JPH055730A - 液体クロマトグラフ装置 - Google Patents

液体クロマトグラフ装置

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JPH055730A
JPH055730A JP3316001A JP31600191A JPH055730A JP H055730 A JPH055730 A JP H055730A JP 3316001 A JP3316001 A JP 3316001A JP 31600191 A JP31600191 A JP 31600191A JP H055730 A JPH055730 A JP H055730A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】本発明は生体成分分析用液体クロマトグラフ装
置に係り、特に生体成分を高精度に分析すると共に、装
置の長寿命化を図った液体クロマトグラフ装置を提供す
ることにある。 【構成】サンプルテーブル７にセットされた検体を、サ
ンプルループ１０にて計量し所定量分離カラム１８又は
２１に送り、前記分離カラムで別に送られてきた溶離液
と、充填剤により各種成分に分解して検出器２３にて検
出する場合に、分離カラムに充填する特定の充填剤を用
い、溶離液を所定のものを選択しかつ分析条件を制御す
る制御装置２５を設けた構成とした。 【効果】所定の充填剤を用い、溶離液等を分析条件に合
わせて選択することによって、分析精度の向上を図れ、
分析結果に基づいて分離カラムの性能劣化を判定して分
析条件を変えて装置の長寿命化を図れる効果がある。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は生体成分分析用液体クロ
マトグラフ装置に係り、特にグリコヘモグロビン分析用
の液体クロマトグラフ装置と、その分離カラム、及びそ
れに用いられる充填剤や溶離液等に関する。
【０００２】
【従来の技術】グリコヘモグロビン(ＧＨｂ；glycosyla
tedhemoglobin）は血液中の糖がその濃度に応じて赤血
球に入った後に、ヘモグロビン（Ｈｂ）と結合して生成
されるものである。ＧＨｂのうち、Ａ1ｃ の濃度は過去
２ヵ月前後の平均的な血糖値を反映すると云われてい
る。
【０００３】Ａ1ｃ は非酵素的に２段階の反応を経て生
成され、不安定型Ａ1ｃ(ｌ−Ａ1ｃ)と安定型Ａ1ｃ（ｓ
−Ａ1ｃ）とに分けられる。ｌ−Ａ1ｃ は食事や生理的
要因によって変動するため、ｓ−Ａ1ｃ をｌ−Ａ1ｃ と
分離して測定することが望ましい。従来のＧＨｂ分析装
置ではＨｂをＡ1ａ，Ａ1ｂ，ＨｂＦ，Ａ1ｃ及びＡ0の５
成分に分離するのに３.５ 分、Ａ1ａ，Ａ1ｂ，ＨｂＦ，
ｌ−Ａ1ｃ，ｓ−Ａ1ｃ、及びＡ0 の６成分に分離するの
に８分を要していることが日本臨床検査自動化学会会誌
（高橋他、１９８７年１２月号頁１３３）に述べられて
いる。
【０００４】なお、人によっては、Ａ1ａ，Ａ1ｂ，Ｈｂ
Ｆの含有率が少なくて検出されなかったり、逆に他のＨ
ｂやＨｂ誘導体が含まれている場合があるため、必ずし
も全ての人の場合、５成分あるいは６成分に分離される
わけではない。しかし、ここでは便宜的に５成分分析あ
るいは６成分分析として示す。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記従来技術ではＨｂ
をＡ1ａ，Ａ1ｂ，ＨｂＦ，Ａ1ｃ及びＡ0の５成分に分離
する場合と、Ａ1ａ，Ａ1ｂ，ＨｂＦ，ｌ−Ａ1ｃ，ｓ−
Ａ1ｃ、及びＡ0 の６成分に分離する場合では、分離カ
ラムの大きさ及び充填剤の種類等によって、同一組成の
溶離液を使用できないため、溶離液を交換しなければな
らず操作が煩雑であるという問題があった。また、従来
から用いられている充填剤を用いた場合、分析に時間が
かかるという問題や、分離カラムの性能劣化に対する検
討が何もなされていなかった。
【０００６】本発明の目的は、同一の溶離液を用いて５
成分分析及び６成分分析を可能にすると共に、安定型Ａ
1ｃ（ｓ−Ａ1ｃ）を他のＨｂ成分と短時間で分離できる
分離カラムとそれを用いた液体クロマトグラフ装置を提
供するにある。さらに、分離カラムの性能劣化の判定を
合理的に行い、分析の信頼性を向上できる液体クロマト
グラフ装置とその使用方法等を提供するにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明は有機多孔質物質に官能基を導入した充填剤
を充填した分離カラムと、１つ以上の溶離液と、検体を
サンプリングして分離カラムへ移送する手段と、分離カ
ラムで分離された成分の濃度変化を検出する手段を有
し、液体クロマトグラフィにより血液中のヘモグロビ
ン，グリコヘモグロビン又はヘモグロビン誘導体を分離
する液体クロマトグラフ装置において、前記分離カラム
に充填する充填剤が乾燥状態での細孔性が６００〜１２
００Å、乾燥状態で１ｇ当りの交換容量が０.１〜０.５
meq であり、粒径が４μｍ以下とし、細孔部分の容積が
０.２〜０.６ｍｌ／ｇ、のものを使用する。さらに、溶
離液としてｐＨ５.０〜７.０の緩衝液を用いるものであ
る。
【０００８】さらに５成分分析をする場合と６成分分析
をする場合とで分離カラムを切り換えて行える構成とし
たものである。
【０００９】また、分離カラムから流出する溶離液から
前記検体の成分濃度に関するクロマトグラムを測定する
手段に、前記分離カラムの分離性能を評価するパラメー
タを演算する演算手段と、求めた評価パラメータが予め
設定した基準値に対し許容範囲にあるかどうかを判定
し、前記分離カラムの性能劣化を判定する評価手段を設
けたものである。
【００１０】
【作用】分離カラムに充填する充填剤を前記充填剤とす
ることによって、分離性能を向上すると共に、分離カラ
ムを短くでき分離時間を短縮できる。また、同一充填剤
を異なる長さの分離カラムに充填し、分離カラムを切り
換えることによって５成分分析と６成分分析を同一溶離
液で行えるようにしたものである。
【００１１】さらに、分離カラムの性能評価手段を設け
ることによって、分析精度向上を図れるほか、分離カラ
ムの性能劣化を判断した場合でも、溶離液等の条件を変
えることによって分離カラムの延命を図ることができ
る。
【００１２】
【実施例】図１は本願発明の液体クロマトグラフ装置の
全体構成を示したものである。
【００１３】図において、１から３は溶離液、４は洗浄
液を入れたボトルユニット部であり、５は前記溶離液を
それぞれ選択する三方電磁弁、前記溶離液１〜３をオー
トサンプラ１４に移送する圧力を発生する選液ポンプ
６，前記オートサンプラ１４の内部にはサンプルテーブ
ル７，吸引ノズル８，検体輸送管９，サンプルループ１
０，六方バルブ１３，シリンダ１１と三方バルブ１２等
から構成される。さらに、三方バルブ１５を介して溶離
液と検体はプレフィルタ１６又は１９を介して分離カラ
ム１８又は２１に送られそれぞれの成分が抽出し、三方
バルブ２２を介して検出器２３に送られる（本図では分
離カラムを２台セットし検体の成分を抽出する装置を示
したが、分離カラムを１台とし、三方バルブ１５，２２
を設けなくとも良い）。検出器２３からの検出信号はデ
ータ処理部２４から制御・記憶部（マイクロコンピュー
タ）２５へ送られ、プリンタ２６，表示部２７に出力さ
れる。また、制御・記憶部２５にはキーボード等の操作
卓が接続され検出条件等の設定ができるようになってい
る。
【００１４】なお図では、データ処理部２４と制御・記
憶部２５とを別々に設けているが当然のことながらこれ
らを一体としても問題は無い。
【００１５】又分離カラム１８，２１とプレフィルタ１
６，１９はそれぞれ温度を調整するカラム恒温槽（カラ
ムオーブン）１７又は２０内に設けられている。
【００１６】さらに、制御・記憶部２５からは各アクチ
ュエータ（例えば、三方バルブ、ポンプ等）に制御信号
を送信したり各アクチュエータから状態を知らせる信号
を受信する構成となっている。この制御・記憶部２５に
は前記分離カラムの性能を評価する評価パラメータや前
記評価パラメータの基準範囲等のデータをテーブル形式
で記憶している。この記憶されたデータは先に述べた操
作卓からの指令により変更できる構成となっている。な
お、前記信号線を図の点線で示している。
【００１７】次に本装置の動作について説明する。
【００１８】サンプルテーブル７にセットされた検体
は、吸引ノズル８と検体輸送管９を介してシリンダ１１
からの圧力によって六方バルブ１３に入り、その後三方
バルブ１５によって分析条件に応じて使用する分離カラ
ム１８又は２１側に移送される。検体はプレフィルタ１
６、又は１９を通って分離カラム１８又は２１に入る。
この時、サンプルループ１０において検体を計量する。
各溶離液Ａ液１，Ｂ液２，Ｃ液３は三方電磁弁５を介し
て選液ポンプ６によって六方バルブと三方バルブ１５を
介してプレフィルタ１６又は１９を通した後、分離カラ
ム１８又は２１に供給される。分離カラム１８、又は２
１からの溶出液を検出器２３を用いて所定の波長におけ
る吸光度を測定し、データ処理装置２４においてデータ
の処理を行うものである。
【００１９】上記装置を用いて実際に溶離液を変化させ
て分析を行った結果について次に述べる。なお、分離カ
ラムを１つだけ設けた装置を用いた場合について述べ
る。
【００２０】本実施例では検体として、抗凝固剤にエチ
レンジアミン四酢酸ナトリュウム塩を添加した新鮮血を
用いた。この血液を溶血剤(１％ Toriton Ｘ−１００
で２００倍に希釈したもの（溶血液）を、前記オートサ
ンプラ１４のサンプルテーーブル７にセットした。分離
カラムのサイズは内径４.６mm ，長さ３５mmとした。ま
