JP6221458B2

JP6221458B2 - 検体の注入状態を判定する方法

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Publication number: JP6221458B2
Application number: JP2013152687A
Authority: JP
Inventors: 原一植松
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2013-07-23
Filing date: 2013-07-23
Publication date: 2017-11-01
Anticipated expiration: 2033-07-23
Also published as: JP2015021931A

Description

本発明は液体クロマトグラフィにおいて、検体注入状態を正確に判定する方法に関する。

液体クロマトグラフィによる測定では様々な要因によるトラブルが発生する可能性を抱えているが、測定結果の精度、信頼性向上のため、多様な対応策が事前に採られている。分析カラムに検体を導入する「検体注入機構」もその１つとして良く知られている。

カラムに検体を注入する方法として、例えば２つの流路形態を切り替えることができる、２位置６方バルブを使用することがあげられる（図３参照）。第一の位置（ロード状態）では検体を保留し計量するループと分析流路が切り離された状態であり、この状態で、ループ内に検体を導入する。第二の位置（インジェクション状態）ではループが分析流路に接続された状態であり、第一の状態から第二状態に切り替えることで、ループ内に保持された検体が分析流路に導入されカラムにより分離される。

正確な分析／定量を行うには、検体保持ループは全量、検体溶液が満たされる必要がある。

検体注入時には、図４に示すような不具合が発生することがある。

図４ａは検体が正常に吸引された状態である。計量ループ内は検体溶液で完全に満たされている。図４ｂは、検体吸引機構の動作不足等の要因により、ループ内に検体が送り込まれず、前回の測定に使用した溶離液が計量ループに残ってしまう場合である。図４ｃは、検体不足等の要因により、ループ内に検体が全く送り込まれず、全量空気になってしまう場合である。図４ｄは、ループ内に検体が送り込まれるものの、検体不足等の要因により一部不足し、一部空気になってしまう場合である。図４ｅは、検体内または検体吸引工程等で気泡が発生し、ループ内に僅かに気泡が混入してしまう場合である。これらの事象が生じた場合（図４ｂ〜ｅ）、何らかの方法で検知し、その分析結果が正常でない旨および原因等をユーザに示す必要がある。

一般的なクロマトの場合、検体注入時の不具合は、システム全体に掛かる圧力を監視することで検知することができる。

図５は、数ミクロンのゲルを使用したイオン交換クロマトのように、システム圧力が１０〜１５ＭＰａ程度かかるような分析系でのクロマトグラムおよび圧力の変動を模式的に示した図である（測定対象：ヘモグロビンＡ１ｃ）。正常に検体が注入された場合、図５ａのように圧力はほぼ一定の値を示す。検体保持ループに空気が混入した場合、図５ｂ、ｃのように注入と同時に圧力が低下しその後元に回復する。システム全体に一定の圧力が掛かっているところに空気が入り、圧縮されるためである。検出器のシグナルは絶対注入量の低下に比例して小さくなる。このように、圧力変動から注入異常を検知／判断することは可能である。また、空気が混入した場合でも、その量が少なければ、圧力により押し潰され、検出器のシグナルに大きな影響を与えることは少ない（図５ｂは気泡がセル内で発生せず検出器に影響しない場合、図５ｃは気泡がセル内で発生し検出器に影響する場合）。

しかしながら、システム圧力が数ＭＰａ〜数１００ＫＰａしかかからないような分析系では、分析圧力と空気混入時の圧力差が少なくなり、圧力変動からを注入異常を検知／判断することが難しくなる。また、システム圧が低いため、僅かな空気の混入であっても、圧力により押し潰されずにセル内で気泡が発生し、検出器のシグナルに影響を与えやすい（図６参照）。

これにより、検体注入時に空気が混入し、検出器セル内で気泡が発生した場合、絶対注入量が低下したにもかかわらず、セル内の光量が増加してしまい検出器のシグナルに影響する。図４ｄのように検体計量ループ内に一部空気が混入すると、注入量が低下したにも関わらず、シグナルは逆に大きくなりやすくなる。図６ｂは検出器セル内で気泡が発生しない場合、図６ｃは検出器セル内で気泡が発生した場合の検出器シグナルの変化および圧力の変化を模式的に示した図である。

