JP2015114197A

JP2015114197A - 乾燥分離材を用いた分離方法及び測定方法

Info

Publication number: JP2015114197A
Application number: JP2013256153A
Authority: JP
Inventors: 原一植松; Genichi Uematsu
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2013-12-11
Filing date: 2013-12-11
Publication date: 2015-06-22

Abstract

【課題】小スケールにも適用でき、かつ定量性にも優れる分離方法を提供する。
【解決手段】試料中の成分Ｓ１と成分Ｓ２を分離する方法であって、
溶離液Ａにより成分Ｓ２を特異的に分離材に結合させる第１の工程と、
溶離液Ｂにより成分Ｓ２を分離材から解離させる第２の工程を有し、
前記第１の工程は、乾燥状態の分離材に試料及び溶離液Ａを接触させ、分離材を分散又は攪拌することによって行われ、その後、濾過操作により成分Ｓ２を含む濾過残渣を残して濾液中に成分Ｓ１を分画し、
前記第２の工程は、前記濾過残渣の分離材に溶離液Ｂを接触させ、分離材に結合していた成分Ｓ２を解離させ、次いで濾過操作により濾液中に成分Ｓ２を分画する。またこの方法により、成分Ｓ１とＳ２の量の総和に対するＳ１又はＳ２の量比を求める。
【選択図】図８

Description

本発明は乾燥分離材を用いた分離方法及び測定方法に関するものであり、特にヘモグロビンＡ１ｃの簡易測定に好適に使用できる方法に関する。

血液中のヘモグロビンは、α鎖Ｎ末端のアミノ酸のバリンのアミノ基とグルコースのアルデヒド基の間の非酵素的な反応によりグルコースと結合する。この結合の第一段階は、可逆的なシッフ塩基反応であるが、さらにアマドリ転移反応を経て不可逆的なケトアミンを形成する。このようにして生成するヘモグロビンとグルコースの結合物は、ヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃ又はＡ１ｃともいう）として知られている。ヘモグロビンの血液中での寿命は約３ヵ月であり、その間グルコースと結合して生成するＨｂＡ１ｃが徐々に蓄積するが、その一方で寿命が尽きたＨｂＡ１ｃは逐次分解されていく。すなわち、ある時点で血液中に存在しているＨｂＡ１ｃの濃度は、その時点からヘモグロビンの寿命のおよそ半分の１〜２ヵ月程遡った過去の血液中のグルコース濃度、すなわち血糖濃度を平均的に反映するものである。このような特徴を有するＨｂＡ１ｃは、一般的な糖尿病の指標である血糖濃度等のように一時的な変動が無く過去の血糖状態を正確に把握できる。

ＨｂＡ１ｃの測定方法としては、高速液体クロマトグラフィ法、免疫学的方法、酵素法などが知られている。

免疫学的方法は、ラテックスを用いた免疫反応を利用してＨｂＡ１ｃを測定する方法である。前処理が必要ではあるが、生化学自動分析装置で測定可能な試薬もあり、大量処理に向いている（特許文献１参照）。酵素法は、酵素により、ＨｂＡ１ｃの糖化ジペプジドを切り出し、それをオキシダーゼ、ペルオキシダーゼによる発色へ導き測定する方法である。生化学自動分析装置で測定可能であり、大量処理に向いている（特許文献２参照）。

高速液体クロマトグラフィ法はカラムによりＨｂＡ１ｃを分離してその面積比率から定量を行うものである。大量処理には向かないとされてきたが、近年分析時間が大幅に短縮され、現在のところ採用施設も多く実質的な標準的測定方法である。図１にその一般的な流路系を示す。高速液体クロマトグラフィ法は、分離モードによりイオン交換モード法とアフィニティモード法に大別される。イオン交換モード法はＨｂＡ１ｃの電荷の違いにより分離する方法（特許文献３、４参照）、アフィニティモード法は、ホウ酸がＨｂＡ１ｃのシスジオール結合にアフィニティ結合する性質を利用した方法（特許文献５参照）である。図２はイオン交換モード、および、アフィニティモードでの代表的なクロマトグラムである。

分離分析の分野で広く使用される「固相抽出法」は試料の前処理の用途で用いられることが多い手法である（図３参照）。一般的な固相抽出法は、シリンジ内に目的の検体の成分と相互作用する分離材を充填しておき、検体を負荷し、複数の溶離液にて溶出操作を行い処理するものである。溶出操作は、目的に応じて加圧または減圧で行われている（図５参照）。この固相抽出法は、試料の精製目的で行われることが多く、定量分析には用いられることは少ない。

これは、測定毎の、固相抽出によって得られた溶質の量が一定でも、溶液の量が異なってしまうと濾液の濃度が変化してしまうため、定量的に測定するには、溶出操作に使用する溶液量を常に一定にするか、濾液を全て分析に供するか、あるいは、濾液を一度乾固させ一定量の別の溶液を添加し分析に供する必要があるからである。

また、固相抽出に使用されるカラムは、分離性能を一定に保つため／分離性能を向上させるために、何らかの溶液で湿潤させておく必要もあり、その液量も考慮しないと定量分析の場合は誤差を生じてしまう。

固相抽出に使用されるカラムは、分離材の充填のし易さ、操作性、品質の均一性のため、微小スケールは扱いにくい。一般的には分離材量は１ｍＬ以上必要とすることが多く、小さなスケールでの操作には不向きであるという欠点がある。

