のジカルボン酸、カコジル酸、等の有機酸または、その塩からなる緩衝液が挙げられる。その他、２−（Ｎ−モリホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス−（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓｔｒｉｓ）、Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、Ｂｉｓｔｒｉｓｐｒｏｐａｎｅ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、グリシルグリシン、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ等の一般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれるものも使用できる。また、ＢｒｉｔｔｏｎとＲｏｂｉｎｓｏｎの緩衝液；ＧＴＡ緩衝液も使用できる。また、イミダゾール等のイミダゾール類；エチレンジアミン、メチルアミン、エチルアミン、トリエチルアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等のアミン類；グリシン、β−アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン等のアミノ酸類；等の有機物も使用できる。
また、無機酸；有機酸；無機酸または有機酸の塩；有機物は、複数混合して用いても良く、また、有機酸、無機酸及び有機物を混合しても良い。
【００３５】
本発明７の溶離液Ｃには、カオトロピックイオンが含有されている。すなわち、より効果的にＨｂＡ０成分を溶出するためには、上記溶離液にカオトロピックイオンを添加するのが好ましい。
添加するカオトロピックイオンの種類は、上述の発明５におけるものと同様のものがあげられる。また、その濃度は、１〜３０００ｍＭが好ましく、より好ましくは１０〜１０００ｍＭであり、特に好ましくは５０〜５００ｍＭの範囲である。。
【００３６】
さらに本発明における上記溶離液群には、以下の物質を添加しても良い。
（１）無機塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウム等）を添加しても良い。これらの塩類の濃度は、特に限定されないが、好ましくは１〜１５００ｍＭである。
（２）ｐＨ調節剤として、公知の酸、塩基を加えても良い。酸としては、例えば、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸等が、塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。これらの酸、塩基の濃度は、特に限定されないが、好ましくは、０．００１〜５００ｍＭである。
（３）メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン等の水溶性有機溶媒を混合しても良い。これらの有機溶媒の濃度は、特に限定されないが、好ましくは０〜８０％（ｖ／ｖ）であり、カオトロピックイオン、無機酸、有機酸、これらの塩等が析出しない程度で用いるのが好ましい。
（４）アジ化ナトリウム、チモール等の防腐剤を添加しても良い。
（５）ヘモグロビンの安定剤として、公知の安定剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤、グルタチオン、アジ化ナトリウム等の還元剤・酸化防止剤等を添加しても良い。
【００３７】
本発明における上記溶離液Ａ・Ｂ・Ｃでは、緩衝能を持つ物質としては、酸解離定数（ｐＫａ）が、２．１５〜６．３９及び６．４０〜１０．５０の範囲に存在するものが用いるのが好ましい。すなわち、緩衝剤として、ｐＫａを、２．１５〜６．３９及び６．４０〜１０．５０の範囲に少なくとも一つずつもつ単一の物質を用いても良く、あるいは、２．１５〜６．３９の範囲に少なくとも一つのｐＫａをもつ物質と６．４０〜１０．５０の範囲に少なくとも一つのｐＫａをもつ物質とを組み合わせて緩衝剤として用いても良い。また、上記緩衝剤を複数組み合わせて用いても良い。
上記緩衝剤のｐＫａの範囲は、測定目的のピークを分離するのに適切な溶離液のｐＨ付近において、より優れた緩衝能を発揮できるように、２．６１〜６．３９及び６．４０〜１０．５０の範囲が好ましく、より好ましくは、２．８０〜６．３５及び６．８０〜１０．００の範囲である。さらに好ましくは、３．５０〜６．２５及び７．００〜９．５０の範囲である。
上記緩衝剤としては、例えば、リン酸、ホウ酸、炭酸等の無機物のほか、カルボン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン酸、アニリンまたはアニリン誘導体、アミノ酸、アミン類、イミダゾール類、アルコール類等の有機物が挙げられる。また、エチレンジアミン四酢酸、ピロリン酸、ピリジン、カコジル酸、グリセロールリン酸、２，４，６−コリジン、Ｎ−エチルモルホリン、モルホリン、４−アミノピリジン、アンモニア、エフェドリン、ヒドロキシプロリン、ペリジン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、グリシルグリシン等の有機物でも良い。
上記カルボン酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、安息香酸等が挙げられる。
上記ジカルボン酸としては、例えば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイン酸、フタル酸、フマル酸等が挙げられる。
上記カルボン酸誘導体としては、例えば、β，β’−ジメチルグルタル酸、バルビツール酸、５，５−ジエチルバルビツール酸、γ−アミノ酪酸、ピルビン酸、フランカルボン酸、ε−アミノカプロン酸等が挙げられる。
上記ヒドロキシカルボン酸としては、例えば、酒石酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸等が挙げられる。
上記アニリンまたはアニリン誘導体としては、例えば、アニリン、ジメチルアニリン等が挙げられる。
上記アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシン、α−アラニン、β−アラニン、ヒスチジン、セリン、ロイシン等が挙げられる。
上記アミン類としては、例えば、エチレンジアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジエタノールアミン等が挙げられる。上記イミダゾール類としては、例えば、イミダゾール、５（４）−ヒドロキシイミダゾール、５（４）−メチルイミダゾール、２，５（４）−ジメチルイミダゾール等が挙げられる。
上記アルコール類としては、例えば、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−エチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール等が挙げられる。
また、上記緩衝剤としては、２−（Ｎ−モリホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス−（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミドジ酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ）プロパン（Ｂｉｓｔｒｉｓｐｒｏｐａｎｅ）、Ｎ−（アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−（Ｎ−モルフォリン）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン（Ｔｒｉｓ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、グリシルグリシン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、グリシン、シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等の一般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれるものを組成する物質も使用できる。これらの物質のｐＫａを表１・２に示す（引用文献：堀尾武一・山下仁平 蛋白質・酵素の基礎実験法 南江堂 １９８５年）。
【００３８】
【表１】
【００３９】
【表２】
【００４０】
溶離液中の上記緩衝剤濃度は、緩衝作用がある範囲であれば良く、好ましくは１〜１０００ｍＭ、より好ましくは１０〜５００ｍＭである。また、上記緩衝剤は、単独でも複数混合して用いても良く、例えば、有機物と無機物を混合して用いても良い。
また、その場合、測定目的のピークを分離するにあたって用いる溶離液は、同一の緩衝剤を含むものを用いるのが好ましいが、溶離液を切り替える際の、（検出器出力の）ベースライン変動が、測定値に悪影響を与えなければ、その必要はない。
さらに、ベースライン変動をより小さくするために、上記測定目的のピークを分離するにあたって用いる溶離液は、緩衝剤の濃度も同一であるものを用いるのがより好ましい。
【００４１】
（溶出方法）
本発明の溶離液は、ヘモグロビン類の分離能、特にＨｂＡｃ１の分離のために特定の溶出方法を用いることができる。
すなわち、本発明の特定の局面では、ＨｂＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン類の溶出にｐＨ４．０〜６．８の溶離液を少なくとも２種類（溶離液Ａ、Ｂ）以上用い、ＨｂＡ０の溶出に溶離液Ｃを用いる方法、或いは、ＨｂＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン類の溶出に少なくとも２種類（溶離液Ａ、Ｂ）以上用い、かつ、溶出力の最も弱い溶離液を先に流し、目的のピークが最適に分離溶離されるように溶離液Ａ、Ｂを交互に流す方法を用いる。
これにより、Ｈｂ類特に安定型ＨｂＡ１ｃをシャープに溶出することができる。
【００４２】
さらに、本発明の特定の局面では、安定型ＨｂＡ１ｃの測定に悪影響を与える可能性のあるのヘモグロビン成分（ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等）を含む血液検体を測定する場合、上記ＨｂＡ０成分を、ＨｂＡと測定に悪影響を与えるＨｂ類（ＨｂＡ２、ＨｂＳ及びＨｂＣ）とに分離し、ＨｂＡを溶出させた後に、測定に悪影響を与える上記Ｈｂ類（ＨｂＡ２、ＨｂＳ及びＨｂＣ）を溶離させる測定方法であるので、ＨｂＡ０ピークからＨｂＡ以外のヘモグロビン成分を除けることができ、より正確な安定型ＨｂＡ１ｃ（％）を算出できる。
ここで、上記ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等を溶離させる場合におけるＨｂＡ０を溶出するための溶離液とは、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等を含みＨｂＡを主成分とするＨｂＡ０ピークを溶出するために用いる溶離液を意味する。この場合では、ＨｂＡ０を溶出するための溶離液の後に、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等を溶離するために、より溶出力の強い溶離液を送液することが必要となる場合がある。