たカラム恒温槽（カラムオーブン）１７の温度は３０℃
に設定した。なお、分離カラム１８の前に血液中の固形
物や溶離液中のゴミを取り除くために、プレフィルタ１
６を設けているものである。
【００２１】 溶離液としてＡ液は； ３３ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4 ７ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4 ｐＨ ６．２ Ｂ液は； ６６ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4 １４ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4 ｐＨ ６.２ Ｃ液は；１６０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4 ４０ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4 ｐＨ ６.１ とした。
【００２２】各成分の分離は、以下に示すようなステッ
プワイズグラジェント法に依った。 Ａ液； ０〜０.２分 Ｂ液； ０.３〜１.５分 Ｃ液； ２.０〜１.９分 Ａ液； ２.０〜３.５分 溶離液流量；１.２ｍｌ／min 検出波長４１５ｎｍにて吸光度を測定した。前記条件に
て得られたクロマトグラフを図２に示す。図２において
ピークｐ１がＡ1ａ，ピークｐ２がＡ2ｂ，ピークｐ３が
ＡｂＦ，ピークｐ４が不安定型Ａ1ｃ（ｌ−Ａ1ｃ），ピ
ークｐ５が安定型Ａ1ｃ（ｓ−Ａ1ｃ），ピークｐ６がＨ
ｂＡ0 である。各ピークの同定方法に関しては後述す
る。
【００２３】図２に示すように、血液中のヘモグロビン
をＡ1ａ，Ａ1ｂ，ＨｂＦ，ｌ−Ａ1ｃ，ｓ−Ａ1ｃ及びＨ
ｂＡ0の６成分に３.５分で分離できた。このように、本
発明によれば従来ｓ−Ａ1ｃ を分離するのに８〜６０分
要していたが前記の時間に短縮された。
【００２４】次に前記実測に用いた充填剤について検討
した結果について述べる。図３に充填剤の細孔径とＡ1
ｃ（又はｓ−Ａ1ｃ）成分のピークについて計算した理
論段数Ｎ（クロマトグラフのピークのシャープさの指標
とした用いられる値で、Ｎが大きいほどシャープなピー
クであることを示す）との関係を示す。
【００２５】図４に充填剤の細孔径とカラムの圧力損失
ΔＰとの関係を示す。
【００２６】なお、理論段数Ｎは次式にて求められる。
【００２７】
【数１】
【００２８】ここで、ｔｒ；各成分の保持時間 σ；ピークの広がりの標準偏差 カラムの圧力損失ΔＰはカラムの入口と出口の圧力差で
あり、ΔＰが大きいとポンプのシールの寿命が短くな
る。また、カラムの寿命が短くなるΔＰは次式で示され
る。
【００２９】
【数２】
【００３０】ここで、 φ；カラムの透過係数 Ｌ；カラムの長さ ｕ；溶離液の線速度 η；溶離液の粘度 ｄｐ；充填剤の粒径 なお、φは充填剤の物性や充填剤の充填状態により決ま
る値である。
【００３１】図３及び図４は、充填剤を真空乾燥(５０
℃、１０時間）後の平均粒径が３.４〜３.５μｍ ，乾
燥重量１ｇ当りの交換容量が０.２〜０.２８meq とほぼ
一定、細孔径が４００〜１６００Åの範囲で変化してい
るものを用い、充填剤の物性とこれら充填剤をカラムに
充填したときのカラム性能との関係を求めたものであ
る。なお充填剤のカラムへの充填はスラリー法によっ
た。スラリー溶剤及び充填剤溶媒としては、５０ｍＭリ
ン酸カリュウム（ｐＨ６.２）を使用し、充填圧力150kg
／cm2にて充填溶媒を１時間選液した。なお、カラムと
しては、内径４.６mm長さ３５mmのステンレス製カラム
を使用した。さらに、試料として、抗凝固剤にエチレン
ジアミン四酢酸ナトリュウム塩を添加して採血した正常
成人の新鮮血を用いた。この血液に溶血剤（１％ Torit
onＸ−１００溶液）を加えて２００倍に希釈したものを
用いた。
【００３２】溶離液としては、リン酸一カリュウム（Ｋ
Ｈ2ＰＯ4）及びリン酸二カリュウム（Ｋ2ＨＰＯ4）を下
記濃度になるように脱塩水に溶解したものを使用した。
【００３３】Ａ液は； ３３ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4 ７ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4 ｐＨ ６.２ Ｂ液は；１６０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4 ４０ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4 ｐＨ ６.１ なお、装置は図１に示したもの（但し、三方バルブ１５
及び２２と分離カラム部２０が無いもの）で、特にポン
プには日立製Ｌ−６２００型インテリジェントポンプ、
ポンプインジェクタには容量１０μｌのものを、検出器
には日立製Ｌ−４２００型ＵＶ−ＶＩＳ検出器を、デー
タ処理装置には日立製Ｌ−２５００形データ処理装置を
用いた。
【００３４】カラム温度は２５℃、検出波長は４１５ｎ
ｍにて分析を行った。各成分の分離は下記に示すリニア
グラジェント法を用いた。
【００３５】Ａ液／Ｂ液＝１００／０（体積比）１０分
⇒Ａ液／Ｂ液＝６０／４０(体積比) 溶離液流量：１.０ｍｌ／min 上述した２１種の充填剤を用いた血液中のヘモグロビ
ン，グリコヘモグロビンなどを測定したものである。
【００３６】図３に示したように、細孔径６００Å〜１
２００Åの充填剤を用いた場合、理論段数は約１４００
段であった。しかし、細孔径が６００Åより小さい場合
や、１２００Åより大きくなると、理論段数Ｎが減少し
ピークがブロードになった。なお、細孔径が４００Åの
ときの理論段数Ｎは約７００段、１６００Åのときは約
２００段である。このように、分離性能の点から細孔径
は６００Å〜１２００Åの範囲が適している。
【００３７】さらに、図４に示すように細孔径が大きく
なるとカラムの圧力損失ΔＰが徐々に増加する傾向があ
る。細孔径が１４００Åより大きくなると、ΔＰは急激
に増大する。細孔径が大きな充填剤は機械的強度が弱
く、充填中や測定中に細孔がつぶれたり、変形したりし
て充填状態が変化して、ΔＰが大きくなるものと考えら
れる。
【００３８】図３及び図４から判るように充填剤として
は、分離性能及びカラムの圧力損失（カラムの透過性）
の点から、細孔径が４００Å〜１４００Åの範囲が適し
ている。
【００３９】図５に乾燥状態での細孔径と細孔部分の容
積との関係を測定した結果を示す。図のように細孔径が
大きくなると細孔部分の容積が小さくなるという傾向が
見られる。先に述べた図３，図４及び、この図５から細
孔部分の容積は０.２〜０.６ｍｌ／ｇの場合に、高分離
で且つ透過性の良い充填剤であることが判る。
【００４０】次に、前記の実験により確認された、最適
な充填剤と細孔径の小さな充填剤及び細孔径の大きな充
填剤の三種類の充填剤を用いて血液を実際に分析した結
果について述べる。
【００４１】表１に使用した充填剤の物性等を示す。
【００４２】
【表１】
【００４３】表において試料１は先の実験で良好な結果
が得られる細孔径の充填剤を、比較例１は細孔径が小さ
いものまた比較例２は細孔径が大きいものである。
【００４４】なお、理論段数Ｎや圧力損失ΔＰは先に述
べた方法で行った。図６，図７及び図８に表１に示した
充填剤を用いたときの検出結果のクロマトグラフを示
す。図６は本発明の充填剤を使用した場合の分析結果で
ある。図において、ピークｐ１がＡ1ａ，ピークｐ２が
Ａ1ｂ，ピークｐ３がＨｂｆ、ピークｐ４が不安定型Ａ1
ｃ（ｌ−Ａ1ｃ），ピークｐ５が安定型Ａ1ｃ（ｓ−Ａ1
ｃ），ピークｐ６がＨｂＡ0である。
【００４５】各ピークの同定は次のように行った。血液
と糖あるいは糖誘導体とをインキュベート(incubate)す
ることにより、種々のグリコヘモグロビンを生成させる
ことができるということが知られており、増大したピー
クを確認することにより、各ピークの同定が可能であ
る。フルクトース−１，６−ニリン酸（Ｆ−１，６−Ｄ
Ｐ），グルコース−６一リン酸（Ｇ−６−Ｐ）添加によ
りＡ1ａ(ピーク１）を、ピルビン酸添加によりＡ1ｂ(ピ
ーク２）を確認した。また、血液グルコースを添加し、
インキューベント酸で検体を調整してクロマトグラムを
測定したところ、ピーク４が顕著に増大したこと、さら
に生理食塩水中でインキューベント後にクロマトグラム
を測定したところ、ピーク４は減少したが、ピーク５は
変化が無かったことから、ピーク４がｌ−Ａ1ｃであ
り、ピーク５がｓ−Ａ1ｃであることを同定した。また
ピーク３は臍帯血の主成分と同一位置に溶出されること
から、ＨｂＦであると同定した。
【００４６】図７は表１の比較例１の細孔径の小さい充
填剤を用いた場合のクロマトグラフを示したもので、図
８は充填剤の細孔径が大きいもの（表１の比較例２）を
用いた場合のクロマトグラフを示したものである。
【００４７】前記２つの図において、ピークｐ１はＡ1
ａ，ピークｐ２がＡ1ｂ，ピークｐ３がＨｂｆ，ピーク
ｐ７がＡ1ｃ，ピークｐ６がＨｂＡ0である。各ピークの
同定は図６と同じ方法で行った。比較例１及び比較例２
では、Ａ1ｃをｌ−Ａ1ｃとｓ−Ａ1ｃ とに分離すること
ができなかった。比較例１及び比較例２は試料１に比べ
て各成分がブロードであり、ピークの切れも悪い。比較
例１及び比較例２で十分な分離性能が得られていないの
は細孔径や細孔容積などの充填剤物質が最適化されてお
らず、理論段数が小さいためである。
【００４８】従って、充填剤としては乾燥状態での細孔
径が６００〜１２００Å、細孔部分の容積が０.２〜０.
