JP2002082105A - 液体クロマトグラフィー用充填剤、カラム、及びそれを用いたヘモグロビン類の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 従来法よりも短時間でかつ高精度にヘモグロ
ビン類を分離することが可能な、充填剤、カラム及びこ
れらを用いたヘモグロビン類の測定方法を提供する。 【解決手段】 ヘモグロビン類の測定方法に用いられ
る、カチオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤であ
って、安定型ＨｂＡ１ｃ保持力試験法により、８０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ５．６０）を使用して測定した保持
力パラメータが２．５〜６０、及び／または、４５ｍＭ
過塩素酸含有３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５０）を
使用して測定した保持力パラメータが１．５〜６０であ
ることを特徴とする液体クロマトグラフィー用充填剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヘモグロビン類の
測定に適した、液体クロマトグラフィー用充填剤、カラ
ム、及びそれを用いたヘモグロビン類の測定方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】ヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃ
という）は、血液中の糖が赤血球に入った後に、ヘモグ
ロビンと不可逆的に結合して生成したものであり、過去
１〜２ヶ月間の血液中の平均的な血糖値（血液中のグル
コース濃度）を反映する。このため、ＨｂＡ１ｃは、糖
尿病のスクリーニング検査や糖尿病患者の血糖管理状態
を把握する等の糖尿病診断の指標として広く利用されて
いる。

【０００３】ＨｂＡ１ｃは、血液中のグルコースとヘモ
グロビンＡ（以下、ＨｂＡという）とが、反応して生成
された糖化ヘモグロビン（以下、ＧＨｂという）であ
り、これが可逆的に反応したものを不安定型ヘモグロビ
ンＡ１ｃ（unstable HbA1c：以下、不安定型ＨｂＡ１ｃ
という）と呼び、不安定型ＨｂＡ１ｃを経て不可逆的に
反応したものを安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（stable HbA
1c：以下、安定型ＨｂＡ１ｃという）と呼んでいる。そ
して、上記糖尿病診断の指標としては、安定型ＨｂＡ１
ｃを用いることが好ましく、臨床検査分野では、高精度
で、しかも、短時間に安定型ＨｂＡ１ｃの比率を測定し
うる方法の開発が望まれていた。

【０００４】従来、ＨｂＡ１ｃの測定方法としては、一
般に液体クロマトグラフィー法や免疫法が用いられてお
り、液体クロマトグラフィー法によるＨｂＡ１ｃの測定
は、主にカチオン交換液体クロマトグラフィー法により
行われている（特公平８−７１９８号公報など）。溶血
試料をカチオン交換液体クロマトグラフィーにより分離
すると、通常、ヘモグロビンＡ１ａ（以下、ＨｂＡ１ａ
という）及びヘモグロビンＡ１ｂ（以下、ＨｂＡ１ｂと
いう）、ヘモグロビンＦ（以下、ＨｂＦという）、不安
定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ並びにヘモグロビン
Ａ０（以下、ＨｂＡ０という）の順に溶出される。

【０００５】このうち、糖尿病の診断の指標として使用
されるのは、最近では、上記したとおり安定型ＨｂＡ１
ｃであり、安定型ＨｂＡ１ｃ値は、全ヘモグロビンピー
クの面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃピークの面積の比率
（％）として求められている。

【０００６】従って、安定型ＨｂＡ１ｃ値を正確に測定
するためには、安定型ＨｂＡ１ｃのピークのみを高精度
に分離する技術が必要であるが、従来においては、安定
型ＨｂＡ１ｃのピークの近傍に出現する不安定型ＨｂＡ
１ｃのピークやアセチル化ヘモグロビン（以下、ＡＨｂ
という）、カルバミル化ヘモグロビン（以下ＣＨｂとい
う）などの修飾ヘモグロビンのピークと、安定型ＨｂＡ
１ｃのピークとを高精度かつ短時間に分離するのは極め
て困難であった。

【０００７】この問題の解決を図るため、例えば特開平
１１−２９５２８８号には、充填剤のイオン交換容量を
規定することにより、ヘモグロビン類の高精度分離を試
みた充填剤が開示されている。しかしながら、イオン交
換容量の最適化のみを行っても、ヘモグロビン類を高精
度かつ短時間に分離測定するには、必ずしも充分なもの
ではなかった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】このようにイオン交換
容量の最適化のみでは不十分であるのは、充填剤とヘモ
グロビンとの相互作用の大きさは、充填剤のイオン交換
容量に基づくカチオン交換作用のみで決定されるもので
はなく、充填剤粒子の非イオン交換性部分による疎水性
相互作用による吸着効果も考慮に入れる必要があるため
であると考えられた。

【０００９】そこで、本発明者らは、「安定型ＨｂＡ１
ｃ保持力試験法による保持力パラメータ」という概念を
新規に導入し、このパラメータを規定した特定の充填剤
を利用することによって、上記従来の問題点を解消でき
ることを見出した。この保持力パラメータは、従来から
用いられていたイオン交換容量のみでは表わすことので
きない、充填剤とヘモグロビンとの相互作用をトータル
として表わす指標であるといえる。