【００４３】
またさらに、本発明の特定の局面では、勾配溶出法または段階溶出法によって溶離液を送液するに際し、分離対象のピークまたはピーク間の溶離タイミングを考慮して分離対象のピークまたはピーク間の分離状態が良くなるように、溶離液の溶出力を一旦低下させる。
具体的には、段階溶出法の場合、溶出力の弱い溶離液から溶出力の強い溶離液に切り替えて送液した後、溶出力の弱い溶離液に切り替え、しばらくしてから溶出力の強い溶離液に切り替えて送液する。
本発明の方法を段階溶出法によって行う場合の装置の構成例を図１に示した。溶離液Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄは、各々溶出力の異なる（例えば、塩濃度、ｐＨ、極性等において異なる）ものであり、電磁弁１によって設定時間に各溶離液に切り替えられるように構成されている。溶離液は、送液ポンプ２により、試料注入部３から導入された試料とともにカラム４に導かれ、各成分が検出器５により検出される。各ピークの面積、高さ等はインテグレータ６により算出される。
【００４４】
（充填剤）
本発明のヘモグロビン類の測定方法における陽イオン交換液体クロマトグラフィーの充填剤は、少なくとも１種以上のカチオン交換基を有している粒子よりなるものであり、例えば、高分子粒子にカチオン交換基を導入することで得られる。
【００４５】
該カチオン交換基は、公知のものでよく特に制限はない。例えば、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基などのカチオン交換基等が挙げられる。また、このカチオン交換基は、複数種導入しても良い。
【００４６】
上記粒子の直径は、好ましくは０．５〜２０μｍ、より好ましくは１〜１０μｍである。
また、粒度分布は、変動係数値（ＣＶ値）（粒径の標準偏差÷平均直径×１００）として、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下である。
【００４７】
上記高分子粒子としては、例えば、シリカ、ジルコニアなどの無機系粒子；セルロース、ポリアミノ酸、キトサンなどの天然高分子粒子；ポリスチレン、ポリアクリル酸エステルなどの合成高分子粒子などが挙げられる。
上記高分子粒子は、導入されるイオン交換基以外の構成成分は、より親水性であることが好ましい。また耐圧性・耐膨潤性の点から架橋度の高いものが好ましい。
【００４８】
上記高分子粒子へのカチオン交換基の導入は、公知の方法により行うことができるが、例えば、高分子粒子を調製後、粒子が有する官能基（水酸基、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基など）に、化学反応でカチオン交換基を粒子に導入させる方法により行うことができる。
【００４９】
また、カチオン交換基を有する単量体を重合して高分子粒子を調製する方法によってもカチオン交換充填剤を調製できる。例えば、カチオン交換基含有単量体と架橋性単量体等とを混合し、重合開始剤の存在下に重合する方法などが挙げられる。
【００５０】
また、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチルなどの重合性カチオン交換基含有エステルを架橋性単量体などと混合し、重合開始剤存在下で重合した後、得られた粒子を加水分解処理し、エステルをカチオン交換基に変換させてもよい。
【００５１】
更に、特公平８−７１９７号公報に記載のように、架橋重合体粒子を調製した後、カチオン交換基を有する単量体を添加して、重合体粒子の表面付近に、該単量体を重合させても良い。
【００５２】
上記充填剤はカラムに充填されて液体クロマトグラフィー測定に用いられる。上記カラムは公知のステンレス製、ガラス製、樹脂製など、特に限定されない。カラムサイズとしては、内径０．１〜５０ｍｍ、長さ１〜３００ｍｍのものが好ましく、内径０．２〜３０ｍｍ、長さ５〜２００ｍｍのものがより好ましい。充填剤のカラムへの充填方法は、公知の任意の方法が使用できるがスラリー充填法がより好ましい。具体的には、例えば、充填剤粒子を溶離液などの緩衝液に分散させたスラリーを送液ポンプなどによりカラムに圧入することにより行う。
【００５３】
本発明方法で用いるカラムのフィルターまたはプレフィルターとしては、イナートな素材からなるフィルター、または、そのフィルターの表面がイナートな素材で覆われているフィルターを用いるのが好ましい。
【００５４】
本発明でカラムのフィルターまたはプレフィルターの表面素材として用いるフィルターのイナートな素材としては、セルロースエステル、セルロースアセテート、セルローストリアセテート、セルロース、セルロースナイトレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフロライド、ポリスルフォン、ポリエチレン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリフッ化ビニリデン、ガラス素材、アクリル共重合体、酸化物セラミック、炭化物セラミック、窒化物セラミック、珪化物セラミック、硼化物セラミック、チタンから成る群の中から少なくとも一つ、または、複数組み合わせてなることを特徴とする。
【００５５】
上記フィルターの形状は、メンブレンフィルター、繊維を積層し焼結したもの、微粒子を焼結成型したものなどがある。
【００５６】
本発明に使用されるＬＣ装置は、公知のもので良く、例えば、送液ポンプ、試料注入装置（サンプラ）、カラム、検出器等から構成される。また、他の付属装置（カラム恒温槽や溶離液の脱気装置等）が適宜付加されても良い。
【００５７】
上記測定法における、他の測定条件としては、公知の条件で良く、溶離液の流速は、好ましくは０．０５〜５ｍＬ／分、より好ましくは０．２〜３ｍＬ／分である。ヘモグロビン類の検出は、４１５ｎｍの可視光が好ましいが、特にこれのみに限定されるわけではない。測定試料は、通常、界面活性剤等溶血活性を有する物質を含む溶液により溶血された溶血液を希釈したものを用いる。試料注入量は、血液検体の希釈倍率により異なるが、好ましくは０．１〜１００μＬ程度である。
【００５８】
【実施例】
以下に実施例、比較例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００５９】
（実施例１）
充填剤の調製
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学製）４５０ｇにベンゾイルパーオキサイド２．０ｇを混合して溶解させ、２．５Ｌの４重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。
これを窒素雰囲気下で攪拌しながら昇温し、８０℃で１．５時間重合させた。反応系を３５℃に冷却した後、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東京化成製）２００ｇを添加して１時間攪拌し、再び８０℃で１．３時間重合させた。
重合後、洗浄し、分級して平均粒径６．５μｍの充填剤を得た。
【００６０】
充填剤のカラムへの充填
得られた粒子をカラムに以下のようにして充填した。粒子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）３０ｍＬに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製の空カラム（内径４．６×３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填した。
【００６１】
ヘモグロビン類の測定
得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘモグロビン類の測定を行った。
測定開始より０〜２．５分の間は溶離液Ｂを送液し、２．５〜３．０分の間は溶離液Ａを送液し、３．０〜３．１分の間は溶離液Ｃを送液し、３．１〜４．０分の間は溶離液Ｂを送液した。
流速：２．０ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μＬ
【００６２】
（測定試料）
健常人血をフッ化ナトリウム採血した全血検体から以下の試料を調製した。なお、溶血試薬として、０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）（東京化成社製）を含有させたリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０）を用いた。
【００６３】
（測定結果）
図２に示すように、不安定型HbA1c と安定型HbA1c が良好に分離した。ピーク１はＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ、ピーク２はＨｂＦ、ピーク３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５はＨｂＡ０を示す。
また、安定型HbA1c の後ろに、妨害ピークが出ず、表３に示すように、安定型HbA1c の測定再現性は、良好であった。
【００６４】
【表３】
【００６５】
（溶離液A,B の溶出力の評価）
測定試料は、グリゴHbコントロール（国際試薬株式会社）のレベル(II)を添付資料に基づいて調製して用いた。
測定条件は、溶出力を評価する溶離液と上記溶離液Ｃを用い、溶離液Ｃの影響が無いように、溶出力を評価する溶離液を長時間を流して、安定型HbA1c の保持時間を求めた。
その結果、溶離液A ：3.0 分、溶離液Ｂ：2.2 分であった。
【００６６】
（実施例２）
充填剤の調製
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学製）４５０ｇにベンゾイルパーオキサイド２．０ｇを混合して溶解させ、２．５Ｌの４重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。
これを窒素雰囲気下で攪拌しながら昇温し、８０℃で１．５時間重合させた。反応系を３５℃に冷却した後、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東京化成製）２００ｇを添加して１時間攪拌し、再び８０℃で１．３時間重合させた。
重合後、洗浄し、分級して平均粒径６．５μｍの充填剤を得た。
【００６７】
充填剤のカラムへの充填
得られた粒子をカラムに以下のようにして充填した。粒子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）３０ｍＬに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製の空カラム（内径４．６×３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填した。
【００６８】
ヘモグロビン類の測定
得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘモグロビン類の測定を行った。
【００６９】