特開２０１２−２５１７８９号公報特開２０１０−１８７６０４号公報特開２０１２-２１５４７０号公報特許第３５０５９０６号公報特開２００２−１３９４８１号公報

従来の固相抽出法では、分離床となる分離材をシリンジ内に充填して使用するものであり、分離を確実に行うため、それ相応の分離床の高さが必要である。

分離材の充填容量を極端に少なくすると、充填の均一性が乏しくなり、ゲル床に隙間やひび割れが生じやすくなる。このような不適切な固相抽出カラムで分離を行った場合、試料の一部が分離材粒子に全く接触することなくゲル床を通過してしまい、分離材との相互作用が全く無いまま溶出し、分離精度を落とす原因になる（図４参照）。そのため、従来の固相抽出法では、少なくとも１ｍＬ程度の分離材量が必要とされている。このように、従来の固相抽出法では、処理スケールを小さくすることは困難である。

また、固相抽出法で使用される分離材は保存液等の溶液で満たされていることから、抽出のために添加する溶媒の容量を正確に把握することはできず、そのため、溶出物の定量を行うには手間も掛かり、精度も劣るという難点がある。

本発明は、前記課題を解決するために成されたものであり、小スケールにも適用しうる分離方法であり、かつ定量性にも優れるため測定方法に適用でき、その結果、グリコヘモグロビン（Ａ１ｃ）の定量をも可能とすることを目的とするものである。

本発明者らは上記課題について鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は以下の通りである。

［１］試料中の成分Ｓ１と成分Ｓ２を分離する方法であって、
溶離液Ａにより成分Ｓ２を特異的に分離材に結合させる第１の工程と、
溶離液Ｂにより成分Ｓ２を分離材から解離させる第２の工程を有し、
前記第１の工程は、乾燥状態の分離材に試料及び溶離液Ａを接触させ、分離材を分散又は攪拌することによって行われ、その後、濾過操作により成分Ｓ２を含む濾過残渣を残して濾液中に成分Ｓ１を分画し、
前記第２の工程は、前記濾過残渣の分離材に溶離液Ｂを接触させ、分離材に結合していた成分Ｓ２を解離させ、次いで濾過操作により濾液中に成分Ｓ２を分画する、
ことを特徴とする方法。
［２］前記試料が血液であり、前記成分Ｓ２がヘモグロビンＡ１ｃである、［１］に記載の方法。
［３］前記分離材が、ポリマーを基材とし、ｍ−アミノフェニルボロン酸を固定化したアフィニティ分離材であり、その粒径が１０μｍから２００μｍであり、１回の分離に使用する分離材の量が乾燥状態で２０ｍｇ以下である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記溶離液Ａが、前記分離材のボロネートアニオンとヘモグロビンＡ１ｃの１，２−シスジオールとが結合できる塩基性緩衝液であり、
前記溶離液Ｂが、前記分離材のボロネートアニオンとヘモグロビンＡ１ｃの１，２−シスジオールとが解離できる糖類またはアミンを含有する緩衝液である、
［３］に記載の方法。
［５］上述の［１］〜［４］いずれかに記載の方法で試料中の成分Ｓ１と成分Ｓ２を分離し、成分Ｓ１の量と成分Ｓ２の量の総和に対する成分Ｓ１または成分Ｓ２の量の比を求めることを特徴とする、成分Ｓ１または成分Ｓ２の測定方法。
［６］成分Ｓ１または成分Ｓ２の量を吸光度により測定する、［５］に記載の測定方法。
以下に本発明を更に詳細に説明する。

初めに従来の固相抽出法での難点である、使用する分離材量が多いという点を解決する手段について説明する。

従来の固相抽出法では、（１）固相抽出カラムに試料を添加し、（２）溶離液Ａを添加し、成分Ｓ２を分離材に結合させ、（３）成分Ｓ１をカラムから溶出させ分画する。続いて、（４）溶離液Ｂを添加し、分離材に結合した成分Ｓ２を解離させ、（５）成分２をカラムから溶出させ分画する。固相抽出法では、分離は全てカラム内で行われる（図７参照）。

これに対し本発明では、乾燥状態の分離材に、試料及び溶離液Ａを接触させ、分離材を分散又は攪拌することにより、成分Ｓ２を分離材に結合させることが大きな特徴である。次いで濾過することにより、分離材に結合しなかった成分Ｓ１を濾液中に分画する工程を行うことも大きな特徴である。次いで、濾過残渣（分離材）に溶離液Ｂを接触させ、分離材に結合していた成分Ｓ２を解離させ、次いで濾過操作により濾液中に成分２を分画する（図８参照）。

ここで、乾燥分離材への試料と溶離液Ａの接触順序には特に限定はなく、同時に接触させてもよく、また順次接触させてもよい。また事前に試料と溶離液Ａを混合してから、乾燥分離材に接触させてもよい。

このように乾燥状態の分離材に、試料及び溶離液を接触させ、分離材を分散または撹拌することにより、従来の固相抽出法のように、分離材の充填状態による性能への影響が少なくなる。そのため、使用する分離材の絶対量を大幅に少なくすることが可能であり、これにより、処理全体のスケールも大幅に少なくすることが可能となる。

また、従来の固相抽出法では、洗浄液／保存液／溶離液Ａなどの溶液により湿潤状態の分離材を使用することから、添加した溶離液の容量を正確に把握することができなかったが、本発明の方法では、乾燥状態の分離材を使用することで、添加した溶離液の容量を正確に把握することが可能となる。これにより、分画された成分の定量分析を正確に行うことが可能となる。