【００１０】つまり本発明の目的は、上記保持力パラメ
ータを規定することにより、従来法よりも短時間でかつ
高精度にヘモグロビン類を分離することが可能な、充填
剤、カラム及びこれらを用いたヘモグロビン類の測定方
法を提供することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】請求項１記載の発明は、
ヘモグロビン類の測定方法に用いられる、カチオン交換
液体クロマトグラフィー用充填剤であって、安定型Ｈｂ
Ａ１ｃ保持力試験法により、８０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ５．６０）を使用して測定した保持力パラメータが
２．５〜６０、及び／または、４５ｍＭ過塩素酸含有３
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５０）を使用して測定し
た保持力パラメータが１．５〜６０であることを特徴と
する液体クロマトグラフィー用充填剤である。

【００１２】請求項２記載の発明は、請求項１記載の液
体クロマトグラフィー用充填剤が、カラム筐体に充填さ
れてなる液体クロマトグラフィー用カラムである。

【００１３】請求項３記載の発明は、請求項１記載の充
填剤または請求項２記載のカラムを使用した、液体クロ
マトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法であ
る。

【００１４】まず、充填剤に係わる本発明について詳説
する。

【００１５】本明細書でいう「安定型ＨｂＡ１ｃ保持力
試験法」とは、特定形態のカラム筐体に充填剤を充填し
た後、ヘモグロビンコントロール希釈液を所定の溶離液
によって溶出させ、保持力パラメータを測定することに
より、充填剤が有する安定型ＨｂＡ１ｃの保持力を評価
する試験法である。

【００１６】上記特定形態のカラム筐体としては、図１
に示すように、円筒形のものであって、円筒底面の内径
が４．６ｍｍ、円筒の高さが３５ｍｍのものを用いる。
また、カラム筐体の素材としては、ステンレスを用い
る。

【００１７】カラム筐体１の両開口端には、フィルター
２を配置し、後述のようにして充填剤３を充填後、エン
ドフィッティング４によりカラム筐体に固定される。フ
ィルターは、直径５．０ｍｍ、厚さ１．５ｍｍの円盤状
であって、孔径２μｍの細孔を有するものを用いる。ま
た、フィルターの素材としては、ＰＥＥＫ（ポリエーテ
ルエーテルケトン）を、エンドフィッティングの素材と
してはステンレスを用いる。

【００１８】上記カラム筐体に充填される充填剤は、カ
チオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤、すなわ
ち、１種または複数種のカチオン交換基を有する充填剤
である。かかる充填剤は、例えば、高分子粒子にカチオ
ン交換基を導入することにより得られ、カチオン交換基
としては、例えば、カルボキシル基、スルホン酸基、リ
ン酸基などが挙げられる。また充填剤粒子を構成する素
材としては、シリカ系、セラミックス系などの無機高分
子粒子；ポリスチレン系、ポリアクリル系などの有機合
成高分子粒子；ポリアミノ酸、キトサンや多糖類などの
天然高分子粒子などが挙げられる。

【００１９】上記高分子粒子へのカチオン交換基の導入
は、公知の方法により行うことができるが、例えば、高
分子粒子を調製後、粒子が有する官能基（水酸基、アミ
ノ基、エポキシ基など）に、化学反応でカチオン交換基
を粒子に導入させる方法により行うことができる。ま
た、カチオン交換基を有する単量体を重合して高分子粒
子を調製する方法によってもカチオン交換充填剤を調製
できる。例えば、カチオン交換基含有単量体と架橋性単
量体等とを混合し、重合開始剤の存在下に重合する方法
などが挙げられる。（メタ）アクリル酸メチル、（メ
タ）アクリル酸エチルなどのカチオン交換基に変換し得
る官能基を有する単量体を架橋性単量体などと混合し、
重合開始剤存在下で重合した後、得られた粒子の該官能
基を化学反応によりカチオン交換基に変換させてもよ
い。更に、特公平８−７１９７号公報に記載のように、
架橋重合体粒子を調製した後、カチオン交換基を有する
単量体を添加して、重合体粒子の表面付近に、該単量体
を重合させても良い。

【００２０】上記充填剤粒子の直径は、好ましくは０．
５〜２０μｍ、より好ましくは１〜１０μｍである。ま
た、粒度分布は、変動係数値（ＣＶ値）（粒径の標準偏
差÷平均直径×１００（％））として、好ましくは４０
％以下、より好ましくは３０％以下である。また、比較
的粒径の小さい充填剤（例えば、粒径３μｍ以下の充填
剤：多孔性及び非多孔性充填剤を含む）を用いてもよ
い。

【００２１】上記カラム筐体への充填剤の充填は、公知
の湿式スラリー法に従い、充填剤０．７ｇを８０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ５．６）３０ｍＬに分散させ、このス
ラリーをパッカーを用いて、ポンプ圧力３００ｋｇｆ／
ｃｍ²（２．９４×１０⁷Ｐａ）でカラム筐体内に定圧充
填することにより行う。

【００２２】上記ヘモグロビンコントロール希釈液は、
市販の凍結乾燥血液試料（コントロール血液）を精製水
で希釈し、これを溶血希釈液で１０１倍に希釈、溶血さ
せたものである。

【００２３】市販の凍結乾燥血液試料としては、例え
ば、国際試薬（株）社製 グリコヘモグロビンコントロ
ール レベル２等を好適に用いることができる。

【００２４】上記溶血希釈液は、下記の組成物を含有す
る水溶液で構成される。 ・ リン酸水素２ナトリウム１２水和物：６．０６ｍＭ ・ リン酸２水素ナトリウム２水和物：２ｍＭ ・ 界面活性剤（トリトンＸ−１００）：０．１（ｗ／
ｗ）％ なおｐＨ調整のために、リン酸または水酸化ナトリウム
を添加してもよい。ｐＨは７．５０±０．０１となるよ
う調整される。

