JP2007085749A - 液体クロマトグラフ分析方法、及び液体クロマトグラフ装置 - Google Patents

Abstract

【課題】
高速分析法の場合、従来のＲＧ工程ではカラム状態を変化させるのには十分な溶離液条件が取れていない。つまり、ＲＧ工程に最終溶離液（第Ｎ緩衝液）と再生液を送液する方法では、カラムが第２試料注入工程以降の状態に至っていない。これは、第２試料注入工程以降のクロマトグラムでは、第１試料注入工程の最終溶離液（第Ｎ緩衝液）のみならず、第（Ｎ−１）緩衝液も無視できずに、リテンションタイムが影響を受けていることを示唆している。
【解決手段】
本発明は、第（Ｎ−１）緩衝液，第Ｎ緩衝液，再生液の３液を送液するＲＧ工程に関する。
本発明により、第１試料注入工程においても、第２試料注入工程以降の状態に等しくなり、第１番目の試料の分離成分のリテンションタイムと、第２番目の試料の分離成分のリテンションタイムとが同じになる。
【選択図】図４

Description

本発明は、液体クロマトグラフィーに関する。

アミノ酸分析計は大別して、蛋白質加水分解物アミノ酸約２０成分を対象とした標準分析と、生体液アミノ酸類縁物質約４０成分またはそれ以上の成分を対象としたすなわち、血清や尿，髄液などの生体液分析法を行うものに分類できる。生体液分析法は、臨床的に利用され、病気の診断や、治療に役立てることができる。

アミノ酸分析法の例としては、特開昭５３−６０２９１号公報，特開昭５９−10849号公報，特開平４−１９４５７０号公報，特開平９−８００３７号公報，特開２００２−
７１６６０号公報がある。また、報告文として、Journal of Chromatography, 224；315-321(1981)“Resolution of 52 ninhydrin-positive compounds with a High-speed
aminoacid analyzer”, Clinical Chemistry 43；8, 1421- 1428 (1997)“Amino Acid
determination in biological fluids by automated ion-exchange chromatography：
performance of Hitachi L-8500A”がある。

これらのアミノ酸分析法では、複数の緩衝液（溶離液）を混合し、混合した緩衝液に試料を添加し、分離カラムを通過させる。カラムに保持された所定成分が、所定の時間（保持時間）に分離することを利用し、クロマトグラムを得て、試料に含まれる成分を分析する。複数の試料を分析する場合は、この分析工程を試料注入毎に繰り返す。つまり、緩衝液と第１番目の試料を分離カラムに通過させて分析し、カラムに再生液を流してカラムを再生し、緩衝液と第２番目の試料を分離カラムに通過させて分析し、これを繰り返すことにより複数の試料を分析する。繰り返される分析工程から得られるクロマトグラムにおいて、試料に同じ成分が含まれる場合、検出された同一成分のピークは、通常、同じ保持時間に出現する。この理由は、一つ前の分析工程で送液された溶離液や再生液のカラム残存履歴が常に繰り返し再現され試料注入されるためである。

しかしながら、カラムに最初に試料を注入する第１試料注入では、それ以前に分析工程が存在しない為、第２試料注入工程以降のカラム状態が異なっている。つまり、溶離液や再生液のカラム残存履歴が第２試料注入以降とは異なる為、第１試料注入のクロマトグラムと、第２試料注入以降のクロマトグラムでは、試料に含まれる各成分の保持時間が異なっている。

この課題を解決するために、特開昭６２−１７７４４８号公報(特公平４−６４５８４)では、予備工程（ＲＧ工程）が取り上げられている。第１緩衝液から第Ｎ緩衝液、及びカラムを再生する再生液を用い、第１緩衝液から第Ｎ緩衝液の順に各液体をカラムに送液し、その後、再生液をカラムに送液する液体クロマトグラフ分析方法において、第１試料注入分析に先立つ予備工程（ＲＧ工程）では、最終溶離液（第Ｎ緩衝液）と再生液を送液している。これにより、第１注入工程が第２試料注入工程以降のカラム状態と等しくなる為、第１試料注入のクロマトグラムと、第２試料注入以降のクロマトグラムでも、保持時間が同じとなる。

特開昭５３−６０２９１号公報 特開昭５９−１０８４９号公報 特開平４−１９４５７０号公報 特開平９−８００３７号公報 特開２００２−７１６６０号公報 特開昭６２−１７７４４８号公報 Journal of Chromatography, 224；315-321(1981)"Resolution of52 ninhydrin-positive compounds with a High-speed amino acid analyzer" Clinical Chemistry 43；8, 1421- 1428 (1997)"Amino Acid determination in biological fluids by automated ion-exchange chromatography：performance of Hitachi L-8500A"

高速分析の場合、前述のＲＧ工程ではカラム状態を変化させるのには十分な溶離液条件が取れずに、第１注入工程が第２試料注入工程以降のカラム状態と同じにならない場合がある。