本発明に用いる濾過方式は、分離材を含む溶液を分離材と溶液に効率よく分離できる方式であれば良く、特に濾過方式を限定するものではない。

濾過方式の第１の例として、シリンジに液体クロマトグラフィの前処理用に市販されているカートリッジフィルタ（ディスクタイプ）を装着した方式が挙げられる（図６ａ）。シリンジ内に分離材を含む溶液を入れ、ピストンで押し出し濾過する方法である。この方法は、専用の真空チャンバ等の器材を必要としないことから簡便に使用することができる。シリンジの容量は、検体の処理容量に応じて選択すれば良いが、処理量の１．５から２倍程度の容量が好適である。

濾過方式の第２の例として、一般的な固相抽出で用いられる底面部にフィルタが圧入されている、空のカートリッジを使用することができる（図６ｂ）。カートリッジ内に分離材を含む溶液を入れ、減圧により濾過する方法である。この方法は、専用の真空チャンバ等の器材を必要とするが、複数の検体を同時に処理できる利点がある。

濾過方式の第３の例として、フィルタを底面に内蔵した内側容器と気密性のある外容器からなる濾過方式でも同様な効果が得られる。一例として、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社から発売されている「ミニユニ（Ｍｉｎｉ−ＵｎｉＰｒｅｐ）」を使用することができる。

これは、外側容器（５４）に微粒子を含む溶液を入れ、フィルタ部（２８）を底面に内蔵した内側容器（５５）を前記の外側容器に挿入する。内側容器（５５）と外側容器（５４）は気密性が保たれているため、前記溶液はフィルタ部（２８）を通して内側の容器に濾過され、微粒子は外側容器（５４）と内側容器（５５）の隙間に残ることになる。つまり、内側の容器に捕集された溶液が「濾液」となる。

このような濾過方式を本発明に適用すると、使用する部材が少なく、操作も簡便化することが可能となる（図２４参照）。

本発明において、試料には特に限定はないが、例えば血液等をあげることができ、こととき成分Ｓ２としてＨｂＡ１ｃ、成分Ｓ１としてヘモグロビンＡ０（以下、ヘモグロビンＡ０を単にＡ０と記載する場合もある）をあげることができる。

本発明で使用する溶血液は、血球の細胞膜を破壊する組成であれば良く、組成、濃度、ｐＨ等を限定するものではない。

本発明で使用する分離材は、試料中の成分Ｓ２を溶離液Ａにより結合し、かつ溶離液Ｂにより解離するものであり、その結果、試料中の成分Ｓ１とＳ２を分離することができるものであれば特に限定はない。ここで結合とは、化学的結合でもよく、また吸着であってもよい。例えばＳ１がヘモグロビンＡ０、Ｓ２がヘモグロビンＡ１ｃの場合、分離材はポリマーを基材とし、ｍ−アミノフェニルボロン酸を固定化したものが好ましい。

また本発明で用いられる分離材は、粒子状が好ましく、その粒径には特に限定はないが、吸引濾過、加圧濾過が簡便な機構または用手法で容易に行えるよう、粒径が数１０μｍ〜数１００μｍが望ましく、１０μｍ〜２００μｍがさらに好ましい。

一般的にクロマト用分離材は湿潤状態又はスラリー状態で供給されるが、本発明に使用する分離材は、乾燥状態で用いることが必要である。そのため、例えば、事前に湿潤状態又はスラリー状態の分離材を吸引濾過し、純水を分離材量の３倍程度用いて洗浄した後、可能な限り純水を除去する。このような分離材を、シリカゲル等の乾燥剤を入れたデシケータ中で、水分を完全に除去した後、本発明の分離材として使用することができる。本発明では小スケールで分離を行うこともできるため、１回の分離での分離材の使用量が乾燥状態で２０ｍｇ以下とすることもできる。

本発明で使用する溶離液については、試料中の成分Ｓ２を溶離液Ａにより分離材に結合し、かつ溶離液Ｂにより分離材から解離するものであり、その結果、試料中の成分Ｓ１とＳ２を分離することができるものであれば特に限定はない。ここで結合とは、化学的結合でもよく、また吸着であってもよい。例えばＳ１がヘモグロビンＡ０、Ｓ２がヘモグロビンＡ１ｃの場合、分離材として上述のポリマーを基材としたｍ−アミノフェニルボロン酸を固定化したものを用いた場合は、溶離液Ａは分離材のボロネートアニオンとＡ１ｃの１，２−シスジオールが結合できる塩基性緩衝液であればよく、組成、濃度、ｐＨ等を限定するものではない。また溶離液Ｂは、分離材のボロネートアニオンとＡ１ｃの１，２−シスジオールが解離できる糖類またはアミンを含有する緩衝液であればよく、組成、濃度、ｐＨ等を限定するものではない。溶離液Ａの一例として、１００ｍｍｏｌ／Ｌグリシン＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸ナトリウム（ｐＨ９．２）、溶離液Ｂの一例として、１００ｍｍｏｌ／Ｌトリスヒドロキシメチルアミノメタン＋５０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸ナトリウム＋１００ｍｍｏｌ／ＬＤ−ソルビトール（ｐＨ８．０）をあげることができる。

本発明では、このような方法で試料中の成分Ｓ１と成分Ｓ２を分離し、成分Ｓ１の量と成分Ｓ２の量の総和に対する成分Ｓ１または成分Ｓ２の量の比を求めることができる。このとき、成分Ｓ１または成分Ｓ２の量の測定法については特に限定はないが、例えば吸光度により測定することができる。