【００２５】安定型ＨｂＡ１ｃ保持力試験に用いられる
溶離液である、８０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．６０）
は、下記の組成物を含有する水溶液で構成される。 ・ リン酸水素２ナトリウム１２水和物：２ｍＭ ・ リン酸２水素ナトリウム２水和物：７８ｍＭ なおｐＨ調整のために、リン酸または水酸化ナトリウム
を添加してもよい。ｐＨは５．６０±０．０１となるよ
う調整される。

【００２６】また、安定型ＨｂＡ１ｃ保持力試験に用い
られるもう一種の溶離液である、４５ｍＭ過塩素酸含有
３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５０）は、下記の組成
物を含有する水溶液で構成される。 ・ 過塩素酸ナトリウム（無水物）：４５ｍＭ ・ リン酸水素２ナトリウム１２水和物：０．７３ｍＭ ・ リン酸２水素ナトリウム２水和物：２９．２７ｍＭ なおｐＨ調整のために、リン酸または水酸化ナトリウム
を添加してもよい。ｐＨは５．５０±０．０１となるよ
う調整される。

【００２７】安定型ＨｂＡ１ｃ保持力試験は、一般的な
液体クロマトグラフィー装置を用いて実施される。例え
ば、図２に示したように、溶離液５ａ、送液ポンプ５、
試料導入装置６、カラム７、カラム恒温槽８、検出器
９、データ処理装置１０などの装置が接続された液体ク
ロマトグラフィー装置（例えば島津製作所製ＬＣ−１０
Ａシステムなど）を用いる。

【００２８】ただし、上記液体クロマトグラフィー装置
において、試料導入装置６のサンプル注入口からカラム
７入口までの配管の長さは１０ｃｍ、カラム７出口から
検出器９入口までの配管の長さは６０ｃｍとされる。ま
た、配管の内径は０．２５ｍｍ、素材はポリエーテルエ
ーテルケトンとする。

【００２９】また、安定型ＨｂＡ１ｃ保持力試験は以下
の条件下で行う。 ・ ヘモグロビンコントロール希釈液（試料）注入量：
１０μＬ ・ カラム恒温槽の温度：４０±０．２℃ ・ 溶離液の流速：１．３０ｍＬ／ｍｉｎ ・ 検出波長：４１５ｎｍ

【００３０】このような安定型ＨｂＡ１ｃ保持力試験法
による保持力パラメータは、ヘモグロビンコントロール
希釈液が試料導入装置６により注入されてから、安定型
ＨｂＡ１ｃのピークトップが溶出されるまでの時間
（分）で表わされる。

【００３１】本発明の充填剤は、少なくとも、上記８０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．６０）を使用して測定した
保持力パラメータが２．５〜６０、あるいは４５ｍＭ過
塩素酸含有３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５０）を使
用して測定した保持力パラメータが１．５〜６０であ
り、より好ましくは、この両方の保持力パラメータを有
する充填剤である。

【００３２】上記８０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．６
０）を使用して測定した保持力パラメータは、より好ま
しくは３．５〜４５、特に好ましくは４．５〜３０であ
る。これは、８０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．６０）を
使用して測定した保持力パラメータが２．５未満である
場合、ヘモグロビン類の充填剤への保持が弱いため、Ｈ
ｂＡ０溶出のための溶出力の強い溶離液の影響を大きく
受け、ヘモグロビン類の分離が悪化し、また、保持力パ
ラメータが６０を超えるとヘモグロビン類が充填剤に吸
着して分離できなくなるためである。

【００３３】上記４５ｍＭ過塩素酸含有３０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ５．５０）を使用して測定した保持力パラ
メータは、より好ましくは２．０〜４５、特に好ましく
は２．５〜３０である。これは、４５ｍＭ過塩素酸含有
３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５０）を使用して測定
した保持力パラメータが１．５未満である場合、ヘモグ
ロビン類の充填剤への保持が弱いため、ＨｂＡ０溶出の
ための溶出力の強い溶離液の影響を大きく受け、ヘモグ
ロビン類の分離が悪化し、また、保持力パラメータが６
０を超えるとヘモグロビン類が充填剤に吸着して分離で
きなくなるためである。

【００３４】次に、カラムに係わる発明について詳説す
る。本発明のカラムは、上述の充填剤が、カラム筐体に
充填されて構成される。

【００３５】本発明のカラムに用いられるカラム筐体
は、一般的に使用されているカラム筐体を用いることが
でき、内径や長さは特に限定されるものではないが、好
ましくは内径０．１〜５０ｍｍ、長さ１〜３００ｍｍ、
より好ましくは内径０．２〜３０ｍｍ、長さ５〜２００
ｍｍ、特に好ましくは内径０．３〜１０ｍｍ、長さ１０
〜１５０ｍｍのものが用いられる。また、カラム筐体の
材質としては、公知のステンレス等の金属、ガラス、Ｐ
ＥＥＫ、テフロン（登録商標）等の樹脂などが用いられ
る。また、カラム筐体内で充填剤と接する部位を、不活
性な素材で被覆してもよく、その素材としては、例えば
ＰＥＥＫ、ポリエチレン、テフロン、チタン化合物、珪
素化合物、シリコン膜等が挙げられる。

