JP6435165B2 - 液体クロマトグラフィ測定方法、液体クロマトグラフィ測定装置、及び液体クロマトグラフィ測定プログラム - Google Patents

Description

本発明は、液体クロマトグラフィ測定方法、液体クロマトグラフィ測定装置、及び液体クロマトグラフィ測定プログラムに係り、特に、血液などの生体試料の分析に使用される液体クロマトグラフィ測定方法、液体クロマトグラフィ測定装置、及び液体クロマトグラフィ測定プログラムに関する。

近年、血液検査におけるグリコヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）の測定では、検査結果の即時報告などの要求が高く、測定時間を短縮する傾向にある。また、特に日本以外の国においては、主要成分としてのＨｂＡ１ｃの測定時に、付随成分として変異Ｈｂ及びサラセミア症スクリーニング指標となるＨｂを検出することが求められている。これは、血液中に変異Ｈｂを含む場合又はサラセミア症スクリーニング指標となるＨｂが高値を示す場合、ＨｂＡ１ｃの測定値が正確に得られない場合があるためである。

また、これらのＨｂは貧血やサラセミア症を含む別の疾患の指標となるため、その同定の要求も高い。

ここで、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を原理とする測定装置において、ＨｂＡ１ｃを測定する装置は一般的に用いられている。

一方、ＨｂＥ、ＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＤなどの変異Ｈｂや、サラセミア症スクリーニング指標となるＨｂＦ、ＨｂＡ２の同定を目的とした測定装置も用いられている。

ＨｂＡ１ｃ及び変異Ｈｂを測定する方法としては、例えば特許文献１に開示された技術がある。

従来、ＨｂＡ１ｃ及び変異Ｈｂは、別々の測定装置で測定するのが通常であった。また、１つの測定装置でＨｂＡ１ｃ及び変異Ｈｂの測定が可能であっても、複数の設定条件（以下、測定モードという）を切り替える必要があった（例えば非特許文献１参照）。

特開２００９−２３６７６８号公報

Ｂｉｏ−Ｒａｄ社「ＶａｒｉａｎｔＩＩ Ｄｕａｌ Ｐｒｏｇｒａｍ」のカタログ

しかしながら、特許文献１記載の技術では、ＨｂＡ１ｃと変異Ｈｂの同時測定を行っているものの、変異Ｈｂの分離項目は、ＨｂＳとＨｂＣのみである。また、変異Ｈｂを含まない通常の測定試料の場合でも、変異Ｈｂを分離、測定するための送液を行うため測定時間が長くなり、ＨｂＡ１ｃの測定で求められている測定時間の短縮を実現するのが困難である。また、溶離液の消費（コスト）も多くなる。

また、複数の測定モードを有する測定装置であっても、先に行った測定結果やクロマトグラムが通常のものと異なる場合、一旦測定を終えてから、別の測定モードに切り替えて測定するために、別のカラムや溶離液を取り付ける操作が必要であり、手間とコストがかかる。

さらに、一旦測定を終了させて再測定するため、測定開始・終了時の溶離液の送液（スタート送液・エンド送液）も必要となったり、また新たな測定試料も必要となったりするため、時間とコスト（溶離液消費）がかかる。

本発明は、測定装置における測定のための設定条件である測定モードを手動で切り替えることなく、また、測定途中または測定終了後に、測定終了処理（エンドシーケンス）や測定開始処理（スタートシーケンス）を実行することなく連続的に、測定試料中の主要成分及び付随成分を測定することができる液体クロマトグラフィ測定方法、液体クロマトグラフィ測定装置、及び液体クロマトグラフィ測定プログラムの提供を目的とする。

請求項１記載の発明の液体クロマトグラフィ測定装置は、液体クロマトグラフィ法により測定試料の主要成分を測定すると共に、前記測定試料の付随成分を検出する第１測定工程を実行するための第１測定手段と、前記付随成分を同定するための、前記第１測定工程と異なる第２測定工程を実行するための第２測定手段と、前記第１測定工程と前記第２測定工程とを切り替える切替手段と、を備え、前記切替手段は、前記第１測定手段によって、前記第１測定工程中に前記付随成分が検出された場合、前記測定試料中に含まれる成分が全て溶出する前に、前記第２測定工程に切り替え、前記第１測定手段によって、前記第１測定工程中に前記付随成分が検出されなかった場合、前記第１測定工程を継続する。

これによれば、一態様において、第１の測定工程中に付随成分が検出された場合には、測定試料中に含まれる成分が全て溶出する前に、第２測定工程に切り替えて付随成分を同定し、第１測定工程中に付随成分が検出されなかった場合は第１測定工程を継続する。ここで、液体クロマトグラフィ装置においては、液体クロマトグラフィ法の原理上、測定のための設定条件を固定的に設定するのが通常である。すなわち、液体クロマトグラフィ法では、溶出成分の溶出パターンは、使用するカラムや溶離液、測定検体の特性により多様に変化する。そのため、測定したい成分を所定のタイミングで適切に溶出するために、液体クロマトグラフィを測定原理とする分析装置においては、搭載するカラム、溶離液及び検体の特性を検証の上、測定条件としての、測定の開始から終了まで送液順序や送液時間が厳密に設定される。そのため、送液順序や時間を途中で変更することは、通常は行われず、想定もされない。つまり、従来の液体クロマトグラフィ測定装置では、測定工程は固定するのが通常である。そして、液体クロマトグラフィを測定原理とする分析装置において、測定工程を変更したい場合には、測定モードを手動で切り替えることが必要となる。つまり、液やカラム、また送液条件の変更や機器調整を手動で行わなければならず、また、工程変更に当たっては、測定終了処理（エンドシーケンス）や測定開始処理（スタートシーケンス）の実行が必要となる。しかし、本発明は、一態様において、測定モードを従来のように手動で切り替えることなく測定工程のみ切り替え、また、測定試料中に含まれる成分が全て溶出する前に、測定終了処理（エンドシーケンス）や測定開始処理（スタートシーケンス）を実行することなく連続的に、測定試料中の主要成分及び付随成分を測定することができる。これにより、早く結果を出したい成分は確実に早く結果を出し、かつ、詳しく追加的に分析したい成分については測定モードを切り替えることなく自動的に測定工程のみを変更するので、従来のように、測定モードを切り替えて測定する場合と比較して測定時間を短縮することができる。

請求項２記載の発明は、前記第２測定工程が複数パターン存在し、前記切替手段は、前記第１測定工程中に前記付随成分が検出された場合、前記複数パターンから選択した前記第２測定工程に切り替える。

これによれば、一態様において、第１測定工程において付随成分を検出後、最適の測定工程に切り替えることが可能となる。

請求項３記載の発明は、前記主要成分は、ＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡ０の少なくとも一方を含み、前記付随成分は、変異Ｈｂ及びサラセミア症スクリーニング指標となるＨｂの少なくとも１種である。

請求項４記載の発明は、前記第１測定工程に対応した第１制御シーケンスに従って前記第１測定工程を実行すると共に、前記第２測定工程に対応した第２制御シーケンスであって、前記第１制御シーケンスにおける所定時点より後のシーケンスが異なるシーケンスを含む第２制御シーケンスに従って前記第２測定工程を実行する制御手段を備え、前記制御手段は、前記第１測定手段によって、前記第１測定工程中に前記付随成分が検出された場合、少なくとも前記所定時点より後の期間においては、前記第２制御シーケンスに従って前記第２測定工程を実行する。

これにより、一態様において、測定モードを従来のように手動で切り替えることなく測定工程のみ切り替え、また、第１測定工程の途中又は終了後に、測定終了処理（エンドシーケンス）や測定開始処理（スタートシーケンス）を実行することなく連続的に、測定試料中の主要成分及び付随成分を測定することができる。

請求項５記載の発明は、前記第２制御シーケンスは、前記第１制御シーケンスにおける前記所定時点以前のシーケンスと同一のシーケンスを含み、前記制御手段は、前記第１測定手段によって、前記付随成分が検出された場合、使用する制御シーケンスを前記第１制御シーケンスから前記第２制御シーケンスに切り替えることにより、前記第１測定工程の前記所定時点までの期間においては、前記第１測定工程と同一の測定工程を進行させ、前記所定時点より後の期間においては、前記第１測定工程と異なる測定工程を進行させる。

これにより、一態様において、前記付随成分が検出された場合、即座に、測定工程を切り替えても、あたかも切替が行われなかったように、引続き所望の主要成分の溶出を進行させることができる。

