JPS62177448A - 液体クロマトグラフイ−分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、液体クロマトグラフィー分析方法に係り、特
に一連の試料を繰り返し液体クロマトグラフィーで分析
する方法に関する。

【従来の技術〕

従来の液体クロマトグラフィーを利用したアミノ酸分析
法では、例えば、特公昭５９−２８６１に示されている
ように、アミノ酸混合物試料を分離カラムに導入し、複
数種の溶離液（緩衝液）を順次分離カラムに供給して全
アミノ酸成分を溶出し、次いで強アルカリ性の再生液を
供給して分離カラムを再生している。そして、このよう
な分析行程は。

一連の試料に対して繰り返し行われる。蛋白加水分解物
アミノ酸試料の測定から、生体液アミノ酸試料の測定の
ために分析装置を用いるときのように、他の分析操作条
件から特定の分析操作条件に変更する場合には１分析行
程の繰り返しの前に予備行程が行われる。

一連の多数の試料の全分析時間を短縮するために、前の
分析行程における再生液供給後から次の試料の分析行程
開始までの時間を短縮すると、分析操作条件変更後の第
１番目の試料の分離成分のリテンションタイムと、第２
番目以降の試料の分離成分のリテンションタイムとが異
なるという現象が生じた。すなわち、第３図に示すよう
に、アミノ酸の各成分のリテンションタイムは、第２回
目以降の分析行程では同じであるが、第１回目の分析行
程のときは遅いのである。

〔発明が解決しようとする問題点〕

発明者らは、一連の試料の全分析時間を短縮するために
障害となる上述の如き現象が生ずる原因を究明した。こ
れについて第２図を参照して説明する。

第２図の例は、蛋白加水分解物アミノ酸試料について、
４段溶離法で溶離液（緩衝液）を切換えて液体クロマト
グラフィー分析した例である。図中、Ｂ１は第１段、Ｂ
２は第２段、Ｂ３は第３段。

Ｂ４は第４段の各緩衝液を示し、Ｂ５はｐＨ１０以上の
強アルカリ性を示す再生液である。また、図の（ａ）は
各液のＰＨを示し、（ｂ）は各液のカウンターイオン濃
度を示す、ＢからＣが第１番目の試料の分析行程を示し
、ＣからＤまでが第２番目の試料の分析行程を示す。Ａ
′からＢまでが予備行程である。

第２図のように、従来は、予備行程において、再生液Ｂ
５を供給したあと、分析行程で用いられる第１段緩衝液
Ｂ１を供給することによって分前カラム内を平衝化し、
その後第１番目の試料を分析計内に導入して分析行程を
開始する。

本発明者らは、Ｂ点、０点、Ｄ点の各点で、順次各試料
の分析行程をスタートし、以降の試料について分析行程
を繰り返すことによって、全分析時間を短縮することを
試みた。

ところが、第１番目の試料については、第３図に示すよ
うな問題が生じた。この場合、第２図の（ａ）に示すＰ
Ｈの変化を見ると、カラム内の条件がどのスタート点で
も同じであるように見える。

しかしながら、カウンターイオン濃度の観点から見ると
、予備行程のスタート点であるＡ′におけるカウンター
イオン濃度は０．２Ｎである。ところが、０点およびＤ
点のカウンターイオン濃度を実測すると、第２図の破線
のようになる。すなわち、第１番目の試料のスタート点
Ｂ点におけるカウンターイオン濃度と、第２番目以降の
試料のスタート点Ｃ点およびＤ点におけるカウンターイ
オン濃度とは、実際には相違していることがわかった。

第２回目以降の分析は、実は完全な平衝化が行われない
ままスタートされ、それなりのリテンションタイムが安
定しているため、再現性が得られるのである。しかし、
第１回目のリテンションタイムと異なるため、成分ピー
クの正確な同定が困難となる。

本発明の目的は、一連の試料を繰り返し分析する場合に
全分析時間を短縮できる液体クロマトグラフィー分析方
法を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明では、一連の試料について複数種の溶離液を用い
同じ順序で成分分離動作が繰り返される一連の分析行程
の前に、分離カラム内の条件を整える予備行程を行う分
析方法において１分析行程で用いられる溶離液の内の最
高カウンターイオン濃度を有する溶離液と最高ＰＲの液
とを上記予備行程の間に上記分離カラムに供給すること
を特徴とする。

