JP2017187319A - 区間分割によるバックグラウンド補正方法 - Google Patents
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Abstract
Description
その一例として、2波長測定によるバックグラウンド補正が挙げられる。
目的の試料成分に対して吸収がある波長を第1波長とし、目的の試料成分に対して吸収がなく、溶離液変化にのみ前記第1波長と同程度の吸収がある波長を第2波長とし、2つの波長で同時に測定を行い、第1波長の吸光度から第2波長の吸光度を差し引くことで、溶離液変化によるベースライン変動を補正する方法である。第1波長と第2波長を1つの光学系で測定可能な検出器を使用することも可能であるが、第1波長測定用の検出器と第2波長測定用の検出器を直列に配して使用しても、ほぼ、同様の効果が得られる(図4参照)。しかしながら、実際の測定系では吸収スペクトルに僅かな差異があり、溶離液変動によるベースライン変動を完全には取り除くことはできない。
事前にバックグラウンドデータを測定しておく方法では余分な工数が生じたりして効率的な方法ではない。本発明では、事前にバックグラウンドデータを一度だけ測定しておき、実検体測定時に算出された係数により前記バックグラウンドデータを加工した後、前記実検体測定時のクロマトグラムから減算し、溶離液切り替えによる検出器のベースライン変動の影響を排除する方法を提供するものである。
・ステップ1:ルーチン分析と同じ測定条件にて、基準となるバックグラウンドデータを取得する。検体をカラムに注入することなく、ステップグラジエントを実行し、検出器の出力変動(時間、出力)を記憶させる。
・ステップ2:ルーチン分析と同じ測定条件にて、基準となる実検体を1度測定し、システムのボイドに溶出するピークを検出し、溶出時間を記憶させる。
以上、ステップ1、2は測定条件が大幅に変化する時にのみ実行する。
・ステップ3:ルーチン分析を実施し、システムのボイドに溶出するピークを検出し、溶出時間と全体のクロマトグラム(検出器出力変動)を記憶させる。
・ステップ4:ステップ2とステップ3で得られたボイドピークの溶出時間の比率を算出し、補正係数(αn)とする。
・ステップ5:ステップ4で得られた補正係数と、溶離液の切り替え時間により基準バックグラウンドデータ(ステップ1)を補正する。
・ステップ6:ステップ3で得られた実検体クロマトグラムから、ステップ5で得られた補正バックグラウンドを減算し、溶離液切り替えの影響を排除したクロマトグラムを作製する。
・ステップ7:ステップ4で得られた減算後のクロマトグラムで、ピーク検出、同定/定量処理を実施する。
αn=RR/RSn
n=検体番号
ボイドピークは、カラムと相互作用を起こさないで溶出することから、カラムを含む注入バルブから検出部までのシステムのボイド容量を流量で除算した時間に溶出する。つまり、ボイドピークの溶出時間は流量の逆数(1/F、F:流量)と原点を通る1次式で表すことができる。同様に、溶離液の切り替えによるベースライン変動の開始時間も、流量の逆数(1/F、F:流量)に対して1次式で表すことができる。この場合、切片は溶離液の切り替え時間になる(図7参照)。アフィニティクロマトグラフィによるHbA1cの分離の場合、非糖化成分とHbA1cの2つのピークに分離し定量される。従って、非糖化成分はゲルに吸着せずに溶出するため、前記ボイドピークとして指標とすることができる(図8参照)。
分離において、溶離液変化が3区間で行われる場合を例として、補正方法を以下に説明する。区間1で溶離液1、区間2で溶離液2、区間3で溶離液3を使用して分離する例である。基準バックグラウンドデータは一定の時間間隔(サンプリングピッチ)で、経過期間とその時点の検出器の出力値(吸光度)が取得され記録される。
区間1での時間データをTR11〜TR1m 、出力データAR11〜AR1m とする。データの組み合わせは、(TR11 、AR11)、(TR12 、AR12)、(TR13 、AR13)、・・・・・・、(TR1m 、AR1m)で称される。時間データに前記ステップ4で得られた補正係数(αn)を乗じることで、時間データを補正し、流量変動を反映することができる。
補正後のバックグラウンドは、(TR11×αn、AR11)、(TR12×αn、AR12)、(TR13×αn、AR13)、・・・・・・、(TR1m ×αn、AR1m)の組み合わせに変換される。
区間2での時間データをTR21〜TR2n 、出力データAR21〜AR2n とする。データの組み合わせは、(TR21 、AR21)、(TR22 、AR22)、(TR23 、AR23)、・・・・・・、(TR2n 、AR2n)で称される。溶離液2に切り替わる時間からの経過時間に前記ステップ4で得られた補正係数(αn)を乗じ、溶離液2に切り替わる時間を加算することで、流量の変動を補正することができる。補正後のバックグラウンドは、
((TR21−TR21)×αn+TR21、AR21)、((TR22−TR21)×αn+TR21 、AR22)、((TR23−TR21)×αn+TR21 、AR23)、・・・・・・、((TR2n−TR21)×αn+TR21 、AR2n)で称される。