請求項６記載の発明は、前記所定時点が、所定の主要成分の所定量の溶出が完了する時点である。

これにより、一態様において、所定の主要成分を所定量溶出させた後はスムーズに、第１測定工程と異なる第２測定工程により、付随成分の溶出を行うことができる。つまり、本実施形態の上記測定工程によれば、付随成分の検出に基づくシーケンスのリアルタイムの切り替えと、ユーザが所望する主要成分の溶出の確実な検出並びに付随成分の同定を効率的に実現できる。

請求項７記載の発明の液体クロマトグラフィ装置は、液体クロマトグラフィ法により測定試料の主要成分を測定すると共に、前記測定試料の付随成分を検出する第１測定工程を実行するための第１測定手段と、前記付随成分を同定するための、前記第１測定工程と異なる第２測定工程を実行するための第２測定手段と、前記第１測定工程と前記第２測定工程とを切り替える切替手段と、少なくとも２測定分以上の測定試料を保持する保持手段と、を備え、前記切替手段は、前記保持手段から１測定分の前記測定試料を導入して、前記第１測定工程に対応した第１制御シーケンスに従って前記第１測定工程を実行し、前記第１測定工程において前記付随成分が検出された場合、第１測定工程の終了後に、前記保持手段から１測定分の前記測定試料を新たに導入し、かつ、使用する制御シーケンスを前記第１制御シーケンスから第２制御シーケンスに切り替え、前記第２測定工程に対応した前記第２制御シーケンスに従って前記第２測定工程を実行する。

これにより、一態様において、第１測定工程により測定試料すべてが溶出されてから検出するため、第１測定工程の途中で第１測定工程と異なる第２測定工程に切り替える場合に比べて、第１測定工程の後半に溶出される付随成分も検出できるという利点がある。また、測定モードを従来のように手動で切り替えることなく測定工程のみ切り替え、また、第１測定工程の途中又は終了後に、測定終了処理（エンドシーケンス）や測定開始処理（スタートシーケンス）を実行することなく連続的に測定試料中の主要成分及び付随成分を測定することもでき、従来の測定モードを手動で切り替えて測定する場合のように新たな測定試料を用意する必要もなく、また測定時間を短縮することができる。

請求項８記載の発明は、前記第１測定手段及び前記第２測定手段が各々、溶離液を含み、前記第１測定工程及び前記第２測定工程が、前記溶離液の種類、前記溶離液の組合せ、及び前記溶離液の使用条件の少なくとも一つにおいて異なる。

請求項９記載の発明は、前記第１測定手段及び前記第２測定手段が各々、カラムを含み、前記第１測定工程及び前記第２測定工程の各々において使用するカラムが異なる。

請求項１０記載の発明の液体クロマトグラフィ測定方法は、液体クロマトグラフィ法により測定試料の主要成分を測定すると共に、前記測定試料の付随成分を検出する第１測定工程中に前記測定試料の付随成分が検出された場合、前記測定試料中に含まれる成分が全て溶出する前に、前記付随成分を同定するための、前記第１測定工程と異なる第２測定工程に切り替え、前記第１測定工程中に前記付随成分が検出されなかった場合、前記第１測定工程を継続する。

これによれば、一態様において、請求項１に記載したのと同様に、従来のように、測定モードを切り替えて測定する場合と比較して測定時間を短縮することができる。

請求項１１記載の発明は、前記第２測定工程が複数パターン存在し、前記第１測定工程中に前記付随成分が検出された場合、前記複数パターンから選択した前記第２測定工程に切り替える。

これによれば、一態様において、請求項２に記載したのと同様に、第１測定工程において付随成分を検出後、最適の測定工程に切り替えることが可能となる。

請求項１２記載の発明は、前記主要成分は、ＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡ０の少なくとも一方を含み、前記付随成分は、変異Ｈｂ及びサラセミア症スクリーニング指標となるＨｂの少なくとも１種である。

請求項１３記載の発明は、前記第１測定工程に対応した第１制御シーケンスに従って前記第１測定工程を実行すると共に、前記第２測定工程に対応した第２制御シーケンスであって、前記第１制御シーケンスにおける所定時点より後のシーケンスが異なるシーケンスを含む第２制御シーケンスに従って前記第２測定工程を実行し、前記第１測定工程中に前記付随成分が検出された場合、少なくとも前記所定時点より後の期間においては、前記第２制御シーケンスに従って前記第２測定工程を実行する。

これによれば、一態様において、請求項４に記載したのと同様に、測定モードを従来のように手動で切り替えることなく測定工程のみ切り替え、また、第１測定工程の途中又は終了後に、測定終了処理（エンドシーケンス）や測定開始処理（スタートシーケンス）を実行することなく連続的に、測定試料中の主要成分及び付随成分を測定することができる。

請求項１４記載の発明では、前記所定時点は、前記測定試料中に含まれる成分の溶出が完了していない時点であり、前記第２制御シーケンスは、前記第１制御シーケンスにおける前記所定時点以前のシーケンスと同一のシーケンスを含み、前記付随成分が検出された場合、使用する制御シーケンスを前記第１制御シーケンスから前記第２制御シーケンスに切り替えることにより、前記第１測定工程の前記所定時点までの期間においては、前記第１測定工程と同一の測定工程を進行させ、前記所定時点より後の期間においては、前記第１測定工程と異なる測定工程を進行させる。

これによれば、一態様において、請求項５に記載したのと同様に、前記付随成分が検出された場合、即座に、測定工程を切り替えても、あたかも切替が行われなかったように、引続き所望の主要成分の溶出を進行させることができる。

請求項１５記載の発明は、前記所定時点が、所定の主要成分の所定量の溶出が完了する時点である。

これによれば、一態様において、請求項６に記載したのと同様に、所定の主要成分を所定量溶出させた後はスムーズに、第１測定工程と異なる第２測定工程により、付随成分の溶出を行うことができる。つまり、本実施形態の上記測定工程によれば、付随成分の検出に基づくシーケンスのリアルタイムの切り替えと、ユーザが所望する主要成分の溶出の確実な検出並びに付随成分の同定を効率的に実現できる。

請求項１６記載の発明の液体クロマトグラフィ測定方法は、液体クロマトグラフィ法により測定試料の主要成分を測定すると共に、前記測定試料の付随成分を検出する第１測定工程中に前記測定試料の付随成分が検出された場合、前記付随成分を同定するための、前記第１測定工程と異なる第２測定工程に切り替え、前記第１測定工程中に前記付随成分が検出されなかった場合、前記第１測定工程を継続する液体クロマトグラフィ測定方法であって、前記第１測定工程に対応した第１制御シーケンスに従って前記第１測定工程を実行すると共に、前記第２測定工程に対応した第２制御シーケンスに従って前記第２測定工程を実行し、少なくとも２測定分以上の測定試料を保持手段に保持し、前記保持手段から１測定分の前記測定試料を導入して前記第１測定工程を実行し、前記第１測定工程において前記付随成分が検出された場合、第１測定工程の終了後に、前記保持手段から１測定分の前記測定試料を新たに導入し、かつ、使用する制御シーケンスを前記第１制御シーケンスから前記第２制御シーケンスに切り替え、前記第２測定工程を実行する。

これによれば、一態様において、請求項７に記載したのと同様に、従来の測定モードを手動で切り替えて測定する場合のように新たな測定試料を用意する必要もなく、また測定時間を短縮することができる。

請求項１７記載の発明の液体クロマトグラフィ測定プログラムは、コンピュータに、液体クロマトグラフィ法により測定試料の主要成分を測定すると共に、前記測定試料の付随成分を検出する第１測定工程中に前記測定試料の付随成分が検出された場合、前記測定試料中に含まれる成分が全て溶出する前に、前記付随成分を同定するための、前記第１測定工程と異なる第２測定工程に切り替え、前記第１測定工程中に前記付随成分が検出されなかった場合、前記第１測定工程を継続する処理を実行させる。

これによれば、一態様において、請求項１に記載したのと同様に、従来のように、測定モードを切り替えて測定する場合と比較して測定時間を短縮することができる。

また、液体クロマトグラフィ測定プログラムの発明について、以下に付記を開示する。

（付記１）
コンピュータに、
液体クロマトグラフィ法により測定試料の主要成分を測定すると共に、前記測定試料の付随成分を検出する第１測定工程中に前記測定試料の付随成分が検出された場合、前記第１測定工程の途中又は終了後に、前記付随成分を同定するための、前記第１測定工程と異なる第２測定工程に切り替え、前記第１測定工程中に前記付随成分が検出されなかった場合、前記第１測定工程を継続する
処理を実行させるための液体クロマトグラフィ測定プログラム。

（付記２）
前記第２測定工程が複数パターン存在し、
前記第１測定工程中に前記付随成分が検出された場合、前記複数パターンから選択した前記第２測定工程に切り替える、
付記１記載の液体クロマトグラフィ測定プログラム。