以下に、前記の方式を血液中に含まれるＡ１ｃを分離し測定に適応するプロトコールを説明する。プロトコールは一例として、以下の概ね１１ステップから構成される（図１２参照）。
（Ｉ）検体溶血工程（検体容量：Ｖ_ｓ、溶血液容量：Ｖ_ｄ）
（ＩＩ）溶離液Ａ添加工程（容量：Ｖ_１１）
（ＩＩＩ）アフィニティ分離材との反応工程（分離材重量：Ｇ）
（ＩＶ）溶離液ＡによるＡ０相当成分溶出工程
（Ｖ）溶離液Ａによる洗浄工程（容量：Ｖ_１２）
（ＶＩ）空気圧送工程
（ＶＩＩ）Ａ０相当成分の吸光度測定工程（Ａ_ａ）
（ＶＩＩＩ）溶離液ＢによるＡ１ｃ相当成分溶出工程（容量：Ｖ_２１）
（ＩＸ）溶離液Ｂによる洗浄工程（容量：Ｖ_２２）
（Ｘ）空気圧送工程
（ＸＩ）Ａ１ｃ相当成分の吸光度測定工程（Ａ_ｂ）
事前に十分に乾燥させたアフィニティ分離材を、容器Ｂに秤量する（分離材重量：Ｇ）。

容器Ａに検体（容量：Ｖ_ｓ）と溶血液（容量：Ｖ_ｄ）を添加し、攪拌により検体を溶血させる（Ｉ）。前記容器Ａに溶離液Ａ（容量：Ｖ_１１）を添加し攪拌する（ＩＩ）。

分離材の入った容器Ｂに前記検体溶液を全量移送し、十分に攪拌し、Ａ１ｃ相当成分を分離材に結合させる（ＩＩＩ）。

フィルタを付けたシリンジに前記の分離材を含んだ溶液を全量移送し、加圧または減圧により濾過し、濾液を容器Ｃに捕集する（ＩＶ）。シリンジに溶離液Ａ（容量：Ｖ_１２）を添加し、加圧または減圧により濾過し、濾液を容器Ｃに捕集する（Ｖ）。空気圧送により溶液を完全に押し出す（ＶＩ）。以上の操作によりＡ０相当成分が濾液に捕集される。濾液の吸光度（Ａ_ａ）を測定する（ＶＩＩ）。

前記操作の残渣の分離材に溶離液Ｂ（容量：Ｖ_２１）を添加し、加圧または減圧により濾過し、濾液を容器Ｄに捕集する（ＶＩＩＩ）。シリンジに溶離液Ｂ（容量：Ｖ_２２）を添加し、加圧または減圧により濾過し、濾液を容器Ｄに捕集する（ＩＸ）。空気圧送により溶液を完全に押し出す（Ｘ）。

以上の操作によりＡ１ｃ相当成分が分離材から解離し濾液に捕集される。濾液の吸光度（Ａ_ｂ）を測定する（ＸＩ）。

Ａ０相当成分の吸光度（Ａ_ａ）とＡ１ｃ相当成分の吸光度（Ａ_ｂ）から、下記式１により
Ａ１ｃ相当成分の比率を求めＡ１ｃ比率（％）を算出する。
Ａ１ｃ比率（％）＝［Ａ_ｂ／（Ａ_ａ＋Ａ_ｂ）］×１００（式１）
工程（Ｉ）から（ＶＩ）で使用する溶液容量、即ちＡ０相当成分の溶出に供した溶液量（Ｖ_ｓ＋Ｖ_ｄ＋Ｖ_１１＋Ｖ_１２）と溶離液Ｂの容量、即ちＡ１ｃ相当成分の溶出に供した溶液量（Ｖ_２１＋Ｖ_２２）は式２のようにできるだけ同じにすることが望ましい。
（Ｖ_ｓ＋Ｖ_ｄ＋Ｖ_１１＋Ｖ_１２）＝（Ｖ_２１＋Ｖ_２２）（式２）
容量が異なる場合、Ａ０相当成分の吸光度（Ａ_ａ）とＡ１ｃ相当成分の吸光度（Ａ_ｂ）を添加した容量で補正する必要がある。

吸光度を測定する波長は、Ａ１ｃを特異的に検出できる波長であり、溶離液Ａおよび溶離液Ｂに対して吸収ができるだけ無い波長であれば良く、特に限定するものではない。一般的には４０５〜４２０ｎｍ程度が使用可能であるが、４１５ｎｍが好適である。

吸光度を測定する方法は、目的とする測定精度で決めれば良く特に限定するものではない。図２３は吸光度測定方法の例を幾つか示したものである。図２３ａは、シングルビームにより簡易測定を行う例である。測定精度を必要としない場合や、検体の濃度が比較的高く溶離液のバックグラウンドの影響が少ない場合などは、この方法で測定を行ってもよい。

図２３ｂはデュアルビーム分光光度計により測定を行う例である。Ａ０相当成分の吸光度（Ａ_ａ）、Ａ１ｃ相当成分の吸光度（Ａ_ｂ）の吸光度を測定する波長（一例、４１５ｎｍ）であっても、溶離液Ａ、溶離液Ｂの吸収が僅かに存在するため、この影響を補正することが可能な方法で、精度良く測定を行うことができる。Ａ０相当成分の吸光度（Ａ_ａ）を測定する際はリファレンスとして溶離液Ａ（吸光度：Ａ_ｒａ）を、Ａ１ｃ相当成分の吸光度（Ａ_ｂ）を測定する際はリファレンスとして溶離液Ｂ（吸光度：Ａ_ｒｂ）を使用することで、溶離液の吸光度を補正することができる。検体の濃度が低い場合などには適した方法である。

図２３ｃは２つの波長により測定を行う例である。Ａ０相当成分、Ａ１ｃ相当成分に対して吸収がある波長を第１波長とし、Ａ０相当成分、Ａ１ｃ相当成分に対して吸収がなく、溶離液Ａ、Ｂにのみ前記第１波長と同程度の吸収がある波長を第２波長とし、２つの波長で同時に測定を行い、第１波長の吸光度から第２波長の吸光度を差し引くことで、溶離液Ａ、溶離液Ｂの吸収の影響を補正することが可能な方法である。一例として、第１波長として４１５ｎｍ、第２波長として４５０ｎｍを使用することで、溶離液の吸収の影響を補正することができる。