空気による検出器のシグナルの変化は、カラムのボイド容量が溶出される付近に発生することが多い。

例えば液体クロマトグラフィ法によるヘモグロビンＡ１ｃ（以下、Ａ１ｃとする）測定法には、大別してイオン交換法とアフィニティ法の２つが存在する。図１はイオン交換法によるＡ１ｃ測定の流路図および代表的なクロマトグラムである。イオン交換クロマト法では塩濃度の異なる複数の溶離液をステップワイズで切り替え、６分画程度に分画し、Ａ１ｃの含有量を算出する方法が一般的である。図２はアフィニティ法によるＡ１ｃ測定の流路図および代表的なクロマトグラムである。アフィニティクロマト法では、ヘモグロビンＡ０（以下、Ａ０とする）を含む成分を第１の溶離液で溶出させ、その後、グルコース等を含有した第２の溶離液でＡ１ｃを含む成分を溶出させる方法が一般的である。

前者のイオン交換法では、Ａ１ｃ、Ａ０ともカラムに対して保持があることから、カラムのボイド容量以降に溶出されてくる。一方、アフィニティ法ではＡ０は殆どカラムに保持されず、カラムのボイド容量付近に溶出する。そのため、Ａ０のピークと検体の溶血液の成分のピークや注入バルブの切り替えによるベース変動等が重なることがある。しかしながら、正常に動作している場合は、検体を希釈／溶血した溶液成分のピークや注入バルブの切り替えによるベース変動はＡ０のピークと比較して極端に小さいことから定量結果に大きく影響するものではない。また、これらの影響を排除するため、２波長測定により補正することも行われている。検体に吸収のある第一の波長（一般的には４１５ｎｍ）と、検体に吸収のない第二の波長（一般的には５００ｎｍ）の２つの波長で同時に測定を行い、前者から後者を差し引くことでベースラインの変動を差し引き、影響を少なくする方法が採られることも多い（特許文献１〜３参照）。これらの方法はいずれも、対象となる成分の測定精度の向上を目的としたもので、装置への検体の注入状態の判定に用いるものではない。

イオン交換法によるＡ１ｃ分離では、Ａ１ｃ、Ａ０ともカラムに対して保持があることから、カラムのボイド容量以降に溶出されてくる。このため、気泡混入によるシグナル異常を検知判断することはできるものの難しい。一方、アフィニティ法ではＡ０を含む成分は殆どカラムに保持されず、カラムのボイド容量付近に溶出するため、気泡混入によるベース変動とＡ０のピークが重なり異常を検知判断することが難しくなる。

国際公開第２００７／１１１２８２号パンフレット国際公開第２００７／１１１２８３号パンフレット特開２００７−３１５９４２号公報

本発明は、液体クロマトグラフィにおいて、注入状態の異常検出を的確に行うことを目的とし成されたものであり、特にＡ１ｃの測定において、カラムのボイド付近にＡ０が溶出するアフィニティによる分離に際し好適である。

本発明者は上記課題に関し鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は、以下の通りである。
（１）液体クロマトグラフィにおいて、検出対象成分を検出するための第一波長と、検出対象成分に吸収がなく、溶離液のベースライン変動をモニタするための第二波長を用いてカラム溶出物の検出出力を取得し、両波長による出力変化に基づいて検体の注入状態を判定する方法。
（２）上述の（１）に記載の方法において、検出対象がヘモグロビンＡ１ｃである方法。
（３）上述の（２）に記載の方法において、第一波長として４０５ｎｍから４２０ｎｍ、第二波長として４９０ｎｍから５２０ｎｍを用いる方法。
（４）上述の（２）又は（３）に記載の方法において、アフィニティ液体クロマトグラフィ法である方法。
（５）上述の（２）〜（４）いずれかに記載の方法において、少なくとも、第一波長ではヘモグロビンＡ１ｃ由来のシグナル変動が計測され、第二波長では微小なベースライン変動が計測された場合、検体がカラムに正常に注入されたと判定する方法。
（６）上述の（２）〜（４）いずれかに記載の方法において、少なくとも、第一波長ではカラムのボイド付近にボイドピークが計測され、第二波長でもカラムのボイド付近にボイドピークが計測された場合、検体が注入されずに代わりに溶離液が注入されたと判定する方法。
（７）上述の（２）〜（４）いずれかに記載の方法において、少なくとも、第一波長ではカラムのボイド付近にボイドピークが計測されず、第二波長でもカラムのボイド付近にボイドピークが計測されない場合、カラムには何も注入されなかったと判定する方法。
（８）上述の（２）〜（４）いずれかに記載の方法において、少なくとも、第一波長ではヘモグロビンＡ１ｃ由来のシグナル変動が計測され、第二波長では過大なベース変動が計測された場合、検体と気泡がカラムに注入されたと判定する方法。
（９）上述の（２）〜（４）いずれかに記載の方法において、少なくとも、第一波長ではヘモグロビンＡ１ｃに由来のシグナル変動が計測されず、第二波長では過大なベース変動が計測された場合、カラムに検体を注入できずに空気を注入したと判定する方法。
以下に本発明を更に詳細に説明する。