（付記３）
前記主要成分は、ＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡ０の少なくとも一方を含み、前記付随成分は、変異Ｈｂ及びサラセミア症スクリーニング指標となるＨｂの少なくとも１種である、
付記１又は付記２記載の液体クロマトグラフィ測定プログラム。

（付記４）
前記第１測定工程に対応した第１制御シーケンスに従って前記第１測定工程を実行すると共に、前記第２測定工程に対応した第２制御シーケンスであって、前記第１制御シーケンスにおける所定時点より後のシーケンスが異なるシーケンスを含む第２制御シーケンスに従って前記第２測定工程を実行し、
前記第１測定工程中に前記付随成分が検出された場合、少なくとも前記所定時点より後の期間においては、前記第２制御シーケンスに従って前記第２測定工程を実行する、
付記１〜３の何れかに記載の液体クロマトグラフィ測定プログラム。

（付記５）
前記第２制御シーケンスは、前記第１制御シーケンスにおける前記所定時点以前のシーケンスと同一のシーケンスを含み、
前記付随成分が検出された場合、使用する制御シーケンスを前記第１制御シーケンスから前記第２制御シーケンスに切り替えることにより、前記第１測定工程の前記所定時点までの期間においては、前記第１測定工程と同一の測定工程を進行させ、前記所定時点より後の期間においては、前記第１測定工程と異なる測定工程を進行させる、
付記４記載の液体クロマトグラフィ測定プログラム。

（付記６）
前記所定時点が、所定の主要成分の所定量の溶出が完了する時点である、
付記４又は付記５記載の液体クロマトグラフィ測定プログラム。

（付記７）
前記第１測定工程に対応した第１制御シーケンスに従って前記第１測定工程を実行すると共に、前記第２測定工程に対応した第２制御シーケンスに従って前記第２測定工程を実行し、
少なくとも２測定分以上の測定試料を保持する保持手段から１測定分の前記測定試料を導入して前記第１測定工程を実行し、前記第１測定工程において前記付随成分が検出された場合、第１測定工程の終了後に、前記保持手段から１測定分の前記測定試料を新たに導入し、かつ、使用する制御シーケンスを前記第１制御シーケンスから前記第２制御シーケンスに切り替える、
付記１〜３の何れかに記載の液体クロマトグラフィ測定プログラム。

本発明によれば、一態様において、測定モードを従来のように手動で切り替えることなく、測定工程のみ切り替え、また、測定途中又は測定終了後に、測定終了処理（エンドシーケンス）や測定開始処理（スタートシーケンス）を実行することなく連続的に、測定試料中の主要成分及び付随成分を測定することができる、という効果を有する。

ＨＰＬＣ装置の一例を示す全体斜視図である。 ＨＰＬＣ装置の概略構成図である。 ＨＰＬＣ装置の測光ユニットの構成を示す一部断面図である。 ＨＰＬＣ装置の制御系の構成図である。 第１実施形態に係る液体クロマトグラフィ測定プログラムのフローチャートである。 クロマトグラムの一例を示す線図である。 クロマトグラムの一例を示す線図である。 制御シーケンスの選択及び切り替えについて説明するための図である。 第２実施形態に係る液体クロマトグラフィ測定プログラムのフローチャートである。 クロマトグラムの一例を示す線図である。 ＨＰＬＣ装置の変形例を示す概略構成図である。

（第１実施形態）

以下、本発明の第１実施形態について説明する。

図１には、高速液体クロマトグラフィ（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）を利用したＨＰＬＣ装置Ｘの外観図を示した。

ＨＰＬＣ装置Ｘは、ラック１０に保持させた採血管１１をテーブル２０にセットして、全血中のグリコヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）濃度を自動で測定するように構成されたものである。このＨＰＬＣ装置Ｘは、複数の溶離液ボトル１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄ、１２Ｅ（図１では５個）、及び装置本体２を備えている。

各溶離液ボトル１２Ａ〜１２Ｅは、後述する分析カラム６０に供給すべき溶離液Ａ〜Ｅを各々保持したものであり、装置本体２におけるホルダ部２１に配置されている。各溶離液は、用途に応じて例えば組成、成分比、ｐＨ、浸透圧等が異なる。

装置本体２は、上述のテーブル２０及びホルダ部２１の他に、筐体３の内部に収容された、脱気ユニット４、試料調製ユニット５、分析ユニット６、及び測光ユニット７を有している（図２参照）。

テーブル２０は、所定部位にセットされたラック１０を移動させることにより、ラック１０に保持させた採血管１１を、後述する試料調製ユニット５におけるノズル５１により採取可能な位置に移動させるように構成されている。

筐体３には、操作パネル３０及び表示パネル３１が設けられている。操作パネル３０は、複数の操作ボタン３２が設けられたものであり、操作ボタン３２を操作することにより、各種の動作（分析動作や印字動作など）を行わせるための信号を生成させ、あるいは各種の設定（分析条件の設定や被験者のＩＤ入力など）を行うことができる。表示パネル３１は、分析結果やエラーである旨を表示するとともに、設定時における操作手順や操作状況などを表示するためのものである。

図２に示したように、脱気ユニット４は、分析ユニット６（分析カラム６０）に溶離液を供給する前に、溶離液から溶存気体を除去するためのものであり、配管８０Ａ、８０Ｂ、８０Ｃ、８０Ｄ、８０Ｅを介して溶離液ボトル１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄ、１２Ｅに連結され、配管８１Ａ、８１Ｂ、８１Ｃ、８１Ｄ、８１Ｅを介して分析ユニット６のマニホールド６１に連結されている。

試料調製ユニット５は、採血管１１から採取した血液から、分析カラム６０に導入する試料を調製するためのものである。この試料調製ユニット５は、ノズル５１、調製液タンク５２、及び希釈槽５３を有している。

ノズル５１は、採血管１１の血液試料１３をはじめとする各種の液体を採取するためのものであり、液体の吸引・吐出が可能であるとともに、上下方向及び水平方向に移動可能とされている。このノズル５１の動作は、後述する制御部１００によって制御される。

調製液タンク５２は、血液試料１３をもとに、分析カラム６０に導入するための導入用試料を調製するための調製液を保持したものである。この調製液タンク５２には、調製液として、赤血球の溶血させるための溶血剤を含む希釈液などが保持されている。希釈液としては、酸素飽和度の高いもの、例えば酸素飽和度が８５％以上のものを使用するのが好ましい。調製液タンク５２からの調製液の採取には、ノズル５１が使用される。

なお、調製液タンク５２には、希釈液として溶血剤を含むものが保持されているが、調製液タンク５２に溶血剤を含まない希釈液と溶血剤とを個別に保持させてもよい。

希釈槽５３は、血液試料１３中の赤血球の溶血及び血液試料１３の希釈を行って導入用試料を調製する場であるとともに、導入用試料を大気に接触させて導入用試料における酸素飽和度を高めるためのものである。この希釈槽５３は、後述する分析ユニット６におけるインジェクションバルブ６３に配管８３を介して接続されており、希釈槽５３において調製された導入用試料がインジェクションバルブ６３を介して分析カラム６０に導入できるように構成されている。また、希釈槽５３は、導入用試料を大気に接触させるために上部が開放されている。

分析ユニット６は、分析カラム６０の充填剤に対する生体成分の吸着・脱着をコントロールし、各種の生体成分を測光ユニット７に供するためのものであり、温調機構（図示省略）により温度コントロールされている。分析ユニット６における設定温度は、例えば４０℃程度とされる。分析カラム６０は、試料中のヘモグロビンを選択的に吸着させるための充填剤を保持させたものである。充填剤としては、例えばメタクリル酸−メタクリル酸エステル共重合体が使用される。

分析ユニット６は、分析カラム６０の他に、マニホールド６１、送液ポンプ６２、及びインジェクションバルブ６３を有している。

マニホールド６１は、複数の溶離液ボトル１２Ａ〜１２Ｅのうちの特定の溶離液ボトルから、インジェクションバルブ６３に選択的に溶離液を供給させるためのものである。このマニホールド６１は、配管８１Ａ〜８１Ｅを介して脱気ユニット４に接続され、配管８４を介してインジェクションバルブ６３に接続されている。

送液ポンプ６２は、溶離液をインジェクションバルブ６３に移動させるための動力を付与するためのものであり、配管８４の途中に設けられている。

インジェクションバルブ６３は、一定量の導入用試料を採取するとともに、その導入用試料を分析カラム６０に導入可能とするものであり、複数の導入ポート及び排出ポート（図示省略）を備えている。このインジェクションバルブ６３には、インジェクションループ６４が接続されている。このインジェクションループ６４は、一定量（例えば数μＬ）の液体を保持可能なものであり、インジェクションバルブ６３を適宜切り替えることにより、インジェクションループ６４が希釈槽５３と連通して希釈槽５３からインジェクションループ６４に導入用試料が供給される状態、インジェクションループ６４が配管８５を介して分析カラム６０と連通してインジェクションループ６４から導入用試料が分析カラム６０に導入される状態を選択することができる。このようなインジェクションバルブ６３としては、例えば六方バルブを使用することができる。