【００３６】カラム筐体の両端には、フィルターを設置
するのが好ましく、このフィルターの素材としては、公
知の素材、例えば、ステンレス、酸化チタン等の金属や
各種樹脂が用いられる。特にヘモグロビン類の吸着が少
ないイナートな素材のものが好ましく、例えば、ＰＥＥ
Ｋ、ポリエチレン、テフロン、チタンなどが用いられ
る。また、ステンレス製のフィルターのように、ヘモグ
ロビン類の吸着が大きいものを用いる場合は、表面をシ
リコーン処理、または、公知のブロッキング試薬（アル
ブミン、牛血清アルブミン、カゼイン、ゼラチンなど）
でブロッキングして用いるのが良い。

【００３７】充填剤のカラム筐体への充填方法は、特に
限定されず公知の任意の方法が使用できるが、スラリー
充填法を用いるのがより好ましい。具体的には、充填剤
を溶離液などの緩衝液に分散させたスラリーを、送液ポ
ンプなどによりカラム筐体に圧入することにより行うこ
とができる。

【００３８】次に、ヘモグロビン類の測定方法に係わる
発明について詳説する。本発明の測定方法は、上述の充
填剤あるいはカラムを用いた、ヘモグロビン類の測定方
法である。

【００３９】本発明方法を実施するのに使用される液体
クロマトグラフィーは、公知のものでよく、例えば、送
液ポンプ、試料注入装置（サンプラ）、カラム、検出器
などから構成される。また、他の付属装置（プレフィル
タ、カラム恒温槽や溶離液の脱気装置など）が適宜付属
されてもよい。

【００４０】また、セミミクロタイプの装置を用いても
よく、一例としては、資生堂社製のＮＡＮＯＳＰＡＣＥ
シリーズが挙げられ、送液ポンプ：イナートポンプ２０
０１ＮＡＮＯＳＰＡＣＥ ＳＩ−１、オートサンプラー
２００３、検出器ＵＶ−ＶＩＳ検出器２００などで構成
される。

【００４１】上記測定方法における溶離液の流速は、好
ましくは０．００１〜５ｍＬ／分、より好ましくは０．
０１〜４ｍＬ／分、特に好ましくは０．１〜３ｍＬ／分
である。ヘモグロビン類の検出は、４１５ｎｍの可視光
が好ましいが、特にこれのみに限定されるわけではな
い。測定試料は、通常、界面活性剤など溶血活性を有す
る物質を含む溶液により溶血された溶血液を、１０〜１
０００倍程度に希釈したものを用いる。液体クロマトグ
ラフィーへの試料注入量は、希釈倍率により異なるが、
好ましくは０．１〜１００μＬ程度である。

【００４２】また、本発明の測定方法においては、下記
の２種以上の溶離液を用い、公知の溶出方法、すなわち
グラディエント溶出法、ステップグラディエント溶出法
により、溶離液の送液を行うのが好ましい。

【００４３】本発明では、少なくとも安定型ＨｂＡ１ｃ
を分離するための溶離液（溶離液Ａ）と、ＨｂＡ０成分
を溶出するための溶離液（溶離液Ｂ）の２種類の溶離液
を用いるのが好ましい。

【００４４】上記溶離液Ａは、ｐＨ４．０〜６．８、好
ましくはｐＨ４．５〜５．８の緩衝液である。これは、
ｐＨが４未満の場合，ヘモグロビン類が変性する可能性
があり、ｐＨが６．８を超えると、ヘモグロビン類のプ
ラス電荷が減少し、カチオン交換基に保持されにくくな
り、分離能が悪くなるためである。

【００４５】溶離液Ａは、複数の異なる組成、異なる液
性の２種以上の溶離液（溶離液Ａ１、溶離液Ａ２…）か
ら構成される溶離液群Ａであってもよい。複数の溶離液
からなる溶離液群Ａを用いる場合、安定型ＨｂＡ１ｃが
溶出されるまでに、リニアグラディエント法あるいはス
テップグラディエント法により溶離液を切り替えること
により溶出を行うことができる。

【００４６】上記溶離液Ａには、以下に示す（１）無機
塩類、（２）ｐＨ調節剤、（３）有機溶媒（４）安定
剤、（５）アミン類、（６）界面活性剤、（７）カオト
ロピックイオン、（８）防腐剤、（９）ｐＨ４〜６．８
で緩衝能を持つ無機酸、有機酸等を添加してもよい。

【００４７】（１）無機塩類としては、例えば、塩化ナ
トリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウ
ム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。これらの塩類
の濃度は、特に限定されないが、好ましくは１〜１５０
０ｍＭである。

【００４８】（２）ｐＨ調節剤として、公知の酸、塩基
を添加してもよい。酸としては、例えば、塩酸、リン
酸、硝酸、硫酸等が挙げられ、また、塩基としては、水
酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水
酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム
等が挙げられる。これらの酸、塩基の濃度は、特に限定
されないが、好ましくは、０．００１〜５００ｍＭであ
る。

【００４９】（３）メタノール、エタノール、アセトニ
トリル、アセトンなどの水溶性有機溶媒と混合してもよ
い。これらの有機溶媒の濃度は、特に限定されないが、
好ましくは０〜８０体積％であり、カオトロピックイオ
ン、無機酸、有機酸、これらの塩などが析出しない程度
で用いるのが好ましい。