本発明において、検出対象成分を検出するための第一波長と、検出対象成分に吸収がなく、溶離液のベースライン変動をモニタするための第二波長を用いてカラム溶出物の検出出力を取得し、両波長による出力変化に基づいて検体の注入状態を判定する。ここで第一波長としては検出対象に吸収のある波長を用いる。また第二波長としては検出対象に吸収のない波長を用いるが、第一波長に近い波長を用いることが好ましい。

本発明において、検出対象としては特に限定はないが、例えばＡ１ｃをあげることができる。Ａ１ｃの場合は第一波長として４０５〜４２０ｎｍ、第二波長として４９０〜５２０ｎｍを用いることが好ましい。

本発明において、液体クロマトグラフィの種類は特に限定されるものではないが、Ａ１ｃを検出対象にする場合はアフィニティ液体クロマトグラフィを用いることが好ましい。

本発明に用いられる検出器としては、第一波長、第二波長の両方の光を照射できる１つの光源を使用し、セルに照射し透過光を前記第一波長と前記第二波長に分け、各々検出する方式の検出器が好適である。しかしながら、前記第一波長で検出できる検出器と、前記第二波長で検出できる検出器を直列に接続しても同様の効果がある。この際は、検出器や各接続配管の容量によるピークの広がりの影響を最小にすることが好ましい。第一波長の検出器を上流側、第二波長の検出器を下流側に配置することが望ましい（図９参照）。

検体注入の方式は、例えば液体クロマトグラフィで一般的に使用される２位置切り替え６方バルブに検体保持ループを接続し、一定量の検体をカラムに導入できるバルブを使用することが好ましい。前記バルブの第一の位置では、ポンプからの溶離液はカラムに直接送液され、この間に検体保持ループ内に検体を吸引または吐出手段を用いて導入させる。第二の位置に切り替えることで、ポンプからの溶離液は検体が保留されているループを経由してカラムに送液される。これにより、検体保持ループ内の検体はカラムに導入／分離され、検出器により強度が測定される。

以下に、検体注入状態による検出器のシグナル変動について、上述の検体注入の方式を用いて、Ａ１ｃをアフィニティクロマトグラフィで検出場合を例にして、図７および表１をもとに説明する。

図中のａ〜ｄの検出器ベース変動（ピーク）は、以下の通りである。ａ：注入バルブ切り替えによる変動（ボイドピーク）、ｂ：溶離液切り替えによるによる変動（ステップグラジエント）、ｃ：気泡又は空気による変動、ｄ０：Ａ０由来の変動、ｄ１ｃ：Ａ１ｃ由来の変動。

検体の注入状態は以下の６つに大別される。

Ｅ０：検体保持ループに検体が確実に保留され、カラムに注入された場合（正常測定）である。第一波長ではｄ０が一定量以上計測され、これはａと重なり合ってボイド付近に見られる。またｄ１ｃも一定量以上計測される。ｂは存在するが、他のピークと重なりあい直接的には観察されない。第二波長では、ステップグラジエントによるベースライン変動ｂが計測され、またａがボイド付近に計測されるが、いずれも変動は微小である。

Ｅ１：何らかの要因により、検体保持ループに検体が全く保留できず、検体が注入されずに代わりに溶離液が注入された場合である。第一波長では、ステップグラジエントによるベースライン変動ｂが計測され、またａがボイド付近に計測されるが、いずれも変動は微小である。第二波長でも、ステップグラジエントによるベースライン変動ｂが計測され、またａがボイド付近に計測されるが、いずれも変動は微小である。

Ｅ２：検体を注入するバルブが何らかの要因によりロード状態からインジェクション状態に切り替わらなかったため、カラムには何も注入されなかった場合である。第一波長では、ステップグラジエントｂによるベースライン変動のみが計測され、その変動は微小である。第二波長でも、ステップグラジエントｂによるベースライン変動のみが計測され、その変動は微小である。なおボイド付近には、第一波長、第二波長いずれも変動は検出されない。