図３に示したように、測光ユニット７は、分析カラム６０からの脱着液に含まれるヘモグロビンを光学的に検出するためのものであり、測光セル７０、光源７１、ビームスプリッタ７２、測定用受光系７３、及び参照用受光系７４を有している。

測光セル７０は、測光エリアを規定するためのものである。この測光セル７０は、導入流路７０Ａ、測光流路７０Ｂ、及び排出流路７０Ｃを有しており、これらの流路７０Ａ、７０Ｂ、７０Ｃが一連に連通している。導入流路７０Ａは、分析カラム６０（図２参照）からの脱離液を測光流路７０Ｂに導入するためのものであり、分析カラム６０に配管８６を介して接続されている。測光流路７０Ｂは、測光対象となる脱離液を流通させ、かつ脱離液を測光するための場を提供するものであり、直線状に形成されている。この測光流路７０Ｂは、両端が開放しているとともに、両端部が透明カバー７５により塞がれている。排出流路７０Ｃは、測光流路７０Ｂの脱離液を排出するためのものであり、配管８７を介して廃液槽８８に接続されている（図２参照）。

光源７１は、測光流路７０Ｂを流通する脱離液に光を照射するためのものである。この光源７１は、光軸Ｌが測光流路７０Ｂの中心を通過するように、測光流路７０Ｂの端面７０Ｂａ（透明カバー７５）に対面した状態で配置されている。光源７１としては、オキシヘモグロビンの最大吸収波長とデオキシヘモグロビンの最大吸収波長との間の波長である４２０ｎｍ及び参照波長である５００ｎｍの光を含んだ波長範囲の光を出射可能なもの、例えばハロゲンランプが使用されている。もちろん、光源７１としては、ハロゲンランプ以外のもの、例えば１または複数のＬＥＤ素子を備えたものを使用することもできる。

ビームスプリッタ７２は、光源７１から出射された光のうち、測光流路７０Ｂを透過した光を分割して測定用受光系７３及び参照用受光系７４に入射させるためのものであり、光軸Ｌ上において、４５度傾斜した状態で配置されている。ビームスプリッタ７２としては、ハーフミラーなどの公知の種々のものを使用することができる。

測定用受光系７３は、ビームスプリッタ７２を透過した光のうち、４２０ｎｍの光を選択的に受光するものであり、光軸Ｌ上に配置されている。この測定用受光系７３は、４２０ｎｍの光を選択的に透過させる干渉フィルタ７３Ａと、干渉フィルタ７３Ａを透過した光を受光するための受光素子７３Ｂと、を備えている。受光素子７３Ｂとしては、フォトダイオードを使用することができる。

参照用受光系７４は、ビームスプリッタ７２において反射して光路が変えられた光のうち、参照波長である５００ｎｍの光を選択的に受光するものである。この測定用受光系７４は、５００ｎｍの光を選択的に透過させる干渉フィルタ７４Ａと、干渉フィルタ７４Ａを透過した光を受光するための受光素子７４Ｂと、を備えている。受光素子７４Ｂとしては、フォトダイオードを使用することができる。

図４には、ＨＰＬＣ装置Ｘの制御系のブロック図を示した。図４に示すように、ＨＰＬＣ装置Ｘは、制御部１００を備えている。制御部１００は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）１００Ａ、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）１００Ｂ、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）１００Ｃ、不揮発性メモリ１００Ｄ、及び入出力インターフェース（Ｉ／Ｏ）１００Ｅがバス１００Ｆを介して各々接続された構成となっている。

Ｉ／Ｏ１００Ｅには、脱気ユニット４、試料調製ユニット５、分析ユニット６、及び測光ユニット７が接続されている。

なお、後述する液体クロマトグラフィ測定プログラムは、本実施形態では一例として不揮発性メモリ１００Ｄに予め記憶される。ＣＰＵ１００Ａは、不揮発性メモリ１００Ｄに記憶された液体クロマトグラフィ測定プログラムを読み込んで実行する。また、ＣＤ−ＲＯＭ等の記録媒体に液体クロマトグラフィ測定プログラムを記録し、これをＣＤ−ＲＯＭドライブ等で読み込むことにより実行するようにしてもよい。

次に、本実施形態の作用について説明する。

図５には、制御部１００のＣＰＵ１００Ａで実行される液体クロマトグラフィ測定処理のフローチャートを示した。

まずオペレータは、血液試料１３が入った採血管１１をラック１０に保持させた状態で、ラック１０をテーブル２０の所定の部位にセットする。採血管１１の血液試料１３は、予め血漿層と血球層に分離させてもよい。血漿層と血球層の分離は、遠心分離機を用いて、あるいは血球成分を自然沈降させることにより行なうことができる。

血漿層と血球層との分離は、ＨＰＬＣ装置Ｘに遠心分離機を組み込んでＨＰＬＣ装置Ｘにおいて行なうようにしてもよく、また、テーブル２０に採血管１１をセットした状態で一定時間静置することにより行ってもよい。

オペレータが操作パネル３０を操作して測定開始を指示すると、ＣＰＵ１００Ａは、不揮発性メモリ１００Ｄに記憶された液体クロマトグラフィ測定プログラムを読み込んで実行する。

ステップＳ１０では、第１測定工程用の血液試料１３を導入する。具体的には、まずラック１０にセットされた採血管１１から、血液試料１３を採取する。すなわち、ノズル５１を動作させることによって採血管１１から血液試料１３を採取する。ノズル５１によって採取された血液試料１３は、ノズル５１を動作させることによって希釈槽５３に供給される。希釈槽５３にはさらに、調製液タンク５２から希釈液が供給され、ノズル５１を利用したピペッティング操作によって希釈槽５３内の液体を混合することによって導入用試料が調製される。なお、溶血剤を含まない希釈液と溶血剤とを併用する場合には、希釈槽５３に対して希釈液及び溶血液を同時的に供給して血液試料１３の希釈及び血液試料１３の血球の溶血を同時的に行なってもよいし、それらを、時間をおいて個別に供給し、血液試料１３の希釈及び血液試料１３の血球の溶血を別工程として行なってもよい。

希釈槽５３において調製された導入用試料は、希釈槽５３において大気と一定時間接触させた後、インジェクションループ６４に供給され、インジェクションループ６４において保持される。

導入用試料を一定時間大気と接触させた場合には、導入用試料の溶存酸素量が増加させられる。このようにして導入用試料の酸素飽和度を高めた場合には、インジェクションループ６４ひいては分析カラム６０に対して溶存酸素量の大きな導入用試料を供給することができる。すなわち、導入用試料に含まれるヘモグロビンにおいて、オキシヘモグロビンの割合が大きなものとすることができる。

ここで、導入用試料と大気との接触時間（大気開放時間）は、例えば１〜２分とされる。これは、大気開放時間が短すぎる場合には導入用試料に対して十分な量の酸素を溶存させることができない一方で、大気開放時間が長すぎる場合には導入用試料調製後からインジェクションループ６４へ導入用試料を導入するまでの時間が大きくなって測定時間が長くなってしまうからである。

また、希釈液として酸素飽和度の高いもの、例えば酸素飽和度が８５％以上のものを使用する場合には、必ずしも希釈後の導入用試料を大気開放する必要はない。すなわち、酸素飽和度の高い希釈液を用いる場合には、希釈槽５３として閉鎖されたものを用いる場合であっても一定時間（例えば１分以上）放置することにより、希釈後の導入用試料の酸素飽和度を高めることができ、ヘモグロビン中のオキシヘモグロビンの割合を大きなものとすることができる。

そして、インジェクションバルブ６３を切り替えてインジェクションループ６４に保持された試料を分析カラム６０に導入させる。分析カラム６０に試料が導入されると、充填剤にＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、変異Ｈｂ、及びサラセミア症スクリーニング指標となるＨｂが吸着される。

ステップＳ１２では、第１測定工程を実行する。第１測定工程は、液体クロマトグラフィ法により測定試料の主要成分を測定すると共に、測定試料の付随成分の有無を検出する工程である。主要成分は、例えばＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡ０の少なくとも一方を含み、付随成分は、例えば変異Ｈｂ及びサラセミア症スクリーニング指標となるＨｂである。変異Ｈｂは、例えばＨｂＥ、ＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＤ等であり、サラセミア症スクリーニング指標となるＨｂは、例えばＨｂＦ、ＨｂＡ２等であるが、これらに限られるものではない。