測定開始より０〜０．６分の間は溶離液Ａを送液し、０．６〜０．９分の間は溶離液Ｂを送液し、０．９〜１．２分の間は溶離液Ａを送液し、１．２〜１．３分の間は溶離液Ｃを送液し、１．３〜１．８分の間は溶離液Ａを送液した。
流速：２．０ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μＬ
【００７０】
（測定試料）
健常人血をフッ化ナトリウム採血した全血検体から以下の試料を調製した。なお、溶血試薬として、０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）（東京化成社製）を含有させたリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０）を用いた。
ａ）糖負荷血：全血検体に５００ｍｇ／ｄＬのグルコース水溶液を添加し、３７℃で３時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、１５０倍に希釈して試料ａとした。
ｂ）ＣＨｂ含有試料：全血検体１０ｍＬに、０．３重量％のシアン酸ナトリウムの生理食塩水溶液１ｍＬを添加し、３７℃で３時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、１５０倍に希釈して試料ｂとした。
ｃ）ＡＨｂ含有試料：全血検体１０ｍＬに、０．３重量％のアセトアルデヒドの生理食塩水溶液１ｍＬを添加し、３７℃で３時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、１５０倍に希釈して試料ｃとした。
【００７１】
（測定結果）
上記測定条件により、試料を測定して得られたクロマトグラムを図３〜５に示す。図３は試料ａ、図４は試料ｂ、図５は試料ｃを測定した結果である。ピーク６はＣＨｂ、ピーク７はＡＨｂを示す。
図３では、ピーク３および４が良好に分離されている。また、図４ではピーク６（ＣＨｂ）、図５ではピーク７（ＡＨｂ）がピーク４から良好に分離されている。
【００７２】
（溶離液A,B の溶出力の評価）
測定試料は、グリゴHbコントロール（国際試薬株式会社）のレベル(II)を添付資料に基づいて調製して用いた。
測定条件は、溶出力を評価する溶離液と上記溶離液Ｃを用い、溶離液Ｃの影響が無いように、溶出力を評価する溶離液を長時間を流して、安定型HbA1c の保持時間を求めた。
その結果、溶離液A ：2.5 分、溶離液Ｂ：1.7 分であった。
【００７３】
（浸透圧の測定）
溶離液Ａ、Ｂの浸透圧を浸透圧測定装置（オズモスタット（OM-6020 ）、京都第一科学社製）で測定した。その結果、溶離液Ａ：163mOsm(3985.35hpa) 、溶離液Ｂ：220mOsm(5379hpa)であった。
【００７４】
（緩衝能の差の評価）
溶離液Ａ、Ｂそれぞれ100ml に0.1 モル/ Ｌの水酸化ナトリウム（和光純薬）1ml 添加した時のpH増加分をｐＨ測定装置（カスタニーLABpH メーター（F23)、堀場製作所社製）で測定した。その結果、緩衝能の差は、0.002 であった。
【００７５】
（実施例３）
溶離液を以下の組成としたこととカラムのフィルターにポリエチレン製のフィルター（直径５ｍｍ×厚さ１．５ｍｍ）を用いたことの他は、実施例２と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図２〜４と同様に良好であった。
【００７６】
（溶離液A,B の溶出力の評価）
測定試料は、グリゴHbコントロール（国際試薬株式会社）のレベル(II)を添付資料に基づいて調製して用いた。
測定条件は、溶出力を評価する溶離液と上記溶離液Ｃを用い、溶離液Ｃの影響が無いように、溶出力を評価する溶離液を長時間を流して、安定型HbA1c の保持時間を求めた。
その結果、溶離液A ：2.6 分、溶離液Ｂ：1.8 分であった。
【００７７】
（浸透圧の測定）
溶離液Ａ、Ｂの浸透圧を浸透圧測定装置（オズモスタット（OM-6020 ）、京都第一科学社製）で測定した。その結果、溶離液Ａ：162mOsm(3960.9hpa)、溶離液Ｂ：218mOsm(5330.1hpa)であった。
【００７８】
（緩衝能の差の評価）
溶離液Ａ、Ｂそれぞれ100ml に0.1 モル/ Ｌの水酸化ナトリウム（和光純薬）1ml 添加した時のpH増加分をｐＨ測定装置（カスタニーLABpH メーター（F23)、堀場製作所社製）で測定した。その結果、緩衝能の差は、0.050 であった。
【００７９】
（比較例１）
溶離液を以下の組成としたことと送液方法を以下のようにした他は、実施例２と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。
測定開始より０〜０．８分の間は溶離液Ｄを送液し、０．８〜１．２分の間は溶離液Ｅを送液し、１．２〜１．３分の間は溶離液Ｆを送液し、１．３〜１．８分の間は溶離液Ｄを送液した。
【００８０】
得られたクロマトグラムを図６〜８に示す。図６は試料ａ、図７は試料ｂ、図８は試料ｃを測定した結果である。 図３〜５に比較して、いずれもHbA1c ピークの後ろに妨害ピークが出現して、測定試料ａを測定した場合、表３に示すようにHbA1c 測定再現性が実施例１〜３比べて比較例１が悪いことが明らかである。
【００８１】
（溶離液D,Eの溶出力の評価）
測定試料は、グリゴHbコントロール（国際試薬株式会社）のレベル(II)を添付資料に基づいて調製して用いた。
測定条件は、溶出力を評価する溶離液と上記溶離液Ｆを用い、溶離液Ｆの影響が無いように、溶出力を評価する溶離液を長時間を流して、安定型HbA1cの保持時間を求めた。
その結果、溶離液Ｄ：2.5 分、溶離液Ｅ：1.7 分であった。
【００８２】
（浸透圧の測定）
溶離液Ｄ、Ｅの浸透圧を浸透圧測定装置（オズモスタット（OM-6020 ）、京都第一科学社製）で測定した。その結果、溶離液Ｄ：163mOsm(3985.35hpa) 、溶離液Ｅ：220mOsm(5379hpa)であった。
【００８３】
（緩衝能の差の評価）
溶離液Ｄ、Ｅそれぞれ100ml に0.1 モル/ Ｌの水酸化ナトリウム（和光純薬）1ml 添加した時のpH増加分をｐＨ測定装置（カスタニーLABpH メーター（F23)、堀場製作所社製）で測定した。その結果、緩衝能の差は、-0.002であった。
【００８４】
（比較例２）
溶離液を以下の組成としたことの他は、比較例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。
測定開始より０〜０．８分の間は溶離液Ｈを送液し、０．８〜１．２分の間は溶離液Ｉを送液し、１．２〜１．３分の間は溶離液Ｊを送液し、１．３〜１．８分の間は溶離液Ｈを送液した。
【００８５】
得られたクロマトグラムを図９〜１１に示す。図９は試料ａ、図１０は試料ｂ、図１１は試料ｃを測定した結果である。 実施例１〜３及び比較例１よりも、不安定型HbA1c 、CHb 及びAHb の分離が悪くなった。
【００８６】
（溶離液H,I の溶出力の評価）
測定試料は、グリゴHbコントロール（国際試薬株式会社）のレベル(II)を添付資料に基づいて調製して用いた。
測定条件は、溶出力を評価する溶離液と上記溶離液Ｊを用い、溶離液Ｊの影響が無いように、溶出力を評価する溶離液を長時間を流して、安定型HbA1c の保持時間を求めた。
その結果、溶離液Ｈ：2.5 分、溶離液Ｉ：1.7 分であった。
【００８７】
（浸透圧の測定）
溶離液Ｈ、Ｉの浸透圧を浸透圧測定装置（オズモスタット（OM-6020 ）、京都第一科学社製）で測定した。その結果、溶離液Ｈ：163mOsm(3985.35hpa) 、溶離液Ｉ：220mOsm(5379hpa)であった。
【００８８】
（緩衝能の差の評価）
溶離液Ｈ、Ｉそれぞれ100ml に0.1 モル/ Ｌの水酸化ナトリウム（和光純薬）1ml 添加した時のpH増加分をｐＨ測定装置（カスタニーLABpH メーター（F23)、堀場製作所社製）で測定した。その結果、緩衝能の差は、0.050 であった。
【００８９】
（カラム耐久性の評価）
実施例１〜３及び比較例１の溶離条件で、上記測定サンプルａを１００検体づつ連続測定し、カラム耐久性を評価した。
図１２に示すように、実施例１〜３では、ＨｂＡ１ｃ測定値は、１０００検体まで一定であったが、比較例１では連続測定するに従って、ＨｂＡ１ｃピークに妨害ピークが重なり、測定値が次第に大きくなった。
【００９０】
【発明の効果】
本発明のヘモグロビン類の測定方法は、上述の通り構成され、勾配溶出法または段階溶出法を用いたカチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法において、ヘモグロビン類の分離を短時間で、高分離能で行うことができ、さらに測定再現性の優れたヘモグロビン類の測定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】カチオン交換液体クロマトグラフィー装置の構成例を示す図。
【図２】実施例１の測定条件により、ヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図３】実施例２の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図４】実施例２の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｂ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図５】実施例２の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｃ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図６】比較例１の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図７】比較例１の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｂ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図８】比較例１の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｃ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図９】比較例２の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１０】比較例２の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｂ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１１】比較例２の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｃ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１２】実施例１〜３及び比較例１における測定回数の増加にともなう安定型ＨｂＡ１ｃ値の変動を示す図。
【図１３】勾配溶出法による溶離液の送液方法を示す図。
【図１４】段階溶出法による溶離液の送液方法を示す図。
【符号の説明】
１ ＨｂＡ１ａ及びｂのピーク
２ ＨｂＦのピーク
