JP6657003B2

JP6657003B2 - 糖化ヘモグロビン測定方法、糖化ヘモグロビン測定装置、及び糖化ヘモグロビン測定プログラム

Info

Publication number: JP6657003B2
Application number: JP2016084714A
Authority: JP
Inventors: 傑吉田; 高木　毅; 毅高木
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 2016-04-20
Filing date: 2016-04-20
Publication date: 2020-03-04
Anticipated expiration: 2036-04-20
Also published as: JP2017194349A

Description

本発明は、糖化ヘモグロビン測定方法、糖化ヘモグロビン測定装置、及び糖化ヘモグロビン測定プログラムに係り、特に、血液などの生体試料中の糖化ヘモグロビンを測定する糖化ヘモグロビン測定方法、糖化ヘモグロビン測定装置、及び糖化ヘモグロビン測定プログラムに関する。

特許文献１には、変異ヘモグロビンの１つであるヘモグロビンＥ（ＨｂＥ）のピークが同定された場合に、ＨｂＥのピークの面積を計算し、安定型糖化ヘモグロビン（ｓＡ１ｃ）のピークの面積又は全ヘモグロビンのピークの面積を補正する技術が開示されている。

特開２０１２−２１５４７０号公報

しかしながら、特許文献１記載の発明は、ＨｂＥを同定した場合の補正方法であり、ヘモグロビンＤ（ＨｂＤ）を同定した場合の補正については適用できない。また、特許文献１記載の発明は、同定した変異ヘモグロビンのピークの面積に応じて補正するものであるが、その変異ヘモグロビンのピークと例えばヘモグロビンＡ０のピークとが近すぎて両者が十分に分離されておらず干渉する場合は、測定対象であるｓＡ１ｃの値が正確でなかったり不安定になったりする可能性がある。また、変異ヘモグロビンとヘモグロビンＡ０とを十分に分離しようとすると、測定時間が長くなってしまう。

また、従来では、例えば、液体クロマトグラフィ法を用いたヘモグロビンの分離分析において、ＨｂＤが検出された場合は、これがｓＡ１ｃの値に影響を与えることが大いに想定されることから、ＨｂＤが検出された場合にはｓＡ１ｃの値を出力しない仕様とするのが通常であった。しかしながら、ＨｂＤが検出された場合にも、ｓＡ１ｃの値を出力できることが従来から要請されており、この場合、ＨｂＤの分離の度合いがｓＡ１ｃの値に与える影響を補正することになるが、このＨｂＤの分離の度合いが、同じ検体でも装置間で異なったり、同じ装置でも温度等の環境条件によって変動する場合があり、その結果、検出したＨｂＤの値を用いてｓＡ１ｃ値を精度良く補正することが困難であった。

本発明は、液体クロマトグラフィ法やキャピラリ電気泳動法、キャピラリ電気クロマトグラフィ法などの分離分析法を用いたヘモグロビンの分離分析において、変異ヘモグロビンがヘモグロビンＡ０と十分に分離されておらず干渉する場合であっても、ｓＡ１ｃの面積比率を精度良く測定することができる糖化ヘモグロビン測定方法、糖化ヘモグロビン測定装置、及び糖化ヘモグロビン測定プログラムの提供を目的とする。

本発明の糖化ヘモグロビン測定方法の一態様は、分離分析法により測定試料のクロマトグラムを取得する取得工程と、前記クロマトグラムに基づいて、ヘモグロビンＡの面積に、前記クロマトグラム上でヘモグロビンＡ０と干渉する変異ヘモグロビンの面積を加算した面積に対する安定型糖化ヘモグロビンｓＡ１ｃの面積比率を補正係数で補正することにより、前記ヘモグロビンＡの面積に対する前記安定型糖化ヘモグロビンｓＡ１ｃの面積比率を算出する算出工程と、を含む。

これによれば、一態様において、変異ヘモグロビンがヘモグロビンＡ０と十分に分離されておらず干渉する場合であっても、ｓＡ１ｃの面積比率を精度良く測定することができる。