第１測定工程は、予め定めた第１制御シーケンスにより、インジェクションバルブ６３を適宜切り替えてインジェクションループ６４に保持された測定試料を分析カラム６０に供給すると共に、溶離液Ａ〜Ｅを順次分析カラム６０に供給することにより、主要成分を測定すると共に、測定試料の付随成分の有無を検出する工程である。

ここで、溶離液Ａは、例えば分析カラム６０の状態を整える、すなわち平衡化する作用を有すると共に、特定の付随成分（例えばＨｂＸ。Ｘは付随成分を表す任意の記号、以下同様）を分析カラム６０から溶出させるための溶離液である。

また、溶離液Ｂは、例えば分析カラム６０からＨｂＡ１ｃを溶出させるための溶離液である。

また、溶離液Ｃは、例えば分析カラム６０からＨｂＡ０を溶出させるための溶離液である。

また、溶離液Ｄは、例えば分析カラム６０内に残存した測定試料を押し流す、すなわち分析カラム６０を洗浄するための溶離液である。

第１制御シーケンスでは、インジェクションバルブ６３の切替操作を行うことにより、以下のシーケンスで各溶離液を分析カラム６０に供給する。

溶離液Ａ（ｔ１秒）→溶離液Ｂ（ｔ２秒）→溶離液Ｃ（ｔ３秒）→溶離液Ｄ→（ｔ４秒）

分析カラム６０に溶離液を供給する順番と、各溶離液を供給する時間（ｔ１〜ｔ４）は、測定試料の主要成分を測定することができると共に、測定試料の付随成分を同定はできなくとも、付随成分の有無又は成分量が設定した基準から外れるか否かを検出することができるように各々設定される。

上記のように第１制御シーケンスに従って、まず溶離液Ａを分析カラム６０にｔ１秒間（例えば１６秒）供給すると、充填材に特定の付随成分が吸着されていた場合には、この付随成分が脱着（溶出）される。

そして、次に溶離液Ｂを分析カラム６０にｔ２秒間（例えば２０秒）供給すると、充填材に吸着されたＨｂＡ１ｃが脱着される。

次に溶離液Ｃを分析カラム６０にｔ３秒間（例えば４５秒）供給すると、充填材に吸着されたＨｂＡ０が脱着される。

次に溶離液Ｄを分析カラム６０にｔ４秒間（例えば８秒）供給すると、分析カラム６０内に残存した測定試料が押し流され、分析カラム６０が洗浄される。

分析カラム６０から排出される各種ヘモグロビンを含む脱着液は、配管８６を介して測光ユニット７の測光セル７０に供給される。測光セル７０に対しては、導入流路７０Ａを介して脱着液が導入され、この脱着液は測光流路７０Ｂ及び排出流路７０Ｃを通過した後に、配管８７を介して廃液槽８８に導かれる。

測光ユニット７においては、脱着液が測光流路７０Ｂを通過する際に、光源７１によって脱着液に対して連続的に光が照射される。その一方で、測光流路７０Ｂを透過した光は、ビームスプリッタ７２において分割された後、測定用受光系７３及び参照用受光系７４において受光される。測定用受光系７３では、干渉フィルタ７３Ａを透過した４２０ｎｍの光が受光素子７３Ｂにおいて選択的に受光される。一方、参照用受光系７４では、干渉フィルタ７４Ａを透過した参照波長である５００ｎｍの光が受光素子７４Ｂにおいて選択的に受光される。受光素子７３Ａ，７４Ａでの受光結果（吸光度）は、制御部１００に出力され、制御部１００においてクロマトグラムが演算される。

クロマトグラムは、図６に示したように、測定を開始してからの経過時間と受光素子７３Ａ，７４Ａでの受光結果としての吸光度との関係を表すグラフである。このクロマトグラムのピークがどの位置に現れるかによって、どのヘモグロビンが検出されたかを知ることができると共に、吸光度の大きさによってヘモグロビンの濃度を知ることができる。

本実施形態では、例えば、測定試料に主要成分としてのＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡ０、及び特定の付随成分（例えばＨｂＸ）が含まれている場合において、第１制御シーケンスによって溶離液を切り替えて分析カラム６０に順次送液した場合に、図６に示すように、ｔａ、ｔｂ、ｔｃの各時点にピークが現れることが予め想定されているとする。この場合、演算されたクロマトグラムから、ｔａ秒の時点でピークが現れているか否かを判断することにより、付随成分が検出されたか否かを判断することができる。同様に、ｔｂの時点でピークが現れているか否かを判断することによりＨｂＡ１ｃが検出されたか否かを判断することができ、ｔｃの時点でピークが現れているか否かを判断することによりＨｂＡ０が検出されたか否かを判断することができる。例えば、図６に示すｔ１からｔ３の途中（ｔｆ付近）までの時点において、ｔａ、ｔｂ、ｔｃ、ｔｆ以外の時点でピークが現れた場合は、予め想定されていない付随成分が検出されたと判断することができる。また、各時点における吸光度の大きさから各ヘモグロビンの濃度を算出することができる。

ステップＳ１２では、演算されたクロマトグラフから各時点に溶出されたピークの吸光度から主要成分の濃度を求めると共に、予め想定された時点若しくは予め定めた想定された時点以外の時点に現れたピークの吸光度から付随成分の濃度を求める。求めた濃度は不揮発性メモリ１００Ｄに記憶する。

ステップＳ１４では、演算したクロマトグラムに基づいて、所望の付随成分が検出されたか否かを判断する。具体的には、演算されたクロマトグラムから、所定の時点までに吸光度が予め定めた閾値ＴＨ以上になったか否かを判断することにより、所定の時点までに付随成分が検出されたことを示すピークが現れているか否かを判断する。なお、閾値ＴＨは、所定の時点までにこの値以上の吸光度が検出されれば付随成分が検出されたと判断できる値に設定される。このように、所望の付随成分の成分量に相当する吸光度が閾値ＴＨ以上の場合は、所望の付随成分が検出されたものと判断され、閾値未満の場合は、所望の付随成分が検出されなかったものと判断される。従って、所望の付随成分の成分量に相当する吸光度が０より大きく且つ閾値ＴＨ未満の場合は、付随成分が存在する場合でも、付随成分が検出されなかったものと見なされる。すなわち、付随成分が検出されない場合とは、付随成分が全く存在しない場合だけでなく、付随成分が存在するが、付随成分が検出されなかったものと見なせる場合を含む。また、例えば、図６に示すｔ１からｔ３の途中（ｔｆ付近）までの時点）において、ｔａ、ｔｂ、ｔｃ、ｔｆ以外の時点でピークが現れた場合は、予め想定されていない付随成分が検出されたと判断することができる。また、所定の時点までに主要成分すべて（例えば、ＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡ０の両方）が予め定めた閾値未満であった場合も、広い意味で、付随成分が検出されたと判断する。例えば、図６のｔ１〜ｔ３の途中の時点（ｔｆ）において、ｔｂ、ｔｃ両方の時点のピークが閾値未満の場合は、ｔｆ以降に付随成分が検出されることから、付随成分が検出されたと判断する。

なお、ステップＳ１４では、所望の付随成分が検出されたか否かを判断する場合の具体例として、吸光度が予め定めた閾値ＴＨ以上になったか否かを判断する場合について説明したが、所望の付随成分が検出されたか否かを判断する際に用いるパラメータは吸光度に限られるものではない。例えば、クロマトグラムのピークの面積、所定の時間までに溶出された全ヘモグロビン成分のピーク面積に対する所定のピーク面積の比率等のパラメータを用いてもよい。すなわち、所望の付随成分が検出されたか否かを判断することができるパラメータであれば、吸光度に限定されるものではない。

また、吸光度、ピークの面積、及び所定の時間までに溶出された全ヘモグロビン成分のピーク面積に対する所定のピーク面積の比率のうち複数のパラメータを適宜組み合わせて、所望の付随成分が検出されたか否かを判断するようにしてもよい。例えば、測定原理上、どのような検体においても一定の閾値を設定して、付随成分の検出を評価できる場合や、また、例えば、検体濃度等の検体条件を一定に揃えた上で測定を実行する場合等は、上記の閾値を固定値として設定できる。一方で、検体濃度を調整する必要がなく、検体濃度等の検体条件を揃えずに測定を実行する場合、吸光度としては、検体濃度によって値が変動する可能性があるため、吸光度に関する閾値を固定値とすると、正確に付随成分を検出できない場合がある。そこで、このような場合には、上記各種パラメータを用いて、付随成分を検出する際の閾値を適宜調整、設定してもよい。こうすることで、測定の状況に応じて最適の閾値を設定することができ、付随成分の検出精度を高めることができる。