図２３ｄは、フローインジェクション法による測定を行う例である。この方法は、溶液の流れに測定試料を導入し、吸光度測定する方法であり、効率よく吸光度測定を行うことが可能な方法である。

何れの例でも、試料を測定するセルには、専用のセルを使用しても良いが、本発明の操作で使用する容器Ｃ、容器Ｄに直接光を照射して測定することも可能であり、操作がより簡便に行うことができる。この場合、容器Ｃ、Ｄには可視光透過樹脂（ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン樹脂等）のものを使用する必要がある。

ここでは、測定の手順として、（Ｉ）検体溶血工程、（ＩＩ）溶離液Ａ添加工程、（ＩＩＩ）アフィニティ分離材との反応工程の順番で記載したが、（Ｉ）検体溶血工程、（ＩＩＩ）アフィニティ分離材との反応工程、（ＩＩ）溶離液Ａ添加工程、の順番に行っても同様な効果が得られ、特に順番を限定するものではない。また、溶離液Ａ，溶離液Ｂの添加工程を２回で記載したが、更に回数を増やしても同様な効果が得られ、特に回数を限定するものではない。逆に、精度は低下するものの、溶離液Ａによる洗浄工程（Ｖ）、溶離液Ｂによる洗浄工程（ＩＸ）を省略したり、（ＶＩ）（Ｘ）の空気圧送工程を省略したりして工程の短縮を行ってもよい。

図２５に前記の濾過方式を本発明に適用した場合の操作手順を示す。

事前に十分に乾燥させたアフィニティ分離材を、外側容器（５４）に秤量する（分離材重量：Ｇ）。
（Ｉ）容器Ａに検体（容量：Ｖ_ｓ）と溶血液（容量：Ｖ_ｄ）を分注し、攪拌により検体を溶血させる。
（ＩＩ）前記容器Ａに溶離液Ａ（容量：Ｖ_１１）を添加し攪拌する。
（ＩＩＩ）分離材の入った外側容器（５４）に前記検体溶液を全量移送し、十分に攪拌し、Ａ１ｃ相当成分を分離材に結合させる。
（ＩＶ）フィルタの付いた内側容器（５５）を挿入し、内側容器内に濾液を捕集する。
（Ｖ）一度、内側容器（５５）を取り外し、外側容器に溶離液Ａ（容量：Ｖ_１２）を添加する。
（ＶＩ）再び内側容器を挿入し濾液を捕集する。
（ＶＩＩ）内側容器に捕集されたＡ０相当成分の吸光度（Ａ_ａ）を測定する。
（ＶＩＩＩ）内側容器（５５）を取り外し、外側容器（５４）に溶離液Ｂ（容量：Ｖ_２１）を添加し、内側容器を挿入し、内側容器に濾液を捕集する。
（ＩＸ）一度、内側容器（５５）を取り外し、外側容器（５４）に溶離液Ｂ（容量：Ｖ_２２）を添加する。
（Ｘ）再び内側容器を挿入し濾液を捕集する。
（ＸＩ）内側容器に捕集されたＡ１ｃ相当成分の吸光度（Ａ_ｂ）を測定する。
Ａ０相当成分の吸光度（Ａ_ａ）とＡ１ｃ相当成分の吸光度（Ａ_ｂ）からＡ１ｃの存在比率を式１により算出する。

溶血液、溶離液Ａおよび溶離液Ｂの使用容量は、処理する試料の量によって最適化すればよく、限定されるものではない。一例として、試料２μＬとした場合、乾燥アフィニティ分離材２０ｍｇ、溶血液９８μＬ、初段の溶離液Ａ２．９ｍＬ（Ｖ_１１）、次段の溶離液Ａ１．０ｍＬ（Ｖ_１２）、初段の溶離液Ｂ２．０ｍＬ（Ｖ_２１）、次段の溶離液Ｂ２．０ｍＬ（Ｖ_２２）で処理を行うことができる。

本発明の分離方法は、小スケールにも適用しうるものであり、かつ定量性にも優れるため、試料中の成分の量比を求める方法にも適用できる。その結果、試料中のグリコヘモグロビン（Ａ１ｃ）等の量比を測定することも可能である。