３ 不安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
４ 安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
５ ＨｂＡ０のピーク
６ ＣＨｂのピーク
７ ＡＨｂのピーク
８ 妨害ピーク
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法に関し、より詳細には、カチオン交換液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、液体クロマトグラフィー（以下、ＬＣという）を用いて試料を分離する場合、溶離液として、一定の溶出力のものを１種類用いる方法や、２種以上の溶離液を用いた勾配溶出法または段階溶出法により、各成分のピークを鋭くし、分離度を改善したり、測定時間を短縮する方法が行われている。
【０００３】
上記勾配溶出法（グラジエント溶離法）とは、溶離液の溶出力を弱いものからから強いものへと時間的に直線的に上昇させる方法（図１３）であり、送液ポンプを複数台用いて、溶出力の異なる液を送液し、その比率を連続的に変化させることにより、全体的な溶出力を変化させる方法である。
【０００４】
また、上記段階溶出法（ステップワイズ溶離法）とは、溶離液の溶出力を段階的に上昇させる方法（図１４）であり、送液ポンプ１台を用い、送液ポンプの上流側で電磁弁等により溶出力の異なる液を切り替え、段階的に溶出力を変化させる方法である。
【０００５】
これらの方法において、溶離液の溶出力を変化させるには、例えば、溶離液の極性、イオン強度、ｐＨなどが挙げられる。（以上の従来の技術については、日本分析化学会関東支部編、高速液体クロマトグラフィーハンドブック、３９〜４０頁、１１７〜１１９頁、１９８５年）。
【０００６】
しかしながら、各成分の性質が類似していたり、短時間で溶出することが要求されていたりする場合、勾配溶出法で勾配が大きすぎたり、段階溶出法で溶出力を上げすぎたりすると、類似した性質の成分間でピークが重なり、分離に悪影響を及ぼす恐れがある。
そこで、このような場合、ピークが重なるポイントで勾配を緩めたり、全くなくしたり、溶出力の上昇の程度を低くしたりしている。しかしながら、このような対策ではピークの鋭さがなくなったり、また、測定時間が延びたりするなど、勾配溶出法または段階溶出法の利点が発揮されない場合があった。
【０００７】
一方、上記液体クロマトグラフィーは、最近臨床検査分野で広く用いられており、特に、血液試料中に含まれている夾雑成分の中から測定対象成分を分離したり、性質の似た複数の成分を相互に分離分析したり、特定の成分を分取するために用いられている。
【０００８】
その中でも、糖化ヘモグロビン、特にヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）は糖尿病診断の指標として広く利用されている。ＨｂＡ１ｃとは血液中の糖が赤血球に入った後に、ヘモグロビンと不可逆的に結合して生成したものであり、過去１〜２カ月間の血液中の平均的な糖濃度を反映する。
【０００９】
液体クロマトグラフィー法によるＨｂＡ１ｃの測定は、主にカチオン交換液体クロマトグラフィー法により行われている（特公平８−７１９８号公報など）。溶血液試料をカチオン交換液体クロマトグラフィーにより分離すると、通常、ヘモグロビンＡ１ａ（以下、ＨｂＡ１ａという）及びヘモグロビンＡ１ｂ（以下、ＨｂＡ１ｂという）、ヘモグロビンＦ（以下、ＨｂＦという）、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ並びにヘモグロビンＡ０（以下、ＨｂＡ０という）などのピークが出現する。なお、糖尿病の診断の指標として使用されているＨｂＡ１ｃは、最近では、上記のうちの安定型ＨｂＡ１ｃであり、その割合は、全ヘモグロビンピークの面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃピークの面積の比率（％）として求められている。
【００１０】
しかしながら安定型ＨｂＡ１ｃピークと不安定型ＨｂＡ１ｃピークの分離が困難であるため、通常、精度良く安定型ＨｂＡ１ｃピークのみを測定することが困難であった。
【００１１】
また、時に、アセチル化ヘモグロビン（以下、ＡＨｂという）やカルバミル化ヘモグロビン（以下、ＣＨｂという）等の「修飾ヘモグロビン」が安定型ＨｂＡ１ｃと重なって溶離してくるという問題があった。
すなわち、カチオン交換ＬＣによる安定型ＨｂＡ１ｃ値の測定を目的として、血液検体のヘモグロビン類を測定する際、安定型ＨｂＡ１ｃの測定値に影響を与えないように、安定型ＨｂＡ１ｃと溶出挙動が近似している不安定型ＨｂＡ１ｃやＡＨｂ及びＣＨｂピークを、安定型ＨｂＡ１ｃピークから分離することが困難であった。
【００１２】
さらに、「異常ヘモグロビン」としてヘモグロビンＳ（以下、ＨｂＳという）ヘモグロビンＣ（以下、ＨｂＣという）が知られている。ＨｂＳはヘモグロビンＡ（以下、ＨｂＡという）のβ鎖のＮ末端から６番目のグルタミン酸がバリンに置換されたものであり、ＨｂＣは同じ部位がリジンに置換されたものである。これらＨｂＳ、ＨｂＣ、及び下記するＨｂＡ２は、ＨｂＡ０より後に順に溶出される。
そして、これらＨｂＳ、ＨｂＣを含む検体の安定型ＨｂＡ１ｃを測定するときには、これらのピーク面積を除いた他のヘモグロビン成分の合計ピーク面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃピーク面積の比率（％）を算出して求める必要がある。
【００１３】
また、ヘモグロビンＡ２（以下、ＨｂＡ２と略す）は、α鎖とδ鎖から成るヘモグロビンであり、ＨｂＦと共に地中海性貧血症（tha lassemia）においてその構成比率が正常者より高い。
そして、上記地中海性貧血症を同時に検査したい場合には、ＨｂＡ２をＨｂＡ０から分離できるような溶離条件を設定する。この場合は、全ヘモグロビンに対するＨｂＦとＨｂＡ２の構成比率が測定結果として算出される。
【００１４】
しかしながら、ＨｂＡ０とＨｂＳ、ＨｂＣ及びＨｂＡ２とのカラムに対する保持能力が近いため、これらのピークを完全に分離するためには、時間を要していただけでなく、精度良く測定することが困難であった。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記従来のヘモグロビン類の測定方法の問題点に鑑み、ヘモグロビン類の分離を短時間で、高分離能で行うことができ、さらに測定再現性の優れたヘモグロビン類の測定方法を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の本発明（以下、本発明１という）では、カチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法において、溶出力の異なる少なくとも２種の溶離液（溶離液Ａ及び溶離液Ｂ）を用い、溶離液ＡのｐＨが、溶離液ＢのｐＨより大きく、溶離液Ａの安定型ヘモグロビンＡ１ｃ溶出力が、溶離液Ｂの安定型ヘモグロビンＡ１ｃ溶出力よりも小さいことを特徴とするヘモグロビン類の測定方法を提供する。
また、請求項２記載の本発明（以下、本発明２という）では、上記溶離液Ａの浸透圧が、上記溶離液Ｂの浸透圧よりも小さいことを特徴とする請求項１記載のヘモグロビン類の測定方法を提供する。
また、請求項３記載の本発明（以下、本発明３という）では、アルカリ性水溶液添加に対する上記溶離液Ａの緩衝能が、上記溶離液Ｂのそれよりも小さいか、あるいは、それと等しいことを特徴とする請求項１または２記載のヘモグロビン類の測定方法を提供する。
また、請求項４記載の本発明（以下、本発明４という）では、ヘモグロビン類の測定中の溶離液送液工程において、少なくとも、上記溶離液Ａを送液した後上記溶離液Ｂを送液する工程、あるいは、上記溶離液Ｂを送液した後上記溶離液Ａを送液する工程が含まれることを特徴とする請求項１〜３いずれか一項に記載のヘモグロビン類の測定方法を提供する。
また、請求項５記載の本発明（以下、本発明５という）では、上記溶離液Ａ及び／又は溶離液Ｂにカオトロピックイオンが含有されており、かつ、ｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ有機酸、無機酸及び／又はこれらの塩が含有されていることを特徴とする請求項１〜４いずれか一項に記載のヘモグロビン類の測定方法を提供する。
また、請求項６記載の本発明（以下、本発明６という）では、上記溶離液Ａ及び溶離液Ｂとは溶出力が異なる溶離液Ｃを用い、該溶離液Ｃは、ヘモグロビンＡ０を溶出するために用い、カラムに流入する際のｐＨが、ヘモグロビン類の等電点と等しいか、または、等電点よりアルカリ側になるように設定されていることを特徴とする請求項１〜５いずれか一項に記載のヘモグロビン類の測定方法を提供する。
また、請求項７記載の本発明（以下、本発明７という）では、上記溶離液Ｃにカオトロピックイオンが含有されていることを特徴とする請求項６記載のヘモグロビン類の測定方法を提供する。
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明１は、溶出力の異なる少なくとも２種の溶離液（本明細書中では、溶離液Ａ及び溶離液Ｂという）を用い、溶離液ＡのｐＨが、溶離液ＢのｐＨより大きく、溶離液Ａの安定型ヘモグロビンＡ１ｃ溶出力が、溶離液Ｂの安定型ヘモグロビンＡ１ｃ溶出力よりも小さいことを特徴とする。
【００１８】
本発明でいう溶離液の安定型ヘモグロビンＡ１ｃ溶出力は、カチオン交換液体クロマトグラフィーによる測定において、同一ロットの安定型ヘモグロビンＡ１ｃ試料を、同一カラム、同一分析条件（溶離液を除いて分析に影響する全ての条件が同じ）で、溶出力を評価する溶離液のみを用い、安定型ヘモグロビンＡ１ｃの保持時間を測定して、これを比較することにより求めることができる。
すなわち、溶離液Ａと溶離液Ｂの場合で、安定型ＨｂＡ１ｃの保持時間を測定したとき、保持時間がそれぞれＴA 、ＴB であったとすると、ＴA ＞ＴB （つまり溶離液Ｂの場合より溶離液Ａの場合の方が安定型ＨｂＡ１ｃの溶出に時間がかかる）である場合、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ溶出力は、溶離液Ａのほうが溶離液Ｂよりも小さいということになる。
上記溶離液の溶出力を変える方法としては、ｐＨや塩濃度、イオン強度、溶液の極性を変える方法が挙げられる。
【００１９】
本発明において上記溶離液ＡのｐＨが、溶離液ＢのｐＨより大きいとは、市販のｐＨ測定装置（例えば、カスタニーＬＡＢ ｐＨメーター（Ｆ２３）、堀場製作所社製）で溶離液Ａ及び溶離液Ｂを測定した場合、溶離液ＡのｐＨが溶離液ＢのｐＨより大きいということである。
具体的には、液温２０℃の場合、溶離液ＡのｐＨは溶離液Ｂに比べて、０．００１〜３．０００大きいことが好ましく、さらに好ましくは、０．０１０〜２．５００大きく、またさらには、０．０２０〜２．０００大きいものが好ましい。
【００２０】
上記溶離液Ａ及びＢは、ヘモグロビン類測定中の溶離液送液工程において、上記ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、異常ヘモグロビン（ＨｂＳ、ＨｂＣ）、ＨｂＡ２、及び修飾ヘモグロビン（ＡＨｂ、ＣＨｂ）を最適に分離できるように送液する。