そして、付随成分が検出された場合はステップＳ１８へ移行し、付随成分が検出されなかった場合は、ステップＳ１６へ移行する。

ステップＳ１６では、主要成分（例えばＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡ０）を検出したか否かを判断し、検出した場合にはステップＳ２２へ移行して、第１測定工程を継続し、検出していない場合はステップ１８へ移行する。

ステップＳ１８では、第１測定工程とは異なる複数の測定工程から１つの測定工程を第２測定工程として選択する。測定工程は、検出したい主要成分の種類や溶出完了の程度によって選択される。

ステップＳ２０では、所定の時点で、第１測定工程から、選択された第２測定工程への切替が実行される。

第１測定工程とは異なる第２測定工程の第２制御シーケンスは、本実施形態では、途中までは第１測定工程の制御シーケンスと同様である。

例えば、まず溶離液Ａを分析カラム６０にｔ１秒間（例えば１６秒）供給する。次に溶離液Ｂを分析カラム６０にｔ２秒間（例えば２０秒）供給する。次に溶離液Ｃを分析カラム６０にｔ３秒間（例えば５０秒）供給する。

次に、溶離液Ｅを分析カラム６０にｔ３’秒間（例えば４０秒）供給する。

次に溶離液Ｄを分析カラム６０にｔ４秒間（例えば８秒）供給する。

このように、第１測定工程とは異なる測定工程の制御シーケンスは、溶離液Ａ、Ｂ、Ｃの順で分析カラム６０に供給する点は第１制御シーケンスと同様であるが、溶離液Ｃを供給する時間、及び、その後に溶離液Ｅを供給する点が異なっている。

そして、溶離液Ｂは、導入用試料からＨｂＡ１ｃを溶出させるための溶離液であり、溶離液Ｃは、導入用試料からＨｂＡ０を溶出させるための溶離液であることから、溶離液Ｃを分析カラム６０に供給中はＨｂＡ１ｃの溶出は終了しており、ＨｂＡ０は溶出途中か溶出がほぼ終了していると考えられる。

従って、ステップＳ１８では、例えば溶離液Ｃを分析カラム６０に３０秒供給した時点で主要Ｈｂの測定が終了し、かつ付随成分が検出された場合には、第１測定工程とは異なる複数の制御シーケンスの中から１つの制御シーケンスを第２制御シーケンスとして選択し、ステップＳ２０では、選択された第２制御シーケンスの途中から実行する。すなわち、第２制御シーケンスでは、溶離液Ｃはｔ３秒間（５０秒）供給することになっているので、溶離液Ｃを分析カラム６０に残り２０秒間供給してから、溶離液Ｅを分析カラム６０に供給する。

また、第２制御シーケンスでは、溶離液Ｅを分析カラム６０に供給することにより、測定対象の付随成分を同定することができる。例えば図７に示すように、溶離液Ｅを分析カラム６０にｔ３’秒間供給することにより、付随成分（図７では一例としてＨｂＳ、ＨｂＣ）を同定（測定）することができる。具体的には、ステップＳ１４と同様の処理により付随成分を同定できる。すなわち、図７に示すように、ｔｄ秒の時点における吸光度が予め定めた閾値ＴＨｓ以上であればＨｂＳが同定できたと判断でき、ｔｅ秒の時点における吸光度が予め定めた閾値ＴＨｃ以上であればＨｂＣが同定できたと判断できる。

一方、ステップＳ２２では、第１測定工程を継続する。すなわち、引き続き第１制御シーケンスに従って溶離液を分析カラム６０に供給する。そして、第１制御シーケンスが終了した場合にはステップＳ２４へ移行する。

ステップＳ２４では、ラック１０にセットされた全ての採血管１１について上記の測定が終了したか否かを判断し、全ての採血管１１について測定が終了した場合は本ルーチンを終了し、測定が終了していない採血管１１が存在する場合には、ステップＳ１０へ戻って上記と同様の測定を引き続き実行する。

このように、本実施形態では、第１測定工程の途中で付随成分を検出したか否かを判断し、付随成分が検出された場合には、第１測定工程から第１測定工程とは異なる測定工程を実行するので、オペレータが測定モードを切り替える操作をしたり、分析カラム６０や溶離液ボトルを交換したりする必要がなく、測定時間を短縮することができる。

なお、本実施形態では、第１測定工程は、主要成分及び付随成分を吸着するための充填剤が収容された分析カラムに測定試料を供給し、その後、前記付随成分（例えばＨｂＸ）を前記分析カラムから溶出させるための溶離液を前記分析カラムに供給し、その後、前記主要成分を前記分析カラムから溶出するための溶離液を前記分析カラムに供給する工程を含むが、本発明はこのような例に限定されない。すなわち、本発明は、前記第１の測定工程において、主要成分及び付随成分を吸着するための充填剤が収容された分析カラムに測定試料を供給し、その後、前記主要成分を前記分析カラムから溶出させるための溶離液を前記分析カラムに供給した後、前記付随成分を前記分析カラムから溶出するための溶離液を前記分析カラムに供給する工程を含んでもよいし、また、前記分析カラムに測定試料を供給した後、前記付随成分を前記分析カラムから溶出させるための溶離液を前記分析カラムに供給し、その後、前記主要成分を前記分析カラムから溶出するための溶離液を前記分析カラムに供給し、さらにその後、別の付随成分（ＨｂＥ、ＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＤの変異Ｈｂ等、サラセミア症のスクリーニング指標となるＨｂは、ＨｂＦ、ＨｂＡ２等）を前記分析カラムから溶出させるための溶離液を前記分析カラムに供給する工程を含んでもよい。

さらに、本実施形態では、第１測定工程とは異なる第２測定工程の第２制御シーケンスが、途中まで、すなわち、ＨｂＡ０の溶出後の時点（ｔｃとｔｆの中間時点）まで、第１制御シーケンスと共通の場合について説明した。このように、検出したい主要成分が所定量溶出される時点まで、第１制御シーケンスと第２制御シーケンスとで共通化することにより、付随成分の検出後に即、制御シーケンスを切り換えても、あたかも切替が行われなかったように、引続き所望の主要成分の溶出処理を進行させることができ、所望の主要成分の溶出完了後、第１制御シーケンスとは異なる第２制御シーケンスにより、第１測定工程とは異なる第２測定工程における溶出処理をスムーズに実行させることができる。すなわち、本実施形態の上記制御シーケンスによれば、付随成分の検出と制御シーケンスの切替をリアルタイムで行うことができ、かつ、ユーザが所望する主要成分の確実な溶出と付随成分の溶出を効率的に実現できる。

（第２実施形態）

以下、本発明の第２実施形態について説明する。

本実施形態に係るＨＰＬＣ装置Ｘは、制御部１００のＣＰＵ１００Ａが、付随成分の有無又は当該付随成分の成分量が設定した基準から外れることを検出した場合に、使用するシーケンスを選択する機能を有する。すなわち、不揮発性メモリ１００Ｄは、第１制御シーケンス及び第１制御シーケンスとは異なる複数の制御シーケンス（第２制御シーケンス）を実行するためのプログラムを記憶し、第１制御シーケンスとして１種類のシーケンス（α）と、第２制御シーケンスとして、３種類の第２制御シーケンス（β、γ、δ）を有する。図８に示すように、第２制御シーケンスβは、ＨｂＦの溶出が完了する時点ｔａ’までは第１制御シーケンスと共通であり、ＨｂＦの溶出が完了する時点ｔａ’後は、第１制御シーケンスと異なるシーケンスにより異なる溶出処理を実行する。第２制御シーケンスγは、ＨｂＡ１ｃの溶出が完了する時点ｔｂ’（ｔｂとｔｃの中間）までは第１制御シーケンスと共通であり、ＨｂＡ１ｃの溶出が完了する時点ｔｂ’後は、第１制御シーケンスとは異なるシーケンスにより異なる溶出処理を実行する。第２制御シーケンスδは、ＨｂＡ０の溶出が所定量（一例として８０％程度）まで完了する時点ｔｃ’まで第１制御シーケンスと共通であり、ｔｃ’後は、第１制御シーケンスとは異なるシーケンスにより異なる溶出処理を実行する。なお、第２制御シーケンスを選択する機能以外の構成は、第１実施形態と同様である。