【００５０】（４）ヘモグロビン類の安定剤として、公
知の安定剤を添加してもよい。該安定剤としては、例え
ば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート
剤、グルタチオン等の還元剤・酸化防止剤等を添加して
もよい。

【００５１】（５）ヘモグロビン類の非特異的吸着を少
なくするために、アミン類を添加してもよい。該アミン
類としては、公知のものが用いられ、好ましくは、分子
量２０〜５００の第１級アミン、第２級アミン及び第３
級アミンが挙げられる。

【００５２】（６）界面活性剤として、ノニオン性界面
活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤
等を添加してもよい。界面活性剤を用いることにより、
溶血を効率よく行うだけでなく、例えば高速液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）等で測定を行う場合、溶血試
薬の通過する流路等を洗浄する効果がある。上記界面活
性剤は、好ましくはノニオン性界面活性剤が使用され、
例えば、ポリオキシエチレン類（以下、ポリオキシエチ
レンをＰＯＥ、エチレンオキシド付加モル数を（ｎ）で
表す。）、ＰＯＥ（７）デシルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）
ドデシルエーテル、ＰＯＥ（１０）トリデシルエーテ
ル、ＰＯＥ（１１）テトラデシルエーテル、ＰＯＥ
（ｎ）セチルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）ステアリルエーテ
ル、ＰＯＥ（ｎ）オレイルエーテル、ＰＯＥ（１７）セ
チルーステアリルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）オクチルフェ
ニルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）ノニルフェニルエーテル、
モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタ
ン、モノステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソル
ビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノラウリン酸ソルビタン、ＰＯ
Ｅ（ｎ）モノパルミチン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モ
ノステアリン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノオレイン
酸ソルビタン等が挙げられる。これらの界面活性剤は、
単独でもまた複数混合して用いてもよい。また、これら
の界面活性剤の添加量は、好ましくは０．０１〜１０重
量％である。

【００５３】（７）溶離液Ａには、カオトロピックイオ
ンを添加してもよい。該カオトロピックイオンとは、水
溶液に解離して生じたイオンにより、水の構造が破壊さ
れ、疎水性物質と水が接触したときに起こる、水のエン
トロピー減少を抑制するもので、具体的には、陰イオン
としては、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオ
ン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イ
オン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオ
ン、塩化物イオン、酢酸イオン等が挙げられ、またその
他に尿素等が挙げられる。また、陽イオンとしては、バ
リウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオ
ン、リチウムイオン、セシウムイオン、カリウムイオ
ン、グアニジンイオン等が挙げられる。これらの中で
も、より好ましくは、陰イオンとしては、トリブロモ酢
酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオ
ン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イ
オン、硝酸イオン、臭化物イオン等が挙げられ、陽イオ
ンとしては、バリウムイオン、カルシウムイオン、マグ
ネシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、グ
アニジンイオン等であり、特に好ましくは、トリブロモ
酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、ヨウ化物イオン、
チオシアン酸イオン、過塩素酸イオン、硝酸イオン、グ
アニジンイオン等が用いられる。

【００５４】（８）防腐剤としてアジ化ナトリウム、チ
モールなどを添加しても良い。

【００５５】（９）ｐＨ４〜６．８で緩衝能を持つ無機
酸、有機酸及び／またはこれらの塩を添加しても良い。
上記無機酸としては、例えば、リン酸、炭酸等が挙げら
れる。上記有機酸及び有機物としては、例えば、カルボ
ン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカ
ルボン酸、カコジル酸、アミノ酸、ピロリン酸等が挙げ
られる。

【００５６】上記カルボン酸としては、例えば、酢酸、
プロピオン酸等が挙げられる。上記ジカルボン酸として
は、例えば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピ
ン酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸等が挙げられ
る。上記カルボン酸誘導体としては、例えば、β、β−
ジメチルグルタル酸、バルビツール酸、アミノ酪酸等が
挙げられる。上記ヒドロキシカルボン酸としては、例え
ば、クエン酸、酒石酸、乳酸等が挙げられる。上記アミ
ノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、アスパラギン
等が挙げられる。上記無機酸または有機酸の塩として
は、公知のものでよく、例えばナトリウム塩、カリウム
塩等が挙げられる。上記無機酸、有機酸及び／またはこ
れらの塩は、単独でもまた、複数混合して用いても良
く、さらに、無機酸と有機酸を混合して用いてもよい。

【００５７】溶離液Ａ中の上記無機酸、有機酸等の濃度
は、水に溶解された状態で、溶離液ＡのｐＨを４．０〜
６．８にする緩衝作用がある範囲であればよく、好まし
くは１ｍＭ〜１０００ｍＭであり、より好ましくは１０
〜５００ｍＭである。

【００５８】上記無機酸、有機酸及び／またはこれらの
塩の中でも、酸解離定数（ｐＫａ）が２．１５〜６．３
９と６．４〜１０．５の両方にあるものを用いるのがよ
り好ましい。この場合、単一でｐＫａ値が２．１５〜
６．３９と６．４〜１０．５の両方にある物質を用いて
もよいし、緩衝液組成として複数の物質を含有している
場合、少なくとも一種の物質のｐＫａ値が２．１５〜
６．３９にあり、別の少なくとも一種の物質のｐＫａ値
が６．４〜１０．５にあるような組み合わせで用いても
よい。