Ｅ３：検体保持ループに検体がほぼ保留されたものの、ループ内で僅かな気泡が発生してしまい、検体と気泡がカラムに注入された場合である。第一波長ではＡ０由来のシグナルｄ０、気泡によるベース変動ｃ、及びａとが合算され、ボイド付近に過大なピークが計測される。またこれとは別に、Ａ１ｃに由来するのピークも出現する。なおｂも存在するものの、他のピークと重なって直接的には観察されない。第二波長では、気泡由来のベース変動ｃとａとが重なり、ボイド付近に過大な変動として計測される。また微小なｂも計測される。

Ｅ４：検体保持ループに多量の空気が混入してしまい、検体が全く保留できず、カラムに検体や溶離液が全く注入されずに空気が注入された場合である。第一波長では空気由来のベース変動ｃが過大な変動としてボイド付近に計測され、また微小なｂが計測される。しかしながらＡ１ｃに由来するピークは出現しない。第二波長では、空気由来のベース変動ｃが過大な変動としてボイド付近に計測される。また微小なｂも計測される。

Ｅ５：その他の異常。

本発明においては、このようなＥ０〜Ｅ５で生じるシグナル変動のうち、Ｅ０〜Ｅ５の各状態で特徴的なものを選択し、それを用いて検体の注入状態を判定することができる。特徴的なシグナル変動としては、上述したもののうち例えば以下のものがあげられる。
Ｅ０：第一波長ではヘモグロビンＡ１ｃ由来のシグナル変動が計測され、第二波長では微小なベースライン変動が計測される。
Ｅ１：第一波長ではカラムのボイド付近にボイドピークが計測され、第二波長でもカラムのボイド付近にボイドピークが計測される。
Ｅ２：第一波長ではカラムのボイド付近にボイドピークが計測されず、第二波長でもカラムのボイド付近にボイドピークが計測されない。
Ｅ３：第一波長ではヘモグロビンＡ１ｃ由来のシグナル変動が計測され、第二波長では過大なベース変動が計測される。
Ｅ４：第一波長ではヘモグロビンＡ１ｃに由来のシグナル変動が計測されず、第二波長では過大なベース変動が計測される。

本発明においては、少なくともこのような特徴的なシグナル変動を基に判定すればよく、さらに他のシグナル変動をも加味して判定してもよい。

なお本発明においては、このようなＥ０〜Ｅ５の判定は、Ｅ５以外はそれぞれを単独で行ってもよく、またはＥ０〜Ｅ５の２以上を組合わせて行ってもよい。

図８に、Ｅ０〜Ｅ５を判定する一例をフローチャートに示した。

第一波長と第二波長による検出の際に、その出力変化から検体の注入状態を判定し、注入部での異常の要因を判定することもできる。

一般的なイオン交換クロマト法によるＡ１ｃ測定方法を示した図である。ａは流路図、ｂは代表的なクロマトグラムである。一般的なアフィニティクロマト法によるＡ１ｃ測定方法を示した図である。ａは流路図、ｂは代表的なクロマトグラムである。検体注入の注入方式を模式的に示した図である。検体注入機構での不具合を模式的に示した図である。システム圧が、１０ＭＰａ〜１５ＭＰａ程度かかる高圧のクロマトグラフィでの、検体注入時に空気が混入した場合のクロマトグラム、圧力変動を模式的に示した図である。ａは正常測定時、ｂは空気混入時である。システム圧が、数ＭＰａ〜数１００ｋＰａ程度の低圧のクロマトグラフィでの、検体注入時に空気が混入した場合のクロマトグラム、圧力変動を模式的に示した図である。ａは正常測定時、ｂは空気混入時でセル内で気泡が発生しない場合、ｃは空気混入時でセル内で気泡が発生した場合である。検体注入状態による、第一波長と第二波長のシグナルの変化を模式的に示した図である。第一波長と第二波長のシグナルの変化をもとに異常内容を判定するフローチャートである。２波長測定の方式を示した図である。ａは１つの検出器による２波長測定、ｂは２つの検出器による２波長測定の場合である。実施例１で使用したアフィニティクロマト法の流路図である。実施例１でのピークの同定法を示した図である。実施例１で、正常に検体が注入された場合と一部気泡が混入して注入された場合の、第一波長および圧力シグナルの変動を示した図である。ａは正常、ｂは気泡が混入した場合である。図１２ａおよびｂの第一波長のシグナル変動をフルスケールで重ね描きした図である。網掛け部はＡ０ピークの同定範囲を示している。実施例１で、正常に検体が注入された場合と一部気泡が混入して注入された場合の、第二波長のシグナル変動を示した図である。実施例１で、検体保留ループ内が完全に空気で満たされた状態で注入された場合の、第一波長、第二波長および圧力シグナルの変動を示した図である。実施例１で、検体保留ループ内に検体が全く導入されず、代わりに溶離液が注入された場合の、第一波長および第二波長の変動を示した図である。実施例１で、検体注入バルブが回転しなかった場合の、第一波長および第二波長の変動を示した図である。