６ｍｌ／ｇが良い。
【００４９】上述のように、本発明によれば血液中のヘ
モグロビンを同じ分析時間でより細かく分けることがで
きる。従って、より正確な測定が可能となる。
【００５０】次に、表２に示す充填剤について検討し
た。
【００５１】
【表２】
【００５２】今回の検討では先に示した充填剤のうちで
分離性能のよい細孔径が８００Å近辺のものについて交
換容量を変化させてその影響を調べたものである。今回
の充填剤は、メタクリレート系ゲルを母材とし、官能基
としてカルボキシメチル基を導入した充填剤で、粒径，
細孔径，細孔容積がほぼ一定で、乾燥重量１ｇ当りの交
換容量の値が０.０５〜０.２meq の範囲で変化している
ものについて、先の実測と同様の条件でクロマトグラフ
を測定し、理論段数Ｎと圧力損失ΔＰを求めて表２に示
している。
【００５３】さらに、乾燥重量１ｇ当りの交換容量と理
論段数の関係を図９に示す。
【００５４】比較例４（交換容量；０.０５meq／ｇ）で
は理論段数Ｎが２５０段と小さかった。この理由は、官
能基（カルボキシメチル基）の導入量が少なくて、サン
プルと充填剤との間の交換反応が速やかに行われなかっ
たことが考えられる。また、比較例３（交換容量；２.
０meq／ｇ）では理論段数Ｎが８００段と実施例２〜５
に比べて小さかった。さらに、ΔＰが実施例２〜５に比
べて１０％程度大きかった。交換容量の大きな充填剤
は、交換容量の小さな充填剤に比べて、溶離液の塩濃度
を変えたとき、膨潤，収縮が大きい。このように交換容
量の大きな充填剤では、膨潤・収縮が大きく不安定であ
ることや透過性が悪いことにより、理論段数Ｎが減少し
たものと考えられる。従って、乾燥重量１ｇ当りの交換
容量としては０.１〜０.５meq がよい。
【００５５】以上のことから、液体クロマトグラフによ
り血液中のヘモグロビン、グリコヘモグロビンなどを高
速、且つ高分離に分析するための分離カラムとしては、
特に、安定型Ａ1ｃと不安定型Ａ1ｃとをクロマト的に短
時間で分析するための分離カラムとしては、乾燥状態で
の細孔径が６００〜１２００Å，乾燥重量１ｇ当りの交
換容量が０.１〜０.５meq である充填剤を充填した分離
カラムが適している。次に、試料１及び比較例２の充填
剤を導入した分離カラムを用いて、蛋白質混合物の分離
を行なった。使用した分離カラムは内径４.６mm ，長さ
３５mmのものを用いた。
【００５６】検体としては、標準蛋白（ミオグロビン，
リボヌクレアーゼ，α−キモトリプシノーゲンＡ，リゾ
チーム）を混合したものを用いた。
【００５７】溶離液としては、リン酸一ナトリュウム，
リン酸二ナトリュウム，塩化ナトリュウムを下記濃度に
なるように脱イオン水に溶解したものを用いた。
【００５８】Ｄ液は； １６.８ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4 ８.２ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4 ｐＨ ７.０ Ｂ液は； １６.８ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4 ８.２ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4 ｐＨ ７.０ 溶離液流量；１.２ｍｌ／min 検出波長 ；２８０ｎｍ 各成分の分離は下に示すようなリニアグラジェント法に
よった。
【００５９】 Ｄ液／Ｅ液＝１００／０ ４分⇒０／１００ ４.１分から６.０分まで、分離カラムを初期状態に戻す
ため、Ｄ液を送液した。
【００６０】試料１の充填剤を用いた場合と比較例２の
充填剤を用いた場合について得られたクロマトグラムを
図１０、図１１に示す。図１０及び図１１において、ピ
ークｐ２７はミオグロビン、ピークｐ２８はリボヌクレ
アーゼＡ，ピークｐ２９はα−キモトリプシノーゲン
Ａ，ピークｐ３０はリゾチームである。
【００６１】図１０では各蛋白質のピークはシャープで
あり、α−キモトリプシノーゲンＡ（ピークｐ２９），
リゾチーム（ピークｐ３０）は各々のピークの前に出現
する蛋白質の分解物，誘導体や不純物と推測させるピー
クをきちんと分離している。図１１では各ピーク保持時
間は図１０とほぼ等しい。しかし、ピーク幅は図１０と
比べると広くなっている。また、α−キモトリプシノー
ゲンＡ，リゾチームと各々のピークの前に出現するピー
クとは分離されていない。
【００６２】従来の分離カラムではこのような蛋白質の
混合物を分離するのに３０分程度の時間を要していた。
本発明では、細孔径，交換容量などの物性を最適化して
いるので、従来の約１／５の分析時間で蛋白質の混合物
を分離することができる。
【００６３】以上述べてきたように、本発明によれば、
分離性能及び透過性の良い分離カラムを得ることができ
るので、生体成分を高分離且つ高速に分離できるという
効果がある。
【００６４】次に、グリコヘモグロビンを分析するのに
有効な溶離液について検討した。
【００６５】充填剤としては、メタクリレート系ゲルに
カルボキシメチル基を導入した充填剤を使用した。この
充填剤の乾燥状態での粒径は３.５±０.４μｍ、比表面
積は２０ｍ2／ｇ，交換容量は０.２８meq／ｇであっ
た。
【００６６】この充填剤をスラリー法にてカラム（内径
４.６mm，長さ３５mm)に充填した。スラリー溶媒及び充
填溶媒としては、１Ｍ ＮａＣｌ溶液を用い、充填圧力
150kg／cm2 にて充填溶媒を１時間送液した。
【００６７】検体としては、抗凝固剤としてエチレンジ
アミン四酢酸ナトリウム塩を添加して採血した正常成人
新鮮血を用いた。この新鮮血に市販の溶血剤を加えて２
００倍に希釈した。
【００６８】装置は図１と同じ液体クロマトグラフの装
置を用いた。但し、検体の注入にはオートサンプラの代
わりに１０μｌのインジェクタを用いた。
【００６９】本発明の溶離液は試料６として以下の組成
のものを用いた。
【００７０】４６ ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4 １０ ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4 ０.００５％（Ｗ／Ｖ） ＮａＮ3 ０.１ｍＭ TritonＸ−１００ ｐＨ ６.２０ 上記試料６に対して比較例５の溶離液として下記のもの
を用いた。
【００７１】４６ ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4 １０ ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4 ０.００５％（Ｗ／Ｖ） ＮａＮ3 ｐＨ ６.２０ 上記のように試料６と比較例５と異なる点は溶離液中に
非イオン性の界面活性剤であるTritonＸ−１００を添加
している点である。
【００７２】試料６及び比較例５の溶離液を用い測定温
度を変化させて、クロマトグラムを測定した。その時の
測定条件を以下に示す。
【００７３】カラム温度；２３℃，３０℃，３５℃，４
０℃，４５℃，５０℃，５５℃，６０℃，６５℃ 検出波長 ；４１５ｎｍ 溶離液流量；１.０ｍｌ／min 図１２に上記試料６及び比較例５の溶離液を用いてクロ
マトグラムを測定した場合のカラム温度とＡ1ｃ成分の
理論段数Ｎとの関係を示した。
【００７４】図１２より、比較例５はカラム温度の上昇
に伴い、理論段数Ｎが減少した。一方、試料６はカラム
温度が上昇しても理論段数Ｎの値は２３℃のときとほぼ
等しい値であった。なお、Ａ1ｃ成分の保持時間ｔR，カ
ラムの圧力損失ΔＰは、比較例５，試料６ともほぼ等し
い値であった。
【００７５】なお、比較例５が温度の上昇に伴って理論
段数Ｎが減少したのは、室温では検体と充填剤との間の
相互作用として、イオン結合が支配的であるが、カラム
温度が上昇するとイオン結合以外の吸着(物理吸着，水
素結合，分子ふるい効果など)の寄与が大きくなり、吸
脱着に要する時間が長くなり、ピークが広がったものと
考えられる。
【００７６】試料６のように、TritonＸ−１００のよう
な非イオン性界面活性剤を添加することにより、充填剤
が解離状態を変えずに、物理吸着などのイオン結合以外
の作用を押さえ、ピーク広がりを抑制する効果が有る。
【００７７】次に、図１に示す液体クロマトグラフ装置
を用いて各溶離液にTritonＸ−100を添加し（試料６）
て血液の分析を行った。各溶離液の組成は下記の通りで
ある。
【００７８】ａ液； ５０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4 １０ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4 ０.００５％(Ｗ／Ｖ)ＮａＮ3 ０.１ｍＭ TritonＸ−１００ ｐＨ６.２０ ｂ液； ６２ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4 １３ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4 ０.００５％(Ｗ／Ｖ)ＮａＮ3 ０.１ｍＭ TritonＸ−１００ ｐＨ６.２０ ｃ液； １５０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4 ５０ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4 ０.００５％(Ｗ／Ｖ)ＮａＮ3 ０.１ｍＭ TritonＸ−１００ ｐＨ６.１０ 上記試料６に対して、比較のためTritonＸ−１００を含
まない溶離液（ａ′，ｂ′，ｃ′液）を用いて測定した