【００２１】
測定に用いられる溶離液としては、上記溶離液Ａ、Ｂ以外にも近接したピークを分離するために他の溶離液を用いても良い。また、測定終了後は、カラム洗浄液、または、溶離液Ａ、Ｂより溶出力の強い溶離液でカラム洗浄を行うことが好ましい。
【００２２】
本発明２は、溶離液Ａの浸透圧が、溶離液Ｂの浸透圧よりも小さいことを特徴とする。
上記溶離液Ａの浸透圧が、溶離液Ｂの浸透圧よりも小さいとは、市販の浸透圧測定装置（例えば、オズモスタット（OM-6020)、京都第一科学社製）において、溶離液Ａ、Ｂの浸透圧を測定した場合、溶離液Ｂの浸透圧より溶離液Ａの浸透圧が小さいということである。
具体的には、上記装置において溶離液を測定した場合、溶離液Ｂの浸透圧は、溶離液Ａに比べて２４．４５〜２４４５０ｈＰａ（上記OM-6020 で測定した場合は、１〜１０００ｍＯｓｍ、１ｍＯｓｍ＝２４．４５ｈＰａ）大きく、より好ましくは、４８．９０〜１２２２５ｈＰａ（２〜５００ｍＯｓｍ）大きく、更には、１２２．２５〜７３３５ｈＰａ（５〜３００ｍＯｓｍ）大きいのが好ましい。
上記溶離液の浸透圧を変える方法としては、溶離液に酸、アルカリ、塩等を添加する方法が挙げられる。
【００２３】
本発明３は、アルカリ性水溶液添加に対する溶離液Ａの緩衝能が、溶離液Ｂのそれよりも小さいか、あるいは、それと等しいことを特徴とする。
【００２４】
上記アルカリ性水溶液添加に対する溶離液Ａの緩衝能が、溶離液Ｂのそれよりも小さいとは、例えば、溶離液Ａ及びＢ各１００ｍｌに０．１モル／Ｌの水酸化ナトリウム１ｍｌを添加した時、溶離液ＡのｐＨ増加分（Ｘ）が、溶離液ＢのｐＨ増加分（Ｙ）と比べて同等以上であることを意味する。
本発明においては、緩衝能の差（Ｋ）を以下のように定義する。
緩衝能の差Ｋ＝（溶離液ＡのｐＨ増加分Ｘ）−（溶離液ＢのｐＨ増加分Ｙ） 上記、溶離液の緩衝能の差（Ｋ）は、液温２０℃において、０．００１〜３．０００であることが好ましく、さらに好ましくは、０．００２〜１．０００である。
【００２５】
上記溶離液には、通常、緩衝能を有する物質として、無機酸、有機酸またはこれらの塩が含まれる。
上記無機酸としては、例えば、炭酸、リン酸等が挙げられる。上記有機酸としては、例えば、カルボン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン酸、アミノ酸、カコジル酸、ピロリン酸等が挙げられる。
上記カルボン酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸等が挙げられる。上記ジカルボン酸としては、例えば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸等が挙げられる。上記カルボン酸誘導体としては、例えば、β、β−ジメチルグルタル酸、バルビツール酸、アミノ酪酸等が挙げられる。上記ヒドロキシカルボン酸としては、例えば、クエン酸、酒石酸、乳酸等が挙げられる。上記アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、アスパラギン等が挙げられる。
上記無機酸または有機酸の塩としては、公知のもので良く、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。
上記無機酸、有機酸またはこれらの塩は、複数種混合して用いても良く、無機酸と有機酸を混合して用いても良い。
上記無機酸、有機酸及び／またはこれらの塩の溶離液中の濃度、複数種用いる場合には複数種の合計の濃度は、溶離液のｐＨを４．０〜６．８にする緩衝作用があれば良く、１〜１０００ｍＭが好ましく、１０〜５００ｍＭが特に好ましい。
【００２６】
本発明４においては、ヘモグロビン類測定中の溶離液送液工程は、少なくとも、上記溶離液Ａを送液した後上記溶離液Ｂを送液する工程、あるいは、上記溶離液Ｂを送液した後上記溶離液Ａを送液する工程を含むものである。
【００２７】
すなわち、上記送液方法とは、溶離液Ａ、ＢをＡ−Ｂ、Ａ−Ｂ−Ａ、Ａ−Ｂ−Ａ−Ｂ、Ａ−Ｂ−Ａ−Ｂ−Ａ・・・、または、Ｂ−Ａ、Ｂ−Ａ−Ｂ、Ｂ−Ａ−Ｂ−Ａ、Ｂ−Ａ−Ｂ−Ａ−Ｂ・・・・のように交互に流すことで、交互に流す回数、Ａ及びＢの順番は、近接したピークを分離溶離するために適宜最適なものにすることが好ましい。
また、測定に用いる溶離液としては、上記Ａ、Ｂ以外の溶離液を組み合わせても良い。
【００２８】
上記溶離液は、例えば、溶出力のより弱い溶離液ＡによりＨｂＡ１ａからＨｂＦ付近まで溶離し、次に溶出力の強い溶離液Ｂに切り替えてＨｂＡ１ｃまでを溶離し、再び、溶離液Ａを流し、その後溶出力の最も強い溶離液に切り替えてＨｂＡ０以降に溶出するヘモグロビン成分を溶出させる。このように、ＨｂＡ１ｃ溶離後、溶離液Ａを再び流すことにより、ＨｂＡ１ｃピーク近傍に、妨害ピークが出現せず、ＨｂＡ１ｃを正確にしかも再現性良く分離溶離できる。
【００２９】
本発明５では、溶離液Ａ及び／又は溶離液Ｂには、カオトロピックイオン、かつ、ｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ有機酸、無機酸及び／又はこれらの塩が含有されていることを特徴とする。
【００３０】
上記カオトロピックイオンとは、化合物が水溶液に溶解したときに解離により生じたイオンであり、水の構造を破壊し、疎水性物質と水が接触したときに起こる水のエントロピー減少を抑制するものである。
陰イオンのカオトロピックイオンとしては、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン、塩化物イオン、酢酸イオン等が挙げられる。また、陽イオンのカオトロピックイオンとしては、バリウムイオン、カルシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、グアニジンイオン等が挙げられる。
これらのカオトロピックイオンの中で第５の発明に用いられるものは、陰イオンとして、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン等を、陽イオンとして、バリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、グアニジンイオン等を用いるのが好ましい。さらに、より好ましくは、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、ヨウ化物イオン、チオシアン酸イオン、過塩素酸イオン、硝酸イオン、グアニジンイオン等が用いられる。
上記溶離液中のカオトロピックイオンの濃度が、０．１ｍＭより低いとヘモグロビン類の測定において、分離効果が低下するおそれがあり、また、３０００ｍＭよりも高いと、ヘモグロビン類の分離効果はそれ以上向上しないので、０．１ｍＭ〜３０００ｍＭが好ましく、１ｍＭ〜１０００ｍＭがより好ましく、更に、１０ｍＭ〜５００ｍＭが好ましい。
また、カオトロピックイオンは複数種混合して用いても良い。
上記カオトロピックイオンは、測定試料と接触する液、例えば、溶血試薬、試料希釈液等に添加しても良い。
【００３１】
また、上記溶離液のｐＨは、４．０〜６．８であることが好ましく、さらに好ましくは４．５〜５．８である。溶離液のｐＨが４未満であると、ヘモグロビン類が変性する可能性があり、ｐＨが６．８を超えると、ヘモグロビン類のプラス荷電が減少し、陽イオン交換基に保持されにくくなり、ヘモグロビン類の分離が悪くなる。
【００３２】
尚、上記溶離液のｐＨは、例えば、後述のｐＨ調節剤の添加量により調節できる。
上記ｐＨの異なる２種類以上の溶離液を、勾配溶出法、あるいは段階溶出法によって送液しても良い。
【００３３】
本発明６では、上記溶離液Ａ及び溶離液Ｂとは溶出力が異なる溶離液Ｃを用い、該溶離液ＣはＨｂＡ０を溶出するために用い、カラムに流入する際のｐＨが、ヘモグロビン類の等電点と等しいか、または、等電点よりアルカリ側になるように設定されているものを用いる。また上記溶離液Ｃは、ＨｂＡ０以外の成分の溶出、例えば、ＨｂＳやＨｂＣの溶出に用いることもでき、また、測定終了時におけるカラム洗浄液としても用いることができる。
【００３４】
本発明６において、ＨｂＡ０の溶出に際し、すなわち、ＨｂＡ１ｃより強く充填剤に保持されたＨｂＡ等から成る「ＨｂＡ０成分」を溶出するためには、カラムに流入する際のｐＨをヘモグロビンの等電点よりアルカリ側になるように設定した溶離液を用いるのが好ましい。この条件を実現するには、ｐＨがヘモグロビンの等電点よりアルカリ側であるひとつの溶離液を送液する方法や、ｐＨの異なる２種以上の溶離液を用いる方法がある。
ヘモグロビンはｐＨが等電点より酸性側からアルカリ側になると、総荷電がプラスからマイナスに変わるため、充填剤の陽イオン交換基との「電気的反発力によってＨｂＡ０成分を溶出」させることができる。
なお、理化学辞典（第４版、１９８７年９月、岩波書店、久保亮五ら編集）、１１７８頁に記載されているように、ヘモグロビンの等電点はｐＨ６．８〜７．０である。そのため、ＨｂＡ０成分を溶出するために、カラムに流入する際の溶離液のｐＨを６．８以上にすることがより好ましい。
この条件を満たすため、測定に用いる溶離液の内、少なくともひとつの溶離液のｐＨが６．８以上であることが必要である。本溶離液のｐＨは望ましくは７．０〜１２．０であり、７．５〜１１．０がより好ましく、更には８．０〜９．５が好ましい。溶離液のｐＨが６．８未満になるとＨｂＡ０成分の溶出が不十分となる。溶離液のｐＨは、用いる充填剤の分解が起こらない範囲に設定すれば良い。
ＨｂＡ０成分の溶出に好適に用いられるｐＨが６．８以上で緩衝能をもつ溶離液としては、例えば、リン酸、ホウ酸、炭酸等の無機酸または、その塩；クエン酸等のヒドロキシカルボン酸、β、β−ジメチルグルタル酸等のカルボン酸誘導体、マレイン酸等のジカルボン酸、カコジル酸、等の有機酸または、その塩からなる緩衝液が挙げられる。その他、２−（Ｎ−モリホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス−（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓｔｒｉｓ）、Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、Ｂｉｓｔｒｉｓｐｒｏｐａｎｅ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、グリシルグリシン、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ等の一般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれるものも使用できる。また、ＢｒｉｔｔｏｎとＲｏｂｉｎｓｏｎの緩衝液；ＧＴＡ緩衝液も使用できる。また、イミダゾール等のイミダゾール類；エチレンジアミン、メチルアミン、エチルアミン、トリエチルアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等のアミン類；グリシン、β−アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン等のアミノ酸類；等の有機物も使用できる。
また、無機酸；有機酸；無機酸または有機酸の塩；有機物は、複数混合して用いても良く、また、有機酸、無機酸及び有機物を混合しても良い。