〔作用〕

本発明では、第１の試料の分析行程を行う前の予備行程
の間に、最高ＰＲの液（例えば再生液）を供給すること
に加えて、分析行程で用いられる最高カウンターイオン
濃度を有する溶謀液を供給することによって、第１試料
の分析行程のスタート時点でのカウンターイオン濃度を
、第２試料以降の分析行程のスタート時点のカウンター
イオン濃度と実質的に同じにし、すべての試料に関する
各分離成分のリテンションタイムの再現性を向上し、全
体の分析時間を短縮する。

〔実施例〕

本発明の一実施例を第１図を参照して説明する。

第１段溶離液Ｂ１のＰＨは３．３．カウンターイオン濃
度は０．２Ｎである。ここで、試料がアミノ酸混合物で
ある場合は、カウンターイオンとしてナトリウムイオン
又はリチウムイオンが通常用いられる。第２段溶離液Ｂ
２はＰＨは３．２であり、カウンターイオン濃度は、０
．２Ｎである。

第３段溶離液Ｂ３のＰＨは４．３であり、カウンターイ
オン濃度は０．２Ｎ　である。第４段溶離液Ｂ４のｐ　
Ｈは４．９　であり、カウンターイオン濃度は１．２Ｎ
である。再生液のｐ　Ｈは１２でありカウンターイオン
濃度は０．２Ｎである。この例は、蛋白加水分解物アミ
ノ酸試料の分析方法である。

第１図において、Ａ点からＢ点の間の予備行程のあと、
第１試料の分析行程はＢ点から開始され。

第２試料の分析行程は０点から開始され、第３試料の分
析行程はＤ点から開始され、以下同様に一連の試料がく
り返し分析される。

予備行程では、最初に第４段溶離液（緩衝液）と同じも
のが供給され、次いで、再生液Ｂ５、第１段溶離液Ｂ１
が供給される。溶離液Ｂ４のカウンターイオン濃度は１
．２Ｎであるので、第１試料の分析行程開始点であるＢ
点におけるカウンターイオン濃度の上昇程度は、第２試
料、第３試料の分析行程開始点Ｃ点、Ｄ点のそれと同じ
にできる。したがって、各分析行程開始点を、従来のも
のより、早めることができ、一連の試料に対する全分析
時間は大幅に短縮できる。

上述の実施例では、蛋白加水分解物アミノ酸試料を説明
しているが、生体液アミノ酸試料でも同様の予備行程が
実施される。生体液アミリ酸試料の分析の場合は、カウ
ンターイオン濃度が、溶離液（緩衝液）の段階が進むに
つれて１段ずつ高くなるが、この場合５予備行程の最初
に、分析行程におけるカウンターイオン濃度の最も高い
最終段溶離液が分離カラムに供給される。

第１図の実施例をアミノ酸分析計で実行する場合には、
操作パネルにウオーミングアツプキーを設け、このキー
をオペレータが押すと、予備行程が第１図の順序で行わ
れるように制御系および流路系を構成することは容易で
ある。また、このウオーミングアツプキーを設ける代り
に、時間を指定して予備行程の開始点を選択するソフト
ウェア機能を持たせるように構成することも容易である
。

予備行程は１分析操作条件が、例えば蛋白加水分解物ア
ミノ酸測定用から生体液アミノ酸測定用に変わったよう
な場合、あるいは１分析装置の始動時の場合に実行され
る。

〔発明の効果〕

本発明によれば、一連の試料についての各分析行程の開
始点を、充分な分離カラム条件に達する前に設定できる
ので、全体の分析時間を短縮でき、この場合、第１試料
の各成分のリテンションタイムを第２試料以降のものと
実質的に一致させることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例を説明するための図、第２図
は従来方法における問題点の原因を説明するための図、
第３図は従来方法によるリテンションタイムの変化例を
示す図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、新たな特定の分析操作条件で試料を液体クロマトグ
   ラフィー分析するために、一連の試料について複数種の
   溶離液を用い同じ順序で成分分離動作が繰り返される一
   連の分析行程の前に、分離カラム内の条件を整える予備
   行程を行う分析方法において、上記分析行程で用いられ
   る溶離液の内の最高カウンターイオン濃度を有する溶離
   液と最高ｐＨの液とを上記予備行程の間に上記分離カラ
   ムに供給することを特徴とする液体クロマトグラフィー
   分析方法。