場合について（比較例５）も測定した。なお測定装置は
実施例１と同じ構成のものを用いている。また、カラム
の温度は２３℃でヘモグロビンの各成分への分離は以下
に示すステップワイズグラジェント法による。
【００７９】ａ液又はａ′液； ０〜０.１分 ｂ液又はｂ′液；０.２〜０.９分 ｃ液又はｃ′液；１.０〜１.４分 ａ液又はａ′液；１.５〜４.０分 溶離液流量；１.２ｍｌ／min 試料６及び比較例５の溶離液を用いて上記分析条件によ
り得られたクロマトグラムを図１３及び図１４に示す。
【００８０】図１３及び図１４において、ピークｐ１は
Ａ1ａ、ピークｐ２はＡ1ｂ，ピークｐ３はＨｂＦ，ピー
クｐ４はＡ1ｃ，ピークｐ５はＨｂＡ0である。
【００８１】また、図１４においてピークｐ６は溶離液
の切替に伴う屈折率の変化により生じる吸収である。な
お、この溶離液の切替に伴う吸収は、Ｈｂの吸収が無い
波長、例えば６９０ｎｍにてリファレンスを測定するこ
とにより、その影響を回避できる。
【００８２】図１３及び図１４より、カラム温度２３℃
では溶離液へのTritonＸ−１００を添加した場合と添加
しない場合とで、保持時間及び、ピークのシャープさと
も同程度である。このように先の試料６で述べたように
カラム温度が２３℃の場合にはTritonＸ−１００を添加
した効果は現れない。
【００８３】次に、試料６の溶離液のうちａ液を下記の
成分にし、他は試料６と同じ溶離液を用いて上記と同じ
分析を行った（試料７）。
【００８４】ａ液； ４２ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4 ９ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4 ０.００５％(Ｗ／Ｖ)ＮａＮ3 ０.１ｍＭ TritonＸ−１００ ｐＨ６.２０ 更に試料６と同じく比較のためTritonＸ−１００を含ま
ない溶離液を用いた分析についても行った（比較例
６）。
【００８５】また、ヘモグロビンの各成分への分離は、
先の試料と同様ステップワイズグラジェント法で行い、
カラム温度は４５℃，検出波長４１５ｎｍで分析した。
図１５と図１６に上記試料７と比較例６の溶離液を用い
て血液を分析して得られたクロマトグラフを示す。
【００８６】図１５及び図１６において、ピークｐ１は
Ａ1ａ，ピークｐ２はＡ1ｂ，ピークｐ３はＨｂＦ，ピー
クｐ４はＡ1ｃ，ピークｐ５はＨｂＡ0，ピークｐ６は溶
離液の切替に伴う吸収、ピークｐ７は（Ａ1ａ＋Ａ1ｂ）
を示す。比較例６（図１６）では各ピークがブロードで
あり、Ａ1ａとＡ1ｂとが分離されない。また、Ａ1ｃと
ＨｂＡ0 の分離が十分ではない。試料７（図１５）では
２３℃の場合（図１３及び図１４）と同じような良好な
分離結果を得ることができた。
【００８７】以上のように、溶離液にTritonＸ−１００
のような非イオン性界面活性剤を含有させることによ
り、カラムを加熱した場合でも良好な分離を得ることが
できた。
【００８８】表３に試料６，７と比較例５，６の溶離液
を用いてカラム温度２３℃と４５℃にてグリコヘモグロ
ビンを測定した場合のＡ1ｃ，Ａ0の保持時間ｔｒとＮ′
（理論段数に準ずる値，ピークのシャープさの指標）カ
ラムの圧力損失ΔＰの値を示す。
【００８９】
【表３】
【００９０】Ｎ′は次式にて求められる。
【００９１】
【数３】
【００９２】式（３）は式（１）において、σが（ピー
ク面積／ピーク高さ）に比例すると仮定して求めた。ピ
ーク面積やピーク高さはＤ−２０００形データプロセッ
サにより計算した。
【００９３】表３から、カラム温度４５℃で、TritonＸ
−１００を添加した溶離液を用いた場合（試料７）のＡ
1ｃ成分のＮ′やＡ0成分のＮ′は、２３℃でのＮ′（試
料６及び比較例５）に等しかった。ΔＰはカラム温度が
高い場合の方が低く、試料７のΔＰは試料６及び比較例
５の場合の約７５％に減少していた。
【００９４】以上のように、溶離液に非イオン性界面活
性剤を添加することにより、カラムを加熱した場合で
も、室温と同様の分離性能示すクロマトグラムを得るこ
とができる。カラムを加熱した方が室温で分析する場合
に比べて、カラムの圧力損失ΔＰが小さく、ポンプのシ
ールへの影響が小さい。また、カラムにかかる圧力が小
さいのでカラムの長寿命化にも効果がある。さらに室温
の場合に比べて、溶離液の流量を大きくできので、分析
の高速化を図る上で有利である。
【００９５】以上のように、本発明のように溶離液の最
適化を図ることにより、カラム温度を制御することによ
り装置のランニングコストを低減できると共に、カラム
温度依存性が小さいため再現性の良い分析結果を得るこ
とができる。これにより、より正確に糖尿病の検診や治
療をおこなうことができる。
【００９６】次に、図１に示すように分離カラムを２セ
ット設けて分析を行なうシステムについて説明する。全
体構成については先に説明しているのでここでの説明は
省略する。なお、下記に使用した分離カラムの仕様，溶
離液組成，試料の調製方法などを示す。
【００９７】ＧＨｂ分析用充填剤としては、メタクリレ
ート系ゲルにカルボキシメチル基を導入した充填剤を用
いた。本充填剤の粒径は３.５±０.７μｍ、充填剤の乾
燥重量１ｇあたりの交換容量は０.２８meq 、細孔径は
７００Å、比表面積は１５ｍ2／ｇであった。なお、物
性の測定には、７０℃で８時間常圧乾燥後、５０℃で１
０時間真空乾燥したものを用いた。
【００９８】カラムには、内径４.６mm，長さ３５mm
（５成分分析用）と、内径４.６mm，長さ８０mm（６成
分分析用）のステンレス製の２種類のカラムを用いた。
充填剤のカラムへの充填は、スラリー法によった。スラ
リー溶媒及び充填溶媒としては、５０ｍＭリン酸塩緩衝
液を用いた。長さ３５mmのカラムの場合には充填圧力15
0kg／cm2，長さ８０mmのカラムの場合には充填圧力２０
０kg／cm2にて、充填溶媒を１時間送液した。
【００９９】検体としては抗凝固剤としてエチレンジア
ミン四酢酸ナトリウム塩を添加して採血した新鮮血を用
いた。この血液を溶血剤(０.１％ Triton−Ｘ１００）
で２００倍に希釈し、これを図１に示したオートサンプ
ラのサンプルテーブル７にセットした。
【０１００】分離カラムとしては内径４.６mm，長さ３
５mm及び、内径４.６mm，長さ８０mmのステンレス製カ
ラムに、上述した平均粒径３.５μｍ のメタクリレート
系ゲルにカルボキシメチル基を導入した充填剤を充填し
たものを用いた（図１の符号１８及び２１）。
【０１０１】溶離液としては、Ａ液１，Ｂ液２，Ｃ液３
を用いた。これらの溶離液の組成を以下に示す。
【０１０２】Ａ液： ４２ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4 ９ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4 Ｂ液： ６２ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4 １３ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4 Ｃ液：１５０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4 ５０ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4 以下に、５成分分析（ＨｂをＡ1ａ，Ａ1ｂ，ＨｂＦ，Ａ
1ｃ及びＡ0に分離）及び６成分分析（ＨｂをＡ1ａ，Ａ1
ｂ，ＨｂＦ，ｌ−Ａ1ｃ，ｓ−Ａ1ｃ及びＡ0に分離）の
場合の溶離条件（溶離液の切替時間，流量，カラム温度
など）を示す。Ｈｂの各成分への分離は、５成分分析の
場合、以下のようなステップワイズグラジェント法によ
った。
【０１０３】Ａ液： ０〜０.４分 Ｂ液：０.５〜１.４分 Ｃ液：１.５〜１.８分 Ａ液：１.９〜３.０分 溶離液の流量：１.４ｍｌ／min カラム温度：４０℃ また、６成分分析の場合には、以下に示すステップワイ
ズグラジェント法によった。
【０１０４】Ａ液： ０〜０.１分 Ｂ液：０.２〜２.５分 Ｃ液：２.６〜３.４分 Ａ液：３.５〜６.０分 溶離液の流量：１.０ｍｌ／min カラム温度：４０℃ 次に、図１の装置の各部分の動作を説明する。まず、５
成分分析の場合について説明する。
【０１０５】サンプルテーブル７にセットされた試料
は、吸引ノズル８と試料輸送管９を介して、シリンジ１
１によって、六方バルブ１３を介して、サンプルループ
１０に入る。サンプルループ１０（容量：１０μｌ）に
て、試料の計量を行う。その後、六方バルブ１３を切替
える。洗浄液４は、三方バルブ１２を介して、６方バル
ブ１３，サンプルループ１０などに送られ、配管の洗浄
を行う。
【０１０６】溶離液１，２，３は、送液ポンプ（インテ
リジェントポンプ）６によって、三方バルブ１５，六方
バルブ１３，サンプルループ１０，プレフィルタ１６を
介して、分離カラム(内径４.６mm，長さ３５mm）１８
に、上述したグラジェント条件に従い、段階的に送られ
る。なお、カラム恒温槽（オーブン）１７の温度は４０
℃に設定した。溶離液が分離カラム１８に送られるのに
伴い、サンプルループ１０中の試料は、分離カラム１８
に供給される。分離カラム１８にて、Ｈｂは各成分に分
離される。分離カラム１８からの溶出液の吸光度をＵＶ
−ＶＩＳ検出器２３で測定する（測定波長：４１５ｎｍ
及び６９０ｎｍ（リファレンス））。
【０１０７】得られたクロマトグラムを図１７に示す。
図１７において、ピークｐ２９はＡ1ａ，ピークｐ３０
はＡ1ｂ，ピークｐ３１はＨｂＦ，ピークｐ３２はＡ
1ｃ，ピークｐ３３はＡ0である。この条件ではＨｂを