【００３５】
本発明７の溶離液Ｃには、カオトロピックイオンが含有されている。すなわち、より効果的にＨｂＡ０成分を溶出するためには、上記溶離液にカオトロピックイオンを添加するのが好ましい。
添加するカオトロピックイオンの種類は、上述の発明５におけるものと同様のものがあげられる。また、その濃度は、１〜３０００ｍＭが好ましく、より好ましくは１０〜１０００ｍＭであり、特に好ましくは５０〜５００ｍＭの範囲である。。
【００３６】
さらに本発明における上記溶離液群には、以下の物質を添加しても良い。
（１）無機塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウム等）を添加しても良い。これらの塩類の濃度は、特に限定されないが、好ましくは１〜１５００ｍＭである。
（２）ｐＨ調節剤として、公知の酸、塩基を加えても良い。酸としては、例えば、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸等が、塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。これらの酸、塩基の濃度は、特に限定されないが、好ましくは、０．００１〜５００ｍＭである。
（３）メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン等の水溶性有機溶媒を混合しても良い。これらの有機溶媒の濃度は、特に限定されないが、好ましくは０〜８０％（ｖ／ｖ）であり、カオトロピックイオン、無機酸、有機酸、これらの塩等が析出しない程度で用いるのが好ましい。
（４）アジ化ナトリウム、チモール等の防腐剤を添加しても良い。
（５）ヘモグロビンの安定剤として、公知の安定剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤、グルタチオン、アジ化ナトリウム等の還元剤・酸化防止剤等を添加しても良い。
【００３７】
本発明における上記溶離液Ａ・Ｂ・Ｃでは、緩衝能を持つ物質としては、酸解離定数（ｐＫａ）が、２．１５〜６．３９及び６．４０〜１０．５０の範囲に存在するものが用いるのが好ましい。すなわち、緩衝剤として、ｐＫａを、２．１５〜６．３９及び６．４０〜１０．５０の範囲に少なくとも一つずつもつ単一の物質を用いても良く、あるいは、２．１５〜６．３９の範囲に少なくとも一つのｐＫａをもつ物質と６．４０〜１０．５０の範囲に少なくとも一つのｐＫａをもつ物質とを組み合わせて緩衝剤として用いても良い。また、上記緩衝剤を複数組み合わせて用いても良い。
上記緩衝剤のｐＫａの範囲は、測定目的のピークを分離するのに適切な溶離液のｐＨ付近において、より優れた緩衝能を発揮できるように、２．６１〜６．３９及び６．４０〜１０．５０の範囲が好ましく、より好ましくは、２．８０〜６．３５及び６．８０〜１０．００の範囲である。さらに好ましくは、３．５０〜６．２５及び７．００〜９．５０の範囲である。
上記緩衝剤としては、例えば、リン酸、ホウ酸、炭酸等の無機物のほか、カルボン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン酸、アニリンまたはアニリン誘導体、アミノ酸、アミン類、イミダゾール類、アルコール類等の有機物が挙げられる。また、エチレンジアミン四酢酸、ピロリン酸、ピリジン、カコジル酸、グリセロールリン酸、２，４，６−コリジン、Ｎ−エチルモルホリン、モルホリン、４−アミノピリジン、アンモニア、エフェドリン、ヒドロキシプロリン、ペリジン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、グリシルグリシン等の有機物でも良い。
上記カルボン酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、安息香酸等が挙げられる。
上記ジカルボン酸としては、例えば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイン酸、フタル酸、フマル酸等が挙げられる。
上記カルボン酸誘導体としては、例えば、β，β’−ジメチルグルタル酸、バルビツール酸、５，５−ジエチルバルビツール酸、γ−アミノ酪酸、ピルビン酸、フランカルボン酸、ε−アミノカプロン酸等が挙げられる。
上記ヒドロキシカルボン酸としては、例えば、酒石酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸等が挙げられる。
上記アニリンまたはアニリン誘導体としては、例えば、アニリン、ジメチルアニリン等が挙げられる。
上記アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシン、α−アラニン、β−アラニン、ヒスチジン、セリン、ロイシン等が挙げられる。
上記アミン類としては、例えば、エチレンジアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジエタノールアミン等が挙げられる。上記イミダゾール類としては、例えば、イミダゾール、５（４）−ヒドロキシイミダゾール、５（４）−メチルイミダゾール、２，５（４）−ジメチルイミダゾール等が挙げられる。
上記アルコール類としては、例えば、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−エチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール等が挙げられる。
また、上記緩衝剤としては、２−（Ｎ−モリホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス−（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミドジ酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ）プロパン（Ｂｉｓｔｒｉｓｐｒｏｐａｎｅ）、Ｎ−（アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−（Ｎ−モルフォリン）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン（Ｔｒｉｓ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、グリシルグリシン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、グリシン、シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等の一般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれるものを組成する物質も使用できる。これらの物質のｐＫａを表１・２に示す（引用文献：堀尾武一・山下仁平 蛋白質・酵素の基礎実験法 南江堂 １９８５年）。
【００３８】
【表１】
【表２】
溶離液中の上記緩衝剤濃度は、緩衝作用がある範囲であれば良く、好ましくは１〜１０００ｍＭ、より好ましくは１０〜５００ｍＭである。また、上記緩衝剤は、単独でも複数混合して用いても良く、例えば、有機物と無機物を混合して用いても良い。
また、その場合、測定目的のピークを分離するにあたって用いる溶離液は、同一の緩衝剤を含むものを用いるのが好ましいが、溶離液を切り替える際の、（検出器出力の）ベースライン変動が、測定値に悪影響を与えなければ、その必要はない。
さらに、ベースライン変動をより小さくするために、上記測定目的のピークを分離するにあたって用いる溶離液は、緩衝剤の濃度も同一であるものを用いるのがより好ましい。
【００４１】
（溶出方法）
本発明の溶離液は、ヘモグロビン類の分離能、特にＨｂＡｃ１の分離のために特定の溶出方法を用いることができる。
すなわち、本発明の特定の局面では、ＨｂＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン類の溶出にｐＨ４．０〜６．８の溶離液を少なくとも２種類（溶離液Ａ、Ｂ）以上用い、ＨｂＡ０の溶出に溶離液Ｃを用いる方法、或いは、ＨｂＡ０よりも前に溶出するヘモグロビン類の溶出に少なくとも２種類（溶離液Ａ、Ｂ）以上用い、かつ、溶出力の最も弱い溶離液を先に流し、目的のピークが最適に分離溶離されるように溶離液Ａ、Ｂを交互に流す方法を用いる。
これにより、Ｈｂ類特に安定型ＨｂＡ１ｃをシャープに溶出することができる。
【００４２】
さらに、本発明の特定の局面では、安定型ＨｂＡ１ｃの測定に悪影響を与える可能性のあるのヘモグロビン成分（ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等）を含む血液検体を測定する場合、上記ＨｂＡ０成分を、ＨｂＡと測定に悪影響を与えるＨｂ類（ＨｂＡ２、ＨｂＳ及びＨｂＣ）とに分離し、ＨｂＡを溶出させた後に、測定に悪影響を与える上記Ｈｂ類（ＨｂＡ２、ＨｂＳ及びＨｂＣ）を溶離させる測定方法であるので、ＨｂＡ０ピークからＨｂＡ以外のヘモグロビン成分を除けることができ、より正確な安定型ＨｂＡ１ｃ（％）を算出できる。
ここで、上記ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等を溶離させる場合におけるＨｂＡ０を溶出するための溶離液とは、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等を含みＨｂＡを主成分とするＨｂＡ０ピークを溶出するために用いる溶離液を意味する。この場合では、ＨｂＡ０を溶出するための溶離液の後に、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、ＨｂＣ等を溶離するために、より溶出力の強い溶離液を送液することが必要となる場合がある。
【００４３】
またさらに、本発明の特定の局面では、勾配溶出法または段階溶出法によって溶離液を送液するに際し、分離対象のピークまたはピーク間の溶離タイミングを考慮して分離対象のピークまたはピーク間の分離状態が良くなるように、溶離液の溶出力を一旦低下させる。
具体的には、段階溶出法の場合、溶出力の弱い溶離液から溶出力の強い溶離液に切り替えて送液した後、溶出力の弱い溶離液に切り替え、しばらくしてから溶出力の強い溶離液に切り替えて送液する。
本発明の方法を段階溶出法によって行う場合の装置の構成例を図１に示した。溶離液Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄは、各々溶出力の異なる（例えば、塩濃度、ｐＨ、極性等において異なる）ものであり、電磁弁１によって設定時間に各溶離液に切り替えられるように構成されている。溶離液は、送液ポンプ２により、試料注入部３から導入された試料とともにカラム４に導かれ、各成分が検出器５により検出される。各ピークの面積、高さ等はインテグレータ６により算出される。
【００４４】
（充填剤）
本発明のヘモグロビン類の測定方法における陽イオン交換液体クロマトグラフィーの充填剤は、少なくとも１種以上のカチオン交換基を有している粒子よりなるものであり、例えば、高分子粒子にカチオン交換基を導入することで得られる。
【００４５】