区間3での時間データをTR31〜TR3n 、出力データAR31〜AR3n とする。データの組み合わせは、(TR31 、AR31)、(TR32 、AR32)、(TR33 、AR33)、・・・・・・、(TR3q 、AR3q)で称される。溶離液2に切り替わる時間からの経過時間に前記ステップ4で得られた補正係数(αn)を乗じ、溶離液2に切り替わる時間を加算することで、流量の変動を補正することができる。補正後のバックグラウンドは、
((TR31−TR31)×αn+TR31、AR31)、((TR32−TR31)×αn+TR31 、AR32)、((TR33−TR31)×αn+TR31 、AR23)、・・・・・・、((TR3q−TR31)×αn+TR31 、AR3q)で称される。
本発明の区間分割補正方法の効果を検証するため、2種類の溶離液によるアフィニティクロマト法でHbA1cの分離を以下のように行った。
基準クロマトグラム測定時の流量と検体測定時の流量が完全に同じである場合、検体測定時の補正係数(αn)は1.000を示すはずであるが、実際には0.934〜0.904の値で変動し、徐々に値が小さくなる傾向を示している。つまり、測定毎に僅かずつ流量が低下していっていることになる。
表2から検体クロマトグラムの補正係数(αn)は0.934と算出されている。
測定開始から溶離液Aが流れる時間である0分から0.6分が第1補正区間になる。
第1補正区間では基準バックグラウンドデータの時間の項に前記補正係数:0.934を乗じ補正を行う。次に溶離液Bが流れる時間である0.6分から1.05分が第2補正区間になる。第2補正区間では基準バックグラウンドデータの時間の項から切り替え時間である0.6分を減算した後、前記補正係数:0.934を乗じ、切り替え時間である0.6分を加算し補正を行う。次に、溶離液Aが流れる時間である1.05分から2.20分が第3補正区間になる。
・5列目(※7)は検体クロマトデータ(※6)から補正後の基準バックグラウンド(※5)を減算処理したデータ、つまり、溶離液切り替えによるバックグラウンドの影響を排除したクロマトグラムのデータである。
本発明の区間分割補正方法による定量性への効果を以下のように検証した。使用した装置、条件は実施例1を全て同じである。
比較のため、バックグラウンド補正を実施しないで、得られた検体クロマトグラムをそのまま定量計算を実施した。表3は基準クロマトでの非糖化成分ピーク(ボイドピーク)の溶出時間および、実際の検体測定での非糖化成分ピーク(ボイドピーク)の溶出時間(n=10)と、両者から算出された補正係数(αn)を示したものである。
処理を行うことで、非糖化成分ピークで14.6 mV・sec(0.3%)、A1cピークで32.1mV・sec(9.5%)減少していることが分かる。A1c%においても前者で7.06から6.42%に大幅に減少している。これは、溶媒の切り替えによりバックグラウンドが変動し、その分余分に面積として計算されてしまっているためである。特に、A1cピークは非糖化成分ピークに対して小さいため、バックグラウンドの影響が大きく、本発明の処理により大幅に値が低下している。つまり、正確に溶媒の切り替えによるバックグラウンドが変動を考慮しないと正確なA1c%の計算ができないことを意味しており、本発明の有効性が示された。
2.試料注入バルブ
3.分析カラム
4.カラム恒温槽
5.検出器
6.試料保持ループ
7.試料(検体)
8.溶離液
9.洗浄液
10.シリンジ
11.電磁弁
12.希釈ポート
13.ドレンポート
14.希釈部
15.脱気装置
16.ニードル
17.光源
18.フォトセンサ(サンプル側)
19.フォトセンサ(リファレンス側)
20.ダイクロイックミラー
21.フローセル
22.溶離液切り替えバルブ
23.制御/データ収集/データ解析装置
24.溶離液A送液ポンプ
25.溶離液B充填ポンプ
26.溶離液A
27.溶離液B
28.溶離液B保持ループ
Claims (2)
- 2種類以上の溶離液を切り替えて分離を行う液体クロマトグラフィにおける、検出器出力のバックグラウンドを補正する方法であって、
カラム交換時や溶離液のロット切り替え時など、測定条件が大幅に変化する時にバックグラウンドデータおよびボイドピークが確認できる基準クロマトグラムを1度測定し、ルーチン測定時は、前記基準クロマトグラムのボイドピーク溶出時間と、検体のボイドピーク溶出時間との比から算出される補正係数と溶離液の区間毎に異なる補正式を使用し、前記バックグラウンドデータを検体毎に補正処理し、前記検体のクロマトフラムから前記補正後のバックグラウンドデータを減算処理することにより、流量の僅かな変動による溶離液切り替えに起因するベースライン変動を排除し、正確な定量結果を得ることを特徴とする液体クロマトグラフィでのバックグラウンド補正方法。 - アフィニティモード液体クロマトグラフィによるHbA1cの分離定量における、請求項1のバックグラウンド補正方法。
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