３.０分サイクルで、Ａ1ａ，Ａ1ｂ，ＨｂＦ，Ａ1ｃ及び
Ａ0 の５成分に分離できる。クロマトグラムより、デー
タ処理装置２４にて、トータルのＨｂ成分に対するＡ1
ｃ 成分の割合を求めた。
【０１０８】６成分分析を行う場合、分離カラムには符
号２１(内径４.６mm，長さ８０mm),フィルタには符号１
９，カラム恒温槽には符号２０を使用した。試料及び溶
離液の流れは、上述した５成分分析の場合と同様であ
る。なお、一つの恒温槽に複数個のカラムを設置しても
よい。
【０１０９】分離カラム１８を用い、上述したようなグ
ラジェント条件にて分析を行った。得られたクロマトグ
ラムを図１８に示す。図１８において、ピークｐ２９は
Ａ1ａ，ピークｐ３０はＡ1ｂ，ピークｐ３１はＨｂＦ，
ピークｐ３４はｌ−Ａ1ｃ、ピークｐ３５はｓ−Ａ1ｃ，
ピークｐ３３はＡ0である。図１８に示したように、Ｈ
ｂを６.０ 分サイクルでＡ1ａ，Ａ1ｂ，ＨｂＦ，ｌ−Ａ
1ｃ，ｓ−Ａ1ｃ及びＡ0の６成分に分離することができ
る。クロマトグラムより、データ処理装置２４にて、ト
ータルのＨｂに対するｓ−Ａ1ｃの割合を求めた。
【０１１０】あらかじめ複数個の溶離条件のプログラム
を入力しておけば、測定したいプログラムをスイッチあ
るいはキーで選択するだけだけで、カラムや溶離液を交
換することなく、異なるタイプの分析を連続して行うこ
とができる。
【０１１１】例えば、５成分分析を行った後、６成分分
析を行う場合には、あらかじめキーボードでそのような
指令を入力しておく。すると、データ処理装置２４の出
力に基づいて、記憶・制御部２５は、送液ポンプ６，三
方バルブ１５，カラムオーブン１７，１８などに信号を
送って、使用するカラムや、溶離液の混合比や流量，カ
ラム温度などの測定条件を変化させる。また、どの試料
を測定するか、オートサンプラ１４に指示を送る。この
ようにして、５成分分析と６成分分析を連続して行うこ
とができる。
【０１１２】また、オートサンプラ１４のサンプルテー
ブルにセットされた試料について、一通り５成分分析を
行った後、Ａ1ｃ 値が基準値を超える試料についての
み、６成分分析を行うということもできる。データ処理
装置２４にてＡ1ｃ 成分の百分率を計算し、記憶・制御
部２５にてその値が基準値を超えるか否か判断する。記
憶・制御部２５から、基準値を超えている試料のNo．の
信号をオートサンプラ１４に送り、その試料についての
み６成分分析を行う。また、記憶・制御部２５から、送
液ポンプ６，三方バルブ１５，カラムオーブン１７，１
８などに信号を送って、測定条件を６成分分析用に変化
させる。
【０１１３】先に述べたように、Ａ1ｃはｌ−Ａ1ｃとｓ
−Ａ1ｃから成り、ｓ−Ａ1ｃが過去２か月前後の血糖値
と相関がある。ｌ−Ａ1ｃ は食事等により変化するた
め、ｓ−Ａ1ｃを測定することが望ましい。しかし、ｓ
−Ａ1ｃの測定（６成分分析）はＡ1ｃの測定に比べて２
倍の時間がかかる（Ａ1ｃ測定の分析時間３分に対し
て、ｓ−Ａ1ｃ測定の分析時間は６分である）。そこ
で、すべての成分についてＡ1ｃの測定を行い、そのう
ち、Ａ1ｃが基準値を超える試料についてのみ、ｓ−Ａ1
ｃの測定を行えば、トータルの分析時間を短縮すること
ができる。
【０１１４】以上述べてきたように、本発明のシステム
では、同一の溶離液を用いて、分離カラム、またはカラ
ム温度、グラジェントのプログラム（溶離液の混合比，
切替時間，溶離液の流量など）を変えるだけで、２つ以
上の異なるタイプの分析を行うことができる。このよう
に、溶離液を交換しないで、異なるタイプの分析を行う
ことができるので、溶離液を交換するという手間がかか
らない。また、コストの低減も図れる。さらに、異なる
タイプの分析を連続して行うこともできるので、分析時
間の短縮も図れる。
【０１１５】以上のように本発明によれば、異なる分画
数の分析を自動的に行える液体クロマトグラフのシステ
ムを提供できる。
【０１１６】次に、分離カラム分析性能の劣化を検出
し、溶離液の組成，流量，切り換え時間やカラム温度な
どの溶離条件を変化させることによって、分離カラムの
延命と、高精度分析を行なうための方法について説明す
る。
【０１１７】本発明は、液体クロマトグラフ装置で検体
が正しく分離されておれば、クロマトグラムから得られ
るある特定成分の保持時間，選択係数，ピーク幅，理論
段数等のパラメータが所定の範囲になるとうい知見、及
び固定された一通りの溶離条件のもとで分離カラムが寿
命に達しても、溶離条件を変化させる前記パラメータを
改善すればさらに多くの検体数まで測定できるという知
見に基づいてなされたものである。そこでこれらのパラ
メータを分離カラムの分離性能の劣化の有無を判断する
評価値として用い、その評価結果に基づいて溶離条件を
変更して分離カラムの寿命の延命を図りかつ、使用者に
カラム劣化を早期に知らせることにより分析精度の低下
を防止するものである。
【０１１８】前記評価パラメータとしては、保持時間，
キャパシティーファクタ，選択係数，各成分に対応する
ピークのピーク幅又は半値幅，このピークの標準偏差σ
またはバリアンスσ2 、このピーク幅とピーク高さの
比、このピークの非対称性値（アシメトリファクタ），
理論段数，ベースラインの直線性の少なくとも１つ以上
の値を用いれば良い。しかも前記評価パラメータは、前
記検体の予め定められた特定成分に対応して設定される
ことが好ましい。
【０１１９】次に、性能評価にかかる分離能と各種評価
パラメータの関係について説明する。
【０１２０】液体クロマトグラフにおいて、分離性能Ｒ
Ｓは次式にて示される。
【０１２１】
【数４】
【０１２２】ここで、α：選択係数、Ｋ′：キャパシテ
ィーファクタ、Ｎ：理論段数である。また、Ｎ，Ｋ′，
αはクロマトグラムより、以下に示す式で求められる。
【０１２３】
【数５】
【０１２４】
【数６】
【０１２５】
【数７】
【０１２６】ここで、ｔｒ，ｔｒ1，ｔｒ2は保持時間
（ただし、ｔｒ1＜ｔｒ2）、ｔｏは充填剤と相互作用の
ない成分の保持時間、σは標準偏差を示す。
【０１２７】カラム長さが一定の場合、α又はＫ′（又
はｔｒ）は充填剤，溶離液組成，カラム温度Ｔにより、
影響を受ける。また、Ｎは充填剤，溶離液組成，カラム
温度Ｔ，溶離液の流量Ｆ（又は線速度ｕ）により影響を
受ける。
【０１２８】液体クロマトグラフ装置において、溶離条
件を限定する因子として先に述べた様にカラムの圧力損
失ΔＰがある。このΔＰは先の式（２）で表わしたよう
に
【０１２９】
【数８】
【０１３０】で求められる。
【０１３１】同一の分離カラムを用いる場合、充填剤及
びカラム長さは一定であるので、式（２）でφ、Ｌ，ｄ
ｐが一定であると考えることができる。従って、ΔＰは
溶離液の粘度ηと溶離液の線速度ｕ（カラム直径が一定
の場合、ｕは流量Ｆに比例する）により変化する。な
お、粘度ηはカラム温度の影響を受ける。
【０１３２】ΔＰがある値（臨界圧）以上になると、Δ
Ｐの急激な上昇が見られる。これは充填剤の変形や充填
状態の変化に起因するものであり、ΔＰが臨界圧よりも
低くなるように溶離条件（カラム温度Ｔと溶離液流量
Ｆ）を設定する必要がある。
【０１３３】溶離液組成，溶離液の流量Ｆ，カラム温度
Ｔなどの測定条件と理論段数Ｎ，保持時間ｔｒ，選択係
数α，圧力損失ΔＰなどの値との関係、検体の好ましい
分離ができるＮ，ｔｒ，α，ΔＰなどの範囲を予め計算
や実験により求めておき、クロマトグラムよりＮ，ｔ
ｒ，α，ΔＰを計算し、これらの値が好ましい分離が得
られる範囲にない場合、溶離液組成、Ｆ，Ｔなどの測定
条件と、Ｎ，ｔｒ，α，ΔＰとの関係から、適当な溶離
液組成、Ｆ，Ｔなどを求めることができる。
【０１３４】なお、評価パラメータとしては上述のほか
に、キャパシティーファクタ、各成分に対応するピーク
のピーク幅又は半値幅、このピークの標準偏差σ又はバ
リアンスσ2 、このピーク幅とピーク高さとの比、この
ピークの非対称性（アシメトリファクタ），ベースライ
ンの直線性などを用いても良い。また、溶離条件として
は、上記の他に、溶離液の混合比，溶離液の種類，溶離
液の流速，通流する溶離液の種類の切り換え時間などを
含めることができる。
【０１３５】このように、液体クロマトグラフ装置に、
上述したような演算処理部を設け、前記演算処理部から
の信号により、溶離液組成，流量，カラム濃度などの測
定条件を変化させることにより、従来と同じ分離カラム
を用いて、より多くの検体数まで測定することができ
る。
【０１３６】次に図面を用いて本発明の動作を説明す
る。上記処理は図１のデータ処理部２４と、記憶・制御
部２５で行っている。図１９に処理と性能評価のフロー
チャートを示す。
【０１３７】まず、データ処理部２４は検出部２３で測
定されたｎ番目の検体のクロマトグラムの測定データを
取り込む（ステップ１０１）。そして、データ処理部２
４は取り込んだ測定データに基づいて、予め定められた
特定部分の評価パラメータを求める（ステップ１０
２）。すなわち、Ａ1ａ，Ａ1ｂ，ＨｂＦ，Ａ1ｃ及びＡ0
成分の保持時間ｔｒ，ＨｂＦとＡ1ｃの選択係数α、Ａ1
ｃとＡ0の選択係数α，Ａ1ｃとＡ0成分の理論段数Ｎを
計算する。なお、ｔｒ，α，Ｎ以外にもカラムの性能評
価の指標として、特定成分のピーク幅，標準偏差σ，バ
リアンスσ2 ，キャパシティーファクタＫ′など自由に
用いることができる。具体的実施例として後述する図２
０，２１の例に従えば、各成分の保持時間ｔｒ及びＡ1
ｃ 成分の理論段数Ｎを計算する。
【０１３８】次に、制御・記憶部２５にて、求めた評価
パラメータが予め定めた基準値に対して一定の許容範囲
に入っているか否かを判断する（ステップ１０３）。こ
の許容範囲の設定は、予め良好な分離が得られるｔｒ，
α，Ｎ等の範囲を設定しておく。なお、図１９のステッ