該カチオン交換基は、公知のものでよく特に制限はない。例えば、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基などのカチオン交換基等が挙げられる。また、このカチオン交換基は、複数種導入しても良い。
【００４６】
上記粒子の直径は、好ましくは０．５〜２０μｍ、より好ましくは１〜１０μｍである。
また、粒度分布は、変動係数値（ＣＶ値）（粒径の標準偏差÷平均直径×１００）として、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下である。
【００４７】
上記高分子粒子としては、例えば、シリカ、ジルコニアなどの無機系粒子；セルロース、ポリアミノ酸、キトサンなどの天然高分子粒子；ポリスチレン、ポリアクリル酸エステルなどの合成高分子粒子などが挙げられる。
上記高分子粒子は、導入されるイオン交換基以外の構成成分は、より親水性であることが好ましい。また耐圧性・耐膨潤性の点から架橋度の高いものが好ましい。
【００４８】
上記高分子粒子へのカチオン交換基の導入は、公知の方法により行うことができるが、例えば、高分子粒子を調製後、粒子が有する官能基（水酸基、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基など）に、化学反応でカチオン交換基を粒子に導入させる方法により行うことができる。
【００４９】
また、カチオン交換基を有する単量体を重合して高分子粒子を調製する方法によってもカチオン交換充填剤を調製できる。例えば、カチオン交換基含有単量体と架橋性単量体等とを混合し、重合開始剤の存在下に重合する方法などが挙げられる。
【００５０】
また、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチルなどの重合性カチオン交換基含有エステルを架橋性単量体などと混合し、重合開始剤存在下で重合した後、得られた粒子を加水分解処理し、エステルをカチオン交換基に変換させてもよい。
【００５１】
更に、特公平８−７１９７号公報に記載のように、架橋重合体粒子を調製した後、カチオン交換基を有する単量体を添加して、重合体粒子の表面付近に、該単量体を重合させても良い。
【００５２】
上記充填剤はカラムに充填されて液体クロマトグラフィー測定に用いられる。上記カラムは公知のステンレス製、ガラス製、樹脂製など、特に限定されない。カラムサイズとしては、内径０．１〜５０ｍｍ、長さ１〜３００ｍｍのものが好ましく、内径０．２〜３０ｍｍ、長さ５〜２００ｍｍのものがより好ましい。充填剤のカラムへの充填方法は、公知の任意の方法が使用できるがスラリー充填法がより好ましい。具体的には、例えば、充填剤粒子を溶離液などの緩衝液に分散させたスラリーを送液ポンプなどによりカラムに圧入することにより行う。
【００５３】
本発明方法で用いるカラムのフィルターまたはプレフィルターとしては、イナートな素材からなるフィルター、または、そのフィルターの表面がイナートな素材で覆われているフィルターを用いるのが好ましい。
【００５４】
本発明でカラムのフィルターまたはプレフィルターの表面素材として用いるフィルターのイナートな素材としては、セルロースエステル、セルロースアセテート、セルローストリアセテート、セルロース、セルロースナイトレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフロライド、ポリスルフォン、ポリエチレン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリフッ化ビニリデン、ガラス素材、アクリル共重合体、酸化物セラミック、炭化物セラミック、窒化物セラミック、珪化物セラミック、硼化物セラミック、チタンから成る群の中から少なくとも一つ、または、複数組み合わせてなることを特徴とする。
【００５５】
上記フィルターの形状は、メンブレンフィルター、繊維を積層し焼結したもの、微粒子を焼結成型したものなどがある。
【００５６】
本発明に使用されるＬＣ装置は、公知のもので良く、例えば、送液ポンプ、試料注入装置（サンプラ）、カラム、検出器等から構成される。また、他の付属装置（カラム恒温槽や溶離液の脱気装置等）が適宜付加されても良い。
【００５７】
上記測定法における、他の測定条件としては、公知の条件で良く、溶離液の流速は、好ましくは０．０５〜５ｍＬ／分、より好ましくは０．２〜３ｍＬ／分である。ヘモグロビン類の検出は、４１５ｎｍの可視光が好ましいが、特にこれのみに限定されるわけではない。測定試料は、通常、界面活性剤等溶血活性を有する物質を含む溶液により溶血された溶血液を希釈したものを用いる。試料注入量は、血液検体の希釈倍率により異なるが、好ましくは０．１〜１００μＬ程度である。
【００５８】
【実施例】
以下に実施例、比較例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００５９】
（実施例１）
充填剤の調製
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学製）４５０ｇにベンゾイルパーオキサイド２．０ｇを混合して溶解させ、２．５Ｌの４重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。
これを窒素雰囲気下で攪拌しながら昇温し、８０℃で１．５時間重合させた。反応系を３５℃に冷却した後、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東京化成製）２００ｇを添加して１時間攪拌し、再び８０℃で１．３時間重合させた。
重合後、洗浄し、分級して平均粒径６．５μｍの充填剤を得た。
【００６０】
充填剤のカラムへの充填
得られた粒子をカラムに以下のようにして充填した。粒子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）３０ｍＬに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製の空カラム（内径４．６×３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填した。
【００６１】
ヘモグロビン類の測定
得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘモグロビン類の測定を行った。
流速：２．０ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μＬ
【００６２】
（測定試料）
健常人血をフッ化ナトリウム採血した全血検体から以下の試料を調製した。なお、溶血試薬として、０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）（東京化成社製）を含有させたリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０）を用いた。
【００６３】
（測定結果）
図２に示すように、不安定型HbA1c と安定型HbA1c が良好に分離した。ピーク１はＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ、ピーク２はＨｂＦ、ピーク３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５はＨｂＡ０を示す。
また、安定型HbA1c の後ろに、妨害ピークが出ず、表３に示すように、安定型HbA1c の測定再現性は、良好であった。
【００６４】
【表３】
（溶離液A,B の溶出力の評価）
測定試料は、グリゴHbコントロール（国際試薬株式会社）のレベル(II)を添付資料に基づいて調製して用いた。
測定条件は、溶出力を評価する溶離液と上記溶離液Ｃを用い、溶離液Ｃの影響が無いように、溶出力を評価する溶離液を長時間を流して、安定型HbA1c の保持時間を求めた。
その結果、溶離液A ：3.0 分、溶離液Ｂ：2.2 分であった。
【００６６】
（実施例２）
充填剤の調製
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学製）４５０ｇにベンゾイルパーオキサイド２．０ｇを混合して溶解させ、２．５Ｌの４重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。
これを窒素雰囲気下で攪拌しながら昇温し、８０℃で１．５時間重合させた。反応系を３５℃に冷却した後、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東京化成製）２００ｇを添加して１時間攪拌し、再び８０℃で１．３時間重合させた。
重合後、洗浄し、分級して平均粒径６．５μｍの充填剤を得た。
【００６７】
充填剤のカラムへの充填
得られた粒子をカラムに以下のようにして充填した。粒子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）３０ｍＬに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製の空カラム（内径４．６×３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填した。
【００６８】
ヘモグロビン類の測定
得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘモグロビン類の測定を行った。
測定開始より０〜０．６分の間は溶離液Ａを送液し、０．６〜０．９分の間は溶離液Ｂを送液し、０．９〜１．２分の間は溶離液Ａを送液し、１．２〜１．３分の間は溶離液Ｃを送液し、１．３〜１．８分の間は溶離液Ａを送液した。
流速：２．０ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μＬ
【００７０】
（測定試料）
健常人血をフッ化ナトリウム採血した全血検体から以下の試料を調製した。なお、溶血試薬として、０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）（東京化成社製）を含有させたリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０）を用いた。
ａ）糖負荷血：全血検体に５００ｍｇ／ｄＬのグルコース水溶液を添加し、３７℃で３時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、１５０倍に希釈して試料ａとした。
ｂ）ＣＨｂ含有試料：全血検体１０ｍＬに、０．３重量％のシアン酸ナトリウムの生理食塩水溶液１ｍＬを添加し、３７℃で３時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、１５０倍に希釈して試料ｂとした。
ｃ）ＡＨｂ含有試料：全血検体１０ｍＬに、０．３重量％のアセトアルデヒドの生理食塩水溶液１ｍＬを添加し、３７℃で３時間反応させ、次いで上記溶血試薬により溶血し、１５０倍に希釈して試料ｃとした。
【００７１】
（測定結果）
上記測定条件により、試料を測定して得られたクロマトグラムを図３〜５に示す。図３は試料ａ、図４は試料ｂ、図５は試料ｃを測定した結果である。ピーク６はＣＨｂ、ピーク７はＡＨｂを示す。
図３では、ピーク３および４が良好に分離されている。また、図４ではピーク６（ＣＨｂ）、図５ではピーク７（ＡＨｂ）がピーク４から良好に分離されている。
【００７２】