例えば、ユーザが、ＨｂＦは必ずデータ出力したい場合、その旨の入力をユーザがＣＰＵ１００Ａに対して行うことで、ＣＰＵ１００Ａは、第１測定工程の実施中に付随成分を検出した場合、ｔａ’まで第１制御シーケンスと共通する第２制御シーケンスβを選択して、当該第２制御シーケンスβに切り替える。同様に、例えば、ユーザが、ＨｂＡ１ｃは必ずデータ出力したい場合、その旨の入力をユーザがＣＰＵ１００Ａに対して行うことで、ＣＰＵ１００Ａは、第１測定工程の実行中に付随成分を検出した場合、第２制御シーケンスとしてｔｂ’まで第１制御シーケンスと共通する第２制御シーケンスγを選択して、当該第２制御シーケンスγに切り替える。また、例えば、ユーザが、ＨｂＡ０の途中までデータ出力し、その後は詳細に検討したい場合、その旨の入力をユーザがＣＰＵ１００Ａに対して行うことで、ＣＰＵ１００Ａは、第１測定工程の実行中に付随成分を検出した場合、ｔｃ’まで第１制御シーケンスと共通する第２制御シーケンスδを選択して、当該第２制御シーケンスδに切り替える。

このように、本実施形態によれば、ユーザがデータ出力を希望する主要成分が所定量溶出される時点までのシーケンスを、第１制御シーケンスと第２制御シーケンスとで共通化することにより、付随成分の検出後に即、第２制御シーケンスに切り換えても、あたかも切替が行われなかったかのように、第２制御シーケンスへの切替後もスムーズに所望の主要成分を溶出でき、かつ、当該所望の主要成分溶出後は、第１制御シーケンスとは異なる第２制御シーケンスにより、付随成分の溶出を行うことができる。すなわち、本実施形態の上記制御シーケンスによれば、付随成分の検出と制御シーケンスの切替をリアルタイムで効率的に行うことができる。

（第３実施形態）

以下、本発明の第３実施形態について説明する。

本実施形態に係るＨＰＬＣ装置Ｘは、希釈槽５３とインジェクションバルブ６３とを接続する配管８３が、少なくとも２測定分以上の測定試料を保持することが可能な容量を有している。その他の構成は第１実施形態で説明したＨＰＬＣ装置Ｘと同一であるので説明は省略する。

次に、本実施形態の作用について説明する。

図９には、本実施形態に係る制御部１００のＣＰＵ１００Ａで実行される液体クロマトグラフィ測定処理のフローチャートを示した。なお、第１実施形態で説明した図５に示すフローチャートと異なる部分を中心に説明する。

ステップＳ１１０では、第１測定工程用の試料を導入する。まず、ラック１０にセットされた採血管１１から、血液試料１３を採取し、希釈槽５３内の液体と混合することによって試料が調製される。希釈槽５３において調製された導入用試料は、２測定分が配管８３に保持される。そして、配管８３に保持された２測定分の試料のうち、１測定分の試料がインジェクションループ６４に供給され、インジェクションループ６４において保持される。

そして、インジェクションバルブ６３を切り替えてインジェクションループ６４に保持された試料を分析カラム６０に導入させる。

ステップＳ１１２では、第１制御シーケンスに従って第１測定工程を実行する。

本実施形態では、第１制御シーケンスは、第１実施形態と異なり、溶離液Ｂ〜Ｄを順次分析カラム６０に供給する。

具体的には、第１制御シーケンスでは、インジェクションバルブ６３の切替操作を行った後、以下のシーケンスで各溶離液を分析カラム６０に供給する。

溶離液Ｂ（ｔ２秒）→溶離液Ｃ（ｔ３秒）→溶離液Ｄ→（ｔ４秒）

上記の順序で溶離液を分析カラム６０に供給し、測光ユニット７の受光素子７３Ａ，７４Ａでの受光結果（吸光度）に基づいてクロマトグラムを演算し、演算したクロマトグラムに基づいてＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡ０の濃度を求める。求めた濃度は不揮発性メモリ１００Ｄに記憶する。

ステップＳ１１２では、演算されたクロマトグラフの各時点におけるピークの吸光度から主要成分の濃度を求めると共に、想定された時点若しくは想定された時点以外の時点におけるピークの吸光度から付随成分の濃度を求める。求めた濃度は不揮発性メモリ１００Ｄに記憶する。

ステップＳ１１６では、演算したクロマトグラムに基づいて、付随成分が検出されたか否かを判断する。本実施形態では、図１０に示すように、第１測定工程を最後まで実行した場合には、ｔｆ秒の時点で付随成分（例えばＨｂＥ）を表すピークが出現する。このため、本実施形態では、ｔｆ秒の時点における吸光度が予め定めた閾値ＴＨｅ以上であるか否かを判断することにより、付随成分が検出されたか否かを判断することができる。

なお、ステップＳ１１６においても、ステップＳ１４と同様に、付随成分が検出されたか否かを判断する際に用いるパラメータは吸光度に限られるものではなく、クロマトグラムのピークの面積、所定の時間までに溶出された全ヘモグロビン成分のピーク面積に対する所定のピーク面積の比率等のパラメータを用いてもよい。また、吸光度、ピークの面積、及び所定の時間までに溶出された全ヘモグロビン成分のピーク面積に対する所定のピーク面積の比率のうち複数のパラメータを適宜組み合わせて、所望の付随成分が検出されたか否かを判断するようにしてもよい。これにより、測定の状況に応じて最適の閾値を設定することができ、付随成分の検出精度を高めることができる。

換言すれば、本実施形態では、第１測定工程を分析カラム内の試料を全て溶出させるｔ４まで実行するため、第１測定工程終了までに付随成分が検出できればよい。

そして、付随成分が検出された場合は第１測定工程の終了後、ステップＳ１１７へ移行し、付随成分が検出されなかった場合は、第１測定工程の終了後、ステップＳ１２３へ移行する。

ステップ１１７では、第１測定工程の実行を終了する。

ステップＳ１１８では、第２測定工程用の試料を導入する。すなわち、配管８３に保持されている第２測定工程用の試料をインジェクションループ６４に保持させた後、分析カラム６０に導入する。

ステップＳ１２０では、第１測定工程とは異なる複数の測定工程から１つの測定工程を第２測定工程として選択する。測定工程の選択は、検出された付随成分の種類などによって決定される。

ステップＳ１２２では、選択された第２測定工程を実行する。この第２測定工程は、第１実施形態で説明した図５のステップＳ２０の処理と同様である。すなわち、本実施形態に係る第２制御シーケンスは、第１実施形態に係る第２制御シーケンスと同一である。

一方、ステップ１２３では、第１測定工程の実行を終了する。そして、ステップＳ１２４では、配管８３に保持されていた第２の測定処理用の試料を廃棄する。すなわち、インジェクションループ６４、分析カラム６０、及び測光ユニット７を介して廃液槽８８に廃液させる。

ステップＳ１２６では、図５のステップＳ２４の処理と同様の処理を実行する。

このように、本実施形態では、２測定分の試料を配管８３に保持しておき、第１測定工程中において、測定試料すべてが溶出される時点までに付随成分を検出したか否かを判断し、付随成分が検出された場合には、第１測定工程とは異なる測定工程を実行する。一方、付随成分が検出されなかった場合は、第１測定工程とは異なる測定工程用の試料を廃棄して次の試料の測定を実行するので、オペレータが測定モードを切り替える操作をしたり、新たな測定試料を用意する必要もなく、また分析カラム６０や溶離液ボトルを交換したりする必要がなく、測定時間を短縮することができる。

なお、本発明は、上述した実施の形態には限定されず、種々に変更可である。例えば制御シーケンスは、前述した制御シーケンスに限られるものではない。また、例えば、血液中のヘモグロビン濃度を測定するためのＨＰＬＣ装置に限らず、血液以外の検体を用いる場合、ヘモグロビン濃度以外の成分を測定する場合、あるいはＨＰＬＣ装置以外の液体クロマトグラフィ装置についても適用することができる。

また、上記実施形態では、分析カラム６０が一つの構成のＨＰＬＣ装置Ｘについて説明したが、第１測定工程用及び第２測定工程用に各々分析カラムを設けた構成としてもよい。

例えば図１１に示すように、第１測定工程用に分析カラム６０Ａ、第２測定工程用に分析カラム６０Ｂを備えると共に、分析カラム６０Ａ及び分析カラム６０Ｂを切り替えるための切替部６５Ａ、６５Ｂを備えた構成とする。そして、ＣＰＵ１００Ａは、第１測定工程を実行する場合は、配管８５と分析カラム６０Ａが接続されるように切替部６５Ａを制御すると共に配管８６と分析カラム６０Ａが接続されるように切替部６５Ｂを制御し、第２測定工程を実行する場合は、配管８５と分析カラム６０Ｂが接続されるように切替部６５Ａを制御すると共に配管８６と分析カラム６０Ｂが接続されるように切替部６５Ｂを制御する。このように、第１測定工程用及び第２測定工程用に各々分析カラムを設けた構成とすることにより、効率的に測定することができる。