【００５９】上記溶離液Ｂとしては、そのｐＨが６．８
以上、好ましくは７〜１２、さらに好ましくは７．５〜
１１、特に好ましくは８〜９．５のものを用いる。溶離
液ＢのｐＨが６．８未満の場合は、高濃度に存在するＨ
ｂＡ０成分の溶出が十分行われず、分離性能やカラム耐
久性の低下の要因となる。また溶離液ＢのｐＨが１２よ
り高い場合は、場合によっては充填剤が変性して劣化す
る恐れがあるがあるため、通液時間をより短くするなど
の方策をとる必要がある。但し、充填剤の分解が測定値
に影響がない場合は、溶離液ＢのｐＨを１２〜１３．５
にしても良い。

【００６０】溶離液Ｂは、複数の異なる組成、異なる液
性の２種以上の溶離液（溶離液Ｂ１、溶離液Ｂ２…）か
ら構成される溶離液群Ｂであってもよい

【００６１】上記溶離液Ｂとしては、例えば、リン酸、
ホウ酸、炭酸等の無機酸または、その塩；クエン酸等の
ヒドロキシカルボン酸、β、β−ジメチルグルタル酸等
のカルボン酸誘導体、マレイン酸等のジカルボン酸、カ
コジル酸、等の有機酸または、その塩からなる緩衝液が
挙げられる。その他、２−（Ｎ−モリホリノ）エタンス
ルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラ
ジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ビス
（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス−（ヒドロキシ
メチル）メタン（Ｂｉｓｔｒｉｓ）、Ｔｒｉｓ、ＡＤ
Ａ、ＰＩＰＥＳ、Ｂｉｓｔｒｉｓｐｒｏｐａｎｅ、ＡＣ
ＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰ
ＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、グリシルグリシ
ン、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ等の一般にグッド（Ｇｏｏｄ）
の緩衝液といわれるものも使用できる。また、Ｂｒｉｔ
ｔｏｎとＲｏｂｉｎｓｏｎの緩衝液；ＧＴＡ緩衝液も使
用できる。また、イミダゾール等のイミダゾール類；エ
チレンジアミン、メチルアミン、エチルアミン、トリエ
チルアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミ
ン等のアミン類；グリシン、β−アラニン、アスパラギ
ン酸、アスパラギン等のアミノ酸類；等の有機物も使用
できる。

【００６２】上記無機酸、有機酸等の中でも、酸解離定
数（ｐＫａ）が２．１５〜６．３９と６．４〜１０．５
の両方にあるものを用いるのがより好ましい。この場
合、単一でｐＫａ値が２．１５〜６．３９と６．４〜１
０．５の両方にある物質を用いてもよいし、緩衝液組成
として複数の物質を含有している場合、少なくとも一種
の物質のｐＫａ値が２．１５〜６．３９にあり、別の少
なくとも一種の物質のｐＫａ値が６．４〜１０．５にあ
る組み合わせで用いてもよい。

【００６３】溶離液Ｂ中の上記無機酸、有機酸等の濃度
は、水に溶解された状態で溶離液ＢのｐＨを６．８以上
にする緩衝作用がある範囲であればよく、好ましくは、
１ｍＭ〜１０００ｍＭであり、より好ましくは１０〜５
００ｍＭである。

【００６４】また、より効果的にＨｂＡ０成分を溶出す
るためには、上記溶離液Ｂに、カオトロピックイオンを
添加することが好ましい。上記カオトロピックイオン
は、前述した同様のものを用いることができる。カオト
ロピックイオンの溶離液Ｂ中の濃度は、１ｍＭ〜３００
０ｍＭが好ましく、１０ｍＭ〜１０００ｍＭがより好ま
しい。特に好ましくは、５０ｍＭ〜５００ｍＭである。

【００６５】上記溶離液Ｂには、前述した溶離液Ａに添
加される各種添加剤、例えば、（１）無機塩類、（２）
ｐＨ調節剤、（３）有機溶媒、（４）安定剤、（５）ア
ミン類、（６）界面活性剤、（８）防腐剤等の物質を添
加してもよい。

【００６６】

【実施例】次に、実施例、比較例を挙げて本発明を詳し
く説明するが、本発明はこれらの実施例にのみ限定され
るものではない。

【００６７】［実施例１］ （１）充填剤の調製 テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化
学社製）４５０ｇ及び２−ヒドロキシ−１，３−ジメタ
クリロキシプロパン（和光純薬社製）５０ｇの混合物に
過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）２ｇを溶解させた。
これを４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社
製）水溶液２５００ｍＬに分散させ、撹拌しながら窒素
雰囲気下で８０℃に昇温し、１．５時間重合させた。次
いで、反応系を３５℃に冷却した後、２−アクリルアミ
ド−２−メチルプロパンスルホン酸（東京化成社製）の
５０％水溶液４００ｇ、メタノール４００ｍＬを添加し
１時間攪拌しながら再び８０℃に昇温し１．３時間重合
させた。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径
６．５μｍの粒子を得た。

【００６８】（２）安定型ＨｂＡ１ｃ保持力試験 上記充填剤について、上述の方法により安定型ＨｂＡ１
ｃ保持力試験を実施した。液体クロマトグラフィーのシ
ステムとしては、下記のものを用いた。 システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製） オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学工業社製） 検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）