実際、図２に示す高速生体液分析法においては、従来のＲＧ工程（特開昭６２−177448号公報）、つまり最終溶離液（第Ｎ緩衝液）と再生液を送液する方法を用いた場合、第１番目の試料の分離成分のリテンションタイムと、第２番目の試料の分離成分のリテンションタイムとが異なることを本願発明者は見出した。

高速分析法の場合、従来のＲＧ工程ではカラム状態を変化させるのには十分な溶離液条件が取れていない。つまり、ＲＧ工程に最終溶離液（第Ｎ緩衝液）と再生液を送液する方法では、カラムが第２試料注入工程以降の状態に至っていない。これは、第２試料注入工程以降のクロマトグラムでは、第１試料注入工程の最終溶離液（第Ｎ緩衝液）のみならず、第（Ｎ−１）緩衝液も無視できずに、リテンションタイムが影響を受けていることを示唆している。

本発明の目的は、第１番目の試料の分離成分のリテンションタイムと、第２番目の試料の分離成分のリテンションタイムと実質同一とすることに関する。

本発明は、第（Ｎ−１）緩衝液，第Ｎ緩衝液，再生液の３液を送液するＲＧ工程に関する。

本発明により、第１試料注入工程においても、第２試料注入工程以降の状態に等しくなり、第１番目の試料の分離成分のリテンションタイムと、第２番目の試料の分離成分のリテンションタイムとが同じになる。これにより、第１試料注入工程以前に、１分析サイクルである第１緩衝液から順に第Ｎ緩衝液までと再生液を送液する長時間の工程を採用する必要がなく、３液のＲＧ工程で十分となる。３液のＲＧ工程を採用することにより短い立ち上がり時間で、すなわち第１注入工程の結果を速やかに手に入れることができるようになる。

以下、本発明の新規な特徴と効果について、図面を用いて説明する。

図１は、本実施例のアミノ酸分析計の装置構成及び流路説明図である。１〜４はそれぞれ第１〜第４緩衝液、５はカラム再生液である。この中から電磁弁シリーズ６によって何れかの緩衝液が選ばれ、緩衝液ポンプ７によってアンモニアフィルタカラム８，オートサンプラ９によって導入されたアミノ酸試料は分離カラム１０で分離される。ここで分離したアミノ酸は、ニンヒドリンポンプ１２によって送られてきたニンヒドリン試薬１１とミキサ１３で混合し、加熱された反応カラム１４で反応する。反応によって発色したアミノ酸（ルーエマン パープル）は検出器１５で連続的に検知され、データ処理装置１６によってクロマトグラム及びデータとして出力され、記録，保存される。

本実施例では高速生体液分析法を用いた。図２に高速生体液分析法の分析プログラムを、表１に高速生体液分析法で用いる緩衝液の組成を示す。

従来のＲＧ工程、つまり高速生体液分析法においては、特開昭６２−１７７４４８号公報（特公平４−６４５８４）に示された方法を用いても、分析操作条件変更後の第１番目の試料の分離成分のリテンションタイムと、第２番目の試料の分離成分のリテンションタイムとが異なるという現象が生じた。

図３はＲＧスタートの従来例、つまり、分析プログラムにおいて初めに第４緩衝液の混合比率が１００％となる段階から始まるＲＧプログラムを用いて分析を開始した際の、第１分析，第２分析、及び第３分析で得られた各クロマトグラムを比較したものである。このとき、第２分析と第３分析で得られたクロマトグラムにおいて、各成分の保持時間は一致しているが、第１分析と第２分析以降の溶出成分について保持時間を比較するとこれらは一致していない。

従来、ＲＧ工程には第４緩衝液と再生液の２液を送液する方法を採用していた。これは、塩濃度が希薄な再生液を送液するだけでは、第１試料注入工程のリテンションタイムが、第２試料注入工程以降のリテンションタイムに等しくならないため、塩濃度の高い第４緩衝液も送液する必要があるためである。しかしながら、当該高速生体液分析法においては、第４緩衝液を送液する従来方法でも不十分であることがわかった。

図４は、図２の分析プログラムにおいて第３緩衝液の混合比率１００％となる段階である３９分から始まる部分をＲＧプログラムとして用いて分析を開始した際の、第１分析，第２分析、及び第３分析で得られた各クロマトグラムを比較したものである。

図４より、第１分析で得られる各溶出成分の保持時間は、第２及び第３分析で得られる各溶出成分の保持時間と一致しており、第１分析から良好な再現性を得ることが可能である。

新規の３液のＲＧ工程では、第３緩衝液，４緩衝液と、再生液を送液する方法とすることで、第１注入工程から第２試料注入工程以降のカラム状態と同じにすることができた。すなわち、塩濃度，ｐＨ、あるいは有機溶媒などその他のモディファイヤ濃度を第２試料注入工程以降のカラム状態と同じにできたものと考えられる。