プ１０３で、ｔ1〜ｔ5は保持時間ｔｒの基準値であり、
ｘ1〜ｘ5は許容範囲の設定値である。また、求めたｔｒ
及びＮの値が良好な分離が得られる範囲内にあるか否か
判断する。例えば各成分のｔｒが±１０％以内にある
か、Ｎが５００段以上になっているかどうか判断する。
【０１３９】この判断の結果、ｔｒ及びＮが設定範囲内
にある場合は、制御・記憶部２５よりオートサンプラ１
４に信号を送り、次の検体ｎ＋１番目の分析を行なう
（ステップ１０４）。
【０１４０】これに対して、ステップ１０３の判断の結
果、評価パラメータの少なくとも１つが許容範囲を外れ
ている場合、予めデータテーブルに記憶されている溶離
条件と評価パラメータの相関関係に従って、外れた評価
パラメータが許容範囲内に入るように、溶離条件の変更
要素及び値を求める（１０５）。例えばｔｒとＮの少な
くとも１つが設定範囲内にない場合は、クロマトグラム
より求めたｔｒ又はＮの値と、予め入力しておいた溶離
液（１液）の濃度（Ａ液とＢ液の混合比）とｔｒ又はＮ
との関係データ（図２０，２１）より、制御・記憶部２
５にて演算処理を行ない、ｔｒが初期値の±１０％以
内、Ｎが５００段以上になるような測定条件を求める。
この場合、１３００検体目のクロマトグラムから求めた
ｔｒ又はＮと図２０又は２１の関係から、ｔｒが初期値
の±１０％以内、Ｎが５００段以上になる測定条件を計
算したところ、第１液としてＡ液／Ｂ液の比を６５／３
５にすることにより、良好な分離が得られることが判
る。
【０１４１】次に、制御・記憶部２５はステップ１０５
の演算処理結果に基づいて、溶離液の混合比，切り替え
時間，流量，カラムオーブンの温度等の溶離条件の変更
を制御する（ステップ１０６）。すなわち、図１の三方
電磁弁５，ポンプ６，カラムオーブン１７又は２０に信
号を送り、各々の溶離液の混合比や切り替え時間，流
量，カラムオーブンの温度を変化させる。上記具体的例
に従えば、三方電磁弁５に信号を送り、溶離液（第１
液）の混合比をＡ液／ｂ液＝６０／４０（初期測定条
件）から、Ａ液／Ｂ液＝６５／３５に変化させる。
【０１４２】ここで、確認及び正しい分析を行なうため
に、演算部２５からオートサンプラ１４に信号を送り、
ｎ番目の試料（１３００検体目のサンプル）をもう一度
サンプリングしてクロマトグラムを測定する（ステップ
１０７）。
【０１４３】そして、ステップ１０７で得られたクロマ
トグラムに基づいて、ステップ102及び１０３と同じ処
理を行ない（ステップ１０８）、その結果が良ければス
テップ１０９に進んで次の検体ｎ＋１番目の分析を行な
わせ、結果が悪ければステップ２１０に進んで、分離カ
ラムを交換する等の指示又は性能が劣化しているとのイ
ンホメイション等をプリンタ２６又は表示部２７に出力
する(ステップ１１０)。
【０１４４】なお、上記ステップ１０７のｎ番目のサン
プルにて測定を行なう前に、市販の標準検体を用いてク
ロマトグラムを測定し、カラムの性能チェクを行なって
も良い。
【０１４５】ここで、カラムの性能の指標となる評価パ
ラメータと溶離条件との相関関係の一般的な傾向につい
て説明する。評価パラメータのうち、保持時間ｔｒは主
として溶離液の組成（混合比），カラム温度，溶離液の
流量及び溶離液の切り替え時間に依存する。また選択係
数αは溶離液の組成（種類，混合比等）及び溶離液の切
り替え時間に依存する。理論段数Ｎ，ピーク幅（ピーク
の半値幅，ピーク幅の標準偏差σ）などのピークのシャ
ープさの指標となる値は、溶離液の組成（種類，混合比
等），カラム温度，溶離液の流量に依存する。またカラ
ムの圧力損失ΔＰは主として溶離液の流量とカラム温度
に依存する。このような関係を有する予め記憶しておい
た溶離条件とカラムの指標となるパラメータとの相関関
係に基づいて、評価パラメータの値が予め設定しておい
た許容範囲から外れた場合、溶離液の組成（種類，混合
比等），カラム温度，溶離液の流量，溶離液の切り替え
時間等の溶離条件を変更する。
【０１４６】また、溶離条件と評価パラメータの相関関
係の強さに差がある場合は、それに従って変更する溶離
条件を選択する。例えば、ｔｒが設定範囲から外れた場
合には（１）溶離液の組成(混合比）、（２）溶離液の
流量及び切り替え時間、（３)カラム温度の順で変化さ
せる。また、αが外れた場合には（１）溶離液の組成
（混合比）、（２）溶離液の切り替え時間の順で変化さ
せる。また、理論段数Ｎ，ピーク幅などが設定範囲から
外れた場合には、（１）溶離液の組成(混合比)、（２）
溶離液の流量、（３）カラム温度の順で変化させる。こ
のような順序で溶離条件を変化させることにより、効率
的に溶離条件を設定することが可能である。
【０１４７】但し、グリコヘモグロビンの分析の場合
は、カラム温度が高くなると血液中の蛋白質が変性する
ため、カラム温度は５５℃以下が望ましい。更に、カラ
ム圧力損失が臨界圧以下になる様に、測定条件を設定し
なければならない。このように、検体の熱的安定性、カ
ラムの耐圧性等についても考慮の上、溶離条件を設定す
る必要がある。
【０１４８】次に、実際に実験した結果について説明す
る。
【０１４９】まず装置は、図１の三方バルブ１５，２２
がなく１つのカラムで構成したものを用いた。ここでの
説明では、分離カラムは１８のものを用いたとして説明
する。本実験における前提の分析条件について説明す
る。検体としては、抗凝固剤としてエチレンジアミン四
酢酸ナトリュウム塩を添加して採血した新鮮血を用い
た。この血液を市販の溶血材で２００倍に希釈し、これ
を図１のオートサンプラ１４のサンプルテーブル７にセ
ットした。分離カラム１８は粒径４.１μｍ のメタクリ
レート系ゲルにカルボキシメチル基を導入した弱酸性陽
イオン交換樹脂をステンレス製カラム１８(内径４.６m
m，長さ３５mm）に充填したものを用いた。分離カラム
１８の前段にプレフィルタ１６を設けている。これは、
血液中の固定物（膜など）や溶離液中の不純物が分離カ
ラム１８に入り、カラムの圧力損失が増大したり、充填
剤が劣化するのを防ぐために設けられたものである。
【０１５０】分離カラム１８の温度をコントロールする
カラムオーブン１７の温度は最初は２５℃に設定した。
溶離液としてはＡ液、Ｂ液及びＣ液を用いた。各液は、
リン酸一カリュウム（ＫＨ2ＰＯ4）及びリン酸二カリュ
ウム（Ｋ2ＨＰＯ4）を下記濃度になるようにイオン交換
水に溶解したものを使用した。
【０１５１】 溶離液としてＡ液は； ３３ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4 ７ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4 ｐＨ ６.２ Ｂ液は； ６６ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4 １４ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4 ｐＨ ６.２ Ｃ液は；１６０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4 ４０ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ4 ｐＨ ６.１ とした。
【０１５２】各成分の分離は、以下に示すようなステッ
プワイズグラジェント法に依った。なお、１液のＡ液／
Ｂ液の比は体積比である。
【０１５３】 １液：Ａ液／Ｂ液＝６０／４０； ０〜０.２分 ２液：Ｂ液 ； ０.３〜１.５分 ３液：Ｃ液 ； ２.０〜１.９分 １液：Ａ液／Ｂ液＝６０／４０； ２.０〜３.５分 溶離液流量；１.２ｍｌ／min サンプルテーブルにセットした検体は吸引ノズル８と検
体輸送管９を介してシリンダ１１によって六方バルブに
入り、その後フィルタ１６を通り、分離カラム１８に入
る。また、サンプルループ１０にて分離カラム１８に注
入する検体を計量する。実験ではサンプルループ１０に
て１０μｌの検体を計量した。洗浄液４は三方バルブ１
２を介して供給され、六方バルブ１３やサンプルループ
１０内の配管を洗浄する。溶離液Ａ液，Ｂ液，Ｃ液は三
方電磁弁５を介して送油ポンプ（インテリジェントポン
プ）６によって、分離カラム１８に供給される。分離カ
ラム１８からの溶出液は検出器２３で波長４１５ｎｍ及
び６９０ｎｍ（リファレンス）における吸光度が測定さ
れる。６９０ｎｍは溶離液の切り替えに伴う吸収を補正
する目的で測定した。
【０１５４】このような測定条件にて測定したクロマト
グラムのうち、１０番目の検体によるクロマトグラムを
図２２に、１３００番目の検体によるクロマトグラムを
図２３に示す。図２２に示すように、前記測定条件では
ヘモグロビンを１サンプル３.５分でＡ1ａ（ピーク２
２），Ａ1ｂ（ピーク２３），ＨｂＦ（ピーク２４）,Ａ
1ｃ（ピーク２５）及びＡ0（ピーク２６）の５成分に分
離できる。
【０１５５】なお、ピーク２１は充填剤と相互作用のな
い成分によるファーストピークである。得られたクロマ
トグラムから、評価パラメータ演算手段を構成するデー
タ処理部２４により、各成分の保持時間ｔｒ，Ａ1ｃ 成
分の理論段数Ｎを求めた。その結果を表４に示す。
【０１５６】
【表４】
【０１５７】表４から判るように、１３００検体目にな
ると、１０検体目に比べてｔｒが小さくなる傾向が見ら
れ、ＨｂＦ成分のｔｒは８８％、Ａ1ｃ 成分のｔｒは８
７％に減少している。また、理論段数Ｎも１８５０段か
ら４６０段に減少しており、ピークがブロードになって
いる。つまり、図２３に示したように、１３００検体目
ではＨｂＦとＡ1ｃ成分の分離が十分ではない。
【０１５８】一方、図２０と図２１に溶離液の第１液の
濃度すなわちＡ液とＢ液の混合比と各Ｈｂ成分の保持時