以下、本発明を実施例を用いて説明する。本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
第一波長で検出ができる第一の可視検出器と、第二波長で検出できる第二の検出器をカラム下流に直列に接続して２波長検出を行い、アフィニティクロマトによるＡ１ｃ測定を実施した。図１０に使用した液体クロマトグラフの流路図を示す。

溶離液１ａ送液ポンプ（４）と検体注入バルブ（６）間に、溶液を保留できるループ（１４）を備えた２位置切り替え６方バルブ（１３）を挿入し、溶離液１ｂを前記の６方バルブのループに保留させ、バルブを切り替えることで、ステップグラジエントを行った。

溶離液１ａを送液するポンプ（４）はＫＮＦ社製定量ポンプＦＭＭ２０を使用し、毎分２５０マイクロリッタの流速、溶離液１ｂを充填するポンプ（１２）も同上のポンプを使用した。

検出器（１０、１１）は東ソー製紫外可視検出器ＵＶ−８０２０を２台直列に接続して、第一波長として４１５ｎｍ（上流側）と第二波長として５００ｎｍ（下流側）の波長で使用した。カラム（８）は内径１．５ｍｍ長さ１０ｍｍのＴＳＫｇｅｌＢＯＲＡＴＥ−５ＰＷ（東ソー（株）製）を充填したものを６０℃に温調して使用した。検体は全血を希釈して使用した。溶離液１ａはグリシン１００ｍｍｏｌ／Ｌ＋硫酸Ｎａ１５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ９．２）、溶離液１ｂはＴｒｉｓ１０ｍｍｏｌ／硫酸Ｎａ５０ｍｍｏｌ／Ｌ＋Ｄ−ソルビトール１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０）を使用した。溶離液１ａで暫くカラムを平衡化した後、検体を注入し、０．５５分後に溶離液１ｂに切り替え、更に０．７５分後に溶離液１ａに戻すステップグラジエントによる分離を行った。

カラムで分離され検出されたピークに対して、同定テーブルを元にピークの同定がなされ定量計算がされる。表２は一般的な同定テーブルを示したものである。

各ピークに対して基準となる溶出時間とその変動の許容幅を設定する。

溶出時間が（ｔ_Ａ０−ｔ_Ａ０×α）〜（ｔ_Ａ０＋ｔ_Ａ０×α）、のピークをＡ０として、溶出時間が（ｔ_Ａ１ｃ−ｔ_Ａ１ｃ×β）〜（ｔ_Ａ１ｃ＋ｔ_Ａ１ｃ×β）のピークをＡ１ｃとして同定した後、定量計算を実施する（図１１参照）。

表３の同定テーブルが今回使用したものである。許容幅に関してはＡ０、Ａ１ｃとも基準溶出時間の１０％とした。

溶出時間が０．２５２〜０．３０８分までに検出されたピークをＡ０として、溶出時間が０．７８９〜０．９６５分までに検出されたピークをＡ１ｃとして同定し定量計算を実施した。

図１２ａは正常に検体が注入された場合、図１２ｂは検体保留ループ内に気泡が混入してしまった場合である。上段は第一波長で計測されたクロマトグラム、下段はその際の圧力変動を示した図である。図１３は両者のクロマトグラムを重ね書きした図である。
本条件では、カラム圧が１００ｋＰａ程度であり一般的なクロマトグラフィよりかなり低いことから、僅かな気泡が混入しても、検体注入時の圧力変動（低下）は少なく、正常注入の場合との差異がみられず、圧力の変動パターンから注入異常を判定することが難しい。
第一波長のみ（図１２）では、ボイド付近に溶出したピークは前記の同定テーブルから両者ともＡ０と同定されてしまう。

第二波長のクロマトグラムを見ると両者の差異が明確になる。検体が正常に注入された場合、第二波長では、溶媒ピークとステップグラジエントによる溶離液変化に由来する僅かなベースライン変動のみが観測されるが、気泡混入による注入異常の場合は第一波長と同様な気泡由来のピークがＡ０の溶出位置（ボイド容量付近）に観測される（図１４参照）。