Ｘ ＨＰＬＣ装置
４ 脱気ユニット
５ 試料調製ユニット
６ 分析ユニット
７ 測光ユニット
１１ 採血管
１３ 血液試料
６０ 分析カラム
１００ 制御部

Claims (17)

1. 液体クロマトグラフィ法により測定試料の主要成分を測定すると共に、前記測定試料の付随成分を検出する第１測定工程を実行するための第１測定手段と、
   前記付随成分を同定するための、前記第１測定工程と異なる第２測定工程を実行するための第２測定手段と、
   前記第１測定工程と前記第２測定工程とを切り替える切替手段と、
   を備え、
   前記切替手段は、
   前記第１測定手段によって、前記第１測定工程中に前記付随成分が検出された場合、前記測定試料中に含まれる成分が全て溶出する前に、前記第２測定工程に切り替え、
   前記第１測定手段によって、前記第１測定工程中に前記付随成分が検出されなかった場合、前記第１測定工程を継続する、
   液体クロマトグラフィ測定装置。
2. 前記第２測定工程が複数パターン存在し、
   前記切替手段は、前記第１測定工程中に前記付随成分が検出された場合、前記複数パターンから選択した前記第２測定工程に切り替える、
   請求項１記載の液体クロマトグラフィ測定装置。
3. 前記主要成分は、ＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡ０の少なくとも一方を含み、前記付随成分は、変異Ｈｂ及びサラセミア症スクリーニング指標となるＨｂの少なくとも１種である、
   請求項１又は請求項２記載の液体クロマトグラフィ測定装置。
4. 前記第１測定工程に対応した第１制御シーケンスに従って前記第１測定工程を実行すると共に、前記第２測定工程に対応した第２制御シーケンスであって、前記第１制御シーケンスにおける所定時点より後のシーケンスが異なるシーケンスを含む第２制御シーケンスに従って前記第２測定工程を実行する制御手段を備え、
   前記制御手段は、前記第１測定手段によって、前記第１測定工程中に前記付随成分が検出された場合、少なくとも前記所定時点より後の期間においては、前記第２制御シーケンスに従って前記第２測定工程を実行する、
   請求項１〜３の何れか１項に記載の液体クロマトグラフィ測定装置。
5. 前記第２制御シーケンスは、前記第１制御シーケンスにおける前記所定時点以前のシーケンスと同一のシーケンスを含み、
   前記制御手段は、前記第１測定手段によって、前記付随成分が検出された場合、使用する制御シーケンスを前記第１制御シーケンスから前記第２制御シーケンスに切り替えることにより、前記第１測定工程の前記所定時点までの期間においては、前記第１測定工程と同一の測定工程を進行させ、前記所定時点より後の期間においては、前記第１測定工程と異なる測定工程を進行させる、
   請求項４記載の液体クロマトグラフィ測定装置。
6. 前記所定時点が、所定の主要成分の所定量の溶出が完了する時点である、
   請求項４又は請求項５記載の液体クロマトグラフィ測定装置。
7. 液体クロマトグラフィ法により測定試料の主要成分を測定すると共に、前記測定試料の付随成分を検出する第１測定工程を実行するための第１測定手段と、
   前記付随成分を同定するための、前記第１測定工程と異なる第２測定工程を実行するための第２測定手段と、
   前記第１測定工程と前記第２測定工程とを切り替える切替手段と、
   少なくとも２測定分以上の測定試料を保持する保持手段と、
   を備え、
   前記切替手段は、
   前記保持手段から１測定分の前記測定試料を導入して、前記第１測定工程に対応した第１制御シーケンスに従って前記第１測定工程を実行し、前記第１測定工程において前記付随成分が検出された場合、第１測定工程の終了後に、前記保持手段から１測定分の前記測定試料を新たに導入し、かつ、使用する制御シーケンスを前記第１制御シーケンスから第２制御シーケンスに切り替え、前記第２測定工程に対応した前記第２制御シーケンスに従って前記第２測定工程を実行する、
   液体クロマトグラフィ測定装置。
8. 前記第１測定手段及び前記第２測定手段が各々、溶離液を含み、前記第１測定工程及び前記第２測定工程が、前記溶離液の種類、前記溶離液の組合せ、及び前記溶離液の使用条件の少なくとも一つにおいて異なる、
   請求項１〜７の何れか１項に記載の液体クロマトグラフィ測定装置。
9. 前記第１測定手段及び前記第２測定手段が各々、カラムを含み、前記第１測定工程及び前記第２測定工程の各々において使用するカラムが異なる、
   請求項１〜８の何れか１項に記載の液体クロマトグラフィ測定装置。
10. 液体クロマトグラフィ法により測定試料の主要成分を測定すると共に、前記測定試料の付随成分を検出する第１測定工程中に前記測定試料の付随成分が検出された場合、前記測定試料中に含まれる成分が全て溶出する前に、前記付随成分を同定するための、前記第１測定工程と異なる第２測定工程に切り替え、前記第１測定工程中に前記付随成分が検出されなかった場合、前記第１測定工程を継続する、
    液体クロマトグラフィ測定方法。
11. 前記第２測定工程が複数パターン存在し、
    前記第１測定工程中に前記付随成分が検出された場合、前記複数パターンから選択した前記第２測定工程に切り替える、
    請求項１０記載の液体クロマトグラフィ測定方法。
12. 前記主要成分は、ＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡ０の少なくとも一方を含み、前記付随成分は、変異Ｈｂ及びサラセミア症スクリーニング指標となるＨｂの少なくとも１種である、
    請求項１０又は請求項１１記載の液体クロマトグラフィ測定方法。
13. 前記第１測定工程に対応した第１制御シーケンスに従って前記第１測定工程を実行すると共に、前記第２測定工程に対応した第２制御シーケンスであって、前記第１制御シーケンスにおける所定時点より後のシーケンスが異なるシーケンスを含む第２制御シーケンスに従って前記第２測定工程を実行し、
    前記第１測定工程中に前記付随成分が検出された場合、少なくとも前記所定時点より後の期間においては、前記第２制御シーケンスに従って前記第２測定工程を実行する、
    請求項１０〜１２の何れか１項に記載の液体クロマトグラフィ測定方法。
14. 前記所定時点は、前記測定試料中に含まれる成分の溶出が完了していない時点であり、
    前記第２制御シーケンスは、前記第１制御シーケンスにおける前記所定時点以前のシーケンスと同一のシーケンスを含み、
    前記付随成分が検出された場合、使用する制御シーケンスを前記第１制御シーケンスから前記第２制御シーケンスに切り替えることにより、前記第１測定工程の前記所定時点までの期間においては、前記第１測定工程と同一の測定工程を進行させ、前記所定時点より後の期間においては、前記第１測定工程と異なる測定工程を進行させる、
    請求項１３記載の液体クロマトグラフィ測定方法。
15. 前記所定時点が、所定の主要成分の所定量の溶出が完了する時点である、
    請求項１３又は請求項１４記載の液体クロマトグラフィ測定方法。
16. 液体クロマトグラフィ法により測定試料の主要成分を測定すると共に、前記測定試料の付随成分を検出する第１測定工程中に前記測定試料の付随成分が検出された場合、前記付随成分を同定するための、前記第１測定工程と異なる第２測定工程に切り替え、前記第１測定工程中に前記付随成分が検出されなかった場合、前記第１測定工程を継続する液体クロマトグラフィ測定方法であって、
    前記第１測定工程に対応した第１制御シーケンスに従って前記第１測定工程を実行すると共に、前記第２測定工程に対応した第２制御シーケンスに従って前記第２測定工程を実行し、
    少なくとも２測定分以上の測定試料を保持手段に保持し、
    前記保持手段から１測定分の前記測定試料を導入して前記第１測定工程を実行し、前記第１測定工程において前記付随成分が検出された場合、第１測定工程の終了後に、前記保持手段から１測定分の前記測定試料を新たに導入し、かつ、使用する制御シーケンスを前記第１制御シーケンスから前記第２制御シーケンスに切り替え、前記第２測定工程を実行する、
    液体クロマトグラフィ測定方法。
17. コンピュータに、
    液体クロマトグラフィ法により測定試料の主要成分を測定すると共に、前記測定試料の付随成分を検出する第１測定工程中に前記測定試料の付随成分が検出された場合、前記測定試料中に含まれる成分が全て溶出する前に、前記付随成分を同定するための、前記第１測定工程と異なる第２測定工程に切り替え、前記第１測定工程中に前記付随成分が検出されなかった場合、前記第１測定工程を継続する、
    処理を実行させるための液体クロマトグラフィ測定プログラム。

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