間ｔｒとＡ1ｃ成分の理論段数との関係をそれぞれ示
す。
【０１５９】この結果は、先に説明した充填剤（粒径
４.１μｍ のメタクリレート系ゲルにカルボキシメチル
基を導入した弱酸性陽イオン交換樹脂）をステンレス製
カラム１８(内径４.６mm，長さ３５mm）に充填したもの
を用いたものである。また、図２０と図２１の結果は、
第１液の混合比（Ａ液とＢ液の混合比）を変化させるだ
けで、溶離液の流量や切り替え時間，カラム温度は最初
２５℃に設定したものである。図２０から第１液のＡ液
の割合を大きくすると、すなわち溶離液の濃度を小さく
するとＡ1ｂ、ＨｂＦ及びＡ1ｃ成分のｔｒが増大する傾
向が見られた。なお、Ａ1ａ及びＡ0成分のｔｒは第１液
の濃度を変えても、ほぼ一定の値を示した。また図２１
から第１液の割合を大きくすると、すなわち溶離液濃度
を小さくすると、理論段数Ｎが大きくなり、ピークがシ
ャープになるという傾向が見られた。図２０と図２１の
第１液の濃度、ここではＡ液とＢ液の混合比と各成分の
ｔｒ及びＡ1ｃ 成分の理論段数との関係より、図２３に
示したように分離カラムの性能が劣化してきた場合（ｔ
ｒ→小，Ｎ→小）、１液のＡ液の割合を大きくする、す
なわち１液の濃度を小さくすることにより、分離性能を
改善できることが判る。なお、上記分離カラム場合で
は、１０検体目の値を基準にして、各Ｈｂ成分のｔｒが
±１０％以内、理論段数Ｎが５００段以上のときＨｂＦ
とＡ1ｃ，Ａ1ｃとＡ0 成分の良好な分離が得られた。
【０１６０】以上の実験結果の図２０，図２１及び表４
の結果を先に説明した図１９のフローチャートに適用す
ることにより分離カラムの特性評価が可能となり、特性
に応じた制御等を実施することにより、分離精度の高い
分析を行なうことができる。以上は、グリコヘモグロビ
ン分析装置を実施例として説明したものであるが、一般
的な液体クロマトグラフ装置の分析に適用すると、図２
４のフローチャートのようになる。
【０１６１】すなわち、まずｎ番目のクロマトグラムを
測定する（２０１）。次に、前記クロマトグラムから、
特定成分のｔｒ，α，バリアンスσ2 ，ピーク幅が設定
範囲内にあるか否かを判断する（２０２）。設定範囲内
にあれば次のサンプルを分析する（２０３）。もし設定
範囲を外れていれば、設定範囲内になる溶離液の混合
比、切り換え時間，流量，カラム温度を演算する（２０
４）。前記演算によって得られた条件に各種値を変更す
る（２０５）。変更した条件で再度ｎ番目のクロマトグ
ラムを測定する（２０６）。前記クロマトグラムから再
度（２０２）と同様に特定成分の各種値が設定範囲内に
あるか否かを判断し（２０７）、設定範囲内にあれば次
のサンプルを分析し（２０８）、もし範囲内になければ
分離カラムを交換する（２０９）。前記のように処理す
ることによって分離カラムの交換時期を伸ばすことがで
きるとともに、分析精度の向上も図れる。
【０１６２】
【発明の効果】以上、本発明によれば、まず血液中のヘ
モグロビン、グリコヘモグロビンまたはヘモグロビン誘
導体，蛋白質などの生体成分を高速且つ高分離に分析す
るための充填剤及びそれを注入することにより小型化を
図った分離カラムと温度変化による影響を受けない分析
を実現した溶離液と、上記分離カラム溶離液等を用いて
高精度高速の分析が可能な液体クトマトグラフ装置を実
現できる。
【０１６３】また、カラムの長さの異なる分離カラムを
用いて同一溶離液を用いてカラムに流す流量等を調節す
ることにより、高精度５分析及び６分析を行な得るよう
にした。
【０１６４】さらに、分離カラムの性能劣化を分離カラ
ムで分離された測定データに基づいて判定し、分離条件
を変えることによって分離カラムの寿命を伸ばすととも
に、分離精度の低下を防止できるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の液体クロマトグラフ装置の全体構成
図。
【図２】本発明の液体クロマトグラフ装置を用いて血液
を分析したクロマトグラム。
【図３】充填剤の細孔径と理論段数の関係図。
【図４】充填剤の細孔径とカラムの圧力損失との関係。
【図５】充填剤の細孔径と細孔部分の容積との関係
図。。
【図６】試料１の充填剤を用いたときのクロマトグラ
ム。
【図７】比較例１の充填剤を用いたときのクロマトグラ
ム。
【図８】比較例２の充填剤を用いたときのクロマトグラ
ム。
【図９】充填剤の乾燥重量１ｇ当りの交換容量と理論段
数との関係図。
【図１０】本発明の充填剤を用いて蛋白質を分析したと
きのクロマトグラム。
【図１１】比較例１の充填剤を用いて蛋白質を分析した
ときのクロマトグラム。
【図１２】溶離液とカラム温度と理論段数の関係図。
【図１３】試料６の溶離液を用いて血液を分析したとき
のクロマトグラム。
【図１４】比較例１の溶離液を用いて血液を分析したと
きのクロマトグラム。
【図１５】試料７の溶離液を用いて血液を分析したとき
のクロマトグラム。
【図１６】比較例２の溶離液を用いて血液を分析したと
きのクロマトグラム。
【図１７】５成分分析時のクロマトグラム。
【図１８】６成分分析時のクロマトグラム。
【図１９】分離カラム性能評価処理のフローチャート。
【図２０】溶離液の混合比と保持時間の関係を示す図。
【図２１】溶離液の混合比と理論段数の関係を示す図。
【図２２】分離カラムが新しいときの分析結果のクロマ
トグラム。
【図２３】分離カラムが古くなったときの分析結果のク
ロマトグラム。
【図２４】本発明の他の分離カラム性能評価処理のフロ
ーチャート。
【符号の説明】
１，２，３…溶離液ボトル、４…洗浄液ボトル、５…三
方電磁弁、６…先液ポンプ、７…サンプルテーブル、８
…吸引ノズル、９…検体輸送管、１０…サンプルルー
プ、１１…シリンダ、１２…三方バルブ、１３…六方バ
ルブ、１６，１９…プレフィルタ、１８，２１…分離カ
ラム、１７，２０…カラムオーブン、２５…制御記憶
部。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】１つ以上の溶離液と、検体をサンプリング
    して１つ以上設けられた分離カラムへ移送する手段と、
    前記分離カラムに前記溶離液を流通させる手段と、分離
    カラムで分離された成分を検出する手段と、各検出され
    た成分比率等を演算処理し、前記演算処理結果に基づい
    て各部の操作条件を決定し送信する制御手段を有するこ
    とを特徴とする液体クロマトグラフ装置。 【請求項２】請求項１において、前記分離カラムに充填
    する充填剤を有機多孔物質に官能基を導入し、乾燥状態
    での細孔径を６００〜１２００Å，乾燥重量１ｇ当りの
    交換容量を０.１〜０.５meq としたことを特徴とする液
    体クロマトグラフ装置。 【請求項３】請求項２において、前記官能基をカルボキ
    シアル基としたことを特徴とする液体クロマトグラフ装
    置。 【請求項４】請求項３において、前記充填剤の乾燥状態
    での粒径を３μｍ〜４μｍとしたことを特徴とする液体
    クロマトグラフ装置。 【請求項５】請求項３において、前記充填剤の細孔部分
    の容積が０.２〜０.６ｍｌ／ｇとしたことを特徴とする
    液体クロマトグラフ装置。 【請求項６】請求項３において、前記溶離液を非イオン
    性界面活性剤を含有させ、ｐＨ5.0〜７.０の緩衝液で構
    成したことをとする液体クロマトグラフ装置。 【請求項７】請求項６において、前記緩衝液が燐酸塩緩
    衝液であることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。 【請求項８】請求項６において、前記非イオン性活性界
    面剤の濃度を１×１０6〜１×１０4moｌ／ｌであること
    を特徴とする液体クロマトグラフ装置。 【請求項９】請求項１において、前記液体クロマトグラ
    フ装置は分析条件入力手段と２つの分離カラムを有し、
    前記制御手段は前記検出手段で検出したデータから各種
    成分比率等を演算処理し、前記演算処理結果と前記分析
    条件入力手段により入力されたデータとに基づいて使用
    する分離カラムの決定等の分析方法及び各部の操作条件
    を決定し送信することを特徴とする液体クロマトグラフ
    装置。 【請求項１０】請求項９において、前記制御手段は複数
    の分離カラムや溶離液、試料から使用する分離カラム、
    溶離液，試料を決定し、前記制御信号を送信し、前記制
    御信号に基づいて１つ以上の試料をサンプリングして選
    択された分離カラムへ移送する手段と、前記制御手段か
    らの信号に基づいて、溶離液及び分離カラムを選択する
    手段，前記制御手段からの信号に基づいて溶離液の流
    量，混合比及び切り替え時間を変化させる手段を有する
    ことを特徴とする液体クロマトグラフ装置。 【請求項１１】請求項９において、溶離液を交換するこ
    となく、分画成分数の異なる分析を行うことを特徴とす
    る液体クロマトグラフ装置。 【請求項１２】請求項９において、分離カラムには乾燥
    状態における平均粒径が４μｍ以下である、多孔性物質
    に官能基を導入した充填剤が充填されている分離カラム
    を用いることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。 【請求項１３】請求項１１において、異なる分画数の分
    離を行う際に、同一の溶離液を用い、分離カラム，溶離
    液の混合比，流量，切り替え時間またはカラム温度を変
    化させることにより行うことを特徴とする液体クロマト