【００６９】上記充填剤の８０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
５．６０）を使用して測定した場合の保持力パラメータ
は１８．５であり、４５ｍＭ過塩素酸含有３０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ５．５０）を使用して測定した場合の保
持力パラメータは８．４であった。

【００７０】（３）性能評価 実施例１の充填剤について、以下のようにしてヘモグロ
ビン類の測定を行ない、性能の評価を行った。 ａ）カラム筐体への充填 上記充填剤をカラム筐体に以下のようにして充填した。
充填剤粒子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
５．８）３０ｍｌに分散し、５分間超音波処理した後、
よく撹拌した。全量をステンレス製のカラム筐体（内径
４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷
精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ
工業社製）を接続し、圧力３００ｋｇｆ／ｃｍ²（２．
９４×１０⁷Ｐａ）で定圧充填した。

【００７１】ｂ）ヘモグロビン類の測定 得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘモグロビ
ン類の測定を行った。 （測定条件） システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製） オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学工業社製） 検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製） 溶離液：溶離液Ａ：４６ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭコハク酸−４７ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３０） 溶離液Ｂ：６０ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭコハク酸−４７ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３０） 溶離液Ｃ：２５０ｍＭの過塩素酸を含む１０ｍＭコハク酸−４ ７ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．４０） 送液パターン：測定開始より０〜０．６分の間は溶離液Ａを送液し、 ０．６〜１．１分の間は溶離液Ｂを送液し、１．１〜 １．２分の間は溶離液Ｃを送液し、１．２〜１．５分の 間は溶離液Ａを送液した。 流速：１．７ｍＬ／分 検出波長：４１５ｎｍ 試料注入量：１０μＬ

【００７２】（測定試料）健常人血をフッ化ナトリウム
採血した全血検体から以下の試料を調製した。なお、溶
血試薬として、０．１重量％ポリエチレングリコールモ
ノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１０
０）（東京化成社製）を含有させたリン酸緩衝溶液（ｐ
Ｈ７．０）を用いた。

【００７３】ｃ）測定結果 上記測定条件により、得られたクロマトグラムを図３に
示した。ピーク１１はＨｂＡ１ａ及びｂ、ピーク１２は
ＨｂＦ、ピーク１３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク１４
は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク１５はＨｂＡ０を示す。図
３より、１．５分サイクルで安定型Ａ１ｃを分離測定で
きたことが分かる。

【００７４】［比較例１］ （１）充填剤の調製 東ソー社から市販されているヘモグロビン測定用カラム
（自動グリコＨｂ分析計ＨＬＣ−７２３ＧＨｂＶ専用カ
ラム）に充填されていた充填剤を比較例１の充填剤とし
た。

【００７５】（２）安定型ＨｂＡ１ｃ保持力試験 比較例１の充填剤について、実施例１と同様にして安定
型ＨｂＡ１ｃ保持力試験を行った。８０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ５．６０）を使用して測定した場合の保持力パ
ラメータは２．１であり、４５ｍＭ過塩素酸含有３０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．５０）を使用して測定した場
合の保持力パラメータは１．１であった。

【００７６】（３）性能評価 実施例１と同様にして、性能評価を行い、得られたクロ
マトグラムを図４に示した。図４から明らかなように、
実施例１に比べてヘモグロビン類の分離パターンが悪化
した。

【００７７】また、ＨｂＡ０溶出後、溶離液Ａでの平衡
化時間を１０分にしたら、実施例１と同様なクロマトグ
ラムが得られたが、測定時間は、１２分もかかってしま
った。

【００７８】［比較例２］ （１）充填剤の調製 資生堂社から市販されているヘモグロビン測定用カラム
（ＳＳ−Ｇｌｙｃｏｐａｋ ４Ｍ−２）に充填されてい
た充填剤を比較例２の充填剤とした。

【００７９】（２）安定型ＨｂＡ１ｃ保持力試験 比較例２の充填剤について、実施例１と同様にして安定
型ＨｂＡ１ｃ保持力試験を行った。８０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ５．６０）を使用して測定した場合の保持力パ
ラメータは１．３０であり、４５ｍＭ過塩素酸含有３０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５０）を使用して測定した
場合の保持力パラメータは０．４５であった。

【００８０】（３）性能評価 実施例１と同様にして、性能評価を行い、得られたクロ
マトグラムを図５に示した。図５から明らかなように、
実施例１に比べてヘモグロビン類の分離パターンが悪化
した。

【００８１】また、ＨｂＡ０溶出後、溶離液Ａでの平衡
化時間を１５分にしたら、実施例１と同様なクロマトグ
ラムが得られたが、測定時間は、１８分もかかってしま
った。

【００８２】［比較例３］ （１）充填剤の調製 実施例１の充填剤の調製において、２−アクリルアミド
−２−メチルプロパンスルホン酸の５０％水溶液の添加
量を１００ｇに代えたこと以外は、実施例１と同様にし
て、比較例３の充填剤を調製した。

【００８３】（２）安定型ＨｂＡ１ｃ保持力試験 比較例３の充填剤について、実施例１と同様にして安定
型ＨｂＡ１ｃ保持力試験を行った。８０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ５．６０）を使用して測定した場合の保持力パ
ラメータは１．２８であり、４５ｍＭ過塩素酸含有３０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５０）を使用して測定した
場合の保持力パラメータは０．３９であった。