一般的な高速液体クロマトグラフィによるグリコヘモグロビン分析計の流路系を示した模式図である。一般的な高速液体クロマトグラフィによる分析結果の一例を示したクロマトグラムである。図ａはイオン交換モード、図ｂはアフィニティモードによる結果である。従来の固相抽出カラムの構造を示した図である。図ａは全体構造、図ｂは分離材充填部の構造を詳細に示した図である。従来の固相抽出カラムの分離材充填部を模式的に示した図である。図ａは分離材量が多い場合、図ｂは分離材量が少ない場合である。従来の固相抽出法での抽出方法を示した図である。図ａは加圧法、図ｂは減圧法である。本発明の方法での構造を示した図である。図ａはカートリッジフィルタ型、図ｂは固相抽出型を詳細に示した図である。従来の固相抽出法でのＡ１ｃ測定法の手順を示した図である。本発明の方法でのＡ１ｃ測定法の手順を示した図である。実施例１での、吸光度測定に使用したフローインジェクションの流路系を示した図である。実施例１での、従来の固相抽出法でのＡ１ｃ測定法のプロトコールを示した図である。実施例１での、従来の固相抽出法でのＡ１ｃ測定法の実際の手順を示した図である。実施例１での、本発明の方法でのＡ１ｃ測定法のプロトコールを示した図である。実施例１での、本発明の方法でのＡ１ｃ測定法の実際の手順を示した図である。実施例１での、従来の固相抽出法でのキャリブレータの測定結果（検量線）である。横軸がＡ１ｃの吸光度比率、縦軸が補正後のＡ１ｃ比率を示している。実施例１での、従来の固相抽出法でのＡ１ｃ比率（％）の推移を示した図である。横軸が測定回数（ｎ＝２０）、縦軸がＡ１ｃ比率を示している。実施例１での、従来の固相抽出法でのＡ１ｃ比率（％）の再現性を示した図である。実施例１での、本発明の方法でのキャリブレータの測定結果（検量線）である。横軸がＡ１ｃの吸光度比率、縦軸が補正後のＡ１ｃ比率を示している。実施例１での、本発明の方法でのＡ１ｃ比率（％）の推移を示した図である。横軸が測定回数（ｎ＝２０）、縦軸がＡ１ｃ比率を示している。実施例１での、本発明の方法でのＡ１ｃ比率（％）の再現性を示した図である。実施例１での、本発明の方法でのフィルタ部の詳細を模式的に示した図である。実施例２での、従来の固相抽出法と従来のアフィニティクロマト法との相関性を示した図である。横軸が従来のアフィニティクロマト法での測定値、縦軸が従来の固相抽出法での測定値である。実施例２での、本発明の方法と従来のアフィニティクロマト法との相関を示した図である。横軸が従来のアフィニティクロマト法での測定値、縦軸が本方法での測定値である。吸光度測定法の一例を示した図である。図ａは簡易測定法、図ｂはデュアルビーム分光光度計による測定、図ｃは２波長測定法、図ｄはフローインジェクションによる測定方法を示している。本発明の別の形態である、濾過機能を有する容器を使用した例を示した図である。本発明の別の形態である、濾過機能を有する容器を使用した場合の操作の流れを示した図である。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は本発明を限定するものではない。

［実施例１］
本発明の効果を検証するため、従来の固相抽出法との比較を実施した。

まず、吸光度測定方法について説明する。本発明の方法および従来の固相抽出法のいずれの吸光度測定も、フローインジェクション法によりオンラインで実施した。図９はその装置構成および流路を示した図である。装置は主に送液ポンプ（１）、試料注入装置（１８）、紫外可視検出器（５）で構成される。一定流速で溶離液を送液しながら、試料注入装置により処理された試料を大量に注入し、検出器出力が平衡（台形状出力）になった値から吸光度を算出した。送液ポンプ（１）は東ソー製ＤＰ−８０２０を毎分０．３５ミリリッタの流速で、試料注入装置（１８）は東ソー製ＡＳ−８０２０（注入量８００マイクロリッタ）を、紫外可視検出器（５）は東ソー製ＵＶ−８０２０を４１５ｎｍの波長で使用した。

次に処理に使用した部材について説明する。検体はＡ１ｃが４．８％程度の全血、Ａ１ｃが７．３％程度の全血、およびキャリブレータ（基準値：５．５９％、１０．３３％東ソー（株）製）を使用した。

溶血液は、グリコヘモグロビン分析計ＨＬＣ−７２３ＧＨｂＶ（東ソー（株）製）専用溶血液をそのまま使用した。Ａ１ｃ分離の溶離液としては、下記の組成のものを調整し使用した。
溶離液Ａ：酢酸アンモニウム１５０ｍｍｏｌ／Ｌ、塩化マグネシウム５０ｎｍｏＬ／Ｌ、５％エタノール、ｐＨ８．７
溶離液Ｂ：トリスヒドロキシメチルアミノメタン５０ｎｍｏＬ／Ｌ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ５０ｍｍｏＬ／Ｌ、ソルビトール１００ｍｍｏＬ／Ｌ、５％エタノール、ｐＨ８．０なお、前記のフローインジェクション用の溶離液にも前記溶離液Ａを使用した。フィルタはクロマト用の前処理用に使用されるディスク型カートリッジフィルタを使用した（孔径：０．４５μｍ、材質：セルロースアセテート、外径：３ｍｍ、「マイショリディスク」東ソー（株）製）。シリンジは２．５ｍＬのディスポプラスティック注射器を使用し、加圧法で使用した。分離材は、メタクリレートポリマーを基材としｍ−アミノフェニルボロン酸を固定化した充てん剤であるＴＳＫｇｅｌＢｏｒｏｎａｔｅ−５ＰＷ（東ソー製）を用いた。従来の固相抽出法で使用する場合は、１ｇ／ｍＬの濃度に調整された前記分離材スラリー２００μＬ（分離材量２０ｍｇ相当）を、ディスクフィルタを装着した２．５ｍＬのプラスティックシリンジに分注し、固相抽出カラムを作製し測定に使用した。本発明の測定方法で使用する場合は、前記分離材スラリーを吸引濾過し、ほぼ完全に水分を除去した後、シリカゲル存在下のデシケータ中で完全に乾燥させ測定に使用した。

次に、比較のための、従来の固相抽出法について説明する。図１０は従来の固相抽出法での処理のプロトコール、図１１は実際の測定手順を示した図である。処理のプロトコールは次の通りである。容器Ａ（２０）に検体２μＬを分注し、溶血液９８μＬを添加し攪拌し溶血した後、全量を前記手順で作製した固相抽出カラム（３９）に負荷する。次に溶離液Ａを２．９ｍＬ添加し、ピストンで加圧し容器Ｃ（２２）に溶出液を捕集する（Ａ１ｃ相当成分を分離材に吸着）。