また、本発明の一態様は、前記算出工程では、前記補正係数による補正前の前記安定型糖化ヘモグロビンｓＡ１ｃの面積比率に応じて、前記補正係数を切り替える。

これによれば、一態様において、ｓＡ１ｃの面積比率を更に精度良く測定することができる。

また、本発明の一態様は、前記算出工程では、ヘモグロビンＡ０の大きさ及び前記変異ヘモグロビンの大きさの少なくとも一方に応じて前記補正係数を変化させる。

また、本発明の一態様は、前記変異ヘモグロビンが、ヘモグロビンＤである。

これによれば、一態様において、ヘモグロビンＤがヘモグロビンＡ０と十分に分離されておらず干渉する場合であっても、ｓＡ１ｃの面積比率を精度良く測定することができる。

また、本発明の一態様は、前記算出工程が、前記ヘモグロビンＡの面積に前記変異ヘモグロビンの面積を加算した第１の加算面積に対する、安定型糖化ヘモグロビンｓＡ１ｃに前記変異ヘモグロビンが糖化した糖化変異ヘモグロビンの面積を加算した第２の加算面積の面積比率を補正係数で補正することにより、前記ヘモグロビンＡの面積に対する前記安定型糖化ヘモグロビンｓＡ１ｃの面積比率を算出する。

また、本発明の一態様は、前記糖化変異ヘモグロビンの面積は、前記変異ヘモグロビンの面積に、前記ヘモグロビンＡの面積に対する前記安定型糖化ヘモグロビンｓＡ１ｃの面積の面積比率を乗算し、当該乗算した値に係数を乗算することにより算出される。

これによれば、例えば、検体に依存する原因で生じるｓＡ１ｃの測定値誤差を低減できる。

また、本発明の一態様は、前記分離分析法が、液体クロマトグラフィ法、キャピラリ電気泳動法、及びキャピラリ電気クロマトグラフィ法の何れかである。

また、本発明の糖化ヘモグロビン測定装置の一態様は、分離分析法により測定試料のクロマトグラムを取得する取得手段と、前記クロマトグラムに基づいて、ヘモグロビンＡの面積に、前記クロマトグラム上でヘモグロビンＡ０と干渉する変異ヘモグロビンの面積を加算した面積に対する安定型糖化ヘモグロビンｓＡ１クロマトグラフィｃの面積の比率を補正係数で補正することにより、前記ヘモグロビンＡの面積に対する前記安定型糖化ヘモグロビンｓＡ１ｃの面積比率を算出する算出手段と、を含む。

本発明の一態様の糖化ヘモグロビン測定プログラムは、コンピュータに、分離分析法により測定試料のクロマトグラムを取得し、前記クロマトグラムに基づいて、ヘモグロビンＡの面積に、前記クロマトグラム上でヘモグロビンＡ０と干渉する変異ヘモグロビンの面積を加算した面積に対する安定型糖化ヘモグロビンｓＡ１ｃの面積の比率を補正係数で補正することにより、前記ヘモグロビンＡの面積に対する前記安定型糖化ヘモグロビンｓＡ１ｃの面積比率を算出する処理を実行させる。

本発明によれば、一態様において、変異ヘモグロビンがヘモグロビンＡ０と十分に分離されておらず干渉する場合であっても、ｓＡ１ｃの面積比率を精度良く測定することができる、という効果を有する。

ＨＰＬＣ装置の概略構成図である。ＨＰＬＣ装置の制御系の構成図である。糖化ヘモグロビン測定プログラムのフローチャートである。クロマトグラムの一例を示す線図である。クロマトグラムの一例を示す線図である。係数αと補正結果との関係を示す線図である。

以下、本発明の実施形態について説明する。以下の実施形態では、分離分析法の一例として液体クロマトグラフィ法を用いる例を示すが、本発明は、この方法に限定されず、分離分析により糖化ヘモグロビンに関するクロマトグラムを生成可能なあらゆる方法、例えば、キャピラリ電気泳動法やキャピラリ電気クロマトグラフィ法についても、同様に当てはまる。

（第１実施形態）

図１には、高速液体クロマトグラフィ（ＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）を利用したＨＰＬＣ装置Ｘの概略構成図を示した。

ＨＰＬＣ装置Ｘは、採血管１１をセットして、全血中のグリコヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）の濃度を自動で測定するように構成されたものである。このＨＰＬＣ装置Ｘは、複数の溶離液ボトル１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄ、１２Ｅ（図１では５個）等を含む装置本体２を備えている。

各溶離液ボトル１２Ａ〜１２Ｅは、後述する分析カラム６０に供給すべき溶離液Ａ〜Ｅを各々保持したものである。各溶離液は、用途に応じて例えば組成、成分比、ｐＨ、浸透圧等が異なる。

装置本体２は、試料調製ユニット５、分析ユニット６、及び測光ユニット７を有している。

採血管１１は、後述する試料調製ユニット５におけるノズル５１により採取可能な位置に移動するように構成されている。

試料調製ユニット５は、採血管１１から採取した血液から、分析カラム６０に導入する試料を調製するためのものである。この試料調製ユニット５は、ノズル５１、及び希釈槽５３を有している。