このように、検出対象に吸収のある第一波長のみを使用した場合はＡ０と判定されてしまうが、検出対象に吸収のない第二波長を同時にモニタすることで、空気混入によるベース変動であることと認定することが可能である。

次に、検体保留ループ内が完全に空気で満たされ注入され、検体が導入されなかった場合を図１５に示す。図１５は第一波長、ｂは第二波長で計測されたクロマトグラム、ｃはその際の圧力変動を示した図である。このように完全に空気を注入してしまった場合は、検体注入時の圧力変動（低下）が発生し、圧力の変動パターンからでも注入異常を判定することもできる。

このような場合、第一波長では、ボイド付近に大きなピークが溶出し、前記の同定テーブルからＡ０のピークとして同定されてしまう。しかしながら、Ａ１ｃのピークが全く出現していないことから検体が注入できなかったことを疑わせる。第二波長でもボイド付近に大きなピークが溶出していることから、このピークはＡ０ではないと判断することができる。

次に、検体が検体保留ループに導かれず、代わりに溶離液が注入された場合を図１６に示す。図１６ａは第一波長で計測されたクロマトグラム、図１６ｂは第二波長で計測されたクロマトグラムを示した図である。第一波長、第二波長ともボイド付近に大きなピークは出現せず、ステップグラジエントによる溶離液変化に由来する僅かなベースライン変動ｂが観測される。また、第一波長、第二波長ともに注入バルブが切り変わったことによる微小な変動ａがボイド付近に出現する。

次に、検体注入バルブが回転しなかった場合を図１７に示す。図１７ａは第一波長で計測されたクロマトグラム、図１７ｂは第二波長で計測されたクロマトグラムを示した図である。第一波長、第二波長とも、ボイド付近に大きなピークは出現せず、かつ注入バルブが切り変わったことによる変動も観測されない。また第一波長、第二波長ともに、ステップグラジエントによる溶離液変化に由来する僅かなベースライン変動が観測された。

このように、僅かな空気混入により注入異常が発生し、圧力の変動で判定が困難な場合であっても、第一波長のシグナル変動と、第二波長のシグナル変動の組み合わせにより、注入状態を容易に判定することができる。

１ａ，１ｂ，１ｃ．溶離液
２ａ，２ｂ，２ｃ．切替弁
３．脱気装置
４．ポンプ
５．圧力センサ
６．検体注入バルブ
７．検体ループ
８．分析カラム
９．カラム恒温槽
１０．検出器１
１１．検出器２
１２．溶離液１ｂ充填ポンプ
１３．溶離液切り替えバルブ
１４．溶離液１ｂ保留ループ
１５．検出器光源
１６．セル
１７．ハーフミラー
１８．波長選択フィルタ１
１９．波長選択フィルタ２
２０．フォトセンサ１
２１．フォトセンサ２
２２．分岐合流ブロック

Claims

アフィニティ液体クロマトグラフィ法において、ヘモグロビンＡ１ｃを検出するための４０５ｎｍから４２０ｎｍの第一波長と、ヘモグロビンＡ１ｃに吸収がなく、溶離液のベースライン変動をモニタするための４９０ｎｍから５２０ｎｍの第二波長を用いてカラム溶出物の検出出力を取得し、両波長による出力変化に基づいて検体の注入状態を判定する方法。
請求項１に記載の方法において、少なくとも、第一波長ではヘモグロビンＡ１ｃ由来のシグナル変動が計測され、第二波長では微小なベースライン変動が計測された場合、検体がカラムに正常に注入されたと判定する方法。
請求項１に記載の方法において、少なくとも、第一波長ではカラムのボイド付近にボイドピークが計測され、第二波長でもカラムのボイド付近にボイドピークが計測された場合、検体が注入されずに代わりに溶離液が注入されたと判定する方法。
請求項１に記載の方法において、少なくとも、第一波長ではカラムのボイド付近にボイドピークが計測されず、第二波長でもカラムのボイド付近にボイドピークが計測されない場合、カラムには何も注入されなかったと判定する方法。
請求項１に記載の方法において、少なくとも、第一波長ではヘモグロビンＡ１ｃ由来のシグナル変動が計測され、第二波長では過大なベース変動が計測された場合、検体と気泡がカラムに注入されたと判定する方法。
請求項１に記載の方法において、少なくとも、第一波長ではヘモグロビンＡ１ｃに由来のシグナル変動が計測されず、第二波長では過大なベース変動が計測された場合、カラムに検体を注入できずに空気を注入したと判定する方法。