次に溶離液Ａを１ｍＬ添加し洗浄を行う。ピストンで加圧した後、最後に空気を圧送し完全に溶液を排出させる。容器Ｃ（２２）に捕集された成分を図９の装置にてＡ０相当成分の吸光度（Ａ_ａ）を測定する。続いて、溶離液Ｂを２ｍＬ添加し、ピストンで加圧し容器Ｄ（２３）に溶出液を捕集する。溶離液Ｂを２ｍＬ添加し、ピストンで加圧し洗浄を行う。最後に空気を圧送し完全に溶液を排出させる。容器Ｄ（２３）に捕集された成分を図９の装置にてＡ１ｃ相当成分の吸光度（Ａ_ｂ）を測定した。前記で得られた吸光度（Ａ_ａ、Ａ_ｂ）から前述の式１によりＡ１ｃ比率（％）を算出した。

次に、本発明の方法による測定法を説明する。図１２は処理のプロトコール、図１３は実際の測定手順を示した図である。処理のプロトコールは以下の通りである。事前に、容器Ｂ（２１）に前記の乾燥させた分離材を２０ｍｇ秤量しておく。別の容器Ａ（２０）に検体２μＬを分注し、溶血液９８μＬを添加し攪拌し溶血を行う。次に溶離液Ａを２．９ｍＬ添加し攪拌する。この試料混合液（容器Ａ）を、前記分離材を入れた容器Ｂ（２１）に全量添加し、１分以上攪拌し、Ａ１ｃ相当成分を分離材に吸着させる。２．５ｍＬのプラスティックシリンジに前記フィルタを装着し、前記分離材を含む混合液を入れ、ピストンで加圧し容器Ｃ（２２）に濾過する。次に溶離液Ａを１ｍＬ添加し洗浄を行う。ピストンで加圧した後、最後に空気を圧送し完全に溶液を排出させる。容器Ｃ（２２）に捕集された濾液成分を図９の装置にてＡ０相当成分の吸光度（Ａ_ａ）を測定する。続いて、溶離液Ｂを２ｍＬ添加し、ピストンで加圧し容器Ｄ（２３）に濾過する。溶離液Ｂを２ｍＬ添加し、ピストンで加圧し洗浄を行う。最後に空気を圧送し完全に溶液を排出させる。容器Ｄ（２３）に捕集された濾液成分を図９の装置にてＡ１ｃ相当成分の吸光度（Ａ_ｂ）を測定した。

ここでは、検体容量（Ｖ_ｓ）、溶血液容量（Ｖ_ｄ）、溶離液Ａの総容量（Ｖ_１１＋Ｖ_１２）及び溶離液Ｂの総容量（Ｖ_２１＋Ｖ_２２）との間に前述の式２の関係が成立していることから、前述の式１によりＡ１ｃ比率（％）を算出した。

従来の固相抽出法および本発明の方法とも、Ａ１ｃの値が異なる２つの検体で各２０回の測定を実施した。検量線は、高濃度に調整したキャリブレータ（通常４ｍＬに溶解するところを、１００μＬに溶解）を使用し、同様な手法でそれぞれ測定を行った。

図１４、１５、１６および表１、２は従来の固相抽出法で測定結果を、図１７、１８、１９および表３、４は本発明の方法で測定結果を示した図である。

キャリブレータ（基準値：５．５９％、１０．３３％）による検量線について説明する（図１４、図１７）。横軸が式１で計算したＡ１ｃ比率（％）、縦軸がキャリブレータの基準値、即ち補正後のＡ１ｃ比率（％）を示している。従来の固相抽出法、本発明の方法の何れでも、正の傾きの検量線が得られることから、何れの方法でもＡ１ｃ比率（％）の測定が可能であることがうかがえる。

次に実検体（Ａ１ｃ約４．８％、約７．３％の検体）の測定値の変動について説明する（図１５、図１８参照）。横軸が測定回数、縦軸がＡ１ｃ比率（％）である。凡例の白丸は式１で計算したＡ１ｃ比率（％）、凡例の黒丸は図１４又は図１７の検量線を用いて補正した後の補正後のＡ１ｃ比率（％）である。従来の固相抽出法（図１５）では、２０回の測定で、低値検体（Ａ１ｃ：４．８％）で２．３％、中値検体（Ａ１ｃ：７．３％）で３．６％の変動に対して、本発明の方法（図１８）では、低値検体（Ａ１ｃ：４．８％）で０．６％、中値検体（Ａ１ｃ：７．３％）で０．６％の変動に収まっており、本発明の精度の良さが分かる。最終結果である補正後のＡ１ｃ比率のＣｖ％（ｎ＝１０）で比較すると、より差異が明らかになる。従来の固相抽出法では、Ｃｖが低値検体で１２．５２％、１２．２３％、中値検体で９．７１％、１２．２１％であるのに対して（図１６、表１、２参照）、本発明の方法では、Ｃｖが低値検体で４．３６％、１．６８％、中値検体で１．７９％、２．６１％と大幅に改善されている（図１９、表３、４参照）。

何れの方法でも、分離材は２０ｍｇと非常に微量である。シリンジ先端にカートリッジフィルタを取り付けた場合、分離材はカートリッジフィルタとシリンジの接続部の空間に溜まる程度の量しかない。固相抽出法では、安定的に良好な充填状態を保つことができず、僅かな空間や亀裂が生じ、Ａ１ｃ相当成分の結合／解離が安定しない。一方、本発明の方法では、Ａ１ｃ成分の結合は別の容器内で攪拌して行われるため、分離材の充填状態の影響は受けない。また、Ａ０相当成分の回収操作は、単純な濾過操作となるため、この操作で前記のような空間や亀裂が生じても回収率への影響は少ない（図２０参照）。