ノズル５１は、採血管１１の血液試料１３をはじめとする各種の液体を採取するためのものであり、液体の吸引・吐出が可能であるとともに、上下方向及び水平方向に移動可能とされている。このノズル５１の動作は、後述する制御部１００によって制御される。

分析ユニット６は、分析カラム６０の充填剤に対する生体成分の吸着・脱着をコントロールし、各種の生体成分を測光ユニット７に供するためのものである。分析ユニット６における設定温度は、例えば４０℃程度とされる。分析カラム６０は、試料中のヘモグロビンを選択的に吸着させるための充填剤を保持させたものである。充填剤としては、例えばメタクリル酸−メタクリル酸エステル共重合体が使用される。

分析ユニット６は、分析カラム６０の他に、マニホールド６１、送液ポンプ６２、及びインジェクションバルブ６３を有している。

マニホールド６１は、複数の溶離液ボトル１２Ａ〜１２Ｅのうちの特定の溶離液ボトルから、分析カラム６０に選択的に溶離液を供給させるためのものである。このマニホールド６１は、配管８０Ａ〜８０Ｅを介して溶離液ボトル１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄ、１２Ｅに各々接続され、配管８４を介してインジェクションバルブ６３に接続されている。

送液ポンプ６２は、溶離液をインジェクションバルブ６３に移動させるための動力を付与するためのものであり、配管８４の途中に設けられている。

インジェクションバルブ６３は、一定量の導入用試料を採取するとともに、その導入用試料を分析カラム６０に導入可能とするものであり、複数の導入ポート及び排出ポート（図示省略）を備えている。このインジェクションバルブ６３には、インジェクションループ６４が接続されている。このインジェクションループ６４は、一定量（例えば数μＬ）の液体を保持可能なものであり、インジェクションバルブ６３を適宜切り替えることにより、インジェクションループ６４が希釈槽５３と連通して希釈槽５３からインジェクションループ６４に導入用試料が供給される状態、インジェクションループ６４がプレフィルターＰＦ及び配管８５を介して分析カラム６０と連通してインジェクションループ６４から導入用試料が分析カラム６０に導入される状態を選択することができる。このようなインジェクションバルブ６３としては、例えば六方バルブを使用することができる。なお、プレフィルターＰＦは、試料や溶離液を濾過するためのフィルターである。

測光ユニット７は、分析カラム６０からの脱着液に含まれるヘモグロビンを光学的に検出するためのものであり、配管８７を介して、分析カラム６０からの脱着液を排出するための廃液槽８８に接続されている。

図２には、ＨＰＬＣ装置Ｘの制御系のブロック図を示した。図２に示すように、ＨＰＬＣ装置Ｘは、制御部１００を備えている。制御部１００は、ＣＰＵ（ＣｅｎｔｒａｌＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇＵｎｉｔ）１００Ａ、ＲＯＭ（ＲｅａｄＯｎｌｙＭｅｍｏｒｙ）１００Ｂ、ＲＡＭ（ＲａｎｄｏｍＡｃｃｅｓｓＭｅｍｏｒｙ）１００Ｃ、不揮発性メモリ１００Ｄ、及び入出力インターフェース（Ｉ／Ｏ）１００Ｅがバス１００Ｆを介して各々接続された構成となっている。

Ｉ／Ｏ１００Ｅには、試料調製ユニット５、分析ユニット６、及び測光ユニット７が接続されている。

なお、後述する糖化ヘモグロビン測定プログラムは、本実施形態では一例として不揮発性メモリ１００Ｄに予め記憶される。ＣＰＵ１００Ａは、不揮発性メモリ１００Ｄに記憶された糖化ヘモグロビン測定プログラムを読み込んで実行する。また、ＣＤ−ＲＯＭ等の記録媒体に糖化ヘモグロビン測定プログラムを記録し、これをＣＤ−ＲＯＭドライブ等で読み込むことにより実行するようにしてもよい。

次に、本実施形態の作用について説明する。

図３には、制御部１００のＣＰＵ１００Ａで実行される糖化ヘモグロビン測定処理のフローチャートを示した。

まずオペレータは、血液試料１３が入った採血管１１をラック１０に保持させた状態で、ラック１０をテーブル２０の所定の部位にセットする。採血管１１の血液試料１３は、予め血漿層と血球層に分離させてもよい。血漿層と血球層の分離は、遠心分離機を用いて、あるいは血球成分を自然沈降させることにより行なうことができる。

血漿層と血球層との分離は、ＨＰＬＣ装置Ｘに遠心分離機を組み込んでＨＰＬＣ装置Ｘにおいて行なうようにしてもよく、また、テーブル２０に採血管１１をセットした状態で一定時間静置することにより行ってもよい。

オペレータが操作パネル３０を操作して測定開始を指示すると、ＣＰＵ１００Ａは、不揮発性メモリ１００Ｄに記憶された糖化ヘモグロビン測定プログラムを読み込んで実行する。

ステップＳ１０では、血液試料１３を導入する。具体的には、まずラック１０にセットされた採血管１１から、血液試料１３を採取する。すなわち、ノズル５１を動作させることによって採血管１１から血液試料１３を採取する。ノズル５１によって採取された血液試料１３は、ノズル５１を動作させることによって希釈槽５３に供給される。希釈槽５３にはさらに、調製液タンク５２から希釈液が供給され、ノズル５１を利用したピペッティング操作によって希釈槽５３内の液体を混合することによって導入用試料が調製される。なお、溶血剤を含まない希釈液と溶血剤とを併用する場合には、希釈槽５３に対して希釈液及び溶血液を同時的に供給して血液試料１３の希釈及び血液試料１３の血球の溶血を同時的に行なってもよいし、それらを、時間をおいて個別に供給し、血液試料１３の希釈及び血液試料１３の血球の溶血を別工程として行なってもよい。

希釈槽５３において調製された導入用試料は、希釈槽５３において大気と一定時間接触させた後、インジェクションループ６４に供給され、インジェクションループ６４において保持される。

導入用試料を一定時間大気と接触させた場合には、導入用試料の溶存酸素量が増加させられる。このようにして導入用試料の酸素飽和度を高めた場合には、インジェクションループ６４ひいては分析カラム６０に対して溶存酸素量の大きな導入用試料を供給することができる。すなわち、導入用試料に含まれるヘモグロビンにおいて、オキシヘモグロビンの割合が大きなものとすることができる。

ここで、導入用試料と大気との接触時間（大気開放時間）は、例えば１〜２分とされる。これは、大気開放時間が短すぎる場合には導入用試料に対して十分な量の酸素を溶存させることができない一方で、大気開放時間が長すぎる場合には導入用試料調製後からインジェクションループ６４へ導入用試料を導入するまでの時間が大きくなって測定時間が長くなってしまうからである。

また、希釈液として酸素飽和度の高いもの、例えば酸素飽和度が８５％以上のものを使用する場合には、必ずしも希釈後の導入用試料を大気開放する必要はない。すなわち、酸素飽和度の高い希釈液を用いる場合には、希釈槽５３として閉鎖されたものを用いる場合であっても一定時間（例えば１分以上）放置することにより、希釈後の導入用試料の酸素飽和度を高めることができ、ヘモグロビン中のオキシヘモグロビンの割合を大きなものとすることができる。

そして、インジェクションバルブ６３を切り替えてインジェクションループ６４に保持された試料を分析カラム６０に導入させる。分析カラム６０に試料が導入されると、充填剤にｓＡ１ｃ、ＨｂＡ０、及び変異Ｈｂ等が吸着される。

ステップＳ１２では、取得工程を実行する。取得工程は、液体クロマトグラフィ法により測定試料の主要成分であるｓＡ１ｃ及びＨｂＡ０を測定して取得すると共に、変異ＨｂであるＨｂＤを測定して取得する。

この取得工程では、インジェクションバルブ６３を適宜切り替えてインジェクションループ６４に保持された測定試料を分析カラム６０に供給すると共に、溶離液Ａ〜Ｃを予め定めた制御シーケンスで順次分析カラム６０に供給することにより、主要成分及び変異Ｈｂを測定して取得する。

ここで、溶離液Ａは、分析カラム６０からｓＡ１ｃを溶出させるための溶離液である。また、溶離液Ａは、後述するＢ液又はＣ液を送液した後で、分析カラム６０内を平衡化するための溶離液でもある。

溶離液Ｂは、分析カラム６０内に残存したＨｂを全て溶出する、すなわち分析カラム６０を洗浄するための溶離液である。

溶離液Ｃは、ｓＡ１ｃの溶出以降に、分析カラム６０からＨｂを溶出させるための溶離液である。

本実施形態では、インジェクションバルブ６３の切替操作を行うことにより、以下の制御シーケンスで各溶離液を分析カラム６０に順次供給する。なお、制御シーケンスは、ｓＡ１ｃ、ＨｂＡ０、及びＨｂＤを測定することができれば以下の制御シーケンスに限られるものではない。

溶離液Ａ→溶離液Ｃ→溶離液Ａ→溶離液Ｂ→溶離液Ａ

分析カラム６０に溶離液を供給する順番と、各溶離液を供給する時間は、ｓＡ１ｃ、ＨｂＡ０、及びＨｂＤを測定することができるように各々設定される。

上記制御シーケンスに従って、まず溶離液Ａを分析カラム６０に予め定めた時間供給すると、充填剤に吸着されたｓＡ１ｃが脱着される。すなわち、分析カラム６０からｓＡ１ｃが溶出される。

次に溶離液Ｃを分析カラム６０に予め定めた時間供給すると、充填剤に吸着されたＨｂＡ０及びＨｂＤが脱着される。すなわち、分析カラム６０からＨｂＡ０及びＨｂＤが溶出される。

次に溶離液Ａを分析カラム６０に予め定めた時間供給すると、分析カラム６０内が平衡化される。

次に溶離液Ｂを分析カラム６０に予め定めた時間供給すると、分析カラム６０内に残存したＨｂが全て溶出され、分析カラム６０が洗浄される。

なお、制御シーケンスは、ｓＡ１ｃ、ＨｂＡ０、及びＨｂＤを測定することができるものであれば上記の制御シーケンスに限られるものではない。

分析カラム６０から排出される各種ヘモグロビンを含む脱着液は、配管８６を介して測光ユニット７の測光セル７０に供給される。測光セル７０に対しては、導入流路７０Ａを介して脱着液が導入され、この脱着液は測光流路７０Ｂ及び排出流路７０Ｃを通過した後に、配管８７を介して廃液槽８８に導かれる。

測光ユニット７においては、脱着液が測光流路７０Ｂを通過する際に、光源７１によって脱着液に対して連続的に光が照射される。その一方で、測光流路７０Ｂを透過した光は、ビームスプリッタ７２において分割された後、測定用受光系７３及び参照用受光系７４において受光される。測定用受光系７３では、干渉フィルタ７３Ａを透過した４２０ｎｍの光が受光素子７３Ｂにおいて選択的に受光される。一方、参照用受光系７４では、干渉フィルタ７４Ａを透過した参照波長である５００ｎｍの光が受光素子７４Ｂにおいて選択的に受光される。受光素子７３Ｂ，７４Ｂでの受光結果（吸光度）は、制御部１００に出力され、制御部１００においてクロマトグラムが演算・取得される。

クロマトグラムは、図４に示したように、測定を開始してからの経過時間と受光素子７３Ｂ，７４Ｂでの受光結果としての吸光度との関係を表すグラフである。このクロマトグラムのピークがどの位置に現れるかによって、どのヘモグロビンが検出されたかを知ることができると共に、吸光度の大きさによってヘモグロビンの濃度を知ることができる。

本実施形態では、例えば、測定試料にｓＡ１ｃ、ＨｂＡ０、及びＨｂＤが含まれている場合において、上記制御シーケンスによって溶離液を切り替えて分析カラム６０に順次送液した場合に、図４に示すように、測定開始時点をｔ０として、ｔａ、ｔｂ、ｔｃの各時点にｓＡ１ｃ、ＨｂＡ０、及びＨｂＤのピークが現れることが予め想定されているとする。この場合、演算されたクロマトグラムから、ｔａ付近でピークが現れているか否かを判断することにより、ｓＡ１ｃが検出されたか否かを判断することができる。同様に、ｔｂ付近でピークが現れているか否かを判断することによりＨｂＡ０が検出されたか否かを判断することができ、ｔｃ付近でピークが現れているか否かを判断することによりＨｂＤが検出されたか否かを判断することができる。

本実施形態で取得すべき測定結果は、下記（１）式で示すように、ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）の面積Ａに対するｓＡ１ｃの面積Ａ１の面積比率Ｒである。ここで、ＨｂＡは、ｓＡ１ｃ及びＨｂＡ０を含む。

Ｒ＝Ａ１／Ａ・・・（１）

上記（１）式の分母であるＨｂＡの面積Ａは、ＨｂＡ０の面積は含まれるが、ＨｂＤの面積は含まれない。ＨｂＤを含む血液試料では、図４に示すように、ＨｂＡ０のピークとＨｂＤのピークが近すぎ、ＨｂＡ０とＨｂＤとが十分に分離されておらず干渉する場合がある。この場合、干渉するＨｂＤの影響を除去してＨｂＡ０の面積を求める必要がある。しかしながら、分析カラム６０の状態や溶離液の状態等によって干渉の度合いが変化し、同じ試料を測定してもＨｂＡ０の面積が一定とならず、上記（１）式の面積比率Ｒが大きく変動してしまう場合がある。

そこで、本実施形態では、以下のような処理を実行することにより、ＨｂＡの面積Ａに対するｓＡ１ｃの面積Ａ１の面積比率Ｒを求める。

まず、ステップＳ１４で、ｓＡ１ｃの面積Ａ１を算出する。具体的には、ｓＡ１ｃが溶出し始める時点ｔ１から、ｓＡ１ｃの溶出が終了する時点ｔ２までの吸光度を積算した値をｓＡ１ｃの面積Ａ１とする。なお、時点ｔ１は、例えば時点ｔａよりも少し前の時点で吸光度が予め定めた閾値以上になった時点とすることができるが、時点ｔ１の特定の方法はこれに限られるものではない。同様に、時点ｔ２は、例えば時点ｔａよりも少し後の時点で吸光度が予め定めた閾値以下になった時点とすることができるが、時点ｔ２の特定の方法はこれに限られるものではない。

ステップＳ１６では、ＨｂＡの面積Ａ１を算出する。具体的には、吸光度の測定を開始した時点ｔ０から、ＨｂＡ０のピークが出現する時点ｔｂとＨｂＤのピークが出現する時点ｔｃの間で吸光度が最も小さくなる時点ｔ３までの吸光度を積算した値をＨｂＡの面積Ａとする。

ステップＳ１８では、ＨｂＤの面積を算出する。具体的には、ＨｂＡ０のピークが出現する時点ｔｂとＨｂＤのピークが出現する時点ｔｃの間で吸光度が最も小さくなる時点ｔ３から、ＨｂＤの溶出が終了する時点ｔ４までの吸光度を積算した値をＨｂＤの面積Ｄとする。なお、時点ｔ４は、例えば時点ｔｃよりも少し後の時点で吸光度が予め定めた閾値以下になった時点とすることができるが、時点ｔ４の特定の方法はこれに限られるものではない。

ステップＳ２０では、ステップＳ１４で算出したｓＡ１ｃの面積Ａ１、ステップＳ１６で算出したＨｂＡの面積Ａ、及びステップＳ１８で算出したＨｂＤの面積Ｄに基づいて、ＨｂＡの面積Ａに対するｓＡ１ｃの面積Ａ１の面積比率Ｒ１を次式により算出する。なお、算出された面積比率Ｒ１は不揮発性メモリ１００Ｄに記憶されたり、表示パネル３１に表示されたりする。

Ｒ１＝（Ａ１／（Ａ＋Ｄ））×ａ＋ｂ・・・（２）

ここで、ａ、ｂは予め定めた補正係数である。上記（２）式に示すように、面積比率Ｒ１は、ＨｂＡの面積ＡにＨｂＤの面積を加算した面積に対するｓＡ１ｃの面積比率を補正係数ａ、ｂで補正したものである。

補正係数ａ、ｂは、以下のようにして設定する。まず、予め定めた参照法を用いてＨｂＡの面積に対するｓＡ１ｃの面積比率を算出する参照装置を用意すると共に複数の試料を用意する。

なお、参照装置としては、変異Ｈｂを含む検体においてもＨｂＡの面積に対するｓＡ１ｃの面積比率を精度良く測定できる方法を用いた装置が用いられ、例えばアフィニティ法を用いた参照装置を用いることができる。なお、参照装置はアフィニティ法を用いた装置に限らず、他の方法を用いた装置でもよい。

そして、参照装置を用いて、用意した複数の試料について上記（１）式で表される面積比率Ｒを各々測定する。また、本実施形態に係るＨＰＬＣ装置Ｘを用いて、参照装置で測定したものと同じ複数の試料について上記（２）式で表される面積比率Ｒ１を各々測定する。

次に、参照装置で測定した複数の試料の面積比率Ｒの各々と、本実施形態に係るＨＰＬＣ装置Ｘで測定した複数の試料の面積比率Ｒ１の各々と、に基づいて、補正係数ａ、ｂを算出する。具体的には、本実施形態に係るＨＰＬＣ装置Ｘで測定した複数の試料の各々について、ＨｂＡの面積ＡにＨｂＤの面積を加算した面積に対するｓＡ１ｃの面積比率に対して補正係数ａ、ｂで補正した場合に、補正後の値の各々が、参照装置で測定した複数の試料の面積比率Ｒの各々と一致するような補正係数ａ、ｂを算出する。これにより、本実施形態に係るＨＰＬＣ装置Ｘにおいて、参照装置と同程度の精度でＨｂＡの面積に対するｓＡ１ｃの面積比率を測定することができる。

ステップＳ２２では、ラック１０にセットされた全ての採血管１１について上記の測定が終了したか否かを判断し、全ての採血管１１について測定が終了した場合は本ルーチンを終了し、測定が終了していない採血管１１が存在する場合には、ステップＳ１０へ戻って上記と同様の測定を引き続き実行する。

このように、本実施形態では、上記（２）式に示すように、ＨｂＡの面積ＡにＨｂＤの面積を加算した面積に対するｓＡ１ｃの面積比率を補正係数ａ、ｂで補正することにより、ＨｂＡの面積Ａに対するｓＡ１ｃの面積Ａ１の比率Ｒ１を算出する。これにより、ＨｂＤがＨｂＡ０と十分に分離されておらず干渉する場合であっても、ＨｂＡの面積に対するｓＡ１ｃの面積比率を精度良く測定することができる。

なお、本発明は、上述した実施の形態には限定されず、種々に変更可である。例えば、本実施形態では、上記（２）式に示すように、補正係数ａ、ｂが各々１種類の場合について説明したが、これに限らず、補正係数による補正前の面積比率に応じて補正係数を切り替えてもよい。例えば、下記（３）式で表される補正前の面積比率Ｒ２が予め定めた閾値ＴＨ以上の場合には補正係数ａ１、ｂ１を用いて上記（２）式により面積比率Ｒ１を算出し、面積比率Ｒ２が閾値ＴＨ未満の場合には、補正係数ａ１、ｂ１のうち少なくとも一方と異なる補正係数ａ２、ｂ２を用いて上記（２）式により面積比率Ｒ１を算出してもよい。なお、補正係数ａ、ｂを各々３種類以上設けてもよい。この場合、閾値を２種類以上設ければよい。

Ｒ２＝Ａ１／（Ａ＋Ｄ）・・・（３）

また、ＨｂＡ０の面積とＨｂＤの面積を加算した面積が同じであっても、ＨｂＡ０のピーク値とＨｂＤのピーク値とが異なる２種類のクロマトグラムの場合、本来であればＨｂＡの面積に対するｓＡ１ｃの面積比率が異なるにもかかわらず、上記（２）式では同じ面積比率となってしまう場合がある。そこで、例えばＨｂＡ０の大きさ及びＨｂＤの大きさに応じて補正係数ａ、ｂを変化させてもよい。具体的には、ＨｂＡ０及びＨｂＤの面積及びピーク値の少なくとも一方に応じて補正係数ａ、ｂを変化させてもよい。

また、本実施形態では、ＨｂＡ０と干渉する変異ヘモグロビンがＨｂＤの場合について説明したが、これに限らず、他の変異ヘモグロビン、例えばヘモグロビンＥとＨｂＡ０が干渉する場合にも本発明を適用可能であることは言うまでもない。

また、本実施形態では、上記（２）式で示したように、面積比率Ｒ１を、（Ａ１／（Ａ＋Ｄ））を変数とする一次式で算出する場合について説明したが、（Ａ１／（Ａ＋Ｄ））を変数とする二次式以上の多項式を用いて面積比率Ｒ１を算出してもよい。

また、例えば、血液中のヘモグロビン濃度を測定するためのＨＰＬＣ装置に限らず、血液以外の検体を用いる場合、ヘモグロビン濃度以外の成分を測定する場合、あるいはＨＰＬＣ装置以外の液体クロマトグラフィ装置についても本発明を適用することができる。

（第２実施形態）

次に、本発明の第２実施形態について説明する。

第２実施形態では、ＨｂＤが糖化した糖化ＨｂＤ（Ｄ１ｃ）の面積を考慮して、ＨｂＡの面積Ａに対するｓＡ１ｃの面積Ａ１の面積比率を算出する場合について説明する。なお、装置構成は第１実施形態と同一であるので、説明は省略する。

図５に示したように、ＨｂＡ０が糖化したものの代表であるｓＡ１ｃは、クロマトグラム上では、ＨｂＡ０に先行して出現するが、ＨｂＤについても同様に、ＨｂＤが糖化したＤ１ｃが出現していることが考えられ、ＨｂＡ０の中に含まれていると考えられる。

また、ＨｂＤの糖化度はＨｂＡ０の糖化度と同様と考えられるため、ＨｂＤの面積Ｄに対するＤ１ｃの面積Ｄ１の面積比率は、ＨｂＡ０の面積Ａ０に対するｓＡ１ｃの面積Ａ１の面積比率と同様であると考えられ、Ａ１／Ａ０＝Ｄ１／Ｄが凡そ成り立つと考えられる。

そこで、本実施形態では、次式によりＨｂＡの面積Ａに対するｓＡ１ｃの面積Ａ１の面積比率Ｒ３を算出する。

Ｒ３＝［（Ａ１＋Ｄ１）／（Ａ＋Ｄ）］×ａ＋ｂ・・・（４）

ここで、Ｄ１は次式により算出される。

Ｄ１＝Ｄ×（Ａ１／Ａ）×α ・・・（５）

ここで、αは係数であり、装置毎に適宜設定される。

図６には、係数αと相関係数との関係を示した。ここで、相関係数とは、参照装置で測定した複数の試料の面積比率Ｒ３と、本実施形態に係るＨＰＬＣ装置Ｘで測定した複数の試料の面積比率Ｒ３と、に基づいて算出した相関係数であり、両者の類似度を表す。

上記（４）、（５）式より、α＝１の場合は、相関係数が最も大きい。また、α＝１に近づくほど、装置間差や環境の差による分離度合い（ＨｂＡ０とＨｂＤとの重なり具合）のばらつきによる影響が生じやすい。

一方、α＝０の場合は、（４）式は（２）式と同一となる。また、α＝０に近づくほど、検体依存の影響が生じやすい。そのため、装置や環境条件等によっては、ｓＡ１ｃの値の算出において、α＝０．４〜０．６の値を設定することが好ましい場合がある。

ＸＨＰＬＣ装置
５試料調製ユニット
６分析ユニット
７測光ユニット
１１採血管
１３血液試料
６０分析カラム
１００制御部

Claims

分離分析法により測定試料のクロマトグラムを取得する取得工程と、
前記クロマトグラムに基づいて、ヘモグロビンＡの面積に、前記クロマトグラム上でヘモグロビンＡ０と干渉する変異ヘモグロビンの面積を加算した面積に対する安定型糖化ヘモグロビンｓＡ１ｃの面積比率を補正係数で補正することにより、前記ヘモグロビンＡの面積に対する前記安定型糖化ヘモグロビンｓＡ１ｃの面積比率を算出する算出工程と、
を含む糖化ヘモグロビン測定方法。
前記算出工程では、前記補正係数による補正前の前記安定型糖化ヘモグロビンｓＡ１ｃの面積比率に応じて、前記補正係数を切り替える
請求項１記載の糖化ヘモグロビン測定方法。
前記算出工程では、前記ヘモグロビンＡ０の大きさ及び前記変異ヘモグロビンの大きさの少なくとも一方に応じて前記補正係数を変化させる
請求項１又は請求項２記載の糖化ヘモグロビン測定方法。
前記変異ヘモグロビンが、ヘモグロビンＤである
請求項１〜３の何れか１項に記載の糖化ヘモグロビン測定方法。
前記算出工程が、前記ヘモグロビンＡの面積に前記変異ヘモグロビンの面積を加算した第１の加算面積に対する、安定型糖化ヘモグロビンｓＡ１ｃに前記変異ヘモグロビンが糖化した糖化変異ヘモグロビンの面積を加算した第２の加算面積の面積比率を補正係数で補正することにより、前記ヘモグロビンＡの面積に対する前記安定型糖化ヘモグロビンｓＡ１ｃの面積比率を算出する
請求項１〜４の何れか１項に記載の糖化ヘモグロビン測定方法。
前記糖化変異ヘモグロビンの面積は、前記変異ヘモグロビンの面積に、前記ヘモグロビンＡの面積に対する前記安定型糖化ヘモグロビンｓＡ１ｃの面積の面積比率を乗算し、当該乗算した値に係数を乗算することにより算出される
請求項５記載の糖化ヘモグロビン測定方法。
前記分離分析法が、液体クロマトグラフィ法、キャピラリ電気泳動法、及びキャピラリ電気クロマトグラフィ法の何れかである
請求項１〜６の何れか１項に記載の糖化ヘモグロビン測定方法。
液体クロマトグラフィ法により測定試料のクロマトグラムを取得する取得手段と、
前記クロマトグラムに基づいて、ヘモグロビンＡの面積に、前記クロマトグラム上でヘモグロビンＡ０と干渉する変異ヘモグロビンの面積を加算した面積に対する安定型糖化ヘモグロビンｓＡ１ｃの面積の比率を補正係数で補正することにより、前記ヘモグロビンＡの面積に対する前記安定型糖化ヘモグロビンｓＡ１ｃの面積比率を算出する算出手段と、
を含む糖化ヘモグロビン測定装置。
コンピュータに、
液体クロマトグラフィ法により測定試料のクロマトグラムを取得し、
前記クロマトグラムに基づいて、ヘモグロビンＡの面積に、前記クロマトグラム上でヘモグロビンＡ０と干渉する変異ヘモグロビンの面積を加算した面積に対する安定型糖化ヘモグロビンｓＡ１ｃの面積の比率を補正係数で補正することにより、前記ヘモグロビンＡの面積に対する前記安定型糖化ヘモグロビンｓＡ１ｃの面積比率を算出する
処理を実行させるための糖化ヘモグロビン測定プログラム。