【００８４】（３）性能評価 実施例１と同様にして、性能評価を行った。実施例１に
比べてヘモグロビン類の分離パターンが悪化した。

【００８５】［比較例４］ （１）充填剤の調製 実施例１の充填剤の調製において、２−アクリルアミド
−２−メチルプロパンスルホン酸の５０％水溶液の添加
量を１０００ｇに代えたこと以外は、実施例１と同様に
して、比較例４の充填剤を調製した。

【００８６】（２）安定型ＨｂＡ１ｃ保持力試験 比較例４の充填剤について、実施例１と同様にして安定
型ＨｂＡ１ｃ保持力試験を行った。８０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ５．６０）を使用して測定した場合の保持力パ
ラメータは７３であり、４５ｍＭ過塩素酸含有３０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ５．５０）を使用して測定した場合
の保持力パラメータは７１であった。

【００８７】（３）性能評価 実施例１と同様にして、性能評価を行った。実施例１に
比べてヘモグロビン類の分離パターンが悪化した。

【００８８】［比較例５］ （１）充填剤の調製 積水化学工業（株）から市販されているヘモグロビン測
定用カラム（MicronexA1c HS-II）に充填されていた充
填剤を比較例５の充填剤とした。

【００８９】（２）安定型ＨｂＡ１ｃ保持力試験 比較例５の充填剤について、実施例１と同様にして安定
型ＨｂＡ１ｃ保持力試験を行った。８０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ５．６０）を使用して測定した場合の保持力パ
ラメータは１００であった。また、４５ｍＭ過塩素酸含
有３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５０）を使用して測
定した場合の保持力パラメータは１００であった。

【００９０】（３）性能評価 実施例１と同様にして、性能評価を行った結果、ヘモグ
ロビン類が充填剤に吸着して短時間で安定化ＨｂＡ１ｃ
を分離することが出来なかった。

【００９１】［比較例６］ （１）充填剤の調製 積水化学工業（株）から市販されているヘモグロビン測
定用カラム（MicronexA1c HS IV）に充填されていた充
填剤を比較例６の充填剤とした。

【００９２】（２）安定型ＨｂＡ１ｃ保持力試験 比較例６の充填剤について、実施例１と同様にして安定
型ＨｂＡ１ｃ保持力試験を行った。８０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ５．６０）を使用して測定した場合の保持力パ
ラメータは９５であった。また、４５ｍＭ過塩素酸含有
３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５０）を使用して測定
した場合の保持力パラメータは９５であった。

【００９３】（３）性能評価 実施例１と同様にして、性能評価を行った結果、ヘモグ
ロビン類が充填剤に吸着して短時間で不安定型ＨｂＡ１
ｃを分離することが出来なかった。

【００９４】

【発明の効果】本発明の充填剤、カラム、及び測定方法
は以上の構成からなるので、安定型ＨｂＡ１ｃを、高精
度かつ短時間で分離、測定することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 安定型ＨｂＡ１ｃ保持力試験法に用いられ
る、特定形態のカラム筐体を示した図。

【図２】 安定型ＨｂＡ１ｃ保持力試験に用いられる液
体クロマトグラフィー装置を示した概略図。

【図３】 実施例１の充填剤によりヘモグロビン類の測
定を行った際のクロマトグラムを示した図。

【図４】 比較例１の充填剤によりヘモグロビン類の測
定を行った際のクロマトグラムを示した図。

【図５】 比較例２の充填剤によりヘモグロビン類の
測定を行った際のクロマトグラムを示した図。

【符号の説明】

１ カラム筐体 ２ フィルター ３ 充填剤 ４ エンドフィッティング ５ 送液ポンプ ５ａ 溶離液 ６ 試料導入装置 ７ カラム ８ カラム恒温槽 ９ 検出器 １０ データ処理装置 １１ ＨｂＡ１ａ及びｂのピーク １２ ＨｂＦのピーク １３ 不安定型ＨｂＡ１ｃのピーク １４ 安定型ＨｂＡ１ｃのピーク １５ ＨｂＡ０のピーク

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｕ 33/72 33/72 Ａ // Ｇ０１Ｎ 30/96 30/96 Ｄ Ｆターム(参考） 2G045 AA25 BB29 BB44 BB50 BB52 CA25 DA48 FA07 FB06 HA06 HA09 JA01 JA08 4G066 AB06B AB07B AB09B AC12B AC17B AC33B AD06B AE10B BA09 BA20 BA36 CA54 DA12 EA01

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヘモグロビン類の測定方法に用いられ
   る、カチオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤であ
   って、 安定型ＨｂＡ１ｃ保持力試験法により、８０ｍＭリン酸
   緩衝液（ｐＨ５．６０）を使用して測定した保持力パラ
   メータが２．５〜６０、 及び／または、４５ｍＭ過塩素酸含有３０ｍＭリン酸緩
   衝液（ｐＨ５．５０）を使用して測定した保持力パラメ
   ータが１．５〜６０であることを特徴とする液体クロマ
   トグラフィー用充填剤。
2. 【請求項２】 請求項１記載の液体クロマトグラフィー
   用充填剤が、カラム筐体に充填されてなる液体クロマト
   グラフィー用カラム。
3. 【請求項３】 請求項１記載の充填剤または請求項２記
   載のカラムを使用した、液体クロマトグラフィーによる
   ヘモグロビン類の測定方法。