    グラフ装置。 【請求項１４】請求項１１において、Ａ1ｃ 成分の比率
    を求める第１のステップ、Ａ1ｃ 成分の比率が設定値を
    超えているか否かを判断する第２のステップ、Ａ1ｃ 成
    分の比率が設定値を超えていた場合、同一の溶離液を用
    い、分離カラム、溶離液の混合比，流量，切り替え時間
    またはカラム温度を変化させることにより、安定型Ａ1
    ｃ の比率を求める第３ステップを有する液体クロマト
    グラフ装置。 【請求項１５】請求項１において、前記制御手段には前
    記検出結果のデータに基づいて前記分離カラムの分離性
    能を評価するパラメータのうちの少なくとも１つを求め
    る評価パラメータ演算部と、前記演算部にて求められた
    パラメータが予め定められた基準値に対し許容範囲に入
    っているか否かを比較し前記分離カラムの性能劣化を判
    断する評価部を有することを特徴とする液体クロマトグ
    ラフ装置。 【請求項１６】請求項１５において、前記制御手段の評
    価部で、前記分離カラムが性能劣化の状態になったと判
    断した場合、その旨または分離カラムを交換すべき旨を
    示す信号を記録手段または表示手段に出力することを特
    徴とする液体クロマトグラフ装置。 【請求項１７】請求項１５において、前記評価パラメー
    タが、保持時間，キャパシタファクタ、選択係数，各成
    分に対応するピークのピーク幅又は半値幅、このピーク
    の標準偏差、又はバリアンス、このピークのピーク幅と
    ピーク高さの比、このピークの非対称性値（アシメトリ
    ファクタ），理論段数，ベースラインの直線性の少なく
    とも１つ以上であることを特徴とする液体クロマトグラ
    フ装置。 【請求項１８】請求項１７において、前記評価パラメー
    タが、前記検体の予め定められた特定成分に対応して設
    定されていることを特徴とする液体クロマトグラフ装
    置。 【請求項１９】複数の溶離液と、１つ以上の分離カラム
    を有し、１つ以上の検体を分析するために、分析条件を
    設定する手段と、分析結果を検出する手段とを有し、前
    記設定手段で設定された分析条件または検出結果から分
    析方法を決定する制御手段と、前記制御手段からの指令
    信号に基づいて前記試料をサンプリングし、選択された
    分離カラムへ移送する手段と、前記指令信号に基づいて
    前記溶離液を選択し、その流量，混合比切り替え時間を
    変化する手段とからなる液体クロマトグラフ装置。 【請求項２０】検体と溶離液が通流される分離カラム
    と、前記分離カラムから流出する溶出液から前記検体の
    成分濃度に関するクロマトグラムを求める検出手段を備
    えた液体クロマトグラム装置において、前記検出手段の
    検出データから前記分離カラムの分離性能を評価するパ
    ラメータのうち少なくとも１つを求める評価パラメータ
    演算手段と、この求めた評価パラメータが予め定めた基
    準値に対して一定の許容範囲に入っているか否かを比較
    し前記分離カラムの性能劣化を判定する評価手段と、前
    記評価パラメータと前記分離カラムにおける溶離条件と
    の相関関係を予め求めて格納するデータテーブルと、前
    記評価手段の判定が前記許容範囲を越える評価パラメー
    タがその許容範囲になる溶離条件を検索する溶離条件検
    索手段と、その検索結果に基づいて溶離条件を変更する
    溶離条件変更手段を設けてなる液体クロマトグラフ装
    置。 【請求項２１】請求項２０において、前記溶離条件検索
    手段は前記分離カラムの圧力損失が設定値を越えない範
    囲で、前記評価パラメータが前記許容範囲内になる溶離
    条件を検索することを特徴とする液体クロマトグラフ装
    置。 【請求項２２】請求項２０において、前記溶離条件が前
    記溶離液の組成又は混合比等の種類，前記溶離液の流速
    又は流量，通流する溶離液の種類の切り替え時間，前記
    分離カラムの温度の少なくとも１つ以上であることを特
    徴とする液体クロマトグラフ装置。 【請求項２３】請求項２０において、前記変更された溶
    離条件により得られる前記クロマトグラムについての前
    記評価手段の判定結果が、前記分離カラムの性能劣化で
    ある場合、前記評価手段は、その旨と分離カラムを交換
    すべき旨と検体のサンプリングを停止すべき旨のいずれ
    か１つを示す信号を出力することを特徴とする液体クロ
    マトグラフ装置。 【請求項２４】生体成分を分析する分離カラムに充填す
    る充填剤を有機多孔質物質にカルボキシアル基の官能基
    を導入し、乾燥状態での細孔径を６００〜１２００Å、
    乾燥重量１ｇ当りの交換容量を０.１〜０.５meq とした
    ことを特徴とする液体クロマトグラフ装置。 【請求項２５】請求項２４において、前記充填剤の乾燥
    状態での粒径を３μｍ〜４μｍとしたことを特徴とする
    液体クロマトグラフ装置。 【請求項２６】請求項２４において、前記充填剤の細孔
    部分の容積が０.２〜０.６ｍｌ／ｇとしたことを特徴と
    する液体クロマトグラフ装置。 【請求項２７】請求項２４において、前記溶離液を非イ
    オン性界面活性剤を含有させ、ｐＨ５.０〜７.０の緩衝
    液で構成したことを特徴とする液体クロマトグラフ装
    置。 【請求項２８】請求項２４において、前記緩衝液が燐酸
    塩緩衝液であることを特徴とする液体クロマトグラフ装
    置。 【請求項２９】請求項２４において、前記非イオン性活
    性界面剤の濃度を１×１０6〜１×104mol／ｌであるこ
    とを特徴とする液体クロマトグラフ装置。 【請求項３０】血液中のヘモグロビン及びグリコヘモグ
    ロビンを分離し検出するための液体クロマトグラフによ
    る分析方法において、前記ヘモグロビンとグリコヘモグ
    ロビンを分離する分離カラム中に官能基を導入した、無
    機多孔性ポリマ又は有機多孔性ポリマからなる充填剤を
    充填し、前記分離カラム中を流通させる溶離液に、非イ
    オン性の界面活性剤を含有するｐＨ５.０〜７.０の緩衝
    液を用いることを特徴とする液体クロマトグラフによる
    分析方法。 【請求項３１】請求項３０において、前記官能基がカル
    ボキシアルキ基であることを特徴とする液体クロマトグ
    ラフによる分析方法。 【請求項３２】請求項３０において、前記分離カラムの
    温度を３０℃〜６５℃に制御することを特徴とする液体
    クロマトグラフによる分析方法。 【請求項３３】請求項３０において、前記緩衝液が燐酸
    塩緩衝液であることを特徴とする液体クロマトグラフに
    よる分析方法。 【請求項３４】請求項３０において、前記非イオン性界
    面活性剤の濃度を１×１０6〜１×104としたことを特徴
    とする液体クロマトグラフによる分析方法。 【請求項３５】検体と溶離液が通流される分離カラム
    と、前記分離カラムから流出する溶出液から前記検体の
    成分濃度に関するクロマトグラムを求める検出手段を備
    えた液体クロマトグラム装置の使用方法において、前記
    検出手段の検出データからから得られる特定成分の保持
    時間，キャパシタファクタ，選択係数，各成分に対応す
    るピークのピーク幅又は半値幅、このピークの標準偏
    差、又はバリアンス、このピークのピーク幅とピーク高
    さの比、このピークの非対称性値（アシメトリファク
    タ），理論段数，ベースラインの直線性などの分離能を
    決める評価パラメータのうち、少なくとも１つ以上の評
    価パラメータが設定範囲内から外れているとき、少なく
    とも現在の溶離条件における前記分離カラムの寿命が来
    たと認識することを特徴とする液体クロマトグラフ装置
    の使用方法。 【請求項３６】請求項３４において、前記評価パラメー
    タが設定範囲内から外れているとき、その外れている評
    価パラメータが設定範囲内に入るように、前記溶離液の
    組成又は混合比等の種類，前記溶離液の流速又は流量，
    通流する溶離液の種類の切り替え時間，前記分離カラム
    の温度の少なくとも１つ以上の溶離条件を変化させて分
    析を行なうことを特徴とする液体クロマトグラフ装置の
    使用方法。 【請求項３７】請求項３６において、前記溶離条件を変
    えても前記評価パラメータが設定範囲内を外れる場合に
    は表示装置に警報を発し、前記分離カラムを交換するま
    で検体のサンプリングを停止することを特徴とする液体
    クロマトグラフ装置の使用方法。 【請求項３８】生体成分を分析する分離カラムに充填さ
    れる充填剤において、有機多孔質物質に官能基を導入
    し、乾燥状態での細孔径を６００〜１２００Å，乾燥重
    量１ｇ当りの交換容量を０.１〜０.５meq としたことを
    特徴とする充填剤。 【請求項３９】請求項３８において、前記官能基をカル
    ボキシル基としたことを特徴とする充填剤。 【請求項４０】請求項３９において、前記充填剤の乾燥
    状態での粒径を３μｍ〜４μｍとしたことを特徴とする
    充填剤。 【請求項４１】請求項３９又は４０において、前記充填
    剤の細孔部分の容積が０.２〜０.６ｍｌ／ｇとしたこと
    を特徴とする充填剤。
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