図３、及び図４に生じた成分の保持時間の違いは塩濃度のカラム履歴の差異に依るものである。第１分析から成分の保持時間を一致させるには、試料注入時でのカラム内の塩濃度の履歴が一致している必要があるが、図３の実施例では、第１分析での試料注入時でのカラム内の塩濃度が、第２分析以降における試料注入時でのカラム内の塩濃度まで達していない。一方図４の実施例では、第１分析の前に挿入した予備工程に、第４緩衝液に加えて第３緩衝液も送液することにより、第４緩衝液のみでは到達できなかった第１分析での試料注入時におけるカラム内の塩濃度を、第２分析以降の試料注入時におけるカラム内の塩濃度と同じレベルに一致させることができる。

この実施例は、３液のＲＧ工程を採用することにより、従来の２液のＲＧ工程に比較し、カラムの塩濃度，ｐＨ、あるいは有機溶媒などその他のモディファイヤ濃度と第２試料注入工程以降の状態と同じにできたものと考えられる。これは、一般化する表記を用いれば、第（Ｎ−１）緩衝液，第Ｎ緩衝液，再生液の順に、各液体をカラムに送液する方法ということができる。

流路説明図。 高速生体液分析法の分析プログラム。 従来のＲＧスタートを用いて連続分析を行ったときのクロマトグラム。 第３緩衝液から始まるＲＧスタートを用いて連続分析を行ったときのクロマトグラム。

符号の説明

１〜４…緩衝液、５…再生液、６…電磁弁シリーズ、７…緩衝液ポンプ、８…アンモニアフィルタカラム、９…オートサンプラ、１０…分離カラム、１１…ニンヒドリン試薬、１２…ニンヒドリンポンプ、１３…ミキサ、１４…反応カラム、１５…検出器、１６…データ処理装置。

Claims (8)

1. 第１緩衝液，第２緩衝液，第３緩衝液，第４緩衝液、及びカラムを再生する再生液を用い、
   試料を分析する分析工程において、第１緩衝液，第２緩衝液，第３緩衝液，第４緩衝液、及び再生液の順に、各液体をカラムに送液する液体クロマトグラフ分析方法であって、
   最初の分析工程に先立つ予備工程において、第３緩衝液，第４緩衝液、及び再生液の順に、各液体をカラムに送液することを特徴とする液体クロマトグラフ分析方法。
2. 第１緩衝液から第Ｎ緩衝液、及びカラムを再生する再生液を用い、
   試料を分析する分析工程において、第１緩衝液から第Ｎ緩衝液の順に各液体をカラムに送液し、その後、再生液をカラムに送液する液体クロマトグラフ分析方法であって、
   最初の分析工程に先立つ予備工程において、第（Ｎ−１）緩衝液，第Ｎ緩衝液，再生液の順に、各液体をカラムに送液することを特徴とする液体クロマトグラフ分析方法。
3. Ｎ種類の緩衝液、及びカラムを再生する再生液を用い、
   試料を分析する分析工程において、Ｎ種類の緩衝液をカラムに送液し、その後、再生液をカラムに送液する液体クロマトグラフ分析方法であって、
   最初の分析工程に先立つ予備工程において、２種類の緩衝液をカラムに送液し、その後、再生液をカラムに送液することを特徴とする液体クロマトグラフ分析方法。
4. イオン交換クロマトグラフィー分析方法であることを特徴とする請求項１〜３記載の液体クロマトグラフ分析方法。
5. 導入された試料を分離するカラムと、第１緩衝液を保持する第１緩衝液容器と、第２緩衝液を保持する第２緩衝液容器と、第３緩衝液を保持する第３緩衝液容器と、第４緩衝液を保持する第４緩衝液容器と、カラムを再生する再生液を保持する再生液容器とを備え、
   試料を分析する分析工程において、第１緩衝液，第２緩衝液，第３緩衝液，第４緩衝液、及び再生液の順に、各液体をカラムに送液する液体クロマトグラフ装置であって、
   最初の分析工程に先立つ予備工程において、第３緩衝液，第４緩衝液、及び再生液の順に、各液体をカラムに送液することを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
6. 導入された試料を分離するカラムと、第１緩衝液から第Ｎ緩衝液をそれぞれ保持する第１から第Ｎ緩衝液容器と、カラムを再生する再生液を保持する再生液容器とを備え、
   試料を分析する分析工程において、第１緩衝液から第Ｎ緩衝液の順に各液体をカラムに送液し、その後、再生液をカラムに送液する液体クロマトグラフ装置であって、
   最初の分析工程に先立つ予備工程において、第（Ｎ−１）緩衝液，第Ｎ緩衝液，再生液の順に、各液体をカラムに送液することを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
7. 導入された試料を分離するカラムと、Ｎ種類の緩衝液をそれぞれ保持するＮ個の緩衝液容器と、カラムを再生する再生液を保持する再生液容器とを備え、
   試料を分析する分析工程において、Ｎ種類の緩衝液をカラムに送液し、その後、再生液をカラムに送液する液体クロマトグラフ装置であって、
   最初の分析工程に先立つ予備工程において、２種類の緩衝液をカラムに送液し、その後、再生液をカラムに送液することを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
8. カラムがイオン交換カラムであることを特徴とする請求項５〜７記載の液体クロマトグラフ装置。

Images