（溶離液A,B の溶出力の評価）
測定試料は、グリゴHbコントロール（国際試薬株式会社）のレベル(II)を添付資料に基づいて調製して用いた。
測定条件は、溶出力を評価する溶離液と上記溶離液Ｃを用い、溶離液Ｃの影響が無いように、溶出力を評価する溶離液を長時間を流して、安定型HbA1c の保持時間を求めた。
その結果、溶離液A ：2.5 分、溶離液Ｂ：1.7 分であった。
【００７３】
（浸透圧の測定）
溶離液Ａ、Ｂの浸透圧を浸透圧測定装置（オズモスタット（OM-6020 ）、京都第一科学社製）で測定した。その結果、溶離液Ａ：163mOsm(3985.35hpa) 、溶離液Ｂ：220mOsm(5379hpa)であった。
【００７４】
（緩衝能の差の評価）
溶離液Ａ、Ｂそれぞれ100ml に0.1 モル/ Ｌの水酸化ナトリウム（和光純薬）1ml 添加した時のpH増加分をｐＨ測定装置（カスタニーLABpH メーター（F23)、堀場製作所社製）で測定した。その結果、緩衝能の差は、0.002 であった。
【００７５】
（実施例３）
溶離液を以下の組成としたこととカラムのフィルターにポリエチレン製のフィルター（直径５ｍｍ×厚さ１．５ｍｍ）を用いたことの他は、実施例２と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図２〜４と同様に良好であった。
（溶離液A,B の溶出力の評価）
測定試料は、グリゴHbコントロール（国際試薬株式会社）のレベル(II)を添付資料に基づいて調製して用いた。
測定条件は、溶出力を評価する溶離液と上記溶離液Ｃを用い、溶離液Ｃの影響が無いように、溶出力を評価する溶離液を長時間を流して、安定型HbA1c の保持時間を求めた。
その結果、溶離液A ：2.6 分、溶離液Ｂ：1.8 分であった。
【００７７】
（浸透圧の測定）
溶離液Ａ、Ｂの浸透圧を浸透圧測定装置（オズモスタット（OM-6020 ）、京都第一科学社製）で測定した。その結果、溶離液Ａ：162mOsm(3960.9hpa)、溶離液Ｂ：218mOsm(5330.1hpa)であった。
【００７８】
（緩衝能の差の評価）
溶離液Ａ、Ｂそれぞれ100ml に0.1 モル/ Ｌの水酸化ナトリウム（和光純薬）1ml 添加した時のpH増加分をｐＨ測定装置（カスタニーLABpH メーター（F23)、堀場製作所社製）で測定した。その結果、緩衝能の差は、0.050 であった。
【００７９】
（比較例１）
溶離液を以下の組成としたことと送液方法を以下のようにした他は、実施例２と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。
【００８０】
得られたクロマトグラムを図６〜８に示す。図６は試料ａ、図７は試料ｂ、図８は試料ｃを測定した結果である。 図３〜５に比較して、いずれもHbA1c ピークの後ろに妨害ピークが出現して、測定試料ａを測定した場合、表３に示すようにHbA1c 測定再現性が実施例１〜３比べて比較例１が悪いことが明らかである。
【００８１】
（溶離液D,Eの溶出力の評価）
測定試料は、グリゴHbコントロール（国際試薬株式会社）のレベル(II)を添付資料に基づいて調製して用いた。
測定条件は、溶出力を評価する溶離液と上記溶離液Ｆを用い、溶離液Ｆの影響が無いように、溶出力を評価する溶離液を長時間を流して、安定型HbA1cの保持時間を求めた。
その結果、溶離液Ｄ：2.5 分、溶離液Ｅ：1.7 分であった。
【００８２】
（浸透圧の測定）
溶離液Ｄ、Ｅの浸透圧を浸透圧測定装置（オズモスタット（OM-6020 ）、京都第一科学社製）で測定した。その結果、溶離液Ｄ：163mOsm(3985.35hpa) 、溶離液Ｅ：220mOsm(5379hpa)であった。
【００８３】
（緩衝能の差の評価）
溶離液Ｄ、Ｅそれぞれ100ml に0.1 モル/ Ｌの水酸化ナトリウム（和光純薬）1ml 添加した時のpH増加分をｐＨ測定装置（カスタニーLABpH メーター（F23)、堀場製作所社製）で測定した。その結果、緩衝能の差は、-0.002であった。
【００８４】
（比較例２）
溶離液を以下の組成としたことの他は、比較例１と同様に操作してヘモグロビン類の測定を行った。
【００８５】
得られたクロマトグラムを図９〜１１に示す。図９は試料ａ、図１０は試料ｂ、図１１は試料ｃを測定した結果である。 実施例１〜３及び比較例１よりも、不安定型HbA1c 、CHb 及びAHb の分離が悪くなった。
【００８６】
（溶離液H,I の溶出力の評価）
測定試料は、グリゴHbコントロール（国際試薬株式会社）のレベル(II)を添付資料に基づいて調製して用いた。
測定条件は、溶出力を評価する溶離液と上記溶離液Ｊを用い、溶離液Ｊの影響が無いように、溶出力を評価する溶離液を長時間を流して、安定型HbA1c の保持時間を求めた。
その結果、溶離液Ｈ：2.5 分、溶離液Ｉ：1.7 分であった。
【００８７】
（浸透圧の測定）
溶離液Ｈ、Ｉの浸透圧を浸透圧測定装置（オズモスタット（OM-6020 ）、京都第一科学社製）で測定した。その結果、溶離液Ｈ：163mOsm(3985.35hpa) 、溶離液Ｉ：220mOsm(5379hpa)であった。
【００８８】
（緩衝能の差の評価）
溶離液Ｈ、Ｉそれぞれ100ml に0.1 モル/ Ｌの水酸化ナトリウム（和光純薬）1ml 添加した時のpH増加分をｐＨ測定装置（カスタニーLABpH メーター（F23)、堀場製作所社製）で測定した。その結果、緩衝能の差は、0.050 であった。
【００８９】
（カラム耐久性の評価）
実施例１〜３及び比較例１の溶離条件で、上記測定サンプルａを１００検体づつ連続測定し、カラム耐久性を評価した。
図１２に示すように、実施例１〜３では、ＨｂＡ１ｃ測定値は、１０００検体まで一定であったが、比較例１では連続測定するに従って、ＨｂＡ１ｃピークに妨害ピークが重なり、測定値が次第に大きくなった。
【００９０】
【発明の効果】
本発明のヘモグロビン類の測定方法は、上述の通り構成され、勾配溶出法または段階溶出法を用いたカチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法において、ヘモグロビン類の分離を短時間で、高分離能で行うことができ、さらに測定再現性の優れたヘモグロビン類の測定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】カチオン交換液体クロマトグラフィー装置の構成例を示す図。
【図２】実施例１の測定条件により、ヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図３】実施例２の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図４】実施例２の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｂ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図５】実施例２の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｃ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図６】比較例１の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図７】比較例１の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｂ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図８】比較例１の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｃ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図９】比較例２の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ａ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１０】比較例２の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｂ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１１】比較例２の測定条件により、ヘモグロビン類の測定（試料ｃ）を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１２】実施例１〜３及び比較例１における測定回数の増加にともなう安定型ＨｂＡ１ｃ値の変動を示す図。
【図１３】勾配溶出法による溶離液の送液方法を示す図。
【図１４】段階溶出法による溶離液の送液方法を示す図。
【符号の説明】
１ ＨｂＡ１ａ及びｂのピーク
２ ＨｂＦのピーク
３ 不安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
４ 安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
５ ＨｂＡ０のピーク
６ ＣＨｂのピーク
７ ＡＨｂのピーク
８ 妨害ピーク
Claims (6)
- カチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法において、
溶出力の異なる少なくとも２種の溶離液（溶離液Ａ及び溶離液Ｂ）を用い、
溶離液ＡのｐＨが、溶離液ＢのｐＨより液温２０℃で０．００１〜３．０００大きく、
かつ、溶離液Ａの浸透圧が、溶離液Ｂの浸透圧よりも２４．４５〜２４４５０ｈＰａ小さく、
溶離液Ａの安定型ヘモグロビンＡ１ｃ溶出力が、溶離液Ｂの安定型ヘモグロビンＡ１ｃ溶出力よりも小さいことを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。 - アルカリ性水溶液添加に対する上記溶離液Ａの緩衝能が、上記溶離液Ｂのそれよりも小さいか、あるいは、それと等しいことを特徴とする請求項１記載のヘモグロビン類の測定方法。
- ヘモグロビン類測定中の溶離液送液工程において、
少なくとも、ヘモグロビンＡ１ａからＨｂＦ付近までを溶離液Ａで溶離し、次に溶離液Ｂに切り替えてＨｂＡ１ｃまでを溶離する工程が含まれることを特徴とする請求項１または２に記載のヘモグロビン類の測定方法。 - 上記溶離液Ａ及び／又は溶離液Ｂにカオトロピックイオンが含有されており、かつ、ｐＨ４．０〜６．８で緩衝能を持つ有機酸、無機酸及び／又はこれらの塩が含有されていることを特徴とする請求項１〜３いずれか一項に記載のヘモグロビン類の測定方法。
- 上記溶離液Ａ及び溶離液Ｂとは溶出力が異なる溶離液Ｃを用い、該溶離液Ｃは、ヘモグロビンＡ０を溶出するために用い、カラムに流入する際のｐＨが、ヘモグロビン類の等電点と等しいか、または、等電点よりアルカリ側になるように設定されていることを特徴とする請求項１〜４いずれか一項に記載のヘモグロビン類の測定方法。
- 上記溶離液Ｃにカオトロピックイオンが含有されていることを特徴とする請求項５記載のヘモグロビン類の測定方法。
Priority Applications (1)
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