このように、本発明は、簡易測定法でありながら、僅かな分離材量であっても精度良くＡ１ｃを定量することができる。

［実施例２］
本発明の方法の精度を確認するため、アフィニティモードの液体クロマトグラフィ法との相関性試験を実施した。検体は全血（２７検体）を使用した。比較のため、実施例１と同じように、従来の固相抽出法での測定も実施した。

アフィニティクロマト法での測定は下記の条件で実施した。分析カラムは内径１．５ｍｍ、長さ１０ｍｍのカラム管にＴＳＫｇｅｌＢｏｒａｔｅ−５ＰＷ（１０μｍ）を充填したものを、４５℃で温調されたカラムオーブン内に設置し使用した。溶離液Ａ、Ｂは前記実施例１で使用したものを使用した。溶離液は毎分２５０マイクロリッタで送液し、ステップグラジエントは、試料注入後、０分から０．６分まで溶離液Ａ、０．６分から１．４分まで溶離液Ｂが流れる条件で実施した。本方法の測定手順および従来の固相抽出法での測定手順は、実施例１と同じ条件で実施した。

図２１は従来の固相抽出法で相関性試験の結果を、図２２および表５は本発明の方法で相関性試験の結果を示した図である。横軸がアフィニティモードの液体クロマトグラフィ法での測定値、縦軸が固相抽出法または本発明の方法による測定値である。表５は各々の結果を集計した表である（表中の丸数字の２は前述の検量線による補正後のＡ１ｃ比率（％）である）。従来の固相抽出法（図２１）では、相関係数が０．４８０９（Ｒ^２：０．２３１３）であるのに対して、本発明の方法（図２２）では相関係数が０．９７２０（Ｒ^２：０．９４４７）と非常に良好な相関性が得られた。これは、実施例１で明らかなように、固相抽出法での再現性が悪いことから、相関性にも悪影響を及ぼしている。

この結果からも、本発明は、簡易測定法でありながら、従来の測定法との相関性を良好で、Ａ１ｃを定量することが可能であることが明らかとなった。

１：送液ポンプ
２：試料導入バルブ
３：分析カラム
４：カラム恒温槽
５：紫外可視検出器
６：ループ
７：試料（検体）
８，８ａ，８ｂ，８ｃ：溶離液
９：洗浄液
１０：シリンジ
１１：電磁弁
１２：希釈ポート
１３：ドレンポート
１４：希釈部
１５：抵抗管
１６：脱気装置
１７：ニードル
１８：試料注入装置
１９：容器
２０：容器Ａ
２１：容器Ｂ
２２：容器Ｃ
２３：容器Ｄ
２４：分注器
２５：シリンジ
２６：ピストン
２７：カートリッジフィルタ
２８：フィルタ部
２９：アフィニティ分離材
３０：溶離液Ａ
３１：溶離液Ｂ
３２：溶血液
３３．真空チャンバ
３４．真空ポンプ
３５．充填溶媒
３６．分離材
３７．溶離液
３８．亀裂／空洞
３９．固相抽出カラム
４０．光源
４１．ハーフミラー
４２．全反射ミラー
４３．フォトセンサ（サンプル側）
４４．フォトセンサ（リファレンス側）
４５．フォトセンサ
４６．セル（サンプル側）
４７．セル（リファレンス側）
４８．測定容器
４９．フローセル
５０．測定試料
５１．試料導入機構
５２．送液機構
５３．溶液
５４．外側容器
５５．内側容器
５６．ダイクロイックミラー

Claims

試料中の成分Ｓ１と成分Ｓ２を分離する方法であって、
溶離液Ａにより成分Ｓ２を特異的に分離材に結合させる第１の工程と、
溶離液Ｂにより成分Ｓ２を分離材から解離させる第２の工程を有し、
前記第１の工程は、乾燥状態の分離材に試料及び溶離液Ａを接触させ、分離材を分散又は攪拌することによって行われ、その後、濾過操作により成分Ｓ２を含む濾過残渣を残して濾液中に成分Ｓ１を分画し、
前記第２の工程は、前記濾過残渣の分離材に溶離液Ｂを接触させ、分離材に結合していた成分Ｓ２を解離させ、次いで濾過操作により濾液中に成分Ｓ２を分画する、
ことを特徴とする方法。
前記試料が血液であり、前記成分Ｓ２がヘモグロビンＡ１ｃである、請求項１に記載の方法。
前記分離材が、ポリマーを基材とし、ｍ−アミノフェニルボロン酸を固定化したアフィニティ分離材であり、その粒径が１０μｍから２００μｍであり、１回の分離に使用する分離材の量が乾燥状態で２０ｍｇ以下である、請求項１又は２に記載の方法。
前記溶離液Ａが、前記分離材のボロネートアニオンとヘモグロビンＡ１ｃの１，２−シスジオールとが結合できる塩基性緩衝液であり、
前記溶離液Ｂが、前記分離材のボロネートアニオンとヘモグロビンＡ１ｃの１，２−シスジオールとが解離できる糖類またはアミンを含有する緩衝液である、
請求項３に記載の方法。
請求項１〜４いずれかに記載の方法で試料中の成分Ｓ１と成分Ｓ２を分離し、成分Ｓ１の量と成分Ｓ２の量の総和に対する成分Ｓ１または成分Ｓ２の量の比を求めることを特徴とする、成分Ｓ１または成分Ｓ２の測定方法。
成分Ｓ１または成分Ｓ２の量を吸光度により測定する、請求項５